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蔺草Juncus effusus俗称席草，属灯心草科Juncaceae多年生宿根草本，是一种重要的经济作物[1]。除了干旱和高海拔地区外，北美洲、欧洲及亚洲等亚热带地区均有分布，中国、日本、韩国及东南亚一些国家均有栽培。蔺草制品具有调节干湿的功能，夏季能保持适度的干燥，使人的皮肤触感异常舒适，因此，蔺草多用于编制榻榻米、草席、草帽、草垫等生活日用品。此外，蔺草还有一定的生态价值和药用价值[2]。中国是世界上利用和栽培蔺草最早的国家之一，但近年来由于蔺草品种混杂非常严重，极大地影响和限制了蔺草的生产。目前，有关蔺草的研究主要集中在生物学特性、生理生化、繁殖栽培技术等方面[3-6]，有关蔺草种质资源遗传多样性的研究还未见报道。本研究利用简单序列重复区间扩增多态性（ISSR）分子标记技术[7-12]对36份蔺草种质进行遗传多样性分析，以揭示蔺草种质资源的主要遗传多态性特点，确定蔺草种质资源的亲缘关系，为蔺草新品种的选育和产业可持续发展奠定基础。
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36份蔺草种质来自美国和中国（浙江、西藏、四川）等不同地区，其中包括22份主要栽培资源和14份野生资源。2013年收集后，栽培于浙江农林大学试验基地。材料来源及采集地见表 1。
表 1 材料来源及采集地
Table 1. Sources of experiment materials
编号 名称 采集地点 来源 1 YD-01 中国浙江宁波鄞州 云达蔺草制品厂 2 YD-02 中国浙江宁波鄞州 云达蔺草制品厂 3 YF-01 中国浙江宁波鄞州 友丰工艺编织厂 4 MY-02 中国浙江宁波鄞州 新艺蔺草制品公司 5 MY-01 中国浙江宁波鄞州 新艺蔺草制品公司 6 MY-03 中国浙江宁波鄞州 新艺蔺草制品公司 7 MY-04 中国浙江宁波鄞州 新艺蔺草制品公司 8 MY-07 中国浙江宁波鄞州 新艺蔺草制品公司 9 YN-02 中国浙江宁波鄞州 新银蔺草制品公司 10 YN-01 中国浙江宁波鄞州 新银蔺草制品公司 11 HB-01 中国浙江宁波鄞州 华备编织品有限公司 12 HB-02 中国浙江宁波鄞州 华备编织品有限公司 13 MM-01 中国浙江宁波鄞州 兴明工艺编织品公司 14 HB-03 中国浙江宁波鄞州 华备编织品有限公司 15 H'-001 中国浙江宁波鄞州 华荣工艺编织品厂 16 H'-002 中国浙江宁波鄞州 华荣工艺编织品厂 17 BC 中国浙江宁波黄古林 新艺蔺草制品公司 18 HGL 中国浙江宁波黄古林 新艺蔺草制品公司 19 DY-01 中国浙江东阳南马 南马梦之娇竹制品厂 20 DY-02 中国浙江东阳南马 南马梦之娇竹制品厂 21 DY-03 中国浙江东阳南马 南马梦之娇竹制品厂 22 NH 中国浙江宁波宁海深甽 野生 23 LS 中国浙江丽水岭头 野生 24 MS 中国浙江象山石浦 野生 25 SN 中国浙江嵊州金庭华堂 野生 26 WN 中国浙江温州文成 野生 27 MG 美国 野生 28 LN 中国西藏林芝 野生 29 SM-01 中国浙江台州三门海游 野生 30 SM-02 中国浙江台州三门悬渚 野生 31 ZJ 中国浙江诸暨枫桥 野生 32 HN 中国浙江湖州 野生 33 DY-04 中国浙江东阳千祥 野生 34 JH 中国浙江金华武义 野生 35 LH 中国浙江台州临海邵家渡 野生 36 SC 中国四川眉山 华升蔺业发展公司 -
采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法，从新鲜的蔺草嫩茎中提取基因组DNA。取新萌生的蔺草嫩茎约0.5 g在液氮冷冻下研磨成粉末，迅速转入2.5 mL离心管，加入800.0 μL预热的2×CTAB提取缓冲液[质量分数为2% CTAB，三羟甲基氨基甲烷与盐酸缓冲液（Tris-HCl）100.0 mmol·L-1，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）25.0 mmol·L-1，氯化钠1.5 mol·L-1，体积分数为1%巯基乙醇]，充分混匀后置于65 ℃水浴45 min，隔10 min轻摇1次，使样品充分悬浮在提取缓冲液中；取出离心管，4 ℃，12 000 r·min-1，离心10~15 min；取上清，加入等体积的V（氯仿）:V（异戊醇）＝24:1混合液，轻柔颠倒混匀，4 ℃，使乳化10 min，取出离心管，4 ℃，12 000 r·min-1，离心10~15 min；重复上一步；取上清，加入等体积-20 ℃预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置于4 ℃沉淀30 min；4 ℃，6 000 r·min-1离心8 min，弃上清，用体积分数为70%的乙醇洗涤沉淀2~3次，风干，加入100.0 μL TE（10.0 mmol·L-1 Tris-HCl，1.0 mmol·L-1 EDTA）溶解，加入1.0 μL 10.0 mg·L-1的RNA降解酶（RnaseA），4 ℃保存。用质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用蛋白核酸分析仪根据D（260）/D（280）的比值判断其纯度。用无菌水稀释到均一质量浓度50.0 mg·L-1，-20 ℃保存备用。
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随机选取2份蔺草种质的DNA，利用加拿大哥伦比亚大学公布的在禾本科Gramineae植物中常用的ISSR引物（UBC801-UBC900）72对（引物由上海生工生物工程股份有限公司合成）进行筛选，筛选出23对扩增条带较稳定、清晰的引物（表 2），用于全部蔺草种质资源扩增。
表 2 引物序列及其扩增产物的多态性
Table 2. Sequence and amplified loci polymorphism of 23 primers
引物名
称引物序列
(5'→3')退火温
度/℃扩增条带
数/条多态性条
带数/条多态比百
分率/%UBC811 (GA)8C 54.6 5 5 100.00 UBC815 ( CT) 8G 54.6 10 8 80.00 UBC817 (CA)8A 52.2 5 5 100.00 UBC818 (CA)8G 54.6 6 5 83.33 UBC825 (AC)8T 52.2 5 4 80.00 UBC 835 (AG)8YC 54.6 5 5 100.00 UBC840 ( GA ) 8YT 53.9 6 5 83.33 UBC842 (GA)8YG 56.2 7 6 85.71 UBC 844 (CT)8RC 56.2 6 6 100.00 UBC855 (AC)8YT 53.9 6 5 83.33 UBC856 (AC)8YA 53.9 7 6 85.71 UBC859 (TG)8RC 56.2 4 4 100.00 UBC 830 (GAA)6 48.2 8 7 87.50 UBC 843 (AC)8TA 52.7 7 6 85.71 UBC 846 (AC)8CC 57.3 6 6 100.00 UBC 862 (AC)8CG 57.3 8 7 87.50 UBC 863 (AC)8CT 55.0 8 8 100.00 UBC 867 (AC)8GT 57.3 6 4 66.67 UBC 874 (TG)8CT 55.0 5 4 80.00 UBC 875 (TG)8GG 54.8 4 4 100.00 UBC 879 (AG)8GC 57.3 7 6 85.71 UBC 895 (AGTG)4 51.6 10 8 80.00 UBC 897 ( ACTC ) 4 51.6 7 6 85.71 总数 148 130 87.84 平均 6.43 5.65 说明：Y=(C，T); R=(A，G)。 -
根据小麦Triticum eastivum[7]，水稻Oryza sativa[13]，冰草属Agropyron[14]，早熟禾Poa[15]和中型狼尾草Pennisetum longissimum var. intermedium[16]等的方法设置ISSR-PCR反应体系和扩增程序。通过预试验，建立蔺草ISSR分析的优化反应体系及反应程序。反应体系总体积20.0 μL，包含1.0 μL DNA模板（50 mg·L-1），14.5 μL双蒸水，1.3 μL镁离子（25 mmol·L-1），2.0 μL缓冲液（10×），1.5 μL脱氧核糖核苷三磷酸（2.5 mmol·L-1），0.2 μL Taq酶（5×16.67 nkat），0.5 μL引物（10.0 μmol·L-1）。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，退火45 s（根据引物的退火温度Tm所得），72 ℃延伸1.5 min，共35个循环；72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。PCR扩增产物用含0.5 mg·L-1溴化乙锭（ethidium bromide，EB）质量分数2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，1×三羟甲基氨基甲烷-硼酸（TBE）缓冲液，120 V电压下电泳40 min。以100 bp DNA梯度为标准分子量标记，电泳结果在紫外凝胶成像系统进行拍照并分析。
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根据在凝胶同一迁移位置上DNA条带有无进行统计，有条带（显性）记为“1”，无条带（隐性）或模糊不清记为“0”，形成0/1矩阵。多态性比例（%）＝（总谱带数-共有带数）/总谱带数×100%。用NTSYSpc 2.1软件进行遗传相似系数计算，利用非加权组平均法（UPGMA）构建聚类树状图。
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利用筛选出的23对ISSR引物对供试材料进行PCR扩增，共扩增出148条稳定清晰的DNA条带（表 2），每对引物扩增带数为4~10条，平均每对引物扩增条带数为6.43条；所有引物中，引物UBC815和引物UBC895扩增带数最多，均为10条，引物UBC859和引物UBC875的引物扩增带数最少，均为4条；在所有供试材料中具有多态性的引物共15对，扩增出多态性条带130条，多态性条带比率为87.84%，平均每对引物扩增出多态性条带5.65条。
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36份蔺草种质间的遗传相似系数（GS）为0.405 6~0.944 1（图 2），具有丰富的遗传多样性。其中，DY-02和DY-03之间的遗传相似系数最大，达0.944 1，表明其亲缘关系较近；遗传相似系数最小的是YF-01与LZ之间，为0.405 6，表明其亲缘关系较远。36份蔺草种质材料中，大多数来自于相同或相近地理位置的材料间相似系数值较大，说明其亲缘关系较近。
图 1 引物UBC863和引物UBC846的扩增图谱
Figure 1. ISSR amplification of effusus with primer UBC863 and UBC846
图 2 36份蔺草种质基于ISSR的遗传相似性UPGMA聚类图
Figure 2. UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 36 accessions
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为使供试蔺草种质间的亲缘关系更加清晰明确，采用UPGMA法对得到的遗传相似系数进行聚类分析，结果如图 2所示。在遗传相似系数为0.650 3处，将36份蔺草种质资源分为5大类群：第Ⅰ大类中有29份材料，又可分为3个亚类：第一亚类包括YD-01，YD-02，XY-04，XY-07，YZ-01，HB-01，HB-02，HR-02，HB-03，HR-01，XM-01，LH，SC，XY-02，XY-01，XY-03，YZ-02；第二亚类包括BC，ZJ，DY-04，HGL，SM-01，SM-02，DY-02，DY-03，NH，XS，WZ；第三亚类仅有DY-01；第Ⅱ大类包括HZ，JH；第Ⅲ大类仅有YF-01；第Ⅳ大类包括LS，SZ和MG；第Ⅴ大类包括LZ。从供试材料的地理来源来看，第一亚类中除LH和SC这2份种质外，其余15份均来自鄞州。第二亚类除BC，HGL，DY-02和DY-03外，其余7份均为野生蔺草种质资源。第Ⅱ大类为2份野生种质，第Ⅳ大类中LS和SZ等2个国内野生种质首先聚在一起，然后再与国外MG野生种质聚为一起。结果表明：材料地理来源对系统聚类结果影响较大，大部分来自于同一地区的材料聚为一类，少部分材料在聚类图中无一定规律；野生种质与栽培种质有分别聚在一起的趋势。
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ISSR标记技术具有多态性丰富、稳定性强、成本低廉及操作简单等优点，广泛应用于植物群体遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究[17]。李君礼等[18]利用简单序列重复（SSR）引物对4个蔺草代表性品种进行PCR扩增，结果表明：67对SSR引物在4个品种中均有扩增条带，但与水稻相比，具有差异的SSR标记却很少，原因可能与蔺草特有的基因组有关。ISSR标记在种内不同种质资源或不同品种间具有较好的鉴别能力[17]。本研究利用ISSR引物对蔺草不同种质资源进行遗传多样性分析，从72对ISSR引物中筛选出23对有效引物（占31.94%）对36份蔺草种质DNA进行PCR扩增，共扩增出148条带，其中具有多态性的引物15对，共扩增出多态性条带130条，多态性条带比率为87.84%，不同引物间扩增出4~8条多态性条带，不同种质资源间的相似系数变化范围为0.405 6~0.944 1，说明蔺草种质资源具有丰富的遗传多样性，同时也证明ISSR引物可在同一种群内不同种质资源间进行鉴别。曾亮等[14]对冰草属植物研究发现，11条有效引物（占11.80%）共检测到84个扩增位点，多态性位点比率为70.2%，品种间遗传相似系数为0.083 0~0.706 0，表现出较高的遗传多态性。刘欢等[19]研究发现，8个ISSR有效引物（占16.67%）共扩增出多态性带144条，86.10%扩增片段能够揭示材料间的遗传差异，48个燕麦Avena品种间相似系数为0.583 3~0.941 7，具有丰富的遗传基础。此外，在中型狼尾草种质[16]、黑麦属Secale植物[20]、芒荻类Miscanthus & Triarrhena植物[21]和芦苇Phragmites australis[22]研究中均发现ISSR引物具有较高的鉴别能力。AL-TURKI等[13]对水稻研究发现，11条ISSR引物平均多态性比例超过75%。JOSHI等也发现30个ISSR引物中有60%的引物能产生清晰扩增产物。在小麦中，NAGAOKA等发现100条引物中33条能产生清晰的扩增产物。以上研究材料均属于单子叶植物，将试验结果与本研究结果相比较，蔺草ISSR引物的有效数目低于水稻和小麦，但高于冰草属、燕麦品种、中型狼尾草和黑麦属植物。从多态性条带比率来看，蔺草的多态性条带比率明显高于冰草、黑麦属植物和水稻，与燕麦和中型狼尾草相差不大，低于芒荻类植物和芦苇。从遗传相似系数来看，蔺草的遗传相似系数与燕麦和黑麦属植物大致相同，略低于中型狼尾草，说明蔺草种质具有广泛的遗传基础，遗传多样性丰富。这为了解蔺草的遗传背景、种质资源的开发利用、新品种培育和生产提供了理论依据。
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遗传多样性是生物多样性的基本组成部分，一般是指种内不同种群间或是一个种群内的不同个体的遗传变异总和[23]。一个物种遗传多样性越高，适应能力越强，越有利于扩展新环境和扩大分布范围[24]。遗传距离是物种居群间遗传相似性的反映，用来揭示群体的遗传结构。李军等[25]研究认为：遗传距离与空间距离之间并无明显的内在关系，自然选择、基因突变及基因流是导致遗传变异的主要因素。另一些研究认为，植物群体间的地理隔离与遗传关系存在着正相关性，即地理距离越大，则遗传距离越大[26]。李绍臣等[23]对黄檗Phellodendron amurense种群研究发现，地理种群近的能很好的聚在一起。本研究结果表明：蔺草种质资源间具有相对较宽的遗传基础，存在较大的遗传变异性，其原因可能是在遗传进化和育种过程中其基因组DNA发生丰富的变异，从而构成丰富的蔺草资源基因库。从聚类的结果来看，大多数来自于相同或相近地理区域的材料可以聚于同一类或亚类，材料间呈现出一定的地域性分布规律，这与冰草属[14]和燕麦种质[20]研究聚类结果一致，其原因可能是长期自然选择使群体基因型趋于相似的结果；野生种质与栽培种质有分别聚在一起的趋势；聚类中来自鄞州栽培种质YF-01单独聚为一大类，可能是由于在长期的进化过程中有个别基因发生了突变；此外，少部分材料在聚类图中不遵循一定的规律，其原因可能是不同地区之间的相互引种导致种质的聚类结果与种质地理来源没有直接联系。
Genetic diversity of Juncus effusus germplasm by ISSR markers
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摘要: 为研究蔺草Juncus effusus种质资源遗传多样性，采用简单序列重复区间扩增多态性（inter-simple sequence repeats，ISSR）分子标记技术对来自不同区域的36份蔺草种质资源进行遗传多样性分析，并探讨它们的亲缘关系。结果显示：72对ISSR引物中共筛选出23对引物能扩增出稳定清晰条带；36份蔺草种质的基因组DNA共扩增出148条带，其中130条多态性条带，多态性比率达87.84%。应用NTSYSpc 2.1软件分析显示，36份蔺草种质材料间的遗传相似系数（genetic similarity，GS）为0.4056~0.9441，表明蔺草种质资源具有丰富的遗传多样性。非加权组平均法（unweighted pair group method using arithmetic averages，UPGMA）聚类显示，在遗传相似系数0.6503处可将36份蔺草种质划分为5大类群，第Ⅰ大类群可分为3个亚类，大多数来自于相同或相近地理区域的材料聚于同一类或亚类，野生种质与栽培种质有分别聚在一起的趋势。研究结果从分子水平揭示了蔺草种质资源的主要遗传多态性特点，为今后蔺草育种及杂交亲本的选择提供理论依据。Abstract: To study the genetic diversity of Juncus effusus resources, the genetic diversity of 36 J. effusus germplasm resources from both home and abroad were analyzed by Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) markers. Analysis included an Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA) cluster analysis. Results showed 23 primers with clear polymorphic bands selected from 72 primers. A total of 148 bands, of which 130 were polymorphic, were amplified from the 36 materials with the proportion of polymorphic loci being 87.84%. The genetic similarity coefficient for varieties was between 0.405 6 and 0.944 1, which showed rich genetic diversity. The UPGMA cluster analysis produced a genetic similarity coefficient of 0.650 3 for the boundaries with the 36 materials divided into five groups and the first group being divided into three subgroups. Results were connected to region and cultivar origin with materials from the same region mostly classified into the same group or subgroup. This research revealed the genetic diversity of J. effusus germplasm resources at the molecular level for the first time which could provide a theoretical basis for breeding.
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Key words:
- botany /
- Juncus effusus /
- germplasm resources /
- ISSR markers /
- genetic diversity
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图 1 引物UBC863和引物UBC846的扩增图谱
M.100bpDNA梯度标记; 1~36.36份蔺草种质资源，顺序同表 1。
Figure 1 ISSR amplification of effusus with primer UBC863 and UBC846
图 2 36份蔺草种质基于ISSR的遗传相似性UPGMA聚类图
Figure 2 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 36 accessions
表 1 材料来源及采集地
Table 1. Sources of experiment materials
编号 名称 采集地点 来源 1 YD-01 中国浙江宁波鄞州 云达蔺草制品厂 2 YD-02 中国浙江宁波鄞州 云达蔺草制品厂 3 YF-01 中国浙江宁波鄞州 友丰工艺编织厂 4 MY-02 中国浙江宁波鄞州 新艺蔺草制品公司 5 MY-01 中国浙江宁波鄞州 新艺蔺草制品公司 6 MY-03 中国浙江宁波鄞州 新艺蔺草制品公司 7 MY-04 中国浙江宁波鄞州 新艺蔺草制品公司 8 MY-07 中国浙江宁波鄞州 新艺蔺草制品公司 9 YN-02 中国浙江宁波鄞州 新银蔺草制品公司 10 YN-01 中国浙江宁波鄞州 新银蔺草制品公司 11 HB-01 中国浙江宁波鄞州 华备编织品有限公司 12 HB-02 中国浙江宁波鄞州 华备编织品有限公司 13 MM-01 中国浙江宁波鄞州 兴明工艺编织品公司 14 HB-03 中国浙江宁波鄞州 华备编织品有限公司 15 H'-001 中国浙江宁波鄞州 华荣工艺编织品厂 16 H'-002 中国浙江宁波鄞州 华荣工艺编织品厂 17 BC 中国浙江宁波黄古林 新艺蔺草制品公司 18 HGL 中国浙江宁波黄古林 新艺蔺草制品公司 19 DY-01 中国浙江东阳南马 南马梦之娇竹制品厂 20 DY-02 中国浙江东阳南马 南马梦之娇竹制品厂 21 DY-03 中国浙江东阳南马 南马梦之娇竹制品厂 22 NH 中国浙江宁波宁海深甽 野生 23 LS 中国浙江丽水岭头 野生 24 MS 中国浙江象山石浦 野生 25 SN 中国浙江嵊州金庭华堂 野生 26 WN 中国浙江温州文成 野生 27 MG 美国 野生 28 LN 中国西藏林芝 野生 29 SM-01 中国浙江台州三门海游 野生 30 SM-02 中国浙江台州三门悬渚 野生 31 ZJ 中国浙江诸暨枫桥 野生 32 HN 中国浙江湖州 野生 33 DY-04 中国浙江东阳千祥 野生 34 JH 中国浙江金华武义 野生 35 LH 中国浙江台州临海邵家渡 野生 36 SC 中国四川眉山 华升蔺业发展公司 
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表 2 引物序列及其扩增产物的多态性
Table 2. Sequence and amplified loci polymorphism of 23 primers
引物名
称引物序列
(5'→3')退火温
度/℃扩增条带
数/条多态性条
带数/条多态比百
分率/%UBC811 (GA)8C 54.6 5 5 100.00 UBC815 ( CT) 8G 54.6 10 8 80.00 UBC817 (CA)8A 52.2 5 5 100.00 UBC818 (CA)8G 54.6 6 5 83.33 UBC825 (AC)8T 52.2 5 4 80.00 UBC 835 (AG)8YC 54.6 5 5 100.00 UBC840 ( GA ) 8YT 53.9 6 5 83.33 UBC842 (GA)8YG 56.2 7 6 85.71 UBC 844 (CT)8RC 56.2 6 6 100.00 UBC855 (AC)8YT 53.9 6 5 83.33 UBC856 (AC)8YA 53.9 7 6 85.71 UBC859 (TG)8RC 56.2 4 4 100.00 UBC 830 (GAA)6 48.2 8 7 87.50 UBC 843 (AC)8TA 52.7 7 6 85.71 UBC 846 (AC)8CC 57.3 6 6 100.00 UBC 862 (AC)8CG 57.3 8 7 87.50 UBC 863 (AC)8CT 55.0 8 8 100.00 UBC 867 (AC)8GT 57.3 6 4 66.67 UBC 874 (TG)8CT 55.0 5 4 80.00 UBC 875 (TG)8GG 54.8 4 4 100.00 UBC 879 (AG)8GC 57.3 7 6 85.71 UBC 895 (AGTG)4 51.6 10 8 80.00 UBC 897 ( ACTC ) 4 51.6 7 6 85.71 总数 148 130 87.84 平均 6.43 5.65 说明：Y=(C，T); R=(A，G)。
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