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北美冬青Ilex verticillata又名轮生冬青、美洲冬青，是冬青科Aquifoliaceae冬青属Ilex多年生灌木，原产美国东北部，雌雄异株，多生长在低洼地区，也可生长在较为干燥的过渡区和山地。与冬青科其他常绿树种相比，北美冬青具有秋冬落叶、果期长等特点。秋冬季节，北美冬青红果挂枝、颜色鲜亮，观赏价值极高[1]，可用于切枝观赏、居室盆栽和景观美化等。北美冬青品种选育工作在欧美国家已开展了多年，优良品种也较多[2-3]；在中国，北美冬青也得到了越来越多的关注，但品种引种工作尚处于起步阶段，仅见于浙江、山东、河南和吉林等地，育种工作更是几近空白。亲缘分析是育种中的重要工作，是保障育种质量的重要前提。分子标记是进行亲缘分析的有效工具[4]。简单重复序列间扩增多态性（inter-simple sequence repeat, ISSR）是一种以简单重复序列（simple sequence repeat, SSR）作为引物，基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术，在多个位点上扩增SSR之间DNA片段的分子标记技术[4]，由加拿大蒙特利尔大学于1994年创建，具有多态性高、操作简便、成本低等特点[5]，在遗传多样性评价、亲缘分析、系统发育、图谱构建、分子辅助育种等方面具有重要应用，已成为植物种质资源遗传基础研究的重要技术[6-11]，成功应用于核桃Juglans regia[12]，柽柳Tamarix chinensis[13]，蔺草Juncus effusus[14]，红花檵木Loropetalum chinense var. rubrum[15]，马铃薯Solanum tuberosum[16]，樱花Cerasus yedoensis[17]等物种的品种鉴定、种质资源收集、遗传多样性和系统进化分析中。本研究拟在前期对国内外北美冬青品种搜集、调查的基础上，以12个北美冬青品种为材料，利用多态性ISSR引物在品种间进行PCR扩增，构建北美冬青品种间的分子指纹图谱，鉴定品种间亲缘关系，为北美冬青新品种选育提供保障。
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以杭州润土园艺科技有限公司北美冬青基地中的12个北美冬青品种为鉴定材料，以落叶冬青Ilex decidua为远缘对照（ck），12个北美冬青品种及对照的基本信息见表 1。采集各北美冬青品种及落叶冬青的幼嫩叶片，迅速放入液氮中带回，-80 ℃超低温冰箱中保存备用。
表 1 北美冬青品种信息
Table 1. Ilex verticillata cultivar information
编号 品种名称 来源 表型特征 R1 Ilex verticillata ‘Oosterwijk’ 荷兰 灌木，叶片8.0 cm × 4.0 cm，花期6月初，果红色，果径9~12mm R2 Ilex verticillata ‘Apollo’ 美国 灌木，雄株，叶片8.0 cm × 4.0 cm，花期5月底 R3 Ilex verticillata ‘Red Sprite’ 美国 灌木，株型紧凑，叶片5.5 cm × 2.5 cm，花期5月下旬，果径10~12mm R4 Ilex verticillata ‘Winter Red’ 美国 灌木，叶片6.0 cm × 3.0 cm，花期6月初，果小而密，果径7~9 mm R5 Ilex verticillata ‘A. Gray’ 美国 灌木，叶片6.5 cm × 3.5 cm，花期5月中旬，果红色，果径10~12mm R6 Ilex verticillata ‘Winter Gold’ 美国 灌木，叶片6.0 cm × 3.0 cm，花期6月初，果黄色，果径7~9 mm R7 Ilex verticillata ‘Jim Dandy’ 美国 灌木，雄株，花期5月中旬 R8 Ilex verticillata ‘Afterglow’ 美国 灌木，株型紧凑，叶片5.5 cm × 2.5 cm，花期5月下旬，果径7~9mm R9 Ilex verticillata × serrata ‘Sparkleberry ’ (female) 美国 灌木，雄株 R10 Ilex verticillata × serrata ‘Sparkleberry ’ (male) 美国 灌木，叶片5.0 cm × 2.5 cm，花期5月下旬，果径5~7mm R11 Ilex verticillata ‘Cacapon’ 美国 灌木，叶片3.5 cm × 5.5 cm，色浓绿，紧凑，花期5月下旬，果径7~9mm R12 Ilex verticillata ‘Southern Gentleman’ 美国 灌木，雄株，叶片6.0 cm × 4.0 cm，花期5月下旬 ck Ilex verticillata 美国 乔木，叶片5.0 cm × 2.0 cm，花期5月初，果径5~7 mm -
采用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取北美冬青基因组DNA[5]。用NanoDrop-1000型分光光度计检测DNA的浓度和纯度；用质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。
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以12条已报道的冬青属ISSR引物为候选引物[表 2，由生工生物工程（上海）有限公司合成]，以提取的各北美冬青品种基因组DNA为模板进行PCR扩增。ISSR-PCR扩增反应体系共20.0 μL，包含三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）3.2 μL，10×缓冲液2.0 μL，模板DNA 1.0 μL，引物1.0 μL，超纯水12.6 μL，rTaq酶0.2 μL（Takara，日本）。ISSR-PCR扩增程序：94.0 ℃预变性4 min；94.0 ℃变性70 s，51.3~61.0 ℃退火50 s，72.0 ℃延伸70 s，共35个循环；72.0 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物用质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，电泳时间为40 min，电泳条带在紫外凝胶成像系统中观察并拍照。
表 2 青属ISSR引物
Table 2. ISSR primers for Ilex
引物编号 引物序列(5′→3′) T退火/℃ ZBSI-001 (CT)8T 51.3 ZBSI-002 (CT)8G 51.3 ZBSI-003 (TC)8G 52.5 ZBSI-004 (AC)8T 52.5 ZBSI-005 (AC)8C 52.5 ZBSI-006 (AC)8G 61.0 ZBSI-007 (GA)8YT 51.3 ZBSI-008 (CA)8RT 56.4 ZBSI-009 (AC)8YG 52.5 ZBSI-010 (TG)8RA 54.2 ZBSI-011 (ATG)5 58.9 ZBSI-012 GAT CAA GC TNN NNN NAT GTG 54.2 -
以0和1分别代表条带的有和无，统计各ISSR引物对12个北美冬青品种的扩增情况。用NTSYSpc 2.10e软件计算各品种间的遗传相似系数，得到相似系数矩阵；基于相似系数矩阵用非加权组平均法（UPGMA）进行品种间聚类分析。
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以12条待测ISSR引物为候选引物，R1~R4品种基因组DNA为模板进行PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳检测，在12条待测引物中筛选出4条在各品种间具有多态性、扩增条带清晰的ISSR引物（ZBSI-002，ZBSI-004，ZBSI-007，ZBSI-009），并以筛选出的多态性引物对各品种的基因组DNA进行PCR扩增，构建DNA指纹图谱。以ZBSI-002引物为例（图 1），12个北美冬青品种间在该引物的扩增位点上多态性较高，初步显示了品种间存在一定的遗传差异。检测引物扩增位点上的基因型分型情况可知，12个北美冬青品种在4条ISSR引物扩增位点上共扩增出63个条带，其中多态性条带的比例占90.48%，说明所选引物的多态性较高，可以用于鉴定12个北美冬青品种间的亲缘关系（表 3）。
图 1 12个北美冬青品种的ZBSI-002引物指纹图谱
Figure 1. Fingerprints of ISSR primer ZBSI-002 between the 12 cultivars of Ilex verticillata
表 3 北美冬青品种在4条ISSR引物位点上的扩增条带
Table 3. Statistics of bands amplified by 4 ISSR primers in the 12 cultivars of Ilex verticillata
引物编号 总条带数 多态性条带数 多态性条带比例/% ZBSI-002 16 15 93.75 ZBSI-004 15 13 86.67 ZBSI-007 18 16 88.89 ZBSI-009 14 13 92.86 合计 63 57 90.48 -
12个北美冬青品种的遗传相似系数为0.54~0.87，仅个别低于0.60（表 4），说明各品种的亲缘关系较近。作为对照的落叶冬青（ck）与各北美冬青品种的遗传相似性系数为0.44~0.68，明显低于北美冬青品种之间的遗传相似系数（表 4），说明北美冬青和落叶冬青种间的亲缘关系低于北美冬青种内亲缘关系，与客观实际相符。
表 4 北美冬青品种间在4条ISSR引物位点上的遗传相似系数
Table 4. Genetic similarity coefficients of 4 ISSR primers in Ilex verticillata cultivars
编号 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 ck R1 1 R2 0.63 1 R3 0.57 0.75 1 R4 0.71 0.70 0.67 1 R5 0.60 0.62 0.78 0.70 1 R6 0.63 0.67 0.57 0.71 0.70 1 R7 0.67 0.68 0.62 0.76 0.59 0.57 1 R8 0.70 0.65 0.78 0.79 0.81 0.70 0.68 1 R9 0.63 0.62 0.59 0.76 0.65 0.70 0.78 0.68 1 R10 0.70 0.59 0.59 0.79 0.62 0.63 0.78 0.75 0.84 1 R11 0.63 0.71 0.68 0.73 0.62 0.60 0.87 0.75 0.81 0.78 1 R12 0.71 0.67 0.57 0.78 0.54 0.62 0.86 0.63 0.76 0.76 0.83 1 ck 0.54 0.56 0.46 0.60 0.46 0.44 0.68 0.56 0.65 0.68 0.65 0.63 1 12个北美冬青品种间的遗传相似系数聚类结果表明：北美冬青品种间存在不同程度的亲缘关系。由图 2可知：R6与其他品种的亲缘关系较远，R9与R10间亲缘关系较近，对比品种的信息（表 1）可知，R9与R10为同一品种的雌雄株，其亲缘关系近是合理的。此外，R7和R11的亲缘关系最近，甚至比R9和R10之间的亲缘关系还近，说明根据特定表型性状筛选出来的不同北美冬青品种，其在遗传水平上的差异可能并不明显。
图 2 12个北美冬青品种遗传相似系数聚类
Figure 2. Clustering of genetic similarity coefficients among 12 cultivars of Ilex verticillata
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ISSR作为一种重要的分子标记技术，已广泛应用于种质鉴定、分子标记辅助选择、遗传多样性评价、亲缘关系分析、遗传图谱构建及基因定位等多个领域，并取得了许多重要的成果。目前，分子标记技术虽尚未应用于北美冬青，但在冬青属其他植物已有应用。付铨盛[18]采用ISSR分子标记技术对华南地区5个省份28个毛冬青Ilex pubescens样品进行了分析，平均相似系数为0.769 3；UPGMA聚类分析结果表明：在0.34水平上秃毛冬青Ilex pubescens var. glabra与毛冬青存在明显分支。钱永生等[19]利用随机扩增多态性DNA（RAPD）和扩增片段长度多态性（AFLPs）标记技术对10种冬青进行了亲缘关系鉴定，发现不同种间多态率分别为91.30%和98.60%。冷欣等[20]运用ISSR分子标记技术对浙江省舟山群岛全缘冬青Ilex integra的6个种群共57个个体进行了遗传多样性分析，利用9条随机引物共扩增出45条多态性条带，多态率为57.70%；UPGMA聚类分析结果表明：亲缘关系较近的为普陀岛和朱家尖岛的种群，舟山岛栽培种群由桃花岛自然种群移植而来。
本研究利用4条ISSR引物对12个北美冬青品种间的亲缘关系进行了分析，共获得57条多态性片段，多态率达90.48%。品种间遗传相似系数为0.54~0.87，表明各品种间的亲缘关系相对较近。品种间遗传相似系数聚类结果表明：北美冬青品种间存在不同程度的亲缘关系；尽管在形态学上非常相近，但利用ISSR分子标记也能明显的鉴别出各个品种间细微的DNA差异，说明ISSR分子标记在北美冬青亲缘关系的鉴定上具有可行性。
本研究对12个北美冬青品种间的亲缘分析结果发现：Ilex verticillata ‘Jim Dandy’（R7）和I. verticillata ‘Cacapon’（R11）间亲缘关系最近，相较I. verticillata × serrata ‘Sparkleberry’这一品种雌雄株（R9和R10）的亲缘关系更近，这说明基于表型筛选出来的不同品种，其遗传水平上的差异可能并不大。此外，从品种表型特征与遗传学间亲缘关系上来看，I. verticillata ‘Afterglow’（R8）与I. verticillata ‘Red Sprite’（R3）的株型、叶片及花期等较为相近，在遗传水平上的亲缘关系也较近；从各品种来源与遗传学亲缘关系上来看，来自荷兰的I. verticillata ‘Oosterwijk’（R1）与来自美国的其他11个北美冬青品种并非分成独立的2个类别，而是与来自美国的5个品种（I. verticillata ‘Winter Red’，I. verticillata × serrata ‘Sparkleberry’，I. verticillata ‘Jim Dandy’等）聚在同1个大类中，因此，不能仅根据植株的表型特征和来源确定各个品种间的亲缘关系。基于本研究的结果，我们建议在今后北美冬青育种过程中可参照亲缘分析结果，通过亲缘关系较远的品种间的杂交等创建新的优良种质，以保证育种群体的遗传多样性水平；同时，也可以将新的品种融入到现有育种群体中来，以扩展现有育种群体的遗传多样性基础，保证北美冬青改良的长期、可持续发展。
Phylogenetic relationships among 12 cultivars of Ilex verticillata based on ISSR molecular markers
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摘要: 北美冬青Ilex verticillata作为切枝观赏和景观美化植物在中国花卉市场受到越来越多的关注。为给北美冬青新品种选育提供保障，采用简单重复序列间扩增多态性（ISSR）分子标记分析了北美冬青品种间的亲缘关系，从12个ISSR引物中筛选出4个多态性引物；对12个北美冬青品种进行了扩增，共获得63个条带，其中多态性条带占90.48%，所选引物的多态性较高，可用于鉴定北美冬青品种间的相对亲缘关系；12个北美冬青品种间的遗传相似系数为0.54~0.87，亲缘关系相对较近；品种间的遗传相似系数聚类结果表明，各品种间存在不同程度的亲缘关系，其中I. verticillata ‘Jim Dandy’和I. verticillata ‘Cacapon’间亲缘关系最近。研究结果为北美冬青品种的选育奠定了理论和实践基础。Abstract: As an important ornamental and landscape plant, Ilex verticillata has received increasing attention in flower markets of China. To foster breeding of new I. verticillata cultivars, genetic relationships between I. verticillata cultivars were analyzed by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. Four primers with polymorphism among I. verticillata cultivars were screened from 12 candidate ISSR primers. Results revealed a total of 63 bands with polymorphic bands accounting for 90.48% implying they could be used to identify relative relationships among different I. verticillata cultivars. The genetic similarity coefficient of the 12 I. verticillata cultivars varied from 0.54 to 0.87 indicating that the genetic relationships among I. verticillata were relatively close. Clustering of these genetic similarity coefficients showed that genetic relationships among cultivars were different with the relationship between I. verticillata 'Jim Dandy' and I. verticillata 'Cacapon' being the closest. This study will help lay an important theoretical and practical basis for genetic breeding of I. verticillata.
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Key words:
- forest tree breeding /
- Ilex verticillata /
- ISSR marker /
- molecular identification /
- genetic relationship
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图 1 12个北美冬青品种的ZBSI-002引物指纹图谱
Figure 1 Fingerprints of ISSR primer ZBSI-002 between the 12 cultivars of Ilex verticillata
图 2 12个北美冬青品种遗传相似系数聚类
Figure 2 Clustering of genetic similarity coefficients among 12 cultivars of Ilex verticillata
表 1 北美冬青品种信息
Table 1. Ilex verticillata cultivar information
编号 品种名称 来源 表型特征 R1 Ilex verticillata ‘Oosterwijk’ 荷兰 灌木，叶片8.0 cm × 4.0 cm，花期6月初，果红色，果径9~12mm R2 Ilex verticillata ‘Apollo’ 美国 灌木，雄株，叶片8.0 cm × 4.0 cm，花期5月底 R3 Ilex verticillata ‘Red Sprite’ 美国 灌木，株型紧凑，叶片5.5 cm × 2.5 cm，花期5月下旬，果径10~12mm R4 Ilex verticillata ‘Winter Red’ 美国 灌木，叶片6.0 cm × 3.0 cm，花期6月初，果小而密，果径7~9 mm R5 Ilex verticillata ‘A. Gray’ 美国 灌木，叶片6.5 cm × 3.5 cm，花期5月中旬，果红色，果径10~12mm R6 Ilex verticillata ‘Winter Gold’ 美国 灌木，叶片6.0 cm × 3.0 cm，花期6月初，果黄色，果径7~9 mm R7 Ilex verticillata ‘Jim Dandy’ 美国 灌木，雄株，花期5月中旬 R8 Ilex verticillata ‘Afterglow’ 美国 灌木，株型紧凑，叶片5.5 cm × 2.5 cm，花期5月下旬，果径7~9mm R9 Ilex verticillata × serrata ‘Sparkleberry ’ (female) 美国 灌木，雄株 R10 Ilex verticillata × serrata ‘Sparkleberry ’ (male) 美国 灌木，叶片5.0 cm × 2.5 cm，花期5月下旬，果径5~7mm R11 Ilex verticillata ‘Cacapon’ 美国 灌木，叶片3.5 cm × 5.5 cm，色浓绿，紧凑，花期5月下旬，果径7~9mm R12 Ilex verticillata ‘Southern Gentleman’ 美国 灌木，雄株，叶片6.0 cm × 4.0 cm，花期5月下旬 ck Ilex verticillata 美国 乔木，叶片5.0 cm × 2.0 cm，花期5月初，果径5~7 mm 
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表 2 青属ISSR引物
Table 2. ISSR primers for Ilex
引物编号 引物序列(5′→3′) T退火/℃ ZBSI-001 (CT)8T 51.3 ZBSI-002 (CT)8G 51.3 ZBSI-003 (TC)8G 52.5 ZBSI-004 (AC)8T 52.5 ZBSI-005 (AC)8C 52.5 ZBSI-006 (AC)8G 61.0 ZBSI-007 (GA)8YT 51.3 ZBSI-008 (CA)8RT 56.4 ZBSI-009 (AC)8YG 52.5 ZBSI-010 (TG)8RA 54.2 ZBSI-011 (ATG)5 58.9 ZBSI-012 GAT CAA GC TNN NNN NAT GTG 54.2
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表 3 北美冬青品种在4条ISSR引物位点上的扩增条带
Table 3. Statistics of bands amplified by 4 ISSR primers in the 12 cultivars of Ilex verticillata
引物编号 总条带数 多态性条带数 多态性条带比例/% ZBSI-002 16 15 93.75 ZBSI-004 15 13 86.67 ZBSI-007 18 16 88.89 ZBSI-009 14 13 92.86 合计 63 57 90.48
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表 4 北美冬青品种间在4条ISSR引物位点上的遗传相似系数
Table 4. Genetic similarity coefficients of 4 ISSR primers in Ilex verticillata cultivars
编号 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 ck R1 1 R2 0.63 1 R3 0.57 0.75 1 R4 0.71 0.70 0.67 1 R5 0.60 0.62 0.78 0.70 1 R6 0.63 0.67 0.57 0.71 0.70 1 R7 0.67 0.68 0.62 0.76 0.59 0.57 1 R8 0.70 0.65 0.78 0.79 0.81 0.70 0.68 1 R9 0.63 0.62 0.59 0.76 0.65 0.70 0.78 0.68 1 R10 0.70 0.59 0.59 0.79 0.62 0.63 0.78 0.75 0.84 1 R11 0.63 0.71 0.68 0.73 0.62 0.60 0.87 0.75 0.81 0.78 1 R12 0.71 0.67 0.57 0.78 0.54 0.62 0.86 0.63 0.76 0.76 0.83 1 ck 0.54 0.56 0.46 0.60 0.46 0.44 0.68 0.56 0.65 0.68 0.65 0.63 1
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