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竹材和竹制品的环保特性已成为竹产业的标志属性。毛竹Phyllostachys edulis的微观结构是由维管束纤维与基体组成的两相复合材料，维管束纤维是影响毛竹宏观力学性能的关键。现有竹纤维分离方法可分为高温蒸煮和机械冲击摩擦2类，如蒸汽爆破、碾压捶打、机械梳解、化学分离等[1−8]。以上分离方法关注的焦点均在于所得纤维产品的性能优劣，而忽视了维管束与薄壁组织的分离效果评价。在分离过程中，常存在纤维热损伤、比强度降低、生产效率低、纤维尺寸一致性差等问题。
数控加工中心可通过数控程序精确控制刀具路径和切削方向，并通过合理设置刀具路径和铣削条件精确控制纤维形状。杨永福等[9]分析了不同刀具前角、切削速度以及进给量等切削参数对竹片平面直角自由切削过程中切削力的影响；郭莹洁等[10−11]研究了铣削加工参数的改变对竹片表面质量及超前劈裂的影响。OGAWA等[12−13]通过设定合适的加工中心切削参数，切削提取得到了长度均匀、无热损伤的竹纤维。上述研究主要围绕竹制品的切削特性和切削提取原竹纤维的加工条件展开，并未深入探讨天然竹维管束纤维制取过程中切削力及切削特性等变化。
为揭示天然毛竹维管束纤维提取过程中铣削参数对切削力及维管束纤维形态的影响，本研究以切削加工三要素为变量，使用双刃直槽硬质合金木工雕刻刀对竹板开展单向顺铣正交切削试验，运用极差、方差分析方法，验证分析铣削参数对切削力的影响，并建立切削力经验公式；基于瞬态切削几何模型和单因素试验，探究切削速度(Vc)、切削深度(Ap)和每齿进给量(fz)对维管束纤维提取质量的影响，以期为合理选取切削参数，高效获取优质竹纤维提供理论以及技术指导。
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选取浙江湖州5年生毛竹，并截取直径约110 mm，竹壁厚度约10 mm的竹段作为试材。去除竹节后放入烘箱中，在70~80 ℃下烘烤8 h。然后，用破竹器将每段试材分成8根竹条，并去除0.8 mm厚度的竹青表皮，最后对竹条进行切割，得到高度分别为36、40和44 mm的竹板毛坯。加工机床采用宁波其锐达机械有限公司生产的KMD-80120型三轴高速雕铣机，主轴最高转速达到12 000 r·min−1；试验刀具为直径10 mm的双刃直槽硬质合金木工雕刻刀。在试验过程中，刀刃径向跳动调整在6 μm以下。切削力测量系统为宁波灵元测控工程有限公司生产的压电晶体测力仪。
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对于纤维增强复合材料，具有大长径比的纤维是理想的[14−17]，因此本研究以纤维长度、纤维直径和纵横比评判维管束纤维质量。设计正交切削试验并获取各参数下的切削力数据，再基于切削力数据分析切削参数对切削力及维管束纤维质量的影响规律。
参考以往研究[18−20]，本研究将竹壁沿径向划分为图1所示的内、中、外3层，其中外部维管束纤维呈半开放型，纤维长轴平均长度为0.39 mm，短轴平均长度为0.23 mm。经测量，竹壁外部维管束纤维在水平方向的平均间隙为0.2~0.4 mm。切削过程中，为得到尽可能完整的维管束纤维，切削步进距(Ae)设置为0.4 mm。在以上加工参数的基础上，将切削速度、每齿进给量及切削深度分别定义为因素A、B、C，制定正交试验方案(表1)。试验采用刀刃平行于维管束纤维，沿X轴单向顺铣，干式切削方式进行，对每个试件连续切削3个步距，每组参数重复切削5个试件。通过以上正交试验，可得到135组切削力数据。
图 1 竹壁分层示意图
Figure 1. Schematic diagram of bamboo wall layering
表 1 正交试验及切削力
Table 1. Forces of orthogonal experimental cutting
序号 切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mm切削力/N 序号 切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mm切削力/N Fx Fy Fx Fy 1 62.8 0.2 4 23.70 −8.89 6 125.7 0.4 4 34.78 −10.86 2 62.8 0.3 12 81.04 −25.87 7 188.5 0.2 8 37.22 −24.62 3 62.8 0.4 8 69.56 −23.88 8 188.5 0.3 4 27.01 −15.82 4 125.7 0.2 12 55.84 −19.59 9 188.5 0.4 12 85.16 −42.63 5 125.7 0.3 8 51.97 −16.12 在切削速度为62.8 m·min−1，每齿进给量为0.2 mm，切削深度为4 mm，切削步进距为0.4 mm条件下，对高度为36 mm的竹块毛坯进行切削试验，每个切削刃的部分切削分力(Fx、Fy、Fz)的动态分布曲线如图2所示。切削力呈周期性变化。由于竹壁维管束纤维呈错列排布，铣削过程中维管束纤维的切削厚度不尽相同，因此加工过程中切削力的最大值变化显著。1个切削周期内，Fx先增后减，且为正值，表明在切削过程中，切削刃始终沿进给方向对竹板产生拉力，且随着切削厚度增至最大，切削力也增至最大；Fy向切削刃始终对竹板产生挤压作用，且顺铣时切削刃切出工件侧面过程中，切削厚度逐渐减小为0，故Fy始终为负值。此外，不同于螺旋铣刀，双刃直槽硬质合金木工雕刻刀在切削过程中对材板无Z轴方向作用力，但机床系统振动会导致Z轴方向作用力产生如图2C所示的微小波动[21]，因此本研究忽略Z轴方向作用力的影响[22−23]。为保证试验数据的一致性，均在切削力曲线中选取重复频率较高、数值较大的切削力数值进行记录。每组试验参数记录15组切削力数据，并计算其平均值作为该组正交试验参数的切削力，正交试验方案及切削力如表1所示。
图 2 切削力动态分布
Figure 2. Dynamic distribution of cutting force
图3为维管束纤维切削瞬态几何模型[24]。定义纤维纵横比为α=L/amax，用以标定维管束纤维的长度和窄度，其中L为切割弧长，amax为最大纤维切削厚度。amax与L可根据下式得到：
图 3 维管束纤维切削瞬态几何关系
Figure 3. Transient geometry of vascular bundle fiber cutting
$$ \mathit{a} _{ \mathrm{\max }} \mathrm= \mathit{f} _{ \mathrm{z}} \mathrm{sin} \mathit{\varphi } _{ \mathrm{0}} \mathrm{\text{；}} $$ (1) $$ \mathit{L} \mathrm{=2{\text{π}} } \mathit{R\varphi } _{ \mathrm{0}} \mathrm{/360。} $$ (2) 式(1)~(2)中：fz为每齿进给量，φ0为最大接触角，R为刀具半径。定义维管束纤维理论直径为De=(L+amax)/2。从每组试验中随机选取的100根维管束纤维，使用游标卡尺分别测量纤维厚度、切割弧长和纤维长度(L0)，并分别以各自平均值作为对应参数的最终数据。
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在每齿进给量为0.4 mm，切削深度为12 mm，切削步进距为0.4 mm条件下，切削速度与切削力平均值的关系如图4所示。切削过程中，Fx为正值，为主要切削力。Fy为负值，切削刃对工件产生挤压作用。随着切削速度的增加，刀具单次切削竹维管束的体积减小，单次切削功率也随之减小，因此Fx随切削速度的增加而减小；Fy在−40 N附近轻微波动。由此可见：切削速度的变化对Fy方向的切削力影响不大，其轻微波动主要由切削系统共振造成。
图 4 切削速度对切削力影响
Figure 4. Influence of cutting speed on cutting force
在每齿进给量为0.4 mm，切削深度为12 mm, 切削步进距为0.4 mm条件下，切削速度对维管束纤维形态的影响如图5所示。随着切削速度的增加，维管束纤维直径(D0)先减小后增大，且数值只有维管束纤维理论直径的0.5~0.7倍(图5A)。这是因为理论切割弧长大于维管束纤维直径，即使维管束纤维被完整切割也无法达到理论值。各参数铣削获得的维管束纤维长度比较稳定，且与理论值的误差极小(图5B)。维管束纤维纵横比随着切削速度的增大而增大，且当切削速度大于125.7 m·min−1时，纤维纵横比有较明显的提高(图5C)。由纤维直径、纤维长度及纤维纵横比的变异系数(CV)可知(图5D)：随着切削速度的变化，纤维长度并未产生明显的变化，纤维直径和纤维纵横比均在切削速度为160.0~188.5 m·min−1时出现最小值且变化幅度较小。综上，提高切削速度有助于获得尺寸稳定且有较大纵横比和直径的维管束纤维。
图 5 切削速度对竹纤维形态的影响
Figure 5. Effect of cutting speed on the shape of bamboo fiber
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在切削速度为125.7 m·min−1，切削深度为12 mm，切削步进距为0.4 mm条件下，每齿进给量与切削力平均值的关系如图6所示。随着每齿进给量增加，单位时间内切下切屑的体积增大，切削功率也随之增大，因此随着每齿进给量的增加，Fx呈近似线性增大，Fy呈近似线性减小。
图 6 每齿进给量对切削力的影响
Figure 6. Influence of feed rate per tooth on cutting force
在切削速度为125.7 m·min−1，切削深度为12 mm, 切削步进距为0.4 mm条件下，每齿进给量对维管束纤维形态的影响如图7所示。不同每齿进给量下获得维管束纤维直径先减小后增大，且当每齿进给量为0.2 mm时出现最大值(图7A)；各参数铣削获得的维管束纤维长度比较稳定，且与理论值接近(图7B)；纤维纵横比随着每齿进给量增加，呈先下降后上升再下降的趋势，且当每齿进给量为0.2 mm时出现最大值(图7C)；纤维长度、纤维直径和纤维纵横比随每齿进给量变化而产生明显的变化，但均在每齿进给量为0.2 mm时获得最优维管束纤维(图7D)。综上，减小每齿进给量有利于获得较高质量的维管束纤维。
图 7 每齿进给量对竹纤维形态的影响
Figure 7. Effect of feed rate per tooth on bamboo fiber morphology
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在切削速度为188.5 m·min−1，每齿进给量为0.3 mm，切削步进距为0.4 mm条件下，切削深度与切削力平均值的关系如图8所示。随着切削深度增加，单位时间内切下切屑的体积增大，切削功率也随之增大，因此Fx随切削深度的增加而增大，而Fy随切削深度的增加而减小。
图 8 切削深度对切削力的影响
Figure 8. Influence of cutting depth on cutting force
在切削速度为188.5 m·min−1，每齿进给量为0.3 mm, 切削步进距为0.4 mm条件下，切削深度对维管束纤维形态的影响如图9所示。不同切削深度下获得维管束纤维直径变化不大，且为理论值的一半左右(图9A)；维管束纤维长度随切削深度增加而增加，且曲线斜率为1，表明纤维长度与理论值保持一致(图9B)；纤维纵横比随着切削深度增加，呈先下降后上升的趋势(图9C)；图9D为切削深度对纤维形态变异系数的影响，其中纤维长度和纤维直径的变异系数基本保持恒定，纤维纵横比的变异系数先降低后升高且在切削深度大于10 mm后基本保持恒定。综上，增加切削深度有利于获得较高质量的维管束纤维。
图 9 切削深度对竹纤维形态的影响
Figure 9. Effect of cutting depth on the shape of bamboo fiber
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对切削力正交试验结果进行极差分析，结果如表2所示。由表2可知：切削深度(C)对Fx和Fy的影响最大，切削速度(A)和每齿进给量(B)分别对Fx和Fy的影响最小。因此，可以得到对Fx和Fy影响最小的最优加工参数方案为A2B1C1。
表 2 切削力正交试验极差
Table 2. Range of cutting force orthogonal experiment
切削力 参数 切削参数 切削力 参数 切削参数 切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mm切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mmFx K1 174.301 116.764 85.497 Fy K1 −58.638 −53.102 −35.573 K2 142.582 160.022 158.749 K2 −46.577 −57.819 −64.624 K3 149.399 189.497 222.037 K3 −83.078 −77.373 −88.096 k1 58.100 38.921 28.499 k1 −19.546 −17.701 −11.858 k2 47.527 53.341 52.916 k2 −15.526 −19.273 −21.541 k3 49.800 63.166 74.012 k3 −27.693 −25.791 −29.365 R 10.573 24.244 45.514 R 12.167 8.090 17.507 主次因素 Ap ＞ fz ＞ Vc 主次因素 Ap ＞ Vc ＞ fz 最优方案 A2B1C1 最优方案 A2B1C1 说明：Ki. 满足要求的单元格求和；ki. Ki的算术平均值；R. 极差。 对切削力数据进行方差分析，结果如表3所示。在单向顺铣过程中，切削深度对Fx影响极显著(P＜0.01)，对Fy影响显著(P＜0.05)。每齿进给量对Fx影响显著(P＜0.05)，对Fy影响不显著。切削速度对Fx和Fy切削力影响均不显著。因此，单向顺铣过程中，切削深度是影响切削力的最主要因素，每齿进给量对切削力的影响大于切削速度。方差分析结果与极差分析结果一致，表明正交试验设计的有效性。
表 3 切削力方差分析
Table 3. Variance analysis of cutting force
方差来源 离差平方和 均方 F值 显著性 方差来源 离差平方和 均方 F值 显著性 Fx Vc 245.647 122.823 14.032 0.067 Fy Vc 230.558 115.279 18.291 0.052 fz 860.307 430.153 49.144 0.020* fz 110.412 55.206 8.760 0.102 Ap 3 125.755 1 562.877 178.556 0.006** Ap 461.497 230.748 36.613 0.027* 误差 17.506 8.753 误差 12.605 6.302 说明：*. 差异显著(P＜0.05)，**. 差异极显著(P＜0.01)。 对不同切削状态下的切削数据进行多元非线性回归分析[25−26]。Fx非线性回归方程决定系数(R2)为0.956，说明对应模型能解释95.6%的变异，模型拟合效果很好。Fy非线性回归方程R2为0.697，说明对应模型仅能解释69.7%的变异。
$$ {F}_{x}=37.818\;3{{A}_{\mathrm{p}}}^{0.865}{{f}_{\mathrm{z}}}^{0.688}{{V}_{\mathrm{c}}}^{-0.135}{\text{，}}{R}^{2}=0.956{\text{；}} $$ (3) $$ {F}_{y}=1.832\;4{{A}_{\mathrm{p}}}^{0.842}{{f}_{\mathrm{z}}}^{0.65}{{V}_{\mathrm{c}}}^{0.312}{\text{，}}{R}^{2}=0.697\mathrm{。} $$ (4) 式(3)~(4)中：Fx和Fy为切削分力；Ap为切削深度度；fz为每齿进给量；Vc为切削速度；R2为决定系数。正交试验与回归方程预测的对比结果如表4所示。Fx的预测值与试验值的误差为±6%左右，说明回归方程具有较高的可靠性。Fy的预测值与试验值的偏差较大，是因为切削刃对竹板反复产生挤压作用，导致切削系统振动。但对比Fy的试验值与预测值可知，预测值与理论值之间的差值在±5 N以内，且Fy的切削力数值相对较小，因此Fy的回归模型能够一定程度上反映其实际切削状态。
表 4 正交试验参数回归方程预测值检验
Table 4. Test of predicted value of regression equation of orthogonal experimental parameters
序号 Fx/N Fy/N 序号 Fx/N Fy/N 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 1 24.31 23.70 −2.57 −8.89 −7.53 −18.06 6 33.16 34.78 4.66 −10.86 −14.66 25.92 2 77.81 81.04 3.99 −25.87 −24.71 −4.69 7 37.25 37.22 −0.08 −24.62 −19.01 −29.51 3 73.81 69.56 −6.11 −23.88 −21.17 −12.80 8 25.41 27.01 5.92 −15.82 −13.80 −14.64 4 57.63 55.84 −3.21 −19.59 −23.57 16.89 9 84.00 85.16 1.36 −42.63 −41.97 −1.57 5 49.00 51.97 5.71 −16.12 −21.80 26.06 为进一步验证回归模型的可靠性，设计各切削要素条件下的非正交试验，试验结果如表5所示。回归方程对各参数的切削力预测与上述非正交试验结果基本一致，说明回归方程具有较高的可靠性。
表 5 非正交试验参数回归方程预测值检验
Table 5. Test of predicted values of regression equations of non-orthogonal experimental parameters
序号 切削速度/(m·min−1) 每齿进给量/mm 切削深度/mm Fx/N Fy/N 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 1 62.8 0.3 4 31.33 32.72 4.25 −9.80 −13.73 28.62 2 62.8 0.4 12 98.78 104.34 5.33 −29.79 −35.13 15.20 3 125.7 0.2 4 21.59 22.24 2.92 −9.35 −8.35 −11.98 4 125.7 0.2 8 39.32 39.29 −0.08 −16.75 −14.65 −14.33 5 125.7 0.3 12 73.80 73.09 −0.97 −30.67 −29.17 −5.14 6 125.7 0.4 8 63.34 62.86 −0.76 −26.29 −20.00 −31.45 7 125.7 0.4 12 89.95 90.53 0.64 −36.98 −37.37 1.04 8 188.5 0.2 12 52.86 56.42 6.31 −26.75 −37.78 29.20 9 188.5 0.3 8 49.20 46.38 −6.08 −24.74 −22.04 −12.25 -
切削深度对维管束纤维切削力的影响最大，平行于刀具进给方向受力主要为切削力，每齿进给量相对于切削速度对切削力的影响更明显，垂直于刀具进给方向主要受挤压力作用，切削速度比每齿进给量对切削力的影响大。对不同切削状态下的切削数据进行多元非线性回归分析，得到切削力非线性回归模型。试验值与模型预测值的对比结果显示：该模型可以较为准确地计算各方向的切削力。
采用铣削方法可提取长度一致性好的维管束纤维，且可通过控制铣刀的切削深度，得到不同长度的维管束纤维。采用较高切削速度、较大切削深度和较小每齿进给量有助于获得较大长径比和直径的维管束纤维。
Effect of milling parameters on cutting force and quality of vascular bundle fiber extraction in bamboo
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摘要:
目的 探究采用铣削方式提取毛竹Phyllostachys edulis维管束纤维时切削力及提取质量的最优切削参数，为高效获取粗细、长度等一致性好的优质天然维管束纤维提供理论参考。 方法 以切削速度(Vc)、每齿进给量(fz)、切削深度(Ap)为变量，使用双刃直槽硬质合金木工雕刻刀，对竹板开展单向顺铣正交切削试验；运用极差和方差分析方法，交互验证切削参数对切削力的影响；利用多元非线性回归方法对试验数据进行分析，建立切削力经验公式；基于瞬态切削几何模型和单因素试验，探究切削三要素对维管束纤维提取质量的影响。 结果 切削过程中，刀具对工件产生X、Y向切削力，Z向切削力在0附近持续波动。切削深度对切削力影响极其显著。平行刀具进给方向主要受切削力作用，每齿进给量比切削速度对切削力的影响更显著；垂直刀具进给方向主要受挤压力作用，切削速度比每齿进给量对切削力的影响更显著。沿刀具进给方向切削力的非线性回归方程决定系数(R2)为0.956，可以较准确地预测切削力大小；垂直刀具进给方向切削力的非线性回归方程决定系数为0.697，但其预测值与理论值之间误差为±5 N，可以反映该方向切削力的总体变化趋势。采用铣削方式获得的平均纤维长度与目标长度误差为±0.1 mm，在切削参数范围内，当切削参数为：Vc=188.5 m·min−1，Ap=12 mm，fz=0.2 mm时，得到较大直径和较大纵横比的维管束纤维。 结论 切削深度是影响切削力大小的最主要因素。平行刀具进给方向，每齿进给量比切削速度对切削力的影响大；垂直刀具进给方向，切削速度比每齿进给量对切削力的影响大。切削力非线性回归模型可以较准确计算各方向的切削力和总体变化趋势；采用的铣削方式可准确控制维管束纤维的目标长度，采用较高切削速度、较大切削深度和较小每齿进给量有助于获得较大长径比和直径的维管束纤维。图9表5参26 Abstract:Objective This study aims to explore the optimal cutting parameters for cutting force and extraction quality when extracting bamboo (Phyllostachys edulis) vascular bundle fibers by milling, and provide theoretical reference for efficient acquisition of high-quality natural vascular bundle fibers with uniform thickness and good consistency in length and size. Method Cutting speed (Vc), feed per tooth (fz), and cutting depth (Ap) were taken as variables, unidirectional milling and orthogonal cutting experiments were conducted on bamboo boards using a double-edged straight groove hard alloy woodworking carving knife. The influence of cutting parameters on cutting force was verified by range analysis and variance analysis. The experimental data were analyzed by multivariate nonlinear regression method to establish an empirical formula for cutting force. Based on transient cutting geometric model and single-factor experiments, the effects of cutting speed, cutting depth, and feed per tooth on the quality of vascular bundle fiber extraction were investigated. Result During the cutting process, only X-Y-directional cutting forces were generated on the workpiece, while the Z-directional cutting force continuously fluctuated near zero value. Cutting depth had an extremely significant impact on cutting force. Within the X-Y plane, cutting force mainly acted along parallel the feed direction of the tool, and feed per tooth had a more significant influence on cutting force than cutting speed. The vertical tool feed direction was mainly affected by extrusion force, and cutting speed had a more significant effect on cutting force than feed per tooth. The coefficient of determination (R2) of nonlinear regression equation for cutting force along the tool feed direction was 0.956, which could accurately predict the magnitude of cutting force. The determination coefficient of the nonlinear regression equation for cutting force in the vertical tool feed direction was 0.697, but the error between its predicted and theoretical value was within ±5 N, reflecting the overall trend of cutting force in this direction. The error between the average fiber length obtained by milling and the target length was within ±0.1 mm. Within the range of cutting parameters, when cutting parameters were Vc=188.5 m·min−1, Ap=12 mm, and fz=0.2 mm, vascular bundle fibers with larger diameters and higher aspect ratio were obtained. Conclusion Cutting depth is the most important factor affecting the magnitude of cutting force. In the parallel tool feed direction, feed per tooth has a greater impact on cutting force than cutting speed. In the vertical tool feed direction, cutting speed has a greater impact on cutting force than feed per tooth. The nonlinear regression model of cutting force can accurately calculate cutting force in various directions and the overall trend of change. The milling method can accurately control the target length of vascular bundle fibers. Higher cutting speed, greater cutting depth, and smaller feed per tooth can help obtain vascular bundle fibers with larger aspect ratio and diameters. [Ch, 9 fig. 5 tab. 26 ref.] -
Key words:
- vascular bundle fibers /
- milling parameters /
- cutting force /
- fiber morphology
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《全国土壤污染状况调查公报》显示，中国耕地土壤污染点位超标率高达19.4%，重金属污染点位超标率为15.5%，其中镉的点位超标率为7.0%，居首位[1]。镉是一种毒性很强的人体非必需元素，极易被作物吸收进入食物链，从而危害人体健康[2]。如何阻遏环境中的镉进入食物链，已成为当前土壤及生态环境领域的研究热点之一[3]。目前，微生物修复技术成为镉污染治理的研究方向之一[4]。蒋成斌[5]筛选到2种耐镉细菌：腐败希瓦菌Shewanella putrefaciens和假单胞菌Pseudomonas sp.，在LB(Luria-Bertani)固体和液体培养上耐受重金属镉离子(Cd2+)浓度分别达到150和40 mmol·L−1。张欣等[6]在模拟镉轻度污染(1 mg·kg−1)试验中通过施入微生物菌剂(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、光合细菌和乳酸菌)后使菠菜Spinacia oleracea镉含量平均下降14.5%。王微等[7]和何小三等[8]利用硅藻土制备的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa菌剂能够显著促进镉胁迫苗期水稻Oryza sativa的生长，抑制镉在根、茎鞘、叶片中的迁移与积累。汪敦飞等[9]研究指出：耐镉铜绿假单胞菌及其菌剂能显著提高镉胁迫水稻苗期的根系活力，增强水稻叶片抗氧化酶系统的活力，提高水稻叶片抗氧化物的含量，从而有效缓解水稻镉胁迫效应。假单胞菌为革兰氏阴性菌，环境适应能力强，世代周期短，具有根际促生能力，已被广泛用作生防菌[10-11]。本课题组前期从水稻根际土壤筛选了1株耐镉的假单胞菌TCd-1，能在高达900 mg·L−1 Cd2+下生长，在100 mg·L−1镉处理下，菌株体内吸收的镉质量分数为9.04 mg·g−1，镉富集系数达到90.4，具有较强镉富集能力，因此有应用于镉污染的修复潜力[12]。但该菌株的培养条件有待优化。响应面分析法是一种综合试验设计和数学建模的方法，既能有效减少试验次数又能考察各个因素之间的交互作用[13-14]，在优化试验设计中，被人们广泛使用[15]。胡瑞萍等[16]利用响应面法优化了枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis NHS1菌株培养基组分，使芽孢含量比优化前提高1.5倍。印杨等[17]利用响应面法优化了生防菌株(巨大芽孢杆菌Megaterium bacillus RB10)的发酵培养条件参数，证实了Box-Behnken设计的有效性和模型的准确可靠[17]。袁辉林[18]以植物促生菌SZ7-1为研究对象，在5 L自动发酵罐中采用单因素试验设计及响应曲面法进行扩大培养，结果表明：优化后的培养条件更利于菌株的生长，且活菌数是优化前的1.62倍。刘江红等[19]通过响应面法优化了芽孢杆菌Bacillus S2的培养条件，使最优乳化指数(E24)提高为81.20%。巩志金等[20]利用响应面法优化了铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的发酵培养基，结果使其产量提高了14.43%。本研究基于响应面法通过单因素筛选试验、Plackett-Burman试验、Box-Behnken 试验和响应面分析法，对TCd-1菌株培养条件进行优化，以期为菌株潜在价值的开发利用和菌剂制备提供技术支持。
1. 材料与方法
1.1 菌种及其活化培养
供试菌株为耐镉的假单胞菌Pseudomonas sp. TCd-1(专利号CN 103952333A)[21]，甘油保存于−80 ℃冰箱。菌株活化时取出塑料冻存管，立即置于30~40 ℃恒温水浴锅中匀速摇动进行快速复苏，待冻存管内结冰全部溶解后，开启冻存管，将内容物转移至种子液培养基内培养。
种子液培养条件：采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠 5.0 g，琼脂 15.0~20.0 g，1.0 L蒸馏水，pH 7.2~7.4)。菌株长出后选取直径约为3 mm的菌落进行平板划线法过夜培养，再从2次培养的固体培养基上挑取1环菌落至100 mL的三角瓶，150 r·min−1，37 ℃，恒温培养18 h，制成菌株种子液。发酵培养条件：牛肉膏蛋白胨液体培养基100 mL，质量分数为0.5%氯化钠，1.0%种子液，150 r·min−1，37 ℃恒温培养24 h。
1.2 试验设计
1.2.1 单因素试验
在发酵培养条件下，选择不同氮源：N1为酵母粉，N2为硫酸铵[(NH4)2SO4]，N3为硝酸铵(NH4NO3)，N4为蛋白胨，N5为硝酸钾(KNO3)，N6为氯化铵(NH4Cl)，N7为硝酸纳(NaNO3)，设置质量分数为0.5%、1.0%、1.5% 3个水平；不同碳源：C1为牛肉膏，C2为可溶性淀粉，C3为葡萄糖，C4为蔗糖，设置质量分数为0.1%、0.3%、0.5% 3个水平；不同无机盐：W1为氯化钙(CaCl2)，W2为氯化镁(MgCl2)，W3为氯化钠(NaCl)，W4为氯化钾(KCl)，W5为磷酸氢二钠(Na2HPO4)，W6为硫酸钠(Na2SO4)，W7为磷酸二氢钠(NaH2PO4)，设置质量分数为0.2%、0.5%、0.8% 3个水平。以菌株最大吸收波长660 nm下的吸光度D(660)作为评价指标，筛选最适的碳源、氮源、无机盐及其质量分数。
1.2.2 Plackett-Burman试验
根据单因素试验得到的最适碳源(牛肉膏)、氮源(酵母粉)、无机盐(MgCl2)，进行Plackett-Burman试验。试验设计如表1。试验次数 n=12，各因素水平设置为高低2个水平，高水平(1)取值为低水平(−1)的1.25倍，其中 D、H、K为空白试验，用于误差估计。考察牛肉膏(A)、酵母粉(B)、MgCl2(C)、培养温度(E)、初始pH(F)、接菌量(G)、培养时间(I)和转速(J) 8个因素对菌株生长的影响，确定影响菌株生长的关键因素。
表 1 Plackett-Burman试验设计因素和水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design因素 水平 因素 水平 因素 水平 −1 1 −1 1 −1 1 A 牛肉膏/% 4.0 5.0 E 温度/% 30.0 37.50 I 培养时间/h 20 24 B 酵母粉/% 0.8 1.0 F 初始pH 6.0 7.50 J 转速/(r·min−1) 160 200 C MgCl2/% 4.0 5.0 G 接菌量/% 1.0 1.250 K 空白3 D 空白1 H 空白2 1.2.3 最陡爬坡及Box-Behnken试验
根据Plackett-Burman试验筛选得到的显著影响菌株生长的关键因素(酵母粉、温度、初始pH)，确定最陡爬坡试验的步长和方向，获得最佳的响应区域。
以最陡爬坡试验得到最佳响应区域(2号试验)作为Box-Behnken试验设计的中心点，各因素取3个水平，以(−1，0，1)表示，设计包括了5个中心点(0，0，0)，即酵母粉0.9%、温度35 ℃、pH 7，共17个组合的响应面试验。各处理3次重复。
表 4 最陡爬坡试验Table 4 Factors and levels of steepest ascent design试验
号B 酵
母粉/%E 温
度/℃F 初
始pH编码 吸光度 1 0.8 40 8.0 (−1，1，1) 1.079±0.058 c 2 0.9 35 7.0 (0，0，0) 1.720±0.006 a 3 1.0 30 6.0 (1，−1，−1) 1.681±0.015 b 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 1.2.4 响应面分析
根据Box-Behnken试验结果，进行方差分析，并拟合线性回归方程，检验拟合防方程的符合程度；利用拟合方程获得最佳培养条件，并在最佳培养条件下进行验证试验。
1.3 数据处理
数据处理和作图使用Excel 2016进行，统计分析使用Design Experts 10和IBM SPSS 22。试验结果以平均值±标准差表示，采用Duncan法进行数据差异显著性检验(P=0.05)。
2. 结果与分析
2.1 单因素试验结果
结果表明：碳源种类及其质量分数显著影响菌株的生长(图1A)，菌液吸光度随牛肉膏、可溶性淀粉质量分数的提高而增大，而葡萄糖和蔗糖质量分数对菌液吸光度的影响较小。各处理中以0.5%牛肉膏培养的吸光度(1.257)最高，显著高于其他各处理(P＜0.05)，比可溶性淀粉的最大值高10.8%，比葡萄糖和蔗糖的最大值分别提高了17.7%和23.6% (图1A)。不同氮源及其质量分数显著(P＜0.05)影响菌株的生长(图1B)，有机氮源(酵母粉、蛋白胨)更利于菌株生长，各处理中以1.0%酵母粉处理的吸光度(1.266)最高，比1.0%蛋白胨高14.2%，比硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、氯化铵和硝酸钠处理的最大吸光度分别高出62.7%、79.8%、76.8%、52.7%、87.0%。不同无机盐显著(P＜0.05)影响菌株的生长(图1C)。培养基含0.5%镁离子时的菌液吸光度(1.197)最高，而钙离子最不利于菌株生长；培养基含0.5%的氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、硫酸钠、磷酸二氢钠与含0.8%的氯化镁、氯化钾、磷酸二氢钠间无显著性差异。可见，选择0.5%牛肉膏、1.0%酵母粉及0.5% MgCl2作为基础培养基是最合适的。
图 1 不同碳源(A)、氮源(B)、无机盐(C)对菌株生长影响Figure 1 Effect of carbon source(A)，nitrogen source(B)，inorganic salt (C) on the growth of strains不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)2.2 Plackett-Burman 试验结果
Plackett-Burman试验结果显示：菌株生长在不同处理间存在显著差异(表2)，以8号、9号、10号吸光度高，且之间无显著性差异。9号吸光度 (1.802)最高，比最低5号(0.981)的值高83.7%。
表 2 Plackett-Burman 试验结果Table 2 Results of Plackett-Burman design试验号 A 牛肉膏 B 酵母粉 C 氯化镁 D 空白1 E 温度 F pH G 接菌量 H 空白2 I 时间 J 转速 K 空白3 吸光度 1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1.235±0.078 f 2 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 1 −1 −1 1.358±0.030 e 3 1 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1.563±0.058 b 4 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 −1 −1 1 1.397±0.021 de 5 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 −1 1 1 0.981±0.042 h 6 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 1 1.440±0.028 cd 7 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 1 1 −1 1.121±0.026 g 8 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1.756±0.010 a 9 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 −1 1 1 1.802±0.003 a 10 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1.783±0.012 a 11 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1.195±0.096 fg 12 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 1.492±0.041 bc 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 进一步的因子分析(表3)结果表明：在设定的试验条件下，显著影响菌株生长的因子为酵母粉(B)、温度(E)和pH (F)，显著性程度从大到小依次为温度、酵母粉、pH。确定这3个因素为影响菌株生长的关键因素，进行最陡爬坡试验。
表 3 Plackett-Burman试验显著性分析结果Table 3 Results of Plackett-Burman design来源 均方和 自由度 均方 F P 显著性 效应系数 显著性排序 效应正负 模型 0.780 00 8 0.098 00 70.01 0.002 5 ** 1.430 A 牛肉膏 0.004 07 1 0.004 07 2.91 0.186 5 0.018 7 ＋ B 酵母粉 0.200 00 1 0.200 00 141.15 0.001 3 ** 0.130 2 ＋ C 氯化镁 0.004 84 1 0.004 84 3.46 0.159 8 0.020 5 ＋ E 温度 0.540 00 1 0.540 00 387.22 0.000 3 ** −0.210 1 − F pH 0.017 00 1 0.017 00 12.45 0.038 7 * −0.038 3 − G 接菌量 0.004 76 1 0.004 76 3.40 0.162 2 −0.020 6 ＋ I 时间 0.000 03 1 0.000 03 0.022 0.892 7 0.002 8 ＋ J 转速 0.013 00 1 0.013 00 9.49 0.054 1 −0.033 4 − 说明：*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01) 2.3 最陡爬坡试验结果
参照表3因子的正负效应可知：因素B、因素E、因素F各具有不同正、负效应系数，即酵母粉(B)具有正效应(+)，依次增大；温度(E)具有负效应(−)，依次减小；pH (F)具有负效应(−)，依次减小。
最陡爬坡试验结果(表4)显示：随着酵母粉质量分数逐渐增大，温度和pH逐渐减小，菌株吸光度呈现先升高后下降的变化趋势。2号的吸光度达到最高水平(1.720)，比1号和3号分别高出2.3%和59.4%，以此确定为因子的最大相应值响应区域，即酵母粉质量分数为0.9%，温度为35 ℃，pH 7的组合可作为Box-Behnken试验设计的中心点(0，0，0)。
2.4 Box-Behnken试验结果
Box-Behnken试验结果表明：不同试验组合间存在显著差异(表5)。14 号吸光度(1.785)最高，比2号(0.922)高93.6%，即14号(0，0，0)：酵母粉质量分数为0.9%，温度为35 ℃，pH 7条件下的吸光度高于2号(0，1，1)：酵母粉质量分数为0.8%，温度为40 ℃，pH=7条件下的吸光度。
表 5 Box-Behnken试验设计Table 5 Results of Box-Behnken design试验序号 B 酵母粉/% E 温度/℃ F 初始pH 吸光度 试验序号 B 酵母粉/% E 温度/℃ F 初始pH 吸光度 1 0 0 0 1.505±0.007 g 10 1 −1 0 1.770±0.023 ab 2 0 1 1 0.922±0.014 j 11 −1 0 −1 1.634±0.021 f 3 1 0 1 1.655±0.035 ef 12 1 0 −1 1.670±0.007 ef 4 −1 −1 0 1.056±0.027 h 13 0 0 0 1.749±0.024 ef 5 0 0 0 1.661±0.018 ef 14 0 0 0 1.785±0.007 a 6 0 −1 −1 0.941±0.042 ig 15 −1 1 0 1.754±0.010 abc 7 −1 0 1 1.524±0.013 g 16 0 0 0 1.733±0.003 bc 8 0 1 −1 0.967±0.060 i 17 0 −1 1 1.727±0.009 cd 9 1 1 0 1.690±0.010 de 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 2.5 Box-Behnken试验回归模型和方差分析结果
回归模型的方差分析结果表明：模型多元相关性系数为0.9958 (表6)，表明仅有0.042 0%的变异不能由此模型解释；回归模型P＜0.01，表明模型是极显著的。模型失拟项的显著性水平P=0.146＞0.05，表明模型失拟不显著。方差分析结果显示，Box-Behnken设计的模型显著性水平P＜0.000 1，表明所采用的拟合模型达到极显著水平，具有统计学意义。由表6可知，3个因素的影响程度从大到小次序为温度(E)、酵母粉(B)、pH(F)；B、E、F、E2 对响应值Y(吸光度)的影响达到极显著水平，EF显著影响Y值。此外，回归方程的相关系数R2=0.9958，变异系数为2.08%，说明该回归方程拟合度高，变异几率低，适用于该菌株试验条件下各影响因素的统计分析。该响应面拟合方程为：Y=1.750 0+0.050 0B−0.307 0E−0.033 3F−4.000 0E−0.030 0BE−0.011 0BF−0.040 7EF−0.023 6B2−0.441 0E2−0.034 9F2。依据单因素和Plackett-Burman试验的结果选择设定的酵母粉(B)、温度(E)和pH(F)的取值范围，利用响应面拟合方程得到3个关键因素的拟合值：酵母粉为1.0%，pH为6.3，温度为33 ℃。该拟合值条件下模型的预测吸光度最大，为1.856。
表 6 Box-Behnken试验回归模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model of Box-Behnken test来源 均方和 自由度 均方 F 显著性 来源 均方和 自由度 均方 F 显著性 模型 1.638 00 9 0.182 00 182.747 ** B2 0.002 36 1 0.002 36 2.371 B 0.020 00 1 0.020 00 20.091 ** E2 0.820 50 1 0.820 00 824.161 ** E 0.756 00 1 0.756 00 759.257 ** F2 0.005 14 1 0.005 14 5.159 F 0.008 90 1 0.008 91 8.951 ** 残差 0.006 97 7 0.001 00 BE 0. 000 06 1 0.000 06 0.064 失拟项 0.004 91 3 0.001 64 3.179 不显著 BF 0.000 48 1 0.000 48 0.486 纯误差 0.002 06 4 0.000 52 EF 0.006 64 1 0.006 64 6.672 * 总和 1.644 00 16 说明：变异系数为2.08%，相关系数为0.995 8，校正决定系数为0.9903，预测系数为0.950 3。*表示显著差异(P＜0.05)，**表示极显 著差异(P＜0.01) 2.6 优化结果验证
综合单因素筛选试验、Plackett-Burman及 Box-Behnken试验模型的拟合值，得到菌株最佳培养条件为：牛肉膏质量分数为0.5%，酵母粉1.0%，氯化镁 0.5%，pH 6.3，温度33 ℃，接菌量1.25%，转速160 r·min−1，培养时间24 h。利用最佳培养条件，进行重复试验验证，得到菌液的吸光度为1.801±0.015，与模型预测的最大值(1.856)相接近，接近程度97.03%，表明模型准确可信，能真实评价各因素及其交互作用对菌株生长的不同影响。同时，与未优化前培养条件下菌株吸光度(1.078±0.021)相比，优化后该值提高了67.07%，达到预期目的。
3. 讨论与结论
3.1 Plackett-Burman试验中显著因素对菌株生长影响
Plackett-Burman 是一种基于非完全平衡块原理的近饱和的两水平试验设计方法。通过N次试验最多可以考察N−1个因素，用最少试验次数可以从众多因素中快速有效地筛选出最为重要的几个主效因子，每个因素取低和高2个水平，高水平取低水平的1.25倍[22-23]。
在本试验中，Plackett-Burman试验从多个因素[牛肉膏(A)、酵母粉(B)、氯化镁(C)、培养温度(E)、初始pH(F)、接菌量(G)、培养时间(I)和转速(J)]中快速筛选出具有显著影响的因素为：酵母粉、pH和温度。其中酵母粉之所以能显著影响菌株生长，在于它能提供优质氮源满足细菌繁殖所必需，而且天然酵母粉主要由多种酵母菌自然繁殖而成，是一种纯天然、无污染的健康营养源[24]。有机氮源比无机氮源含有更丰富的氨基酸、维生素及生长因子等营养物质，其中氨基酸可以直接参与微生物体内的转氨或脱氨作用(图1)，更适用于菌株生长。温度是诸多因素中显著影响因素之一，因为可能随着温度升高，菌体生长速度及营养消耗的速率也随之加快，明显缩短进入生长稳定期的时间；从酶本身特性来看，酶具有高效催化性，能够降低生化反应的活化能，但酶本身作用条件较温和，对温度比较敏感，很容易因温度过高而丧失活性[25]。温度也会影响细胞膜的流动性，进而影响膜内外物质(水分、有机物、各种离子等)的交换和吸收。pH 显著影响菌株生长速率可能在于其对菌株生长需要的酶、各种生物大分子的稳定性造成破坏等，导致失去生物活性；pH也会影响到培养基中金属离子的存在形式，造成其不易或者不被吸收；pH同样会影响微生物细胞膜所带电荷状态，进而改变细胞膜的通透性，最终直接或间接影响微生物对所需营养物质的吸收和代谢产物的排出。
3.2 响应面在优化培养条件的应用
响应面分析是利用统计学和数学模型的方法对需要优化的多因素系统进行建模和分析[13-15]，Box-Behnken试验设计是其中拟合模型之一，目前常被用于生物发酵过程培养基和培养条件的优化。该方法不仅可以建立连续变量的曲面模型和拟合方程，还可以对影响微生物生长和发酵过程的各种因子及其交互作用进行评价，确定最佳水平范围，通过最少的试验组数获得更为精确有效的结论，极大地节约资源和降低成本，使其效应最大化[26]。
细菌生长和培养是一个动态发酵过程，受外部发酵环境以及内部培养基成分的共同影响。此次试验以牛肉膏蛋白胨培养基为基础，通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验确定菌株培养基组分和外部培养条件，系统优化了重金属镉耐性假单胞菌TCd-1培养体系，为后续进一步深入研究其菌剂制备及应用于重金属镉污染土壤的修复效应奠定了基础。
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表 1 正交试验及切削力
Table 1. Forces of orthogonal experimental cutting
序号 切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mm切削力/N 序号 切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mm切削力/N Fx Fy Fx Fy 1 62.8 0.2 4 23.70 −8.89 6 125.7 0.4 4 34.78 −10.86 2 62.8 0.3 12 81.04 −25.87 7 188.5 0.2 8 37.22 −24.62 3 62.8 0.4 8 69.56 −23.88 8 188.5 0.3 4 27.01 −15.82 4 125.7 0.2 12 55.84 −19.59 9 188.5 0.4 12 85.16 −42.63 5 125.7 0.3 8 51.97 −16.12 
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表 2 切削力正交试验极差
Table 2. Range of cutting force orthogonal experiment
切削力 参数 切削参数 切削力 参数 切削参数 切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mm切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mmFx K1 174.301 116.764 85.497 Fy K1 −58.638 −53.102 −35.573 K2 142.582 160.022 158.749 K2 −46.577 −57.819 −64.624 K3 149.399 189.497 222.037 K3 −83.078 −77.373 −88.096 k1 58.100 38.921 28.499 k1 −19.546 −17.701 −11.858 k2 47.527 53.341 52.916 k2 −15.526 −19.273 −21.541 k3 49.800 63.166 74.012 k3 −27.693 −25.791 −29.365 R 10.573 24.244 45.514 R 12.167 8.090 17.507 主次因素 Ap ＞ fz ＞ Vc 主次因素 Ap ＞ Vc ＞ fz 最优方案 A2B1C1 最优方案 A2B1C1 说明：Ki. 满足要求的单元格求和；ki. Ki的算术平均值；R. 极差。
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表 3 切削力方差分析
Table 3. Variance analysis of cutting force
方差来源 离差平方和 均方 F值 显著性 方差来源 离差平方和 均方 F值 显著性 Fx Vc 245.647 122.823 14.032 0.067 Fy Vc 230.558 115.279 18.291 0.052 fz 860.307 430.153 49.144 0.020* fz 110.412 55.206 8.760 0.102 Ap 3 125.755 1 562.877 178.556 0.006** Ap 461.497 230.748 36.613 0.027* 误差 17.506 8.753 误差 12.605 6.302 说明：*. 差异显著(P＜0.05)，**. 差异极显著(P＜0.01)。
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表 4 正交试验参数回归方程预测值检验
Table 4. Test of predicted value of regression equation of orthogonal experimental parameters
序号 Fx/N Fy/N 序号 Fx/N Fy/N 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 1 24.31 23.70 −2.57 −8.89 −7.53 −18.06 6 33.16 34.78 4.66 −10.86 −14.66 25.92 2 77.81 81.04 3.99 −25.87 −24.71 −4.69 7 37.25 37.22 −0.08 −24.62 −19.01 −29.51 3 73.81 69.56 −6.11 −23.88 −21.17 −12.80 8 25.41 27.01 5.92 −15.82 −13.80 −14.64 4 57.63 55.84 −3.21 −19.59 −23.57 16.89 9 84.00 85.16 1.36 −42.63 −41.97 −1.57 5 49.00 51.97 5.71 −16.12 −21.80 26.06
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表 5 非正交试验参数回归方程预测值检验
Table 5. Test of predicted values of regression equations of non-orthogonal experimental parameters
序号 切削速度/(m·min−1) 每齿进给量/mm 切削深度/mm Fx/N Fy/N 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 1 62.8 0.3 4 31.33 32.72 4.25 −9.80 −13.73 28.62 2 62.8 0.4 12 98.78 104.34 5.33 −29.79 −35.13 15.20 3 125.7 0.2 4 21.59 22.24 2.92 −9.35 −8.35 −11.98 4 125.7 0.2 8 39.32 39.29 −0.08 −16.75 −14.65 −14.33 5 125.7 0.3 12 73.80 73.09 −0.97 −30.67 −29.17 −5.14 6 125.7 0.4 8 63.34 62.86 −0.76 −26.29 −20.00 −31.45 7 125.7 0.4 12 89.95 90.53 0.64 −36.98 −37.37 1.04 8 188.5 0.2 12 52.86 56.42 6.31 −26.75 −37.78 29.20 9 188.5 0.3 8 49.20 46.38 −6.08 −24.74 −22.04 −12.25
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20240536
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