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白及Bletilla striata为兰科Orchidaceae白及属Bletilla多年生草本植物，以其干燥块茎入药，具有止血[1]、促进伤口愈合[2]、抗菌[3]、抗病毒[4]、抗肿瘤[5]等药理作用。此外，白及块茎含较多的胶质多糖，具有抗衰老、美白和抗氧化[2]等功能，因此也被广泛应用于化妆品行业。白及的花色鲜艳美丽，具有较高的观赏价值[6]。由于白及种子无胚乳，自然萌发率低，白及的需求量与野生资源的缺乏产生了巨大的冲突[7]，因此开展白及资源的保护及种质资源的研究工作刻不容缓。随着生物技术的发展，除了形态标记[8]、细胞标记[9]、生理生化标记[10]等传统的标记技术外，遗传多样性研究出现了新的基于基因组DNA水平的标记技术——分子标记。分子标记是在群体中易于跟踪和量化的基因位点，并且可能与特定基因或性状相关[11]。与其他标记相比，分子标记具有多态性好、数量多以及高共显性、简单稳定、易于追溯等优点[12]。简单重复序列间扩增(ISSR)和相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记是针对非特异性序列进行扩增的，因此对于白及这类基因组序列信息较为匮乏的物种而言是一种快速鉴定的方法[13]。邢佳鑫等[14]应用简单重复序列(SSR)和ISSR标记对外观较相似的白及样本进行遗传多样性分析，探索了快速鉴定白及组培苗真伪的新方法；洪建聪等[15]利用筛选出的15对SRAP引物组合将50份白及样本分成6个大类；陈锦等[16]利用ISSR和随机扩增多态性(RAPD)标记研究白及种质资源的遗传多样性，结果显示：白及种源间的遗传差异与地理距离相关，还发现ISSR不受时间和地点的限制，比RAPD有更高的多态性比率，结果相对更稳定可靠；孙宇龙等[17]通过SRAP标记将12个白及野生种源聚类成3支系，并发现遗传距离和地理距离间有显著正相关性，为白及野生资源的就地保护和迁地保护提供了理论依据；WANG等[18]使用ISSR标记分析了白及再生植株的克隆保真度，结果发现：再生植株与母株的相似度接近100.0%，表明通过愈伤组织和原球茎培养的再生植株在遗传上是稳定的。
目前，同时应用2种分子标记技术在分子水平上对白及种质资源进行的相关研究较少。本研究采用ISSR和SRAP分子标记技术，对从浙江省、云南省、贵州省和四川省搜集的32个白及种源进行亲缘关系及遗传多样性的初步分析，揭示白及个体间与种源间的遗传分化，为白及资源的保护和利用提供参考。
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2020年6—7月在浙江、云南、贵州、四川等22个地区采集32个白及种源，并将采集到的白及叶片洗净擦干，经液氮速冻后放置−80 ℃超低温冰箱备用。种源基本信息见表1。
表 1 白及种源信息
Table 1. Source information of B. striata samples
编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 1 浙江温州泰顺 9 云南丽江永胜 17 四川乐山沐川(2) 25 四川汶川水磨(2) 2 浙江台州天台 10 云南普洱思茅 18 四川雅安石棉 26 四川汶川水磨(3) 3 浙江衢州江山 11 云南曲靖会泽 19 四川内江东兴(1) 27 四川都江堰虹口(1) 4 浙江金华磐安 12 贵州遵义正安 20 四川内江东兴(2) 28 四川都江堰虹口(2) 5 浙江宁波象山 13 贵州黔西南安龙 21 四川内江东兴(3) 29 四川成都大邑 6 浙江杭州临安 14 贵州遵义赤水 22 四川内江东兴(4) 30 四川成都彭州(1) 7 云南红河蒙自(1) 15 贵州毕节大方 23 四川内江东兴(5) 31 四川成都彭州(2) 8 云南红河蒙自(2) 16 四川乐山沐川(1) 24 四川汶川水磨(1) 32 四川甘孜康定 -
主要仪器：JXFSTPRP-24L组织快速研磨仪(中国上海净信实业发展有限公司)、TU-100恒温金属浴(中国上海一恒科技有限公司)、Colibri超微量分光光度计(德国Titertek Berthold公司)、Centrifuge 5415 R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、Mini-P25微孔板离心机(中国杭州奥盛仪器有限公司)、T100 Thermal Cycler PCR仪、PowerPac HC高电流电泳仪[伯乐生命医学产品(中国上海)有限公司]、JY04S-3C凝胶成像系统(中国北京君意东方电泳设备有限公司)、B2042BluEye TM蓝光切胶仪(中国苏州宇恒生物科技有限公司)。
主要试剂：植物基因组DNA快速抽提试剂盒(中国上海生工生物股份有限公司)、2×Flash PCR MasterMix(中国北京康为世纪生物科技有限公司)、10 × loading buffer、DL 15000 DNA Marker、DL 2000 DNA Marker(日本TAKARA公司)。β-巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙醇、氯仿、异戊醇等均为中国上海国药集团化学试剂有限公司生产；ISSR引物和SRAP引物由北京擎科生物科技有限公司合成。
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取洁净干燥的白及嫩叶，采用植物基因组DNA快速抽提试剂盒提取样本DNA，并用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳法检测完整性，选择条带清晰明亮且无拖尾与杂带的DNA，用超微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度，结合DNA浓度及电泳的结果，将较优的DNA样品液用双蒸水(ddH2O)稀释至20 mg·L−1，放置冰箱−20 ℃保存备用。
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本研究采用的ISSR引物为哥伦比亚大学公布的第9套100个ISSR通用引物序列；SRAP引物为参考前人[19-20]设计的238对SRAP引物组合，共包含14条上游引物(Me1~Me14)和17条下游引物(Em1~Em17)。引物的筛选经过初筛和复筛2个步骤：从32个供试材料中选取4个表型性状差异较明显的材料作为样本DNA，对引物进行初筛，选出扩增产物主带明显、条带清晰的引物。经过引物的初筛后，选择所有样本DNA作为模板，针对初筛后的引物进行复筛，选择多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物作为本研究的引物。根据每条引物的退火温度(Tm) ± 5 ℃的范围，设置8个温度梯度进行聚合酶链式反应(PCR)；根据条带得出每个引物的最适退火温度。
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ISSR-PCR扩增体系(20 μL)：1 μL DNA模板、1 μL引物(20 mg·L−1)、10 μL 2×Flash PCR MasterMix、8 μL ddH2O；ISSR-PCR扩增程序：98 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s；退火(每个引物的退火温度不同)15 s，72 ℃延伸15 s；共35个循环，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。
SRAP-PCR扩增体系(20 μL)：1 μL DNA模板、1 μL引物(20 mg·L−1)、10 μL 2×Flash PCR MasterMix、7 μL ddH2O；SRAP-PCR扩增程序：98 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s；退火(每个引物的退火温度不同)15 s，72 ℃延伸15 s；共38个循环，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。
PCR扩增产物在含有Gelred核酸染料的质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中，130 V，电泳50 min后，经凝胶成像系统(JY04S-3C)拍照保存。
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人工读取电泳结果数据，并进行统计处理。将条带中清晰可见以及可重复的标记为“1”，同一位置上条带缺失或者弱带标记为“0”，形成“0、1”数据矩阵，分别得到ISSR、SRAP及综合两者(SSR+SRAP)的数据。通过Excel表格，统计每个引物或每对引物组合扩增的条带以及多态性条带数，计算多态位点百分率(PPB)，利用Popgene 32.0软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s多态性信息指数(I)、种源总基因多样性(Ht)、种源内基因多样性(Hs)、基因分化系数(Gst = 1−Hs/Ht)和基因流(Nm)等遗传多样性参数，并计算种源间的遗传距离和遗传一致性，使用OmicStudio工具(
https://www.omicstudio.cn/tool )对遗传距离进行主坐标(PCoA)分析，利用NTSYS-pc 2.10e软件对种源进行聚类分析，并绘制非加权组平均法(UPGMA)树状图。 -
提取白及基因组DNA后，经琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并通过超微量分光光度计检测其浓度、纯度，均符合要求，可进行下一步试验。
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经过2次筛选，共获得11条条带清晰、多态性高且重复性好的引物(表2)。11条引物共扩增出188条条带，多态性条带有174条，PPB为92.20%。11条引物平均扩增条带数为17.09条，平均多态性条带数为15.82条。扩增位点数最多的引物是UBC876，扩出了25条条带；其次是引物UBC868和UBC881，均扩增出20条条带；扩增条带最少的引物是UBC855，只扩增出9条条带，PPB为64.71%~100.00%，其中，引物UBC827、UBC842、UBC855、UBC876、UBC879和UBC881的PPB为100%，均表现出极高的多态性，占总引物的54.55%；UBC880的PPB最低，为64.71%。以引物UBC876为例，它对所采集白及样本的ISSR-PCR的扩增结果见图1。
表 2 ISSR引物信息及扩增结果
Table 2. ISSR primer information and amplification results
引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 UBC823 (TC)8C 15 12 80.00 8 UBC876 (GATA)2(GACA)2 25 25 100.00 2 UBC826 (AC)8C 18 17 94.44 9 UBC879 C(TTCAC)3 15 15 100.00 3 UBC827 (AC)8G 16 16 100.00 10 UBC880 (GGAGA)3 17 11 64.71 4 UBC842 (GA)8(C/T)G 18 18 100.00 11 UBC881 (GGGTG)3 20 20 100.00 5 UBC855 (AC)8(C/T)T 9 9 100.00 合计 188 174 6 UBC866 (CTC)6 15 12 80.00 平均 17.09 15.82 92.20 7 UBC868 (GAA)6 20 19 95.00 
图 1 引物UBC876对所采集白及样本的ISSR-PCR扩增结果
Figure 1. Amplification results of B. striata with primer UBC876 of ISSR
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经过2次筛选，共获得11对条带清晰、多态性高且重复性好的引物组合(表3)。11对引物组合共扩增出216条条带，多态性条带有202条，多态性比率占93.52%，11对引物平均扩增条带数为19.64条，平均多态性条带数为18.36条。引物组合Me13-Em9扩增位点数最多，扩出28条条带；其次为引物组合Me3-Em2和Me11-Em10，均扩增出22条条带；扩增条带最少的引物组合为Me12-Em6，仅扩增出16条条带。引物的PPB为83.33%~100.00%，其中，引物组合Me9-Em13、Me11-Em10和Me12-Em6的PPB最高，均为100.00%，占总引物的25.93%；引物组合Me11-Em12的PPB最低，为83.33%。以引物组合Me9-Em13为例，它对部分白及基因组DNA的ISSR-PCR的扩增结果见图2。
表 3 SRAP引物信息及扩增结果
Table 3. SRAP primer information and amplification results
引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 Me1-Em12 BATA DCAT 19 17 89.47 8 Me11-Em12 BACG DCAT 18 15 83.33 2 Me3-Em2 BAAT DTGC 22 20 90.91 9 Me12-Em6 BAAA DGCA 16 16 100.00 3 Me5-Em5 BAAG DAAC 18 17 94.44 10 Me12-Em7 BAAA DCAA 17 16 94.12 4 Me6-Em2 BACT DTGC 19 16 84.21 11 Me13-Em9 BAAC DCGA 28 27 96.43 5 Me9-Em13 BACA DCTA 18 18 100.00 合计 216 202 6 Me9-Em14 BACA DCTC 19 18 94.74 平均 19.64 18.36 93.52 7 Me11-Em10 BACG DCAG 22 22 100.00 说明：B表示TGAGTCCAAACCGG；D表示GACTGCGTACGAATT 
图 2 引物组合Me9-Em13对所采集白及样本的SRAP-PCR扩增结果
Figure 2. Amplification results of B. striata with primer combination Me9-Em13 of SRAP
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利用Popgene 32.0软件对32个白及种源的遗传距离和遗传一致度进行计算，表明在ISSR研究中，遗传一致度为0.5745~0.8989，遗传距离为0.1065~0.5543。遗传一致度最高的是21号四川内江东兴(3)和22号四川内江东兴(4)种源，为0.8989；它们的遗传距离最小，为0.1065，说明其亲缘关系较近。遗传一致度最低的是13号贵州黔西南安龙和25号四川汶川水磨(2)种源，它们的遗传一致度均为0.5745；它们的遗传距离最大，为0.5543，说明其亲缘关系较远。在SRAP研究中，遗传一致度为0.5231~0.8102，遗传距离为0.2105~0.5231。遗传距离最小的是2号浙江台州天台和3号浙江衢州江山种源；遗传距离最大的是4号浙江金华磐安和30号四川成都彭州(1)种源。综合ISSR和SRAP数据，遗传一致度为0.5668~0.8119，遗传距离为0.2084~0.5677；遗传距离最小的是25号四川汶川水磨(2)和32号四川甘孜康定种源，遗传距离最大的是4号浙江金华磐安和11号云南曲靖会泽种源。
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将32个种源按地区划分为4个群体(浙江、云南、贵州和四川)，使用Popgene 32.0软件分析种源的遗传多样性指数(表4)。在ISSR研究中，32个种源在物种水平上，Na为1.9255，Ne为1.4619，H为0.2819，I为0.4327，PPB为92.55%。在群体水平上，Na为1.5000~1.7926；Ne为1.3176~1.4393；H为0.1824~0.2607；I为0.2717~0.3940；PPB为50.00%~79.26%。可见，相对于物种水平而言，群体间的遗传多样性水平较低。在SRAP研究中，变异水平也是物种大于群体，与ISSR研究结果相似。综合ISSR和SRAP数据，32个种源在物种水平上，Na为1.9307，Ne为1.4988，H为0.2971，I为0.4509，PPB为93.07%。在群体水平上，Na为1.5000~1.8342，平均为1.6349；Ne为1.3281~1.4660，平均为1.3888；H为0.1877~0.2756，平均为0.2256；I为0.2780~0.4163，平均为0.3369；PPB为50.00%~83.42%，平均为63.49%，也是群体间的遗传多样性水平更低。其中，从ISSR、SRAP及综合ISSR和SRAP的研究结果来看，Na、Ne、H、I及PPB数值最小的均是贵州省种源，浙江省种源次之，各数值最大的均是四川种源，说明四川白及种源具有较高的遗传多样性，贵州白及种源遗传多样性较低。
表 4 白及的遗传多样性
Table 4. Genetic diversity of B. striata
研究方法 种源地 Na Ne H I PPB/% 浙江 1.5000 1.3215 0.1841 0.2729 50.00 ISSR 云南 1.6489 1.4042 0.2328 0.3473 64.89 贵州 1.5000 1.3176 0.1824 0.2717 50.00 四川 1.7926 1.4393 0.2607 0.3940 79.26 群体水平 1.6104 1.3707 0.2150 0.3215 61.04 物种水平 1.9255 1.4619 0.2819 0.4327 92.55 SRAP 浙江 1.5833 1.3753 0.2153 0.3191 58.33 云南 1.6713 1.4163 0.2432 0.3631 67.13 贵州 1.5000 1.3373 0.1923 0.2835 50.00 四川 1.8704 1.4891 0.2886 0.4357 87.04 群体水平 1.6563 1.4045 0.2349 0.3504 65.63 物种水平 1.9352 1.5309 0.3103 0.4667 93.52 ISSR+SRAP 浙江 1.5446 1.3503 0.2007 0.2976 54.46 云南 1.6609 1.4107 0.2384 0.3558 66.09 贵州 1.5000 1.3281 0.1877 0.2780 50.00 四川 1.8342 1.4660 0.2756 0.4163 83.42 群体水平 1.6349 1.3888 0.2256 0.3369 63.49 物种水平 1.9307 1.4988 0.2971 0.4509 93.07 -
利用NTSYS-pc 2.10e软件将32个种源的标记结果进行聚类分析，得到相应的UPGMA树状图(图3)。ISSR的UPGMA树状图显示：32个种源的种质资源遗传相似系数为0.650~0.900，变幅为0.250。其中，在遗传相似系数为0.680时，可将32个白及种源分为4个类群：Ⅰ类群包括26个种源，其中浙江种源6个，云南种源2个、贵州种源3个，四川种源15个；Ⅱ类群包括2个云南红河蒙自种源；Ⅲ类群仅包括13号贵州黔西南安龙种源，Ⅳ类群包括11号云南曲靖会泽种源、17号四川乐山沐川(2)种源和24号四川汶川水磨(1)种源共3个。在遗传相似系数为0.738时，Ⅰ类群又可分为4个类群(ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ类群) (图3A)。SRAP的UPGMA树状图显示：遗传相似系数为0.630~0.810，变幅为0.180。其中，在遗传相似系数为0.658时，可将样本分为3个类群：Ⅰ类群包括浙江种源6个和贵州种源4个；Ⅱ类群包括云南种源4个和四川种源10个；Ⅲ类群包括云南曲靖会泽种源和四川种源7个(图3B)。ISSR+SRAP的UPGMA树状图显示：遗传相似系数为0.660~0.810，变幅为0.150。其中，在遗传相似系数为0.688时，可将样本分为5个类群：Ⅰ类群包括浙江种源6个和贵州种源4个；Ⅱ类群包括云南种源2个和四川种源7个；Ⅲ类群包括2个云南红河蒙自种源；Ⅳ类群包括云南曲靖会泽种源和四川种源7个；Ⅴ类群包括四川种源3个(图3C)。使用OmicStudio工具将ISSR+SRAP的标记结果进行PCoA分析(图4)，结果与UPGMA聚类结果基本一致。
图 3 32个白及种源的UPGMA聚类图
Figure 3. UPGMA cluster map of 32 provenance of B. striata
图 4 综合ISSR和SRAP标记数据的PCoA分析
Figure 4. PCoA analysis of ISSR and SRAP markers data
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陈锦等[16]、周天华等[21]、和志娇等[22]、吴劲松[23]、孙宇龙等[17]分别应用RAPD、SSR、ISSR、扩增片段长度多态性(AFLP)和SRAP等单一分子标记技术研究了白及种质资源的遗传多样性，其中每个引物最少扩增得到1条多态性条带，最多的有19条，PPB最低为46.10%，最高则达90.48%。本研究综合了ISSR和SRAP等2种标记方法对32个白及种源进行了分析，筛选出的11条ISSR引物，共扩增出188条条带，多态性条带174条，平均每条引物15.82条，最多的达25条(UBC876)，PPB为92.20%；筛选出的11对SRAP引物组合，共扩增出216条条带，多态性条带有202条，平均每对引物19.64条，最多达27条(Me13-Em9)，PPB为93.52%。结果充分体现了供试白及种源在分子水平上具有丰富的遗传多样性，同时也验证了ISSR和SRAP标记技术在白及种源多态性检测方面的高效率，且SRAP的检测效率略高于ISSR。综合ISSR和SRAP数据分析白及遗传多样性指数发现：四川省白及种源的Na、Ne、H、I及PPB最大，云南种源次之，贵州种源最小，说明四川白及种源的遗传多样性水平最高，适应环境能力较强。
和志娇等[22]采用ISSR标记对不同种源的野生白及进行遗传多样性评价，发现不同地理位置和不同海拔采集到的白及个体的遗传距离有差异；孙宇龙等[17]也发现：遗传距离和地理距离间有显著正相关性；洪建聪等[15]和GUO等[24]则发现：白及个体的遗传距离与地理距离无直接关联。本研究综合了ISSR和SRAP标记数据发现：21号四川内江东兴(3)种源与22号四川内江东兴(4)种源、2号浙江台州天台种源与3号浙江衢州江山种源、25号四川汶川水磨(2)种源与32号四川甘孜康定种源的遗传距离较小，亲缘关系较近；13号贵州黔西南安龙种源与25号四川汶川水磨(2)种源、4号浙江金华磐安种源与11号云南曲靖会泽种源和30号四川成都彭州(1)种源遗传距离较大，亲缘关系较远。总体上同省的样品间遗传距离相对较小，这些在UPGMA聚类图和PCoA分析图上也有比较直观的体现。UPGMA聚类显示：聚为一类的白及种源大多来自同一省份，而在PCoA分析图中，云南种源与四川种源的亲缘关系较近，浙江种源与贵州种源的亲缘关系较近。整体上各个种源间的遗传距离与地理位置呈现出一定的相关性，但又不完全按照地理位置的远近聚类，有些甚至有所交叉。
物种的遗传特性主要受到生态环境、生物学特征、繁殖方式以及各种人为活动的影响[25]，野生白及由于长期的异花授粉和自然选择，其遗传背景复杂[24]；人工栽培白及则多是从山上采挖假鳞茎进行种植，品种混杂，品质参差不齐。又由于白及对生境的依赖性较高，因此生境的破坏和片段化都会影响其遗传多样性，所以在保护物种多样性时，首先应保护生态环境。本研究的某些白及种源可能是来自不同地区的引种，在土壤、养分、温度和水分等环境条件的作用下，导致地理距离较近的种源遗传性状产生了相似的变异，从而使不同种源间的遗传距离与地理距离存在一定的重合性。总的来说，本研究32个白及种源的遗传多样性水平较高。
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本研究综合利用ISSR和SRAP等2种分子标记技术，对浙江、云南、贵州、四川32个白及种源进行遗传多样性分析。结果显示：种源间具有较高的遗传多样性，且ISSR和SRAP技术均可有效揭示白及的遗传多样性和亲缘关系，运用2种分子标记技术也使得研究的可信度更高。
Genetic diversity analysis of Bletilla striata germplasm by ISSR and SRAP markers
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摘要:
目的 采用简单重复序列间扩增(ISSR)和相关序列扩增多态性(SRAP)等2种标记技术分析不同种源白及Bletilla striata样本的遗传多样性水平和遗传关系，为白及种质的鉴定、分类、保护和开发提供理论依据。 方法 从100个ISSR引物和238对SRAP引物组合中筛选出多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，用Popgene 32.0计算来自浙江、云南、贵州和四川等省32个不同种源白及的遗传多样性参数和遗传距离，用NTSYS-pc 2.10e进行聚类分析。 结果 从100个ISSR引物中筛选出11个多态性较好的引物，共扩增出188个条带，平均每个引物扩增出17.09个条带，其中多态性位点174个，占总扩增片段的92.20%；从238对SRAP引物组合中筛选出11对多态性较好的引物组合，共扩增出216个条带，平均每个引物扩增出19.64个条带，其中多态性位点202个，占总扩增片段的93.52%。综合ISSR和SRAP的标记结果发现：四川白及种源的遗传多样性水平最高，贵州最低；非加权组平均法(UPGMA聚类)和主坐标分析(PCoA分析)结果显示：聚为一类的白及种源大多来自同一省份，云南省与四川省白及种源的遗传距离较近，浙江省和贵州省白及种源的遗传距离较近，说明遗传距离与地理距离存在一定的重合，但并不呈正相关。 结论 本研究所选白及种源间具有较高的遗传多样性，ISSR和SRAP标记技术均可有效揭示白及的遗传多样性和亲缘关系。图4表4参25 -
关键词:
- 白及 /
- 遗传多样性 /
- 简单重复序列间扩增(ISSR)标记 /
- 相关序列扩增多态性(SRAP)标记
Abstract:Objective The objective is to analyze the genetic diversity and genetic relationship of 32 Bletilla striata samples from different provenances by ISSR and SRAP markers, so as to provide theoretical basis for identification, classification, conservation and development of B. striata germplasm. Method Primers with high polymorphism, clear amplification bands and good repeatability were selected from 100 ISSR primers and 238 pairs of SRAP primers for polymerase chain reaction (PCR) amplification. Genetic diversity parameters and genetic distance of B. striata from 32 different provenances in Zhejiang, Yunnan, Guizhou and Sichuan were calculated by Popgene 32.0, and cluster analysis was performed by NTSYS-PC 2.10e. Result 11 highly polymorphic primers were screened from 100 ISSR primers, and a total of 188 bands were amplified, with an average of 17.09 bands per primer, among which 174 were polymorphic loci, accounting for 92.20% of the total amplified fragments. 11 pairs of highly polymorphic primer pairs were screened from 238 pairs of SRAP primer pairs, and a total of 216 bands were amplified, with an average of 19.64 bands per primer, including 202 polymorphic loci, accounting for 93.52% of the total amplified fragments. Based on ISSR and SRAP markers, the genetic diversity level of B. striata population in Sichuan Province was the highest, while that in Guizhou Province was the lowest. UPGMA and PCoA analysis showed that the clustered B. striata samples were mostly from the same province. The genetic distance of B. striata population between Yunnan Province and Sichuan Province was relatively close, and that between Zhejiang Province and Guizhou Province was relatively close, indicating that there was a certain overlap between genetic distance and geographical distance, but there was no positive correlation. Conclusion B. striata provenances selected in this study have high genetic diversity. Both ISSR and SRAP markers can effectively reveal the genetic diversity and genetic relationship of B. striata. [Ch, 4 fig. 4 tab. 25 ref.] -
Key words:
- Bletilla striata /
- genetic diversity /
- ISSR marker /
- SRAP marker
-
森林与湿地、海洋并称为全球三大生态系统，被誉为“地球之肺”“绿色水库”和“物种基因库”[1]。森林生态系统是陆地生态系统中面积最大、组成结构最复杂、生物种类最丰富、适应性最强、稳定性最大、功能最完善、与人类生存发展关系最密切的一种自然生态系统，对改善和维护生态环境起着决定性的作用[2-3]。森林不仅能够为人类提供清新的空气、清洁的水源和舒适宜人的气候环境等生态产品，还能够提供保持水土、涵养水源、防风固沙、调节气候、生物多样性保育等生态服务[4]。CONSTANZA等[5]对全球生态系统服务价值进行较为全面的评估，算出全球陆地生态系统服务功能平均每年的价值高达33万亿美元，相当于当年全世界国民生产总值的1.8倍，不仅在国际上引起了广泛关注，而且掀起了对生态系统服务价值研究的热潮。联合国千年生态系统评估组(millennium ecosystem assessment，MA)开展了全球尺度和33个地区的生态系统与人类福利的研究，对生态系统的内涵、分类、评价基本理论和方法均进行了深入的阐述，极大推进了生态系统服务在世界范围内的理论方法及应用方面的研究[6]。侯元兆等[7]在国外生态服务价值评估的基础上，第1次估算出中国森林资源的价值约13.7万亿元，开创了国内森林生态系统生态服务价值评估的先河。有学者分别从不同尺度对中国、浙江省、泰顺县的森林生态系统服务价值进行评估[8-10]。也有学者分别对草原、湿地、森林等不同类型的生态系统进行价值评估[11-14]。本研究依据LY/T 1721−2008《森林生态系统服务功能评估规范》[15]，对乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的物质量及价值量进行评估，有助于增进人们对森林环境的保护意识以及对自然保护区的重视程度。
1. 研究区概况
乌岩岭国家级自然保护区(27°20′52″~27°48′39″N，119°37′08″~119°50′00″E)地处浙江省泰顺县西北部，总面积约18 861.5 hm2，其中林业用地17 605.1 hm2，占土地总面积的93.3%。乌岩岭在全球陆生生物圈的地带生物群落分类中属于热带、暖温带交错区，由于地理位置处于28°N附近的敏感区，且靠近太平洋，加上保护区西北面高山阻隔，温度偏高。乌岩岭有775属种子植物，其中，包括中国种子植物属的15个分布区类型。乌岩岭国家级自然保护区是中国—日本森林植物亚区华东区与华南区过渡地带，无论是地形、地势、气候等非生物因素和动植物种群都呈现明显过渡性。乌岩岭国家级自然保护区被誉为物种基因库，森林覆盖率为92.8%，其中阔叶林蓄积量达28 万m3以上，所占比例为45%，是华东地区保存最完善的大面积原生性中亚热带常绿阔叶林[16]。
2. 研究方法
2.1 数据来源
数据来源有乌岩岭国家级自然保护区典型森林样地调查数据(2017年)、乌岩岭国家级自然保护区森林资源二类清查数据(2017年)、泰顺县气象局监测数据和中华人民共和国林业行业标准LY/T 1721−2008《森林生态系统服务功能评估规范》。不同类型林分净生产力和土壤年固碳量采用华东地区森林生态系统定位站的观测数据[17]。
2.2 评估内容与指标体系
依据LY/T 1721−2008《森林生态系统服务功能评估规范》，同时结合乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统的实际情况，本次评估选取固碳释氧、涵养水源、积累营养物质、保育土壤、净化大气环境、生物多样性保护等6项服务15项指标(表1)，并从物质量和价值量2个方面对乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务进行评估。
表 1 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务评估指标体系Table 1 Evaluation index system of forest ecosystem service in Wuyanling National Nature Reserve服务类别 评估指标 涵养水源 调节水量、净化水质 保育土壤 固土、保肥 固碳释氧 固碳、释氧 积累营养物质 林木营养积累(氮、磷、钾) 净化大气环境 负离子量、二氧化硫量、氟化物量、氮氧化物量、滞尘量 生物多样性保护 物种保育 2.3 评估方法
参照LY/T 1721−2008《森林生态系统服务功能评估规范》，对以上指标进行评估。乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的物质量结合表2计算得出，价值量结合表3计算得出。林分类型分为针叶林(杉木Cunninghamia lanceolata林、马尾松Pinus massoniana林、柳杉Cryptomeria fortunei林)，常绿阔叶林，针阔混交林，经济林(主要为茶树Camellia sinensis、猕猴桃Actinidia chinensis林)，竹林。
表 2 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务物质量的参数数据Table 2 Material quality parameter data of forest ecosystem services in Wuyanling National Nature Reserve涵养水源 保育土壤 积累营养物质 林分类型 地表径
流量/
mm林分蒸
散量/
mm土壤侵
蚀模数/
(t·hm−2·a−1)土壤
容重/
(t·m−3)土壤
氮/%土壤
磷/%土壤
钾/%土壤
有机
质/%氮/% 磷/% 钾/% 针叶林 马尾松林 5.70 916.08 0.11 1.396 0.090 0.084 1.293 2.156 0.325 0.160 0.680 杉杉木林 5.70 1 072.92 0.16 1.200 0.096 0.082 1.333 2.516 0.324 0.165 0.700 柳杉林 5.70 1 072.92 0.11 0.956 0.081 0.087 1.342 3.270 0.324 0.165 0.700 常绿阔叶林 2.60 667.63 0.14 0.901 0.149 0.088 1.333 3.391 0.237 0.972 1.390 针阔混交林 2.60 966.05 0.13 1.372 0.090 0.075 1.233 3.059 0.280 0.566 1.0325 经济林 6.30 914.69 0.13 1.407 0.154 0.119 1.073 3.139 0.180 0.072 0.390 竹林 6.30 902.20 0.11 1.242 0.138 0.109 1.109 3.256 0.031 0.012 0.562 净化大气环境 生物多样性保护 林分类型 负离子量/
(个·cm−3)平均树
高/m吸收二氧
化硫量/
(kg·hm−2·a−1)吸收氟
化物量/
(kg·hm−2·a−1)吸收氮氧
化物量/
(kg·hm−2·a−1)滞尘量/
(kg·hm−2·a−1)香农-威纳
多样性指数针叶林 马尾松林 6 678 13.75 117.60 4.65 6.0 33 200 2.29 杉木林 4 880 13.36 117.60 4.65 6.0 33 200 0.83 柳杉林 7 335 16.83 117.60 4.65 6.0 33 200 1.62 常绿阔叶林 24 175 14.02 88.65 2.58 6.0 21 655 3.03 针阔混交林 9 825 11.50 152.13 2.58 6.0 21 655 2.03 经济林 877 1.20 152.13 2.58 6.0 21 655 0.45 竹林 11 753 14.06 152.13 2.58 6.0 21 655 0.84 说明：年平均降水量采用保护区2010−2016年生态站监测数据，为2 405.36 mm·a−1；无林地水土流失土壤年侵蚀模数参照中国科 学院观测点泥沙流失量，为17.66 t·hm−2·a−1[18]。土壤氮、土壤磷、土壤钾、土壤有机质、氮、磷、钾均为质量分数 表 3 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务价值量的参数数据Table 3 Value parameter data of forest ecosystem services in Wuyanling National Nature Reserve单位库容
造价/(元·t−1)水质净化费用/
(元·t−1)运输和挖取单位
体积的土方花费/
(元·m−3)磷酸二铵化肥
价格/(元·t−1)氯化钾化肥
价格/(元·t−1)有机质价格/
(元·t−1)固碳费用/
(元·t−1)6.11 2.09 12.60 2 400.00 2 200.00 320.00 1 200.00 氧气制造
费用/(元·t−1)负离子制造
费用/(10−18元·个−1)二氧化硫排
污费/(元·kg−1)氟化物排
污费/(元·kg−1)氮氧化物排
污费/(元·kg−1)滞尘排污费/
(元·kg−1)1 000.00 9.46 1.85 0.69 0.97 0.23 3. 评估结果与分析
3.1 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的物质量
由表4可知：2017年乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统净化大气环境服务的物质量最大，其次为涵养水源的物质量，为3.99×108 m3。
表 4 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的物质量Table 4 Material quality of ecosystem services in Wuyanling National Nature Reserve林分类型 固碳量/
(t·a−1)释氧量/
(t·a−1)固碳释氧量/
(t·a−1)调/净水量/
(m3·a−1)积累营养物质量/
(t·a−1)固土量/
(t·a−1)针叶林 马尾松林 5.96×103 1.19×104 1.78×104 4.75×107 1.16×104 5.62×104 杉木林 2.20×104 4.82×104 7.02×104 7.57×107 4.82×104 9.99×104 柳杉林 9.78×102 2.25×103 3.23×103 2.77×106 2.25×103 3.67×103 常绿阔叶林 3.91×104 9.19×104 1.31×105 1.97×108 2.01×105 1.99×105 针阔混交林 9.84×102 1.97×103 2.95×103 5.71×106 3.10×103 6.97×103 经济林 4.58×101 1.04×102 1.50×102 2.55×105 6.07×101 3.02×102 竹林 2.50×104 6.08×104 8.58×104 7.00×107 3.23×104 8.21×104 均值 1.34×104 3.10×104 4.45×104 5.70×107 4.26×104 6.40×104 合计 9.41×104 2.17×105 3.11×105 3.99×108 2.98×105 4.48×105 林分类型 保肥量/
(t·a−1)负离子量/
(个·a−1)二氧化硫/
(kg·a−1)氟化物/
(kg·a−1)氮氧化物量/
(kg·a−1)滞尘量/
(kg·a−1)针叶林 马尾松林 2.04×105 1.55×1023 3.77×105 1.49×104 1.92×104 1.06×108 杉木林 4.02×105 1.96×1023 6.71×105 2.65×104 3.43×104 1.90×108 柳杉林 1.75×104 1.36×1022 2.46×104 9.72×102 1.25×103 6.94×106 常绿阔叶林 9.88×105 2.02×1024 1.01×106 2.93×104 6.82×104 2.46×108 针阔混交林 3.10×104 2.36×1022 6.04×104 1.03×103 2.38×103 8.60×106 经济林 1.34×103 9.51×1018 2.62×103 8.00×101 1.03×102 3.72×105 竹林 3.78×105 4.06×1023 7.11×105 1.21×104 2.81×104 1.01×108 均值 2.89×105 4.03×1023 4.08×105 1.21×104 2.19×104 9.42×107 合计 2.02×106 2.82×1024 2.85×106 8.49×104 1.53×105 6.59×108 3.2 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的价值量
由表5可知：2017年乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的总价值为100.24×108元·a−1，单位面积生态服务价值为3.92×105元·hm−2·a−1。马尾松林、常绿阔叶林、针阔混交林、杉木林、柳杉林、经济林、竹林生态服务价值分别为1.00×109、5.33×109、1.34×108、1.93×109、7.59×107、5.32×106和1.55×109元·a−1。马尾松林、常绿阔叶林、针阔混交林、杉木林、柳杉林、经济林、竹林的单位面积生态服务价值分别为3.21×105、4.69×105、3.36×105、3.38×105、3.63×105、3.10×105、3.31×105、3.51×105和3.92×105元·hm−2·a−1。
表 5 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的价值量Table 5 Value quality of ecosystem services in Wuyanling National Nature Reserve生态系统服务价值量/(元·a−1) 单位面积
生态服务
价值/
(元·hm−2·a−1)林分类型 固碳释
氧价值生物多样性
保护价值涵养水
源价值积累营养
物质价值保育土
壤价值净化大
气价值生态服务
总价值针叶林 马尾松林 1.90×107 3.20×107 3.90×108 8.15×107 4.50×108 2.76×107 1.00×109 3.21×105 杉木林 7.46×107 1.71×107 6.21×108 3.36×108 8.34×108 4.65×107 1.93×109 3.38×105 柳杉林 3.43×106 1.05×106 2.28×107 1.57×107 3.12×107 1.76×106 7.59×107 3.63×105 常绿阔叶林 1.39×108 2.27×108 1.62×109 1.43×109 1.85×109 7.72×107 5.33×109 4.69×105 针阔混交林 3.15×106 3.97×106 4.68×107 2.20×107 5.54×107 2.30×106 1.34×108 3.36×105 经济林 1.59×105 5.16×104 2.09×106 4.17×105 2.51×106 9.07×104 5.32×106 3.10×105 竹林 9.08×107 1.40×107 5.74×108 1.51×108 6.88×108 2.83×107 1.55×109 3.31×105 均值 4.71×107 4.22×107 4.68×108 2.90×108 5.59×108 2.63×107 1.43×109 3.51×105 合计 3.30×108 2.96×108 3.27×109 2.03×109 3.91×109 1.84×108 1.00×1010 3.92×105 保护区森林生态系统服务价值所占比例分别为保育土壤39.00%、涵养水源32.65%、积累营养物质20.27%、固碳释氧3.29%、生物多样性保护2.95%、净化大气环境1.83%。可见，保育土壤、涵养水源和积累营养物质是乌岩岭森林生态系统主要的服务价值，三者比例之和高达91.92%，占据绝对优势。
保护区不同森林类型生态系统服务价值从大到小依次为常绿阔叶林、杉木林、竹林、马尾松林、针阔混交林、柳杉林、经济林，其对应的生态系统服务价值所占比例分别为53.20%、19.24%、15.43%、9.98%、1.33%、0.76%、0.05%。可见，常绿阔叶林对乌岩岭森林生态系统服务价值贡献在50%以上，占绝对地位。
4. 讨论
乌岩岭国家级自然保护区不同森林类型的生态服务价值与单位面积服务价值的排序并不一致，这说明生态系统服务价值除受各林分面积大小的影响外，还受林分的结构、活力、生态力的影响[19-21]。常绿阔叶林的单位面积生态服务价值远远高于其他林分，因此可在森林总面积保持不变的情况下，通过把针叶林改造成阔叶林等林相改造技术，提高林分质量，优化生态系统的结构，进而增加生态系统服务的产出和价值[22-24]。
乌岩岭国家级自然保护区提供的主要生态服务是保育土壤、涵养水源，这与付梦娣等[10]对泰顺县生态服务的研究一致，但乌岩岭国家级自然保护区的单位面积生态服务价值(3.92×105元·hm−2·a−1)是泰顺县单位面积生态服务价值(1.90×105元·hm−2·a−1)的2倍多。可见，乌岩岭国家级自然保护区对维护泰顺县生态安全具有重要作用。
乌岩岭国家级自然保护区净化大气环境服务价值达1.84×108元，这其中还不包括可吸入颗粒物(PM10)，细颗粒物(PM2.5)等服务价值。可见，保护区在养生保健、预防疾病等方面具有巨大的潜力，十分适合建设成为森林康养基地[25]。借助乌岩岭的生态优势，整合森林康养资源，丰富生态旅游产品的内涵，提高康养的层次和满意度，从而实现保护区的可持续发展，开辟绿水青山转化为金山银山的另一种途径。
自然保护区生态补偿资金的分配与生态系统服务长期脱钩，是造成保护区与周边村民矛盾的重要因素。生态补偿的本质就是对生态系统服务的外溢效益进行补偿[26]。评估生态系统的服务价值可作为生态补偿标准的依据[27]。
-
图 1 引物UBC876对所采集白及样本的ISSR-PCR扩增结果
Figure 1 Amplification results of B. striata with primer UBC876 of ISSR
图 2 引物组合Me9-Em13对所采集白及样本的SRAP-PCR扩增结果
Figure 2 Amplification results of B. striata with primer combination Me9-Em13 of SRAP
表 1 白及种源信息
Table 1. Source information of B. striata samples
编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 1 浙江温州泰顺 9 云南丽江永胜 17 四川乐山沐川(2) 25 四川汶川水磨(2) 2 浙江台州天台 10 云南普洱思茅 18 四川雅安石棉 26 四川汶川水磨(3) 3 浙江衢州江山 11 云南曲靖会泽 19 四川内江东兴(1) 27 四川都江堰虹口(1) 4 浙江金华磐安 12 贵州遵义正安 20 四川内江东兴(2) 28 四川都江堰虹口(2) 5 浙江宁波象山 13 贵州黔西南安龙 21 四川内江东兴(3) 29 四川成都大邑 6 浙江杭州临安 14 贵州遵义赤水 22 四川内江东兴(4) 30 四川成都彭州(1) 7 云南红河蒙自(1) 15 贵州毕节大方 23 四川内江东兴(5) 31 四川成都彭州(2) 8 云南红河蒙自(2) 16 四川乐山沐川(1) 24 四川汶川水磨(1) 32 四川甘孜康定 
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表 2 ISSR引物信息及扩增结果
Table 2. ISSR primer information and amplification results
引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 UBC823 (TC)8C 15 12 80.00 8 UBC876 (GATA)2(GACA)2 25 25 100.00 2 UBC826 (AC)8C 18 17 94.44 9 UBC879 C(TTCAC)3 15 15 100.00 3 UBC827 (AC)8G 16 16 100.00 10 UBC880 (GGAGA)3 17 11 64.71 4 UBC842 (GA)8(C/T)G 18 18 100.00 11 UBC881 (GGGTG)3 20 20 100.00 5 UBC855 (AC)8(C/T)T 9 9 100.00 合计 188 174 6 UBC866 (CTC)6 15 12 80.00 平均 17.09 15.82 92.20 7 UBC868 (GAA)6 20 19 95.00
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表 3 SRAP引物信息及扩增结果
Table 3. SRAP primer information and amplification results
引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 Me1-Em12 BATA DCAT 19 17 89.47 8 Me11-Em12 BACG DCAT 18 15 83.33 2 Me3-Em2 BAAT DTGC 22 20 90.91 9 Me12-Em6 BAAA DGCA 16 16 100.00 3 Me5-Em5 BAAG DAAC 18 17 94.44 10 Me12-Em7 BAAA DCAA 17 16 94.12 4 Me6-Em2 BACT DTGC 19 16 84.21 11 Me13-Em9 BAAC DCGA 28 27 96.43 5 Me9-Em13 BACA DCTA 18 18 100.00 合计 216 202 6 Me9-Em14 BACA DCTC 19 18 94.74 平均 19.64 18.36 93.52 7 Me11-Em10 BACG DCAG 22 22 100.00 说明：B表示TGAGTCCAAACCGG；D表示GACTGCGTACGAATT
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表 4 白及的遗传多样性
Table 4. Genetic diversity of B. striata
研究方法 种源地 Na Ne H I PPB/% 浙江 1.5000 1.3215 0.1841 0.2729 50.00 ISSR 云南 1.6489 1.4042 0.2328 0.3473 64.89 贵州 1.5000 1.3176 0.1824 0.2717 50.00 四川 1.7926 1.4393 0.2607 0.3940 79.26 群体水平 1.6104 1.3707 0.2150 0.3215 61.04 物种水平 1.9255 1.4619 0.2819 0.4327 92.55 SRAP 浙江 1.5833 1.3753 0.2153 0.3191 58.33 云南 1.6713 1.4163 0.2432 0.3631 67.13 贵州 1.5000 1.3373 0.1923 0.2835 50.00 四川 1.8704 1.4891 0.2886 0.4357 87.04 群体水平 1.6563 1.4045 0.2349 0.3504 65.63 物种水平 1.9352 1.5309 0.3103 0.4667 93.52 ISSR+SRAP 浙江 1.5446 1.3503 0.2007 0.2976 54.46 云南 1.6609 1.4107 0.2384 0.3558 66.09 贵州 1.5000 1.3281 0.1877 0.2780 50.00 四川 1.8342 1.4660 0.2756 0.4163 83.42 群体水平 1.6349 1.3888 0.2256 0.3369 63.49 物种水平 1.9307 1.4988 0.2971 0.4509 93.07
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