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白及Bletilla striata为兰科Orchidaceae白及属Bletilla多年生草本植物，以其干燥块茎入药，具有止血[1]、促进伤口愈合[2]、抗菌[3]、抗病毒[4]、抗肿瘤[5]等药理作用。此外，白及块茎含较多的胶质多糖，具有抗衰老、美白和抗氧化[2]等功能，因此也被广泛应用于化妆品行业。白及的花色鲜艳美丽，具有较高的观赏价值[6]。由于白及种子无胚乳，自然萌发率低，白及的需求量与野生资源的缺乏产生了巨大的冲突[7]，因此开展白及资源的保护及种质资源的研究工作刻不容缓。随着生物技术的发展，除了形态标记[8]、细胞标记[9]、生理生化标记[10]等传统的标记技术外，遗传多样性研究出现了新的基于基因组DNA水平的标记技术——分子标记。分子标记是在群体中易于跟踪和量化的基因位点，并且可能与特定基因或性状相关[11]。与其他标记相比，分子标记具有多态性好、数量多以及高共显性、简单稳定、易于追溯等优点[12]。简单重复序列间扩增(ISSR)和相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记是针对非特异性序列进行扩增的，因此对于白及这类基因组序列信息较为匮乏的物种而言是一种快速鉴定的方法[13]。邢佳鑫等[14]应用简单重复序列(SSR)和ISSR标记对外观较相似的白及样本进行遗传多样性分析，探索了快速鉴定白及组培苗真伪的新方法；洪建聪等[15]利用筛选出的15对SRAP引物组合将50份白及样本分成6个大类；陈锦等[16]利用ISSR和随机扩增多态性(RAPD)标记研究白及种质资源的遗传多样性，结果显示：白及种源间的遗传差异与地理距离相关，还发现ISSR不受时间和地点的限制，比RAPD有更高的多态性比率，结果相对更稳定可靠；孙宇龙等[17]通过SRAP标记将12个白及野生种源聚类成3支系，并发现遗传距离和地理距离间有显著正相关性，为白及野生资源的就地保护和迁地保护提供了理论依据；WANG等[18]使用ISSR标记分析了白及再生植株的克隆保真度，结果发现：再生植株与母株的相似度接近100.0%，表明通过愈伤组织和原球茎培养的再生植株在遗传上是稳定的。
目前，同时应用2种分子标记技术在分子水平上对白及种质资源进行的相关研究较少。本研究采用ISSR和SRAP分子标记技术，对从浙江省、云南省、贵州省和四川省搜集的32个白及种源进行亲缘关系及遗传多样性的初步分析，揭示白及个体间与种源间的遗传分化，为白及资源的保护和利用提供参考。
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2020年6—7月在浙江、云南、贵州、四川等22个地区采集32个白及种源，并将采集到的白及叶片洗净擦干，经液氮速冻后放置−80 ℃超低温冰箱备用。种源基本信息见表1。
表 1 白及种源信息
Table 1. Source information of B. striata samples
编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 1 浙江温州泰顺 9 云南丽江永胜 17 四川乐山沐川(2) 25 四川汶川水磨(2) 2 浙江台州天台 10 云南普洱思茅 18 四川雅安石棉 26 四川汶川水磨(3) 3 浙江衢州江山 11 云南曲靖会泽 19 四川内江东兴(1) 27 四川都江堰虹口(1) 4 浙江金华磐安 12 贵州遵义正安 20 四川内江东兴(2) 28 四川都江堰虹口(2) 5 浙江宁波象山 13 贵州黔西南安龙 21 四川内江东兴(3) 29 四川成都大邑 6 浙江杭州临安 14 贵州遵义赤水 22 四川内江东兴(4) 30 四川成都彭州(1) 7 云南红河蒙自(1) 15 贵州毕节大方 23 四川内江东兴(5) 31 四川成都彭州(2) 8 云南红河蒙自(2) 16 四川乐山沐川(1) 24 四川汶川水磨(1) 32 四川甘孜康定 -
主要仪器：JXFSTPRP-24L组织快速研磨仪(中国上海净信实业发展有限公司)、TU-100恒温金属浴(中国上海一恒科技有限公司)、Colibri超微量分光光度计(德国Titertek Berthold公司)、Centrifuge 5415 R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、Mini-P25微孔板离心机(中国杭州奥盛仪器有限公司)、T100 Thermal Cycler PCR仪、PowerPac HC高电流电泳仪[伯乐生命医学产品(中国上海)有限公司]、JY04S-3C凝胶成像系统(中国北京君意东方电泳设备有限公司)、B2042BluEye TM蓝光切胶仪(中国苏州宇恒生物科技有限公司)。
主要试剂：植物基因组DNA快速抽提试剂盒(中国上海生工生物股份有限公司)、2×Flash PCR MasterMix(中国北京康为世纪生物科技有限公司)、10 × loading buffer、DL 15000 DNA Marker、DL 2000 DNA Marker(日本TAKARA公司)。β-巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙醇、氯仿、异戊醇等均为中国上海国药集团化学试剂有限公司生产；ISSR引物和SRAP引物由北京擎科生物科技有限公司合成。
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取洁净干燥的白及嫩叶，采用植物基因组DNA快速抽提试剂盒提取样本DNA，并用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳法检测完整性，选择条带清晰明亮且无拖尾与杂带的DNA，用超微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度，结合DNA浓度及电泳的结果，将较优的DNA样品液用双蒸水(ddH2O)稀释至20 mg·L−1，放置冰箱−20 ℃保存备用。
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本研究采用的ISSR引物为哥伦比亚大学公布的第9套100个ISSR通用引物序列；SRAP引物为参考前人[19-20]设计的238对SRAP引物组合，共包含14条上游引物(Me1~Me14)和17条下游引物(Em1~Em17)。引物的筛选经过初筛和复筛2个步骤：从32个供试材料中选取4个表型性状差异较明显的材料作为样本DNA，对引物进行初筛，选出扩增产物主带明显、条带清晰的引物。经过引物的初筛后，选择所有样本DNA作为模板，针对初筛后的引物进行复筛，选择多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物作为本研究的引物。根据每条引物的退火温度(Tm) ± 5 ℃的范围，设置8个温度梯度进行聚合酶链式反应(PCR)；根据条带得出每个引物的最适退火温度。
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ISSR-PCR扩增体系(20 μL)：1 μL DNA模板、1 μL引物(20 mg·L−1)、10 μL 2×Flash PCR MasterMix、8 μL ddH2O；ISSR-PCR扩增程序：98 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s；退火(每个引物的退火温度不同)15 s，72 ℃延伸15 s；共35个循环，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。
SRAP-PCR扩增体系(20 μL)：1 μL DNA模板、1 μL引物(20 mg·L−1)、10 μL 2×Flash PCR MasterMix、7 μL ddH2O；SRAP-PCR扩增程序：98 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s；退火(每个引物的退火温度不同)15 s，72 ℃延伸15 s；共38个循环，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。
PCR扩增产物在含有Gelred核酸染料的质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中，130 V，电泳50 min后，经凝胶成像系统(JY04S-3C)拍照保存。
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人工读取电泳结果数据，并进行统计处理。将条带中清晰可见以及可重复的标记为“1”，同一位置上条带缺失或者弱带标记为“0”，形成“0、1”数据矩阵，分别得到ISSR、SRAP及综合两者(SSR+SRAP)的数据。通过Excel表格，统计每个引物或每对引物组合扩增的条带以及多态性条带数，计算多态位点百分率(PPB)，利用Popgene 32.0软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s多态性信息指数(I)、种源总基因多样性(Ht)、种源内基因多样性(Hs)、基因分化系数(Gst = 1−Hs/Ht)和基因流(Nm)等遗传多样性参数，并计算种源间的遗传距离和遗传一致性，使用OmicStudio工具(
https://www.omicstudio.cn/tool )对遗传距离进行主坐标(PCoA)分析，利用NTSYS-pc 2.10e软件对种源进行聚类分析，并绘制非加权组平均法(UPGMA)树状图。 -
提取白及基因组DNA后，经琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并通过超微量分光光度计检测其浓度、纯度，均符合要求，可进行下一步试验。
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经过2次筛选，共获得11条条带清晰、多态性高且重复性好的引物(表2)。11条引物共扩增出188条条带，多态性条带有174条，PPB为92.20%。11条引物平均扩增条带数为17.09条，平均多态性条带数为15.82条。扩增位点数最多的引物是UBC876，扩出了25条条带；其次是引物UBC868和UBC881，均扩增出20条条带；扩增条带最少的引物是UBC855，只扩增出9条条带，PPB为64.71%~100.00%，其中，引物UBC827、UBC842、UBC855、UBC876、UBC879和UBC881的PPB为100%，均表现出极高的多态性，占总引物的54.55%；UBC880的PPB最低，为64.71%。以引物UBC876为例，它对所采集白及样本的ISSR-PCR的扩增结果见图1。
表 2 ISSR引物信息及扩增结果
Table 2. ISSR primer information and amplification results
引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 UBC823 (TC)8C 15 12 80.00 8 UBC876 (GATA)2(GACA)2 25 25 100.00 2 UBC826 (AC)8C 18 17 94.44 9 UBC879 C(TTCAC)3 15 15 100.00 3 UBC827 (AC)8G 16 16 100.00 10 UBC880 (GGAGA)3 17 11 64.71 4 UBC842 (GA)8(C/T)G 18 18 100.00 11 UBC881 (GGGTG)3 20 20 100.00 5 UBC855 (AC)8(C/T)T 9 9 100.00 合计 188 174 6 UBC866 (CTC)6 15 12 80.00 平均 17.09 15.82 92.20 7 UBC868 (GAA)6 20 19 95.00 
图 1 引物UBC876对所采集白及样本的ISSR-PCR扩增结果
Figure 1. Amplification results of B. striata with primer UBC876 of ISSR
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经过2次筛选，共获得11对条带清晰、多态性高且重复性好的引物组合(表3)。11对引物组合共扩增出216条条带，多态性条带有202条，多态性比率占93.52%，11对引物平均扩增条带数为19.64条，平均多态性条带数为18.36条。引物组合Me13-Em9扩增位点数最多，扩出28条条带；其次为引物组合Me3-Em2和Me11-Em10，均扩增出22条条带；扩增条带最少的引物组合为Me12-Em6，仅扩增出16条条带。引物的PPB为83.33%~100.00%，其中，引物组合Me9-Em13、Me11-Em10和Me12-Em6的PPB最高，均为100.00%，占总引物的25.93%；引物组合Me11-Em12的PPB最低，为83.33%。以引物组合Me9-Em13为例，它对部分白及基因组DNA的ISSR-PCR的扩增结果见图2。
表 3 SRAP引物信息及扩增结果
Table 3. SRAP primer information and amplification results
引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 Me1-Em12 BATA DCAT 19 17 89.47 8 Me11-Em12 BACG DCAT 18 15 83.33 2 Me3-Em2 BAAT DTGC 22 20 90.91 9 Me12-Em6 BAAA DGCA 16 16 100.00 3 Me5-Em5 BAAG DAAC 18 17 94.44 10 Me12-Em7 BAAA DCAA 17 16 94.12 4 Me6-Em2 BACT DTGC 19 16 84.21 11 Me13-Em9 BAAC DCGA 28 27 96.43 5 Me9-Em13 BACA DCTA 18 18 100.00 合计 216 202 6 Me9-Em14 BACA DCTC 19 18 94.74 平均 19.64 18.36 93.52 7 Me11-Em10 BACG DCAG 22 22 100.00 说明：B表示TGAGTCCAAACCGG；D表示GACTGCGTACGAATT 
图 2 引物组合Me9-Em13对所采集白及样本的SRAP-PCR扩增结果
Figure 2. Amplification results of B. striata with primer combination Me9-Em13 of SRAP
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利用Popgene 32.0软件对32个白及种源的遗传距离和遗传一致度进行计算，表明在ISSR研究中，遗传一致度为0.5745~0.8989，遗传距离为0.1065~0.5543。遗传一致度最高的是21号四川内江东兴(3)和22号四川内江东兴(4)种源，为0.8989；它们的遗传距离最小，为0.1065，说明其亲缘关系较近。遗传一致度最低的是13号贵州黔西南安龙和25号四川汶川水磨(2)种源，它们的遗传一致度均为0.5745；它们的遗传距离最大，为0.5543，说明其亲缘关系较远。在SRAP研究中，遗传一致度为0.5231~0.8102，遗传距离为0.2105~0.5231。遗传距离最小的是2号浙江台州天台和3号浙江衢州江山种源；遗传距离最大的是4号浙江金华磐安和30号四川成都彭州(1)种源。综合ISSR和SRAP数据，遗传一致度为0.5668~0.8119，遗传距离为0.2084~0.5677；遗传距离最小的是25号四川汶川水磨(2)和32号四川甘孜康定种源，遗传距离最大的是4号浙江金华磐安和11号云南曲靖会泽种源。
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将32个种源按地区划分为4个群体(浙江、云南、贵州和四川)，使用Popgene 32.0软件分析种源的遗传多样性指数(表4)。在ISSR研究中，32个种源在物种水平上，Na为1.9255，Ne为1.4619，H为0.2819，I为0.4327，PPB为92.55%。在群体水平上，Na为1.5000~1.7926；Ne为1.3176~1.4393；H为0.1824~0.2607；I为0.2717~0.3940；PPB为50.00%~79.26%。可见，相对于物种水平而言，群体间的遗传多样性水平较低。在SRAP研究中，变异水平也是物种大于群体，与ISSR研究结果相似。综合ISSR和SRAP数据，32个种源在物种水平上，Na为1.9307，Ne为1.4988，H为0.2971，I为0.4509，PPB为93.07%。在群体水平上，Na为1.5000~1.8342，平均为1.6349；Ne为1.3281~1.4660，平均为1.3888；H为0.1877~0.2756，平均为0.2256；I为0.2780~0.4163，平均为0.3369；PPB为50.00%~83.42%，平均为63.49%，也是群体间的遗传多样性水平更低。其中，从ISSR、SRAP及综合ISSR和SRAP的研究结果来看，Na、Ne、H、I及PPB数值最小的均是贵州省种源，浙江省种源次之，各数值最大的均是四川种源，说明四川白及种源具有较高的遗传多样性，贵州白及种源遗传多样性较低。
表 4 白及的遗传多样性
Table 4. Genetic diversity of B. striata
研究方法 种源地 Na Ne H I PPB/% 浙江 1.5000 1.3215 0.1841 0.2729 50.00 ISSR 云南 1.6489 1.4042 0.2328 0.3473 64.89 贵州 1.5000 1.3176 0.1824 0.2717 50.00 四川 1.7926 1.4393 0.2607 0.3940 79.26 群体水平 1.6104 1.3707 0.2150 0.3215 61.04 物种水平 1.9255 1.4619 0.2819 0.4327 92.55 SRAP 浙江 1.5833 1.3753 0.2153 0.3191 58.33 云南 1.6713 1.4163 0.2432 0.3631 67.13 贵州 1.5000 1.3373 0.1923 0.2835 50.00 四川 1.8704 1.4891 0.2886 0.4357 87.04 群体水平 1.6563 1.4045 0.2349 0.3504 65.63 物种水平 1.9352 1.5309 0.3103 0.4667 93.52 ISSR+SRAP 浙江 1.5446 1.3503 0.2007 0.2976 54.46 云南 1.6609 1.4107 0.2384 0.3558 66.09 贵州 1.5000 1.3281 0.1877 0.2780 50.00 四川 1.8342 1.4660 0.2756 0.4163 83.42 群体水平 1.6349 1.3888 0.2256 0.3369 63.49 物种水平 1.9307 1.4988 0.2971 0.4509 93.07 -
利用NTSYS-pc 2.10e软件将32个种源的标记结果进行聚类分析，得到相应的UPGMA树状图(图3)。ISSR的UPGMA树状图显示：32个种源的种质资源遗传相似系数为0.650~0.900，变幅为0.250。其中，在遗传相似系数为0.680时，可将32个白及种源分为4个类群：Ⅰ类群包括26个种源，其中浙江种源6个，云南种源2个、贵州种源3个，四川种源15个；Ⅱ类群包括2个云南红河蒙自种源；Ⅲ类群仅包括13号贵州黔西南安龙种源，Ⅳ类群包括11号云南曲靖会泽种源、17号四川乐山沐川(2)种源和24号四川汶川水磨(1)种源共3个。在遗传相似系数为0.738时，Ⅰ类群又可分为4个类群(ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ类群) (图3A)。SRAP的UPGMA树状图显示：遗传相似系数为0.630~0.810，变幅为0.180。其中，在遗传相似系数为0.658时，可将样本分为3个类群：Ⅰ类群包括浙江种源6个和贵州种源4个；Ⅱ类群包括云南种源4个和四川种源10个；Ⅲ类群包括云南曲靖会泽种源和四川种源7个(图3B)。ISSR+SRAP的UPGMA树状图显示：遗传相似系数为0.660~0.810，变幅为0.150。其中，在遗传相似系数为0.688时，可将样本分为5个类群：Ⅰ类群包括浙江种源6个和贵州种源4个；Ⅱ类群包括云南种源2个和四川种源7个；Ⅲ类群包括2个云南红河蒙自种源；Ⅳ类群包括云南曲靖会泽种源和四川种源7个；Ⅴ类群包括四川种源3个(图3C)。使用OmicStudio工具将ISSR+SRAP的标记结果进行PCoA分析(图4)，结果与UPGMA聚类结果基本一致。
图 3 32个白及种源的UPGMA聚类图
Figure 3. UPGMA cluster map of 32 provenance of B. striata
图 4 综合ISSR和SRAP标记数据的PCoA分析
Figure 4. PCoA analysis of ISSR and SRAP markers data
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陈锦等[16]、周天华等[21]、和志娇等[22]、吴劲松[23]、孙宇龙等[17]分别应用RAPD、SSR、ISSR、扩增片段长度多态性(AFLP)和SRAP等单一分子标记技术研究了白及种质资源的遗传多样性，其中每个引物最少扩增得到1条多态性条带，最多的有19条，PPB最低为46.10%，最高则达90.48%。本研究综合了ISSR和SRAP等2种标记方法对32个白及种源进行了分析，筛选出的11条ISSR引物，共扩增出188条条带，多态性条带174条，平均每条引物15.82条，最多的达25条(UBC876)，PPB为92.20%；筛选出的11对SRAP引物组合，共扩增出216条条带，多态性条带有202条，平均每对引物19.64条，最多达27条(Me13-Em9)，PPB为93.52%。结果充分体现了供试白及种源在分子水平上具有丰富的遗传多样性，同时也验证了ISSR和SRAP标记技术在白及种源多态性检测方面的高效率，且SRAP的检测效率略高于ISSR。综合ISSR和SRAP数据分析白及遗传多样性指数发现：四川省白及种源的Na、Ne、H、I及PPB最大，云南种源次之，贵州种源最小，说明四川白及种源的遗传多样性水平最高，适应环境能力较强。
和志娇等[22]采用ISSR标记对不同种源的野生白及进行遗传多样性评价，发现不同地理位置和不同海拔采集到的白及个体的遗传距离有差异；孙宇龙等[17]也发现：遗传距离和地理距离间有显著正相关性；洪建聪等[15]和GUO等[24]则发现：白及个体的遗传距离与地理距离无直接关联。本研究综合了ISSR和SRAP标记数据发现：21号四川内江东兴(3)种源与22号四川内江东兴(4)种源、2号浙江台州天台种源与3号浙江衢州江山种源、25号四川汶川水磨(2)种源与32号四川甘孜康定种源的遗传距离较小，亲缘关系较近；13号贵州黔西南安龙种源与25号四川汶川水磨(2)种源、4号浙江金华磐安种源与11号云南曲靖会泽种源和30号四川成都彭州(1)种源遗传距离较大，亲缘关系较远。总体上同省的样品间遗传距离相对较小，这些在UPGMA聚类图和PCoA分析图上也有比较直观的体现。UPGMA聚类显示：聚为一类的白及种源大多来自同一省份，而在PCoA分析图中，云南种源与四川种源的亲缘关系较近，浙江种源与贵州种源的亲缘关系较近。整体上各个种源间的遗传距离与地理位置呈现出一定的相关性，但又不完全按照地理位置的远近聚类，有些甚至有所交叉。
物种的遗传特性主要受到生态环境、生物学特征、繁殖方式以及各种人为活动的影响[25]，野生白及由于长期的异花授粉和自然选择，其遗传背景复杂[24]；人工栽培白及则多是从山上采挖假鳞茎进行种植，品种混杂，品质参差不齐。又由于白及对生境的依赖性较高，因此生境的破坏和片段化都会影响其遗传多样性，所以在保护物种多样性时，首先应保护生态环境。本研究的某些白及种源可能是来自不同地区的引种，在土壤、养分、温度和水分等环境条件的作用下，导致地理距离较近的种源遗传性状产生了相似的变异，从而使不同种源间的遗传距离与地理距离存在一定的重合性。总的来说，本研究32个白及种源的遗传多样性水平较高。
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本研究综合利用ISSR和SRAP等2种分子标记技术，对浙江、云南、贵州、四川32个白及种源进行遗传多样性分析。结果显示：种源间具有较高的遗传多样性，且ISSR和SRAP技术均可有效揭示白及的遗传多样性和亲缘关系，运用2种分子标记技术也使得研究的可信度更高。
Genetic diversity analysis of Bletilla striata germplasm by ISSR and SRAP markers
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摘要:
目的 采用简单重复序列间扩增(ISSR)和相关序列扩增多态性(SRAP)等2种标记技术分析不同种源白及Bletilla striata样本的遗传多样性水平和遗传关系，为白及种质的鉴定、分类、保护和开发提供理论依据。 方法 从100个ISSR引物和238对SRAP引物组合中筛选出多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，用Popgene 32.0计算来自浙江、云南、贵州和四川等省32个不同种源白及的遗传多样性参数和遗传距离，用NTSYS-pc 2.10e进行聚类分析。 结果 从100个ISSR引物中筛选出11个多态性较好的引物，共扩增出188个条带，平均每个引物扩增出17.09个条带，其中多态性位点174个，占总扩增片段的92.20%；从238对SRAP引物组合中筛选出11对多态性较好的引物组合，共扩增出216个条带，平均每个引物扩增出19.64个条带，其中多态性位点202个，占总扩增片段的93.52%。综合ISSR和SRAP的标记结果发现：四川白及种源的遗传多样性水平最高，贵州最低；非加权组平均法(UPGMA聚类)和主坐标分析(PCoA分析)结果显示：聚为一类的白及种源大多来自同一省份，云南省与四川省白及种源的遗传距离较近，浙江省和贵州省白及种源的遗传距离较近，说明遗传距离与地理距离存在一定的重合，但并不呈正相关。 结论 本研究所选白及种源间具有较高的遗传多样性，ISSR和SRAP标记技术均可有效揭示白及的遗传多样性和亲缘关系。图4表4参25 -
关键词:
- 白及 /
- 遗传多样性 /
- 简单重复序列间扩增(ISSR)标记 /
- 相关序列扩增多态性(SRAP)标记
Abstract:Objective The objective is to analyze the genetic diversity and genetic relationship of 32 Bletilla striata samples from different provenances by ISSR and SRAP markers, so as to provide theoretical basis for identification, classification, conservation and development of B. striata germplasm. Method Primers with high polymorphism, clear amplification bands and good repeatability were selected from 100 ISSR primers and 238 pairs of SRAP primers for polymerase chain reaction (PCR) amplification. Genetic diversity parameters and genetic distance of B. striata from 32 different provenances in Zhejiang, Yunnan, Guizhou and Sichuan were calculated by Popgene 32.0, and cluster analysis was performed by NTSYS-PC 2.10e. Result 11 highly polymorphic primers were screened from 100 ISSR primers, and a total of 188 bands were amplified, with an average of 17.09 bands per primer, among which 174 were polymorphic loci, accounting for 92.20% of the total amplified fragments. 11 pairs of highly polymorphic primer pairs were screened from 238 pairs of SRAP primer pairs, and a total of 216 bands were amplified, with an average of 19.64 bands per primer, including 202 polymorphic loci, accounting for 93.52% of the total amplified fragments. Based on ISSR and SRAP markers, the genetic diversity level of B. striata population in Sichuan Province was the highest, while that in Guizhou Province was the lowest. UPGMA and PCoA analysis showed that the clustered B. striata samples were mostly from the same province. The genetic distance of B. striata population between Yunnan Province and Sichuan Province was relatively close, and that between Zhejiang Province and Guizhou Province was relatively close, indicating that there was a certain overlap between genetic distance and geographical distance, but there was no positive correlation. Conclusion B. striata provenances selected in this study have high genetic diversity. Both ISSR and SRAP markers can effectively reveal the genetic diversity and genetic relationship of B. striata. [Ch, 4 fig. 4 tab. 25 ref.] -
Key words:
- Bletilla striata /
- genetic diversity /
- ISSR marker /
- SRAP marker
-
阔叶材横截面微观图像由管孔、木射线、生长轮、木纤维和轴向薄壁组织构成，其中管孔是木材研究最重要的特征之一[1-3]。管孔不仅是分析考古木材样品的构造特征与保护状态的研究要素[3]，也是研究某一地区若干年内木材生长量和环境气候变化相关性的依据[4]。管孔的分割是微观木材图像中提取管孔特征量和进行木材树种自动识别的关键步骤[5−6]，因此，微观木材图像中的管孔分割有重要的研究意义。近些年来应用于管孔分割的算法主要有数学形态学、区域生长、目标遗传和水平集等[7-9]。张广群等[9]首先运用多目标遗传算法成功地分割出图像中的大部分管孔，但会出现复管孔或管孔团的漏分，同时部分轴向薄壁组织会连同其附近的管孔一起被分割出来。汪杭军[10]运用局部水平集算法，以局部灰度分布的均值作为统计信息，加强了管孔区域和背景区域的对比度，该算法虽然克服了漏分问题，但出现了噪声的误分割，一部分噪声为一些轮廓较大的木射线组织，另一部分为形状大小与管孔相似的木纤维组织。祁亨年等[11]运用改变结构元素和形态尺度的数学形态学算法对管孔进行分割，该算法克服了木射线和木纤维组织等噪声的影响，但出现了图像边缘细节丢失，如较小的管孔被当作噪声去除或是较大的管孔部分组织缺失。SHEN等[12]通过检测闭合区域的平均面积得出最适合的结构元素，并运用形态学算法对管孔进行分割，但还是会出现小孔漏分，大孔误分的情况。由于木材横截面微观图像中管孔数量众多、形态各异且随机分布，木纤维和轴向薄壁组织横截面也呈现一个个相对较小的孔洞，从而对管孔进行分割较为困难。综上所述，微观木材图像中管孔的分割依然是目前的研究热点和难点。本研究提出了一种改进K-means聚类与分水岭的木材横截面管孔分割算法，旨在解决管孔漏分、误分和噪声去除的问题并快速分割出管孔区域。
1. 数据与方法
1.1 数据来源
日本森林数据库(
https://db.ffpri.go.jp/WoodDB/JWDB/home.php )。该数据库成立于1928年，现有木材标本29 000余号，隶属270科2 050属8 500种；切片标本约90 000号[13]。本研究用到的木材树种为大红叶枫Acer amoenum(15帧图像)、尖齿槭A. argutum(5帧)、细柄槭A. capillipes(4帧)、茶条槭A. ginnala(1帧)、桑叶槭A. morifolium(3帧)、毛果槭A. nikoense(3帧)、日本槭A. nipponicum(5帧)、赛波德槭A. sicboldianum(24帧)、花楷槭A. ukurunduense(6帧)、红脉槭A. rufinerve(25帧)、薄叶槭A. tenuifolium(3帧)和褐枝猕猴桃Actinidia rufa(7帧)。1.2 改进的K-means聚类算法
传统的K-means聚类算法以距离作为相似性的评价指标，基本思想是按照距离将样本聚成不同的簇，两点距离越近，相似度就越大，以得到紧凑且独立的簇作为聚类目标[14-15]。传统的K-means聚类算法将样本映射到RGB颜色特征空间，构造新的映射关系，能够打破聚类只能是球状的限制，但聚类中心的选择会较大程度上影响分类效果，尤其是当聚类中心的选取全部位于管孔以外时，管孔区域会被整体归为噪声。此外，由于初始聚类中心的随机生成，可能会导致分类结果不一致或将木纤维或轴向薄壁组织被整体分割出来。基于此，针对以上问题进行算法改进，实现聚类中心的自适应选取。在RGB色彩空间下提取彩色木材微观图像的三通道分量。结合木材横截面原图，能够看出生长轮和木射线区域颜色较深，颜色值较小，所以其对应颜色值较小的峰值附近区域；管孔区域颜色较浅，颜色值较大，所以其对应颜色值较大的峰值附近区域；轴向薄壁组织和木纤维区域颜色较为平均，颜色值介于前两者之间，所以其对应两峰之间的波谷附近区域。分别取3个分量的均值组成第1个中心点，代表颜色直方图波谷附近区域，该点作为轴向薄壁组织和木纤维区域的簇类中心；遍历三通道分量，对于大于各自均值的所有颜色值取中值作为第2个中心点，由于该点对应颜色值较大，所以该点作为管孔的簇类中心；小于各自均值的所有颜色值取中值作为第3个中心点，由于该点对应颜色值较小，所以作为生长轮和木射线区域的簇类中心，分别代表颜色直方图两峰峰值附近区域。设通道分量为
$ {M}_{j} $ ，$ {M}_{j}\in (r,\;g,\;b) $ ，Xn处的颜色值为In，$ 0 ＜ I $ ≤255。计算每个通道分量的均值$ \overline{M}_{j} $ ，均值两侧的中值为M1和M2，Meidan表示取目标数组的中值函数。$$ {\overline{M}}_{j}=\frac{1}{n}\sum _{{n}}^{1}{I}_{n}； $$ (1) $$ {M_1} = {\rm{Meidan}}\left( {0,\;{{\overline M}_j}} \right)； $$ (2) $$ {M_2} = {\rm{Meidan}}\left( {{{\overline M}_j},\;255} \right)\text{。} $$ (3) 根据图像中各组织部分对应的颜色峰值或波谷得出这一组织部分的中心点，再以这3个点作为初始聚类中心点，运用K-means算法实现管孔的粗分割。
1.3 改进的分水岭算法
虽然K-means聚类算法能够将木材微观图像中的管孔区域和背景区域区分开，但两者的颜色梯度差异较小，这可能会导致分水岭变换的过度分割。为了增加管孔区域和背景区域的颜色梯度差异，使分水岭变换在梯度运算判断极大值点时更加准确，更加有效地实现管孔的精分割，按照聚类的结果将木材微观图像进行3类颜色编码。第1类轴向薄壁组织细胞壁和木纤维区域进行红色编码，第2类管孔区域进行绿色编码，第3类生长轮和木射线区域进行蓝色编码。最后，通过形态学操作和分水岭变换实现管孔的精分割。
1.4 管孔分割
为实现木材横截面微观图像的管孔分割，具体步骤如下(图1)：①提取木材横截面微观图像的RGB分量并绘制颜色直方图；②根据木材微观图像中的3类目标区域，即轴向薄壁组织和木纤维、管孔、生长轮和木射线，确定聚类初始中心点；③根据像素点与聚类中心点之间的欧式距离求出新的簇类中心并判断中心点是否改变，若不一致则继续迭代，一致则进行下一步；④对划分出的3类区域进行颜色编码；⑤最后通过形态学操作去除面积较小的噪声，运用分水岭算法分割出管孔。
1.5 验证
以大红叶枫横截面原图(997×1 418)为例，将本研究算法和现有算法(阈值分割、分水岭、K-means聚类与阈值分割)的分割效果进行对比分析，并以平均管孔有效分割率(F)作为算法分割性能的评价指标进行评价。
$$ {P}_{i}=\frac{{T}_{i}}{{N}_{i}} ； $$ (4) $$ F=\frac{1}{n}\sum\limits_{i=1}^{n}{P}_{i}\text{。} $$ (5) 式(4)~(5)中，Ti表示每张图像的管孔实际分割总数，Ni表示每张图像中的管孔总数，Pi表示每张图像的管孔有效分割率，重复次数n的取值为101，
$ i\in n $ ，F表示平均管孔有效分割率。2. 结果与分析
2.1 算法实现
随机选择3种木材微观横截面原图(图2)。在RGB色彩空间下提取彩色木材微观图像的三通道分量(图3)。可以看出3个分量均有2个峰和1个波谷组成，其中2个峰分别代表管孔区域和生长轮、木射线区域，波谷代表轴向薄壁组织和木纤维区域。
按照颜色直方图得到初始聚类中心点。尖齿槭颜色值为(130.0, 144.0, 169.0)，(20.0, 22.0, 49.0)，(68.0, 78.4, 104.8)；红脉槭颜色值为(84.6, 89.2, 110.4)，(167.0, 184.0, 193.0)，(32.0, 28.0, 56.0)；赛波德槭颜色值为(181.0, 173.0, 207.0)，(64.0, 40.0, 110.0)，(113.0, 99.4, 154.9)。运用改进K-means聚类算法划分簇类(图4)。
为了增加管孔区域和背景区域两者的颜色梯度差异，对聚类粗分割结果进行色彩编码(图5)，第1类对轴向薄壁组织细胞壁和木射线区域进行红色编码，颜色值为(202, 12, 22)；第2类对管孔区域进行绿色编码，颜色值为(53, 106, 195)；第3类对生长轮以及木射线区域归进行蓝色编码，颜色值为(29, 209, 107)。
经过灰度转换、开闭运算等图像形态学处理后，消除了绝大部分的木射线、木纤维和轴向薄壁组织等面积较小的噪声。此外运用分水岭变换对已分类的木材微观图像进行目标分割，即管孔分割(图6)，将管孔快速准确地分割。从最终的分割结果来看，除了极个别的细小管孔未被检测到之外，其余管孔均被完整地分割，分割出的轮廓也与实际轮廓基本吻合。
2.2 验证结果
如图7所示：阈值分割算法每张木材横截面微观图像平均有88.1%的管孔被准确有效地分割出来；分水岭算法每张木材横截面微观图像平均有91.4%的管孔被准确有效地分割出来，但存在噪声误分的问题；K-means聚类与阈值分割算法先运用K-means聚类算法将木材图像分为3类，再采用阈值分割和canny算子做管孔精分割，结果每张木材横截面微观图像平均有96.3%的管孔被准确有效地分割出来，但部分木射线和轴向薄壁组织也被分割出来，且存在轮廓不饱满的问题；本研究算法为改进K-means聚类与分水岭算法，结果每张木材横截面微观图像平均有97.1%的管孔被准确有效地分割出来，分割出的管孔与实际管孔基本吻合。
为验证本研究算法分割管孔的准确性，对12类树种的横截面微观图像在各算法下的分割结果进行了比较(表1)，能够看出阈值分割不存在管孔误分，但因面积较小而漏分的管孔较多；分水岭算法不仅存在管孔漏分且会误分割出木射线、木纤维以及轴向薄壁组织；K-means聚类与阈值分割存在木射线和轴向薄壁组织的误分割；本研究算法基本不存在管孔的漏分和误分问题。
表 1 各算法分割效果对比Table 1 Comparison of segmentation effects of various algorithms算法 管孔
漏分木射线
误分轴向薄壁
组织误分木纤维
误分阈值分割 是 否 否 否 分水岭 是 是 是 是 K-means聚类与阈值分割 否 是 是 否 本研究算法 否 否 否 否 3. 结论
本研究改进的K-means聚类与分水岭的管孔分割算法，解决了初始中心点的随机性，并能有效地区分管孔区域与木纤维、木射线以及轴向薄壁组织等噪声区域，对管孔分割更为准确。本研究算法采用取图像颜色直方图对应的峰值确定初始聚类中心点和色彩编码的方式，充分将管孔与绝大部分噪声区域区分开，更适合于木材横截面微观图像分割任务。通过形态学处理和分水岭算法，对管孔进行精分割，将两者结合从而得到更为准确的分割结果。与其他分割算法相比，本研究算法分割效果显著提升，在大小不一且随机分布的管孔分割过程中鲁棒性高，有效避免了管孔漏分问题，具有良好的分割性能。
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图 1 引物UBC876对所采集白及样本的ISSR-PCR扩增结果
Figure 1 Amplification results of B. striata with primer UBC876 of ISSR
图 2 引物组合Me9-Em13对所采集白及样本的SRAP-PCR扩增结果
Figure 2 Amplification results of B. striata with primer combination Me9-Em13 of SRAP
表 1 白及种源信息
Table 1. Source information of B. striata samples
编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 编号 种源地 1 浙江温州泰顺 9 云南丽江永胜 17 四川乐山沐川(2) 25 四川汶川水磨(2) 2 浙江台州天台 10 云南普洱思茅 18 四川雅安石棉 26 四川汶川水磨(3) 3 浙江衢州江山 11 云南曲靖会泽 19 四川内江东兴(1) 27 四川都江堰虹口(1) 4 浙江金华磐安 12 贵州遵义正安 20 四川内江东兴(2) 28 四川都江堰虹口(2) 5 浙江宁波象山 13 贵州黔西南安龙 21 四川内江东兴(3) 29 四川成都大邑 6 浙江杭州临安 14 贵州遵义赤水 22 四川内江东兴(4) 30 四川成都彭州(1) 7 云南红河蒙自(1) 15 贵州毕节大方 23 四川内江东兴(5) 31 四川成都彭州(2) 8 云南红河蒙自(2) 16 四川乐山沐川(1) 24 四川汶川水磨(1) 32 四川甘孜康定 
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表 2 ISSR引物信息及扩增结果
Table 2. ISSR primer information and amplification results
引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 UBC823 (TC)8C 15 12 80.00 8 UBC876 (GATA)2(GACA)2 25 25 100.00 2 UBC826 (AC)8C 18 17 94.44 9 UBC879 C(TTCAC)3 15 15 100.00 3 UBC827 (AC)8G 16 16 100.00 10 UBC880 (GGAGA)3 17 11 64.71 4 UBC842 (GA)8(C/T)G 18 18 100.00 11 UBC881 (GGGTG)3 20 20 100.00 5 UBC855 (AC)8(C/T)T 9 9 100.00 合计 188 174 6 UBC866 (CTC)6 15 12 80.00 平均 17.09 15.82 92.20 7 UBC868 (GAA)6 20 19 95.00
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表 3 SRAP引物信息及扩增结果
Table 3. SRAP primer information and amplification results
引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 引物
编号SRAP引物 正向引
物(5′→3′)反向引
物(5′→3′)扩增条
带数/条多态性条
带数/条PPB/% 1 Me1-Em12 BATA DCAT 19 17 89.47 8 Me11-Em12 BACG DCAT 18 15 83.33 2 Me3-Em2 BAAT DTGC 22 20 90.91 9 Me12-Em6 BAAA DGCA 16 16 100.00 3 Me5-Em5 BAAG DAAC 18 17 94.44 10 Me12-Em7 BAAA DCAA 17 16 94.12 4 Me6-Em2 BACT DTGC 19 16 84.21 11 Me13-Em9 BAAC DCGA 28 27 96.43 5 Me9-Em13 BACA DCTA 18 18 100.00 合计 216 202 6 Me9-Em14 BACA DCTC 19 18 94.74 平均 19.64 18.36 93.52 7 Me11-Em10 BACG DCAG 22 22 100.00 说明：B表示TGAGTCCAAACCGG；D表示GACTGCGTACGAATT
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表 4 白及的遗传多样性
Table 4. Genetic diversity of B. striata
研究方法 种源地 Na Ne H I PPB/% 浙江 1.5000 1.3215 0.1841 0.2729 50.00 ISSR 云南 1.6489 1.4042 0.2328 0.3473 64.89 贵州 1.5000 1.3176 0.1824 0.2717 50.00 四川 1.7926 1.4393 0.2607 0.3940 79.26 群体水平 1.6104 1.3707 0.2150 0.3215 61.04 物种水平 1.9255 1.4619 0.2819 0.4327 92.55 SRAP 浙江 1.5833 1.3753 0.2153 0.3191 58.33 云南 1.6713 1.4163 0.2432 0.3631 67.13 贵州 1.5000 1.3373 0.1923 0.2835 50.00 四川 1.8704 1.4891 0.2886 0.4357 87.04 群体水平 1.6563 1.4045 0.2349 0.3504 65.63 物种水平 1.9352 1.5309 0.3103 0.4667 93.52 ISSR+SRAP 浙江 1.5446 1.3503 0.2007 0.2976 54.46 云南 1.6609 1.4107 0.2384 0.3558 66.09 贵州 1.5000 1.3281 0.1877 0.2780 50.00 四川 1.8342 1.4660 0.2756 0.4163 83.42 群体水平 1.6349 1.3888 0.2256 0.3369 63.49 物种水平 1.9307 1.4988 0.2971 0.4509 93.07
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[1] CHEN Zhiyan, CHENG Lizeng, HE Yichen, et al. Extraction, characterization, utilization as wound dressing and drug delivery of Bletilla striata polysaccharide: a review [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 120: 2076 − 2085. [2] DONG Jianwei, ZHAO Lixing, CAI Le, et al. Antioxidant activities and phenolics of fermented Bletilla formosana with eight plant pathogen fungi [J]. Journal Bioscience and Bioengineering, 2014, 118(4): 396 − 399. [3] WANG Lining, HE Yongzhi, ZHAO Qiduo, et al. Phenolic compounds from Bletilla striata [J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2017, 19(10): 981 − 986. [4] DIAO Huajia, LI Xin, CHEN Jiangning, et al. Bletilla striata polysaccharide stimulates inducible nitric oxide synthase and proinflammatory cytokine expression in macrophages [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008, 105(2): 85 − 89. [5] ZHANG Guangyuan, QIAO Jin, LIU Xin, et al. Interactions of self-assembled Bletilla striata polysaccharide nanoparticles with bovine serum albumin and biodistribution of its docetaxel-loaded nanoparticles[J/OL]. Pharmaceutics, 2019, 11(1): 43[2022-09-01]. doi:10.3390/pharmaceutics11010043. [6] PRIDGEON A M, CRIBB P J, CHASE M W, et al. Genera Orchidacearum, Volume 4, Epidendroideae (Part 1)[M]. New York: Oxford University Press, 2005. [7] CHUNG M Y, CHUNG M G. Pollination biology and breeding systems in the terrestrial orchid Bletilla striata [J]. Plant Systematics and Evolution, 2005, 252: 1 − 9. [8] JIAO Jie, JIA Xiangrong, LIU Pei, et al. Species identification of polygonatirhizoma in China by both morphological and molecular marker methods [J]. Comptes Rendus Biologies, 2018, 341(2): 102 − 110. [9] MALLARD B W, TIRALONGO J. Cancer stem cell marker glycosylation: nature, function and significance [J]. Glycoconjugate Journal, 2017, 34(4): 441 − 452. [10] 聂新辉, 尤春源, 张大伟, 等. 棉花抗低温生理指标和分子标记鉴定体系研究[J]. 新疆农业科学, 2013, 50(1): 8 − 14. NIE Xinhui, YOU Chunyuan, ZHANG Dawei, et al. Study on the physiological indexes and identifiable system of molecule marker about cotton cold resistance [J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 2013, 50(1): 8 − 14. [11] HAYWARD A C, TOLLENAERE R, DALTON-MORGAN J, et al. Molecular marker applications in plants [J]. Methods in Molvcular Biology, 2015, 1245: 13 − 27. [12] HADIPOUR M, KAZEMITABAR S K, YAGHINI H, et al. Genetic diversity and species differentiation of medicinal plant persian poppy (Papaver bracteatum L. ) using AFLP and ISSR markers[J/OL]. Ecological Genetics and Genomics, 2020, 16: 100058[2021-09-01]. doi:10.1016/j.egg.2020.100058. [13] 金亮, 郭方其, 付曼曼, 等. 中药材白及分子鉴定研究进展[J/OL]. 分子植物育种, 2021-07-14[2021-09-01]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210713.1319.003.html. JIN Liang, GUO Fangqi, FU Manman, et al. Progress on molecular authentication of Bletilla striata [J/OL]. Molecular Plant Breeding, 2021-07-14[2021-09-01]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210713.1319.003.html. [14] 邢佳鑫, 陈玲, 张希, 等. SSR和ISSR法对白芨的真伪鉴定[J]. 热带农业科学, 2019, 39(10): 42 − 47. XING Jiaxin, CHEN Ling, ZHANG Xi, et al. Authenticity identification of Bletilla striata by SSR and ISSR [J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture, 2019, 39(10): 42 − 47. [15] 洪建聪, 郭艳, 翟利娜, 等. 野生白及资源遗传多样性的SRAP分析[J]. 中草药, 2019, 50(8): 1966 − 1971. HONG Jiancong, GUO Yan, ZHAI Lina, et al. Genetic diversity of wild Bletilla striata based on SRAP markers [J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2019, 50(8): 1966 − 1971. [16] 陈锦, 杨侃侃, 王志伟, 等. 利用RAPD、ISSR标记分析白芨种质资源遗传多样性的研究[J]. 中国农学通报, 2017, 33(12): 137 − 142. CHEN Jin, YANG Kankan, WANG Zhiwei, et al. Study on genetic diversity of Bletilla striata germplasm resources using RAPD and ISSR markers [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2017, 33(12): 137 − 142. [17] 孙宇龙, 侯北伟, 耿丽霞, 等. 基于SRAP标记的白芨遗传多样性和遗传结构评价[J]. 药学学报, 2016, 51(1): 147 − 152. SUN Yulong, HOU Beiwei, GENG Lixia, et al. Evaluation of genetic diversity and population structure of Bletilla striata based on SRAP markers [J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2016, 51(1): 147 − 152. [18] WANG C X, TIAN M. Callus-mediated and direct protocorm-like body formation of Bletilla striata and assessment of clonal fidelity using ISSR markers [J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2014, 36(9): 2321 − 2330. [19] FERRIOL M, PICÓ B, NUEZ F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers [J]. Theoretical and Applied of Genetics, 2003, 107(2): 271 − 82. [20] BUDAK H, SHEARMAN R C, PARMAKSIZ I, et al. Molecular characterization of Buffalograss germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers [J]. Theoretical and Applied of Genetics, 2004, 108: 328 − 334. [21] 周天华, 黎君, 丁家玺, 等. 白及种质资源及其近缘种的SSR指纹图谱研究[J]. 西北植物学报, 2017, 37(4): 673 − 681. ZHOU Tianhua, LI Jun, DING Jiaxi, et al. SSR fingerprints of Bletilla striata Rchb. f. germplasm and its relatives or congeners [J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2017, 37(4): 673 − 681. [22] 和志娇, 吕丽芬, 杨丽云, 等. 白芨种质资源遗传多样性的ISSR分析[J]. 西南农业学报, 2008, 21(4): 1081 − 1085. HE Zhijiao, LÜ Lifen, YANG Liyun, et al. Gennetic diversity of Bletilla Rchb. f. germplasms by ISSR analysis [J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2008, 21(4): 1081 − 1085. [23] 吴劲松. 白及属植物AFLP遗传多样性分析及鉴定研究[D]. 南京: 南京师范大学, 2014. WU Jinsong. Analysis and Identification of AFLP Genetic Diversity of Bletilla Rchb. f. [D]. Nanjing: Nanjing Normal University, 2014. [24] GUO Yan, ZHAI Lina, LONG Hao, et al. Genetic diversity of Bletilla striata assessed by SCoT and IRAP markers [J/OL]. Hereditas, 2018, 155: 35[2021-09-01]. doi:10.1186/s41065-018-0074-4. [25] HAMRICK J L, GODT M J W. Effects of life history traits on genetic diversity in plant species [J]. Transaction of the Royal Society of London Series B, 1996, 351: 1291 − 1298. 期刊类型引用(2)
1. 刘舜慧，王琼珺，林泽燕，杨彩媚. 基于Box-Behnken优选罗勒精油软膏剂的成型工艺研究. 甘肃中医药大学学报. 2023(01): 49-55 . 
百度学术2. 景莎莎，梁宇，胡海洋. 他莫昔芬脂质体的制备及抗肿瘤活性研究. 西北药学杂志. 2023(05): 78-83 . 百度学术其他类型引用(0)
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