下载:
-
香榧绿藻Chlorella sp.是一种附着在榧树Torreya grandis枝、叶表面的粗糙灰绿色苔状物[1]。近些年，随着香榧T. grandis ‘Merrillii’种植面积的不断扩大，香榧病害发生率也在逐年攀升。现阶段香榧绿藻病害主要依赖石硫合剂等除藻剂进行防治，效果较明显，但存在抗药性以及会对环境造成二次污染等问题[2]。为保证榧农收益并贯彻可持续发展的理念，研发设计一种新型绿色灭藻剂具有重要意义。
近几年利用植物源物质对藻类进行抑制的研究不断开展，并且植物源物质作为抑藻剂具有见效快、易控制、生态安全性高等特点[3]。大蒜油作为一种提取自大蒜Allium sativum的天然产物，主要成分是二烯丙基硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)和二烯丙基三硫化物(DATS)[4−5]。已有研究证明：大蒜油具有生物活性作用，已被应用于医学、食品、抑菌等各个领域[6−8]。有研究表明：以β-环糊精包封大蒜油纳米颗粒，能够通过控制释放来延长大蒜油的活性，但这需要很高的包封率(75%~90%)[9−10]。SALEHI等[11]研究发现：银纳米粒子和大蒜油的联合作用可有效治疗耐药性微生物菌株引起的皮肤感染。STREHLOW等[12]将大蒜油封装于乳糖形成的微球中，开发出一种用于治疗肺部疾病的微粒制剂。由此可见，科研人员通过改性包封大蒜油来改善其挥发性强、气味强烈、不溶于水等物理化学特性，但改性过程都较复杂，包封率较低[13]。因此急需一种新型的方法，在保存大蒜油的同时扩大其适用性，保证其杀菌效果的同时又弥补其易挥发等不足。微乳液恰好能够兼顾两者。微乳液是指由水、油、表面活性剂以及少量助表面活性剂自发形成的透明或半透明并带有淡蓝色光泽的热力学稳定体系，粒径为10~100 nm，具有良好的稳定性、两亲性等特点[14−15]。微乳技术解决了微胶囊化技术包埋率低的问题[16]。有研究表明：表面包埋技术能降低油品的氧化速率[17−19]。将大蒜油制备成微乳液不仅能克服诸多加工技术限制，而且在一定程度上掩盖了大蒜油的刺激性气味。另外，100 nm以下的大蒜油微乳液更有利于进一步对其进行封装和加工[20]。随着微乳液在药物制备、采油、微生物反应器、纳米颗粒合成等方面的广泛应用，大蒜油制备成微乳液将具有广阔的市场价值，这对大蒜油的推广应用具有重要意义[21−23]。
基于以上分析，本研究分析了表面活性剂和助表面活性剂与大蒜油之间的质量配比对水包油微乳液形成条件的影响以及粒径分布特征，测试了最佳条件制备的大蒜油微乳液的离心、温度、pH稳定性以及抑藻效果。
-
材料与试剂：大蒜油(江苏正大清江制药有限公司)，槐糖脂(化学纯，陕西亿康龙生物技术有限公司)，吐温80 (Tween 80，化学纯)，司盘80 (Span 80，化学纯)，丁二酸二辛酯磺酸钠(多库脂钠，化学纯)，无水乙醇(分析纯)，正丁醇(分析纯)，苏丹Ⅲ(分析纯)，亚甲基蓝(分析纯)均购自上海麦克林生化科技有限公司。香榧绿藻来自浙江农林大学林业与生物技术学院。
仪器与设备：MS104TS 型电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司)；DF-101S 型集热式磁力搅拌器(上海聚昆仪器设备有限公司)；紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技公司)；DT-300型zeta粒度分析仪(康塔仪器公司)。
-
运用相转变法制备大蒜油微乳液。按照预定比例称取一定量的表面活性剂、助表面活性剂和大蒜油混合均匀，使混合表面活性剂与大蒜油质量比为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9。在磁力搅拌器的持续搅拌下，向其中缓慢滴加水相，当体系由浑浊变为澄清时，停止滴水，记录此时各相质量百分比，以油相、水相、表面活性剂(含助表面活性剂)混合物相作为顶点，标出各临界点并连线即得大蒜油微乳区。
-
根据GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[24]，分别以槐糖脂、Tween 80、Span 80、丁二酸二辛酯磺酸钠作为表面活性剂，无水乙醇作为助表面活性剂，固定表面活性剂与助表面活性剂的质量比为1∶1。按照1.2.1的方法制备大蒜油微乳液，并对微乳液状态进行细致描述[25]。结果见表1。
表 1 不同表面活性剂对微乳液形成的影响
Table 1. Effects of different surfactants on the formation of microemulsion
表面活性剂种类 不同表面活性剂与大蒜油质量比对微乳液的影响 9∶1 8∶2 7∶3 6∶4 5∶5 4∶6 3∶7 2∶8 1∶9 槐糖脂 − =− − =− − =− − =− − =+ − =+ − =+ − =+ − Tween 80 − − − =− − =− − =− − =− − × × Span 80 =− − =+ − =++ − =× − =× − =× ++ =+ − =× + =× ++ 多库脂钠 − − + + =++ − =++ − =++ ++ + + + + 说明：澄清透明(−)；较透明(+)；浑浊(+ +)；静置分层(=)；白色浊液(×)；分层，上下层均透明(=− −)；分层，上层较透明，下层透明(=+ −)；分层，上层浑浊，下层透明(=++ − )；分层，上层白色浊液，下层透明(=× −)；分层，上层白色浊液，下层较透明(=× +)；分层，上层白色浊液，下层浑浊(=× ++)。 -
分别以丙三醇、无水乙醇、正丁醇、无水乙醇与正丁醇按质量比1∶1混合为助表面活性剂，将表面活性剂与助表面活性剂按质量比1∶1混合。按照1.2.1的方法配制大蒜油微乳液，并根据微乳区域面积选择最适助表面活性剂。
-
以Tween 80、正丁醇为助表面活性剂，比较5、25、45 ℃条件下大蒜油微乳液面积，确定最佳实验温度。
-
在单因素实验的基础上，采用L9(33)混合正交实验，选取混合表面活性剂与大蒜油质量比A(λ)、助表面活性剂与表面活性剂质量比B(Km)、制备温度C(T)为因素，大蒜油粒径为考察对象进行3因素3水平正交实验。正交实验因素水平如表2所示。
表 2 正交实验因素表
Table 2. Orthogonal experiment factor table
水平 A(λ) B(Km) C(T)/℃ 1 4∶6 1∶2 5 2 5∶5 1∶1 25 3 6∶4 2∶1 45 -
分别向已制备好的等体积大蒜油微乳液中滴入苏丹Ⅲ和亚甲基蓝溶液。亚甲基蓝为水溶性染料，苏丹Ⅲ为油溶性染料。若亚甲基蓝在微乳液中扩撒速率快，且易分散，则为水包油型(O/W)型微乳液；若苏丹Ⅲ扩散速率快，且易分散，则为油包水型(W/O型)微乳液。
-
将大蒜油微乳液在不同的转速(5000和10000 r·min−1)离心15 min，观察微乳液状态，在220 nm下测定其吸光度，并与未离心的微乳液(对照)的吸光度进行比较，按公式(1)计算透光率[26]。
$$ T = \frac{{{A_0}}}{{{A_1}}} \times 100\%。 $$ (1) 式(1)中：T为透光率(%)，A0为离心前微乳液吸光度，A1为离心后微乳液吸光度。将微乳液在不同温度条件下(−20、4、25、37、80 ℃)储存6 h，恢复室温后，在220 nm 下测定其吸光度，并与室温下微乳液的吸光度进行比较，按公式(1)计算透光率。将大蒜油微乳液加入到不同pH (1、5、9、13)溶液中，测定其在220 nm 波长下的吸光度，并与室温下微乳液吸光度作比较，按公式(1)计算透光率。
-
用20 mL二甲基亚砜配制8 g·L−1大蒜油微乳液母液，向藻液中滴入0.5、4.0 mL大蒜油微乳液母液，使溶液最终体积为100 mL，大蒜油微乳液最终质量浓度为40、320 mg·L−1，实验组3个平行，对照组滴入等量二甲基亚砜，在第4、8、12 天观察藻液颜色变化，并运用血小板计数法，记录藻细胞密度变化。抑藻率计算公式如下：
$$ R_{{\rm{I}}} = \frac{{N_{{\rm{0}}} - N_{{\rm{S}}}}}{{N_{{\rm{0}}}}} \times 100\% 。 $$ (2) 式(2)中：RI为抑制率(%)，N0为对照组藻细胞密度，NS为处理组藻细胞密度。
-
采用SPSS 26.0分析数据，并运用Origin 2018和Graphad prism 8绘制图形。
-
按照1.2.1方法制备大蒜油微乳液并绘制拟三元相图，通过观察微乳液的状态、品相和计算微乳区面积(以总面积为1计)，考察表面活性剂对大蒜油微乳液形成的影响。结合表1和图1可知：4种表面活性剂中Span 80乳化效果不理想，各比例均存在明显分层现象，并随着油相质量的增加，品相越来越浑浊，难以形成微乳液。这表明Span 80并不适合作为制备大蒜油微乳液的表面活性剂。Tween 80的微乳区面积为14.42%，乳化效果最优，在表面活性剂相与大蒜油质量比为9∶1、8∶2、7∶3时，可形成外观澄清透明的微乳液，表面活性剂相与大蒜油质量比为6∶4、5∶5、4∶6、3∶7时，仅有少量浮油形成，表面活性剂相与大蒜油质量比为2∶8、1∶9时则为白色乳浊液。槐糖脂在制备大蒜油微乳液的过程中容易出现大油滴，仅表面活性剂相与大蒜油质量比为9∶1时能够形成较好的微乳液，微乳区面积为11.23%。多库脂钠微乳区面积为12.62%，在表面活性剂相与大蒜油质量比9∶1、8∶2时能够形成品相良好的微乳液，但随着油相质量的增加，品相开始分层并出现浑浊现象，并且浮油居多。这说明在相同环境下，同等质量的Tween 80较槐糖脂、多库脂钠能够增溶更多的大蒜油，更好地形成微乳液，多余的油会以浮油形式存在于微乳液上层，形成WinsorⅠ型微乳体系[27]。
图 1 不同表面活性剂对微乳液的影响
Figure 1. Effects of different surfactants on microemulsion
-
实验发现：丙三醇作为助剂时无论如何改变表面活性剂与大蒜油质量比(Km)值，都无法形成大蒜油微乳液，其原因可能是大蒜油在丙三醇中溶解度低。由图2可知：用无水乙醇、正丁醇以及两者质量比1∶1混合作为助表面活性剂的微乳区面积分别为12.76%、15.89%、20.76%；不添加助剂的面积仅有11.46%。说明助表面活性剂的加入有明显的增溶效果。使用正丁醇作为助表面活性剂时，大蒜油微乳液均未出现分层现象。这说明正丁醇能够增溶更多质量的大蒜油(图3A)，其原因可能是正丁醇具有4个碳原子，表现出优于无水乙醇的亲水亲油性能。以质量比为1∶1混合两者作为助表面活性剂时，増溶效果最为明显，并且在质量比为6∶4、5∶5、4∶6时所形成的大蒜油微乳液品相较单独使用正丁醇的大蒜油微乳液具有更明显的丁达尔现象，这说明前者所形成的大蒜油微乳液粒径更小(图3B)。这可能是因为正丁醇具有良好的亲脂性，无水乙醇具有良好的亲水性，两者混合嵌入表面活性剂分子之间，与表面活性剂共同构成界面膜，分布在互不相溶的2种液体的接触界面上，改变界面膜的曲率，降低了界面膜张力，增加了界面流动性，促使微小液滴的形成，进而增大微乳区的面积和微乳液的稳定性[28]。
图 2 不同助剂的大蒜油微乳液拟三元相图
Figure 2. Quasi-ternary phase diagram of garlic oil microemulsion under different additives
图 3 不同体系下的大蒜油微乳液丁达尔现象
Figure 3. Tyndall phenomenon of garlic oil microemulsion under different systems
-
以Tween 80为表面活性剂，以质量比1∶1混合无水乙醇和正丁醇作为助表面活性剂，在表面活性剂与助表面活性剂质量比为1∶1条件下，探讨不同制备温度对大蒜油微乳液的影响(图4)。45和5 ℃所形成的微乳区面积分别为15.14%、13.31%，均远小于25 ℃处理下所形成的微乳区面积(20.63%)，这与前人研究结果一致[29]。因此，选择25 ℃为大蒜油微乳液的制备温度，此时可达到最大的増溶效果。
图 4 不同温度下的大蒜油微乳液拟三元相图
Figure 4. Quasi-ternary phase diagram of garlic oil microemulsion under different temperatures
-
如表3所示：以粒径为评测指标，3因素排序为A＞B＞C；以分级评分为指标，3因素排序为B＞A＞C。粒径与分级评分的最优方案均为A1B3C2，即混合表面活性剂与大蒜油质量比为4∶6，无水乙醇、正丁醇和Tween 80质量比为1∶1∶1，制备温度为25 ℃。有效粒径(d97)为20.1 nm，多分散系数(PDI)为0.144 (图5)。
表 3 正交实验结果
Table 3. Orthogonal experimental results
实验号 A(λ) B(Km) C(T)/℃ 粒径/nm 分级评分 1 1 1 1 59.3 92.5 2 2 3 3 87.2 90.1 3 1 2 3 65.5 91.7 4 2 1 2 105.2 89.4 5 3 1 3 139.6 82.4 6 1 3 2 20.1 96.3 7 3 3 1 43.0 93.7 8 3 2 2 129.2 84.8 9 2 2 1 154.7 81.4 粒径 K1 144.9 304.1 257 K2 347.1 349.4 254.4 K3 311.8 150.3 292.3 R 202.2 199.1 37.9 分级评分 K1 280.5 260.3 267.6 K2 260.9 257.9 270.5 K3 260.9 280.1 261.2 R 19.6 22.2 9.1 说明：微乳液状态分级评分：Ⅰ级. 为澄清透明黄色溶液，流动性好(91~100)；Ⅱ级. 澄清透明伴有淡蓝色光泽，流动性较好(81~90)；Ⅲ级. 半透明伴有淡蓝色光泽溶液(61~80)；Ⅳ级. 分层，乳化效果不好，有浮油(60以下)。 
图 5 A1B3C2大蒜油微乳液粒径分布
Figure 5. Particle size distribution of A1B3C2 garlic oil microemulsion
-
由图6可以明显观察到：亚甲基蓝溶液在大蒜油微乳液中均匀分布，而苏丹Ⅲ则扩散缓慢，并出现分层现象。说明制备的大蒜油微乳液为水包油型(O/W型)微乳液。
图 6 亚甲基蓝(左)和苏丹Ⅲ(右)在大蒜油微乳液中的扩散结果
Figure 6. Diffusion results of methylene blue (left) and Sudan Ⅲ (right) in garlic oil microemulsion
-
按照A1B3C2重复制备5个批次大蒜油微乳液，并在5 000和10 000 r·min−1下离心15 min，设5次重复。结果表明：对照的微乳液透光率为95.43%，5 000 r·min−1离心后微乳液的透光率为94.18%，10 000 r·min−1离心后微乳液的透光率为93.52%。这说明大蒜微乳液在高速离心后，微乳颗粒发生聚集现象，透光率有所降低，但透光率均高于90%，聚集程度较小，因此大蒜油微乳液具有较高的离心稳定性。
-
如图7A所示：在25和37 ℃下，微乳体系保持着较高的透光率。80 ℃下，大蒜油微乳液透光率低于37 ℃以及对照，并且存在极显著差异(P＜0.01)，原因可能是Tween 80中的氢键不稳定，其亲水性随温度升高而降低，造成微乳体系的稳定性降低[14]。在5 ℃处理下的大蒜油微乳液透光率有所下降，但微乳液透光率略大于90%，且与25 ℃以及室温和对照之间无明显差异(P＞0.05)，说明微乳液的稳定性较好，与−20 ℃之间存在显著差异(P＜0.05)。这表明低温条件对大蒜油微乳液的影响要小于高温条件，大蒜油微乳液更适合在常温条件下储存。
图 7 大蒜油微乳液的温度和pH稳定性
Figure 7. Temperature and pH stability of garlic oil microemulsion
-
如图7B所示：不同pH对大蒜油微乳液透光率的影响与对照组之间均不显著。其原因可能是Tween 80是非离子型表面活性剂，亲水性受酸碱浓度的影响较小，所以大蒜油微乳液的pH稳定性良好。此结果与前人研究一致[17]。
-
图8为添加不同质量浓度大蒜油微乳液后，藻液状态的变化情况。对照组第12天藻液颜色较第0 天时明显加深，表明藻液生长状态良好。添加40、320 mg·L−1大蒜油微乳液的处理组藻液颜色在第4、8、12天均呈不同程度的减退，最后发黄直至透明。如图9所示：第0 天时对照组与处理组之间无明显差异，第4、8、12天时，对照组与处理组之间均存在显著差异(P＜0.05)，第12 天时，40和320 mg·L−1处理组之间无显著差异(P＞0.05)，这说明随着培养时间的延长，低质量浓度(40 mg·L−1)与高质量浓度(320 mg·L−1)大蒜油微乳液之间的药效差异逐渐减小。第12 天时，40 mg·L−1处理组抑藻率为80.65%，320 mg·L−1处理组抑藻率为82.54%，可能是因为微乳液体系使低质量浓度大蒜油能够缓慢释放并持续作用于藻液[30−31]。
图 8 大蒜油微乳液的抑藻效果
Figure 8. Algae inhibition effect of garlic oil microemulsion
图 9 不同质量浓度大蒜油微乳液对香榧绿藻藻细胞密度的影响
Figure 9. Effects of different concentrations of garlic oil microemulsion on the algal density in Chlorella sp.
-
采用相转变法制备大蒜油微乳液，从不同表面活性剂、助表面活性剂中筛选最佳组分，确定制备大蒜油微乳液的最佳制备条件为：Tween 80/无水乙醇/正丁醇为混合表面活性剂，其中：m(Tween 80)∶m(无水乙醇)∶m(正丁醇)为1∶1∶1，混合表面活性剂与大蒜油质量比为4∶6，制备温度为25 ℃。在该条件下制备的大蒜油微乳液外观澄清透明伴有淡蓝色光泽。该体系能在常温以及较低温度下保存，透光率高，稳定性良好。320 mg·L−1大蒜油微乳液抑藻率为82.54%。
Preparation and algae inhibition of garlic oil microemulsion
-
摘要:
目的 将大蒜油加工制备成大蒜油微乳液，以期提高大蒜油的稳定性，并开发新型植物源灭藻剂。 方法 运用相转变法和拟三元图探讨表面活性剂和助表面活性剂种类以及质量比(Km)对大蒜油微乳液体系形成的影响并进行正交实验。考察了以最优条件制备的大蒜油微乳液在不同温度、不同pH以及5 000和10 000 r·min−1离心条件下的稳定性，并进行了大蒜油微乳液抑藻实验。 结果 最佳制备条件为25 ℃、以吐温80 (Tween 80)为表面活性剂，乙醇和正丁醇为助表面活性剂，三者质量比为1∶1∶1，混合表面活性剂与大蒜油质量比为4∶6。所得微乳液为黄色澄清透明状液体并伴有淡蓝色光泽，有效粒径为20.1 nm，多分散系数为0.144。320 mg·L−1大蒜油微乳液的抑藻率为82.54%。 结论 成功制备的水包油型大蒜油微乳液，稳定性良好，粒径大小合适，抑藻效果明显，有望制备成新型的灭藻剂。图9表3参31 Abstract:Objective This study aims to prepare microemulsion from garlic oil in order to improve the stability of garlic oil and develop a new type of plant-derived algaecide. Method The effects of surfactant and co-surfactant types and mass ratio (Km) on the formation of garlic oil microemulsion system were investigated by phase transition method and pseudo-ternary diagram, and orthogonal experiments were carried out. The stability of garlic oil microemulsion prepared under the optimal conditions under different temperature, pH and centrifugation conditions of 5 000 and 10 000 r·min−1 was investigated, and the algae inhibition of garlic oil microemulsion experiment was carried out. Result The optimum preparation conditions were 25 ℃, Tween 80 as surfactant, ethanol and n-butanol as co-surfactants. The mass ratio of the three was 1∶1∶1, and the mass ratio of mixed surfactant and garlic oil was 4∶6. The obtained microemulsion was yellow clear transparent liquid with light blue luster. The average particle size was 20.1 nm and the polydispersity coefficient was 0.144. The algae inhibition rate of 320 mg·L−1 garlic oil microemulsion was 82.54%. Conclusion The successfully prepared oil-in-water type garlic oil microemulsion has good stability, suitable particle size, and obvious algae inhibitory effect. It is expected to be a new algaecide. [Ch, 9 fig. 3 tab. 31 ref.] -
Key words:
- garlic oil microemulsion /
- pseudo-ternary phase diagram /
- surfactant /
- Chlorella sp.
-
Wuschel-related homeobox (WOX)是植物特有的新型转录因子，属于Homepbox (HOX)超家族，包含由60~65个氨基酸组成的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋的保守结构域。WOX家族基因分为3个独立进化支，即现代进化支(modern clade，WUS)，中间进化支(intermediate clade)和远古进化支(ancient clade)[1-3]，其中WUS是最早发现的WOX家族成员[4]。WOXs蛋白在植物胚胎形成[5]、干细胞维持[6]和花发育[7]等方面发挥重要作用。拟南芥Arabidopsis thaliana中WOX家族有15个成员，分别是AtWUS和AtWOX1~AtWOX14[4]，其中，AtWOX10、AtWOX13和AtWOX14蛋白属于远古进化分支，AtWUS和AtWOX1~7等8个蛋白质属于WUS分支，AtWOX8、AtWOX9、AtWOX11和AtWOX12蛋白属于中间进化分支。AtWUS在胚珠、花药和茎尖分生组织中表达，是维持中央分生组织的关键基因，AtWOX11和AtWOX12参与新生根器官发生，在顶端分生组织发育阶段，AtWUS参与干细胞稳态维持[8]。超表达AtWUS促进棉花Gossypium hirsutum体细胞胚胎发育和器官发生[9]。水稻Oryza sativa中，OsWOX11激活冠根的萌发和生长，过表达OsWOX11可促进雌蕊增加[10]；OsWOX3A参与水稻叶片、小穗、分蘖和侧根的发育[11]；在茎顶端分生组织和腋分生组织中OsWOX4正调控干细胞[12]。超表达WOX11 (PeWOX11a和PeWOX11b)或WOX11/12a增加转基因植株不定根数量[13-14]。在小麦Triticum aestivum中超表达TaWUS影响外花轮状器官发育，TaWOX9促进转基因拟南芥根的发育[15]。
WOXs转录因子不仅调控植物生长发育，而且参与胁迫响应。在水稻中OsWOX12A和OsWOX12B等基因的表达受干旱、寒冷和盐胁迫差异调控，超表达OsWOX11通过促进根毛生长发育提高转基因植株干旱胁迫耐受性[16-17]。84K杨树Populus alba×P. glandulosa中，干旱胁迫诱导PagWOX11/12a基因强烈表达，促进根系伸长和生物量生长，上游调控因子PagERF35激活PagWOX11/12a表达[18]，PagWOX11/12a通过调控PagCYP736A12基因表达，调节活性氧(reactive oxygen species，ROS )清除，提高杨树耐盐性[19]。
杜仲Ecommia ulmoides是杜仲科Eucommiaceae杜仲属Eucommia的落叶乔木，为中国二级保护植物，叶片、树皮和果皮中富含杜仲胶，是重要的胶用和药用经济树种，具有极高的开发利用价值[20]。杜仲叶片中含有绿原酸、黄酮类、木脂素类、环烯醚萜类、α-亚麻酸等药用成分，具有抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力等重要作用[21-22]。鉴于WOX基因在拟南芥、水稻、玉米Zea mays、杨树、油菜Brassica napus、铁皮石斛Dendrobium officinale等中的作用，推测WOX家族基因可能在杜仲叶芽的形成和激活过程中起关键作用。本研究以杜仲基因组数据为基础，对杜仲WOX家族基因进行了全基因组鉴定和生物信息学分析，基于转录组分析WOX在杜仲叶片不同发育时期以及杜仲胶形成中的表达模式，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测杜仲WOX基因(EuWOXs)在‘紫叶’杜仲‘Ziye’叶片发育中的表达水平，以期为EuWOXs功能的深入研究奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
自西北农林科技大学苗圃(陕西杨凌)，取生长正常长势一致的2年生‘紫叶’杜仲幼苗的叶芽(茎尖)、生长叶(3 cm长叶片)、幼叶(完全展开的新叶)，用液氮迅速处理，置于−80 ℃冰箱保存。
1.2 方法
1.2.1 杜仲WOX蛋白(EuWOXs)的鉴定及理化性质分析
拟南芥WOX蛋白序列下载于TAIR数据库(
https://www.arabidopsis.org/index.jsp )，根据Pfam号(PF00046)在杜仲基因组数据库中筛选出WOX家族基因候选序列，利用美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的保守结构域搜索服务(Conserved Domain Search Service，CD Search)检测蛋白质保守结构域，筛选出具有完整WOX结构域的蛋白质作为EuWOX家族成员，利用生物信息学方法[23]分析EuWOXs的理化性质。1.2.2 杜仲WOX家族基因染色体定位及系统进化分析
通过杜仲基因组数据库搜索WOX基因在染色体上的位置及每条染色体长度，利用MapGene2Chromosome v2 (
http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/ )软件绘制WOX家族基因染色体定位。利用DNAMAN进行蛋白序列比对，通过Clustal X 1.83对杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白进行多序列比对，利用MEGA 6.0邻接法(neighbor-joining)，重复次数设置为1 000次[24]，构建系统发育树，根据拟南芥同源基因对EuWOXs蛋白命名。1.2.3 EuWOXs的结构、基序及启动子分析
利用GSDS (
http://gsds.gao-lab.org/index.php )软件分析EuWOXs的内含子和外显子分布。利用MEME (http://meme-suite.org/ )软件分析EuWOXs基序，参数设置为：any number of Repetitions，maximum number of Motifs=20，minimum width≥6，and maximum width≤50。分离EuWOXs启动子(ATG)上游2 000 bp序列，利用Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/ )分析EuWOXs启动子顺式作用元件。1.2.4 EuWOXs的表达模式分析
从NCBI的Short Read Arshive (SRA)数据库中下载‘秦仲1号’‘Qinzhong No.1’叶片不同发育时期(叶芽、初生叶、幼叶、老叶)(版本号：SRP218063)[25]及高产胶杜仲品种‘秦仲2号’‘Qinzhong No.2’、低产胶杜仲品种‘小叶’‘Xiaoye’(版本号：SRP158357)[26]的转录组数据，使用每1百万个映射上的碱基中映射到外显子的每1千个碱基上的碱基个数(fragments per kilobase million，FPKM)值表示EuWOXs相对表达丰度，取对数(log2)进行统计分析，利用TBtools工具绘制基因表达图谱[27]。
使用Trizol(天根DP424)提取RNA，反转录成cDNA，通过Primer 3.0软件设计EuWOXs特异性引物(引物序列见表1)，通过Quant Studio 6(新加坡Life Technologies公司)，All-in-One SYBR Premix EX TaqTM kit(美国Gene Copoeia公司)进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应，10 μL反应体系：2× mix 5.00 μL、正向引物/反向引物各0.25 μL、cDNA 2.00 μL、ROX 0.20 μL、双蒸水2.30 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45个循环。以UBCE2为内参基因[26]，通过$2^{-\Delta \Delta C_t} $法对3次生物学重复进行数据分析。
表 1 引物序列Table 1 Primer sequences基因名 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) EuWOX1 ATGGTGGGTGACCAGCTTAG TTCTCTGGCCTTGTGGTTCT EuWOX2 ACCGTACCCCAACCTACTCC ACTTCCCGTTGGATGAAGTG EuWOX4-1 GGAACCCTACGCAAGAACAG GCGCTTCTGCTTTTGTCTCT EuWOX4-2 TAGAGCAGATCACGGCACAG CTAGGGTCGGATGTTGGAGA EuWOX5 GACGGAGCAAGTGAGAGTCC TCTCCCGTGCCTTATGATTC EuWOX11 ACTCGAGTTTTGTGGCCTGT AATTGGAGGCATCTGGATTG EuWOX13-1 GGTCTGAGGGCATGTGTTTT TTGGAGATATGGGTGGTGGT EuWOX13-2 GGGTTGTTCGTCAAGGTCAT GTTGGAATCCACCGTTGTCT UBCE2 AGTGGGTGGTGCTGTAGTCC AACTCCCGTTTCGTTTGTTG 1.2.5 EuWOXs蛋白互作关系分析
通过STRING软件(
https://string-db.org/ )上传EuWOXs蛋白质序列，利用拟南芥数据库，根据拟南芥WOXs蛋白已知互作关系，预测EuWOXs互作蛋白，通过Cytoscape 3.7.0软件对EuWOXs蛋白质互作信息进行评估和预测[28]。2. 结果与分析
2.1 杜仲WOX家族基因鉴定及其蛋白质理化性质
由表2可知：从杜仲基因组中共鉴定到8个EuWOXs，分布在8条染色体上(图1)；均含有HD保守结构域，其中EuWOX1序列最长，编码352个氨基酸，EuWOX13-2序列最短，编码191个氨基酸。EuWOXs分子量为22.12~40.36 kDa，EuWOX11等电点最小，为5.62，EuWOX4-1等电点最大，为9.04；亚细胞定位预测结果显示：EuWOXs均定位在细胞核中，均为亲水性蛋白。
表 2 EuWOXs蛋白质序列特征及亚细胞定位Table 2 Sequence characteristics and subcellular location of E. ulmoides WOX proteins基因号 基因名 拟南芥
同源基因染色体 位置 CDS长度/
bp氨基酸数/
个分子量/
kDa等电点 亚细胞
定位EUC13591-RA EuWOX1 AT3G18010.1 Super-Scaffold_235 3540694-3544292 1059 352 40.36 5.78 细胞核 EUC12552-RA EuWOX2 AT5G59340.1 Scaffold912_obj 156744-159059 810 269 30.16 8.11 细胞核 EUC15721-RA EuWOX4-1 AT1G46480.1 Super-Scaffold_242 604979-606289 618 205 23.48 9.04 细胞核 EUC21176-RA EuWOX4-2 AT1G46480.1 Scaffold272_obj 37477-39280 642 213 24.31 8.82 细胞核 EUC18832-RA EuWOX5 AT3G11260.1 Super-Scaffold_117 336319-340482 549 182 20.70 6.92 细胞核 EUC00362-RA EuWOX11 AT3G03660.1 Super-Scaffold_154 68808-70507 765 254 27.67 5.62 细胞核 EUC00756-RA EuWOX13-1 AT4G35550.1 Super-Scaffold_233 319468-325733 810 269 30.42 6.22 细胞核 EUC02503-RA EuWOX13-2 AT4G35550.1 Super-Scaffold_71 6332599-6364092 576 191 22.11 6.54 细胞核 2.2 EuWOXs的保守结构域
利用DNAMAN软件对8个EuWOXs及12个拟南芥WOXs蛋白(AtWOXs)保守结构域进行序列分析。结果(图2)显示：WOXs蛋白质HD结构域氨基酸及其分布具有显著的相似性，均包含由60个氨基酸组成的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋，螺旋较环和转角保守。谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)和脯氨酸(Pro)是螺旋Ⅰ (Helix Ⅰ)结构域的保守氨基酸，脯氨酸、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸是螺旋Ⅱ (Helix Ⅱ)结构域的保守氨基酸，相比之下，螺旋Ⅲ (Helix Ⅲ)结构域最为保守，其中保守氨基酸有天冬酰胺(N)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、谷氨酰胺、天冬酰胺和精氨酸(R)。EAR-like仅存在于EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX4-2和EuWOX5中，属于WUS，暗示EuWOXs在进化过程中具有保守性。
图 2 拟南芥和杜仲WOXs的蛋白质同源结构域序列分析Figure 2 Sequence analysis of WOX proteins homeo domain in A. thaliana and E. ulmoides2.3 不同物种WOX家族蛋白的系统发育树
对8个杜仲EuWOXs、15个拟南芥AtWOXs、18个毛果杨Populus trichocarpa WOX蛋白(PotriWOXs)、13个水稻OsWOXs、20个玉米ZmWOXs的蛋白质序列进行多重比对，构建无根系统发育树。结果如 图3所示：74个WOXs蛋白共分为3组[远古进化支、中间进化支和现代进化支(WUS)]，其中远古进化支含有12个WOXs蛋白，中间进化支含22个WOXs蛋白，现代进化支包含的蛋白数量最多，共有40个。8个EuWOXs中，EuWOX13-1和EuWOX13-2属于远古进化支，EuWOX11属于中间进化支，EuWOX1、EuWOX2、EuWOX5、EuWOX4-1和EuWOX4-2等5个蛋白质属于WUS。进化结果显示：杜仲与毛果杨亲缘关系最近。
图 3 杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白系统发育树Figure 3 WOX proteins phylogenetic trees of E. ulmoides, A. thaliana, P. trichocar, O. sativa and Z. mays2.4 EuWOXs基因结构及蛋白质的保守结构域
利用GSDS软件构建EuWOXs基因内含子-外显子结构图，结果如图4显示：EuWOXs含有1~3个内含子，EuWOX13-2、EuWOX2和EuWOX5基因含有2个外显子，EuWOX11、EuWOX13-1、EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3个外显子，EuWOX1含有4个外显子。不同进化分支基因结构差异显著，同一分支基因结构也存在差异。属于中间进化支的EuWOX11含有3个外显子，同属远古进化支的EuWOX13-1和EuWOX13-2分别含有3个和2个外显子，在WUS中，EuWOX2和EuWOX5含有2个外显子，EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3个外显子，而EuWOX1含有4个外显子。
蛋白质保守基序分析显示：EuWOXs含有10个保守基序，分别命名为Motif 1~Motif 10 (图5)，其中Motif 1和Motif 2最为保守，是WOX的核心基序，存在于所有EuWOXs中。Motif 6较为保守，存在于4个EuWOXs蛋白质(EuWOX4-2、EuWOX2、EuWOX1和EuWOX5)中。相同分支EuWOXs含有相似的保守基序，不同分支EuWOXs基序之间存在显著差异，Motif 4~Motif 10只存在于现代进化分支，Motif 3只在EuWOX13-1和EuWOX13-2蛋白质中存在。
2.5 杜仲EuWOXs启动子顺式作用元件分析
顺式作用元件分析结果(图6)显示：EuWOXs启动子中主要包括脱落酸(ABRE)和水杨酸反应元件(TCA-element)、厌氧响应元件(ARE)、光响应元件(Box 4)及玉米蛋白代谢调节元件(O2-site)。所有顺式作用元件中光响应元件最多，达77个，其中Box 4元件有26个，所占比例是34%；G-box和GT1-motif元件均有9个，占比为12%，表明EuWOXs基因表达可能与光合作用有关。EuWOXs共含有46个激素响应元件，32个胁迫响应元件，其中ABRE和ARE元件数量最多，均含有14个，所占比例分别为31%和44%，暗示EuWOXs参与杜仲激素及胁迫响应。此外EuWOXs共含有12个生长发育调控相关元件，其中O2-site有6个，占50%。
2.6 EuWOXs基因表达模式分析
利用‘秦仲1号’叶片不同发育时期转录组数据对EuWOXs基因的表达模式进行分析。结果(图7)可见：EuWOXs在叶片不同发育时期表达丰度存在显著差异，EuWOX11和EuWOX2在杜仲叶芽、初生叶、幼叶、老叶时期均不表达，EuWOX5仅在叶芽和老叶中低表达，EuWOX13-2在4个时期中的FPKM值均大于20，推测EuWOX13-2参与杜仲叶片的整个发育过程；EuWOX13-1和EuWOX4-1在叶芽中表达丰度最高，随着叶片发育表达水平逐渐降低，表明EuWOX13-1和EuWOX4-1主要在叶芽中发挥作用；EuWOX1在生长叶中表达量相对较高，其余EuWOXs基因表达丰度较低，FPKM值小于5。
图 7 EuWOXs在杜仲叶片不同发育阶段的表达模式Figure 7 Expression patterns of EuWOXs at different developmental stages in E. ulmoides leaves利用RT-qPCR检测EuWOXs在‘紫叶’杜仲叶片不同发育阶段(叶芽、生长叶、幼叶)的表达水平。结果(图8)可见：EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX5和EuWOX13-2在生长叶中表达量最高，随着叶片发育表达水平呈先升高后降低趋势，EuWOX4-2在幼叶中表达量最高，EuWOX13-1在叶芽中表达量最高，随着叶片发育，表达量逐渐降低，暗示EuWOX13-1在叶片发育的起始阶段发挥重要作用。EuWOX1、EuWOX13-1和EuWOX13-2在‘紫叶’杜仲叶片中的表达趋势与‘秦仲1号’一致。
图 8 杜仲EuWOXs基因在杜仲叶片不同发育时期的表达模式Figure 8 Expression pattern of EuWOX genes in E. ulmoides leaves at different developmental stages利用‘秦仲2号’和‘小叶’杜仲成熟叶片转录组数据检测EuWOXs的表达模式。由如图9可见：大部分EuWOXs转录水平较低，其中有6个EuWOXs基因几乎不表达，EuWOX13-2表达水平最高，FPKM值＞40，不同胶含量样品之间无显著差异，推测EuWOXs在杜仲胶形成过程中发挥作用较小。
图 9 EuWOXs在杜仲胶形成中的表达模式Figure 9 Expression patterns of EuWOX genes in the form of Eu-rubber2.7 EuWOXs蛋白互作网络预测分析
植物WOXs蛋白由多基因家族编码，蛋白质之间可能存在相互作用。利用STRING数据库，构建EuWOXs蛋白相互作用网络。图10显示：该网络包含21个节点(互作蛋白)和82条边(相互作用组合)。EuWOX4-1可与20个蛋白质互作，其中包含干细胞分化抑制因子(CLE41和CLE44)，细胞增殖和愈伤组织形成蛋白(CLV1、CLV3和ACT7)，胚胎发育相关蛋白(TPL、BBM和APM1)，维管组织发育蛋白(PXY、HB-8、ATHB-15、MOL和RUL1)，细胞程序化死亡调控因子(LOL1)，参与DNA的复制和延伸(MCM1、POLD2)以及信号转导蛋白(F14K14)，花药发育关键调控因子(RPK2)，参与DNA的复制植物发育相关转录因子GRAS(HAM3和SCL27)等，推测EuWOXs全面参与了杜仲的生长发育。
图 10 EuWOXs蛋白互作网络预测Figure 10 Prediction of interaction network between EuWOX proteins3. 讨论
WOX蛋白是植物特有的高度保守的一类转录因子，广泛参与植物的生长发育、干细胞维持、组织器官发生和形成等多种生物学过程。到目前为止，WOX家族基因已在多个物种进行了研究报道，如拟南芥中含有15个、毛果杨18个、水稻中有13个、玉米中有20个、毛竹Phyllostachys edulis 中存在27个[29]，小麦中有26个[30]、茶树Camellia sinensis中包含18个[31]，黄瓜Cucumis sativus中有11个[3]，陆地棉Gossypium hirsutum中含有38个[32]。小麦(17 Gb)[33]、玉米(2 300 Mb)[34]和毛竹(2 021 Mb)[35]基因组大于杜仲(1.2 Gb)[36]，拟南芥(164 Mb)[37]、水稻(441 Mb) [38]和毛果杨(392.3 Mb)[39]基因组小于杜仲。杜仲WOX数量低于拟南芥、毛果杨、水稻、玉米、小麦和毛竹，表明WOXs基因的丰富程度与基因组大小无关，这可能与基因重复有关。
杜仲基因组中共鉴定出8个EuWOXs，分布在8条染色体上。EuWOXs均为核定位蛋白，在现代进化支(WUS)、中间进化支和远古进化支分别含有5、1和2个成员，其系统发育模式与拟南芥、水稻、陆地棉等类似[29，31-32]。EuWOXs基因启动子中含有多种生长发育、激素响应、非生物胁迫以及光周期响应元件。在水稻中，WUS的OsWOX5和中间进化支的OsWOX11、OsWOX12A和OsWOX12B基因表达受生长素、细胞分裂素和赤霉素调节，超表达OsWOX11可提高水稻抗旱性[16-17]。细胞分裂素强烈促进苹果Malus pumila WOX1和WOX3基因表达，生长素诱导黄瓜CsWOX1b和CsWOX3基因表达[3]。在拟南芥中，生长素反应因子5 (AUXIN RESPONSE FACTOR，ARF5)上调AtWOX1和PRS (AtWOX3)基因的表达，ARF2、ARF3和ARF4抑制AtWOX1和PRS的表达[40]。OsWOX3A参与水稻器官发育、叶片横向轴伸长、颖花外稃形态发生以及分蘖和侧根发育[10]，MtWOX1的同源基因STENOFOLIA是蒺藜苜蓿Medicago truncatula叶片生长和维管组织形成的必须基因[41]，PttWOX4在杨树形成层中特异表达，PttWOX4a/b RNAi干扰后导致维管形成层宽度缩小，次生生长减弱[42]。推测EuWOXs可能在杜仲生长发育、激素和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。
WOX家族基因参与叶片发育。属于中间支的AtWOX9/STIMPY过表达导致拟南芥叶缘波浪化[43]，SlLAM1主要在番茄Solanum lycopersicum叶片、花和果实中表达，SlLAM1缺失导致叶片变窄，次生小叶数量减少[44]，超表达黄瓜CsWOX9导致转基因拟南芥角果变短，莲座叶和分枝数目增加[3]。来源于WUS的AtWOX3是拟南芥侧托叶发育的必需基因，Atwox1和Atwox3缺失突变体导致叶片和花器官变窄，影响叶片横向扩张和花瓣融合[45-46]；GhWOX9_At，GhWUSa_At和GhWUSb_Dt主要在棉花幼叶中高量表达[47]。远古进化分支中的OsWOX13在水稻叶、茎、根维管组织中表现为空间表达调控，在花和发育中的种子中是时间表达调控[48]。在杜仲中，EuWOX13-1在叶芽中表达量最高，随着叶片发育，转录水平逐渐降低，暗示EuWOX13-1主要在杜仲叶片发育的早期阶段发挥作用。EuWOX13-2在生长叶中表达量较高，在叶片发育过程中呈现先升高后降低的趋势。EuWOX13-1和EuWOX13-2是一对重复基因，其表达水平的差异可能与基因结构不同有关，也可能是EuWOX13-1和EuWOX13-2在重复后发生了功能分化。在甘蓝型油菜Brassica napus中，BnCWOX13a与BnCWOX13c互为同源基因，然而它们的表达趋势完全不同[49]，在拟南芥中，AtWOX13在初生根、侧根、雌蕊和胚发育中动态表达，而AtWOX13的直系同源基因AtWOX14只在侧根形成的早期阶段和发育的花药中特异表达[50]，由此推测EuWOX13-2可能只获得了EuWOX13-1基因的部分功能，具体功能还需要进一步研究。
-
图 2 不同助剂的大蒜油微乳液拟三元相图
Figure 2 Quasi-ternary phase diagram of garlic oil microemulsion under different additives
图 3 不同体系下的大蒜油微乳液丁达尔现象
Figure 3 Tyndall phenomenon of garlic oil microemulsion under different systems
图 4 不同温度下的大蒜油微乳液拟三元相图
Figure 4 Quasi-ternary phase diagram of garlic oil microemulsion under different temperatures
图 5 A1B3C2大蒜油微乳液粒径分布
Figure 5 Particle size distribution of A1B3C2 garlic oil microemulsion
图 6 亚甲基蓝(左)和苏丹Ⅲ(右)在大蒜油微乳液中的扩散结果
Figure 6 Diffusion results of methylene blue (left) and Sudan Ⅲ (right) in garlic oil microemulsion
图 9 不同质量浓度大蒜油微乳液对香榧绿藻藻细胞密度的影响
Figure 9 Effects of different concentrations of garlic oil microemulsion on the algal density in Chlorella sp.
表 1 不同表面活性剂对微乳液形成的影响
Table 1. Effects of different surfactants on the formation of microemulsion
表面活性剂种类 不同表面活性剂与大蒜油质量比对微乳液的影响 9∶1 8∶2 7∶3 6∶4 5∶5 4∶6 3∶7 2∶8 1∶9 槐糖脂 − =− − =− − =− − =− − =+ − =+ − =+ − =+ − Tween 80 − − − =− − =− − =− − =− − × × Span 80 =− − =+ − =++ − =× − =× − =× ++ =+ − =× + =× ++ 多库脂钠 − − + + =++ − =++ − =++ ++ + + + + 说明：澄清透明(−)；较透明(+)；浑浊(+ +)；静置分层(=)；白色浊液(×)；分层，上下层均透明(=− −)；分层，上层较透明，下层透明(=+ −)；分层，上层浑浊，下层透明(=++ − )；分层，上层白色浊液，下层透明(=× −)；分层，上层白色浊液，下层较透明(=× +)；分层，上层白色浊液，下层浑浊(=× ++)。 
下载: 导出CSV
表 2 正交实验因素表
Table 2. Orthogonal experiment factor table
水平 A(λ) B(Km) C(T)/℃ 1 4∶6 1∶2 5 2 5∶5 1∶1 25 3 6∶4 2∶1 45
下载: 导出CSV
表 3 正交实验结果
Table 3. Orthogonal experimental results
实验号 A(λ) B(Km) C(T)/℃ 粒径/nm 分级评分 1 1 1 1 59.3 92.5 2 2 3 3 87.2 90.1 3 1 2 3 65.5 91.7 4 2 1 2 105.2 89.4 5 3 1 3 139.6 82.4 6 1 3 2 20.1 96.3 7 3 3 1 43.0 93.7 8 3 2 2 129.2 84.8 9 2 2 1 154.7 81.4 粒径 K1 144.9 304.1 257 K2 347.1 349.4 254.4 K3 311.8 150.3 292.3 R 202.2 199.1 37.9 分级评分 K1 280.5 260.3 267.6 K2 260.9 257.9 270.5 K3 260.9 280.1 261.2 R 19.6 22.2 9.1 说明：微乳液状态分级评分：Ⅰ级. 为澄清透明黄色溶液，流动性好(91~100)；Ⅱ级. 澄清透明伴有淡蓝色光泽，流动性较好(81~90)；Ⅲ级. 半透明伴有淡蓝色光泽溶液(61~80)；Ⅳ级. 分层，乳化效果不好，有浮油(60以下)。
下载: 导出CSV
-
[1] 叶晓明, 钱宇汀, 叶雯, 等. 香榧绿藻的生物学特性及物种鉴定[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(4): 629 − 637. YE Xiaoming, QIAN Yuting, YE Wen, et al. Biological characteristics and species identification of Chlorella sp. with Torreya grandis ‘Merrillii’ [J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2019, 36(4): 629 − 637. [2] 吕军美, 郑文彪, 刘金龙, 等. 石硫合剂防治香榧绿藻的试验[J]. 南方林业科学, 2015, 43(3): 30 − 33. LÜ Junmei, ZHENG Wenbiao, LIU Jinlong, et al. Test of LSSS control of Chlorella [J]. South China Forestry Science, 2015, 43(3): 30 − 33. [3] XING Wei, HUANG Wenmin, LIU Guihua. Effect of excess iron and copper on physiology of aquatic plant Spirodela polyrrhiza (L. ) Schleid [J]. Environmental Toxicology, 2010, 25(2): 103 − 112. [4] CORZO-MARTÍNEZ M, CORZO N, VILLAMIEL M. Biological properties of onions and garlic [J]. Trends in Food Science &Technology, 2007, 18(12): 609 − 625. [5] EHNERT S, BRAUN K F, BUCHHOLZ A, et al. Diallyl-disulphide is the effective ingredient of garlic oil that protects primary human osteoblasts from damage due to cigarette smoke [J]. Food Chemistry, 2012, 132(2): 724 − 729. [6] BORLINGHAUS J, FOERSTER J, KAPPLER U, et al. Allicin, the odor of freshly crushed garlic: a review of recent progress in understanding allicin’s effects on cells[J/OL]. Molecules, 2021, 26(6): 1505[2022-04-10]. doi: 10.3390/molecules26061505. [7] 赵娜娜, 麦迪娜·托乎塔森, 卢若滨. 12种植物精油对两种仓储害虫熏蒸活性的研究[J]. 中国粮油学报, 2020, 35(8): 128 − 133. ZHAO Nana, Maidina Tuohutasen, LU Ruobin. Fumigant activity of 12 essential oils against Tribolium castaneum and Trogoderma variabile [J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2020, 35(8): 128 − 133. [8] ZENG Tao, ZHANG Cuili, SONG Fuyong, et al. Garlic oil alleviated ethanol-induced fat accumulation via modulation of SREBP-1, PPAR-α, and CYP2E1 [J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(3/4): 485 − 491. [9] 齐美玲, 高晶, 邵清龙. 大蒜素-β-环糊精包合物的制备及大蒜素的含量测定[J]. 北京理工大学学报, 2004, 24(7): 650 − 652. QI Meiling, GAO Jing, SHAO Qinglong. Preparation of allic in-β-cyclodextr in inclusion complex and determination of allicin by gas chromatography [J]. Transactions of Beijing Institute of Technology, 2004, 24(7): 650 − 652. [10] AYALA-ZAVALA J F, SOTO-VALDEZ H, GONZÁLEZ-LEÓN A, et al. Microencapsulation of cinnamon leaf (Cinnamomum zeylannicum) and garlic (Allium sativum) oils in β-cyclodextrin [J]. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2008, 60: 359 − 368. [11] SALEHI B, ZUCCA P, ORHAN I E, et al. Antimicrobial synergic effect of allicin and silver nanoparticles on skin infection caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus spp. [J]. Annals of Medical and Health Sciences Research, 2014, 4: 863 − 868. [12] STREHLOW B, BAKOWSKY U, PINNAPIREDDy S R, et al. A novel microparticulate formulation with allicin in situ synthesis[J/OL]. Journal of Pharmaceutics & Drug Delivery Research, 2016, 5[2022-04-10]. doi:10.4172/2325-9604.1000143. [13] SALEHI B, ZUCCA P, ORHAN I E, et al. Allicin and health: a comprehensive review [J]. Trends in Food Science &Technology, 2019, 86: 502 − 516. [14] LOURITH N, KANLAYAVATTANAKUL M, RUKTANONCHI U. Formulation and stability of Moringa oleifera oil microemulsion [J]. Soft Matter, 2016, 14(1/2/3/4): 64 − 71. [15] 田莞尔, 易有金, 李昌珠, 等. 利用微乳技术从植物油料中同步提取油脂及天然活性成分的研究进展[J]. 中国粮油学报, 2019, 34(12): 115 − 122. TIAN Waner, YI Youjin, LI Changzhu, et al. Advances in the simultaneous extraction of oils and natural active ingredients from vegetable oils by microemulsion technology [J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2019, 34(12): 115 − 122. [16] 黄国平, 温其标, 罗志刚, 等. 微乳技术在食品化学中的应用[J]. 食品科技, 2003(1): 7 − 10. HUANG Guoping, WEN Qinbiao, LUO Zhigang, et al. Microemulsions for food-chemistry applications [J]. Food Science and Technology, 2003(1): 7 − 10. [17] 闫圣坤, 万文瑜, 王庆惠, 等. 核桃油微乳液的制备及其稳定性研究[J]. 保鲜与加工, 2020, 20(5): 100 − 106. YAN Shengkun, WAN Wenyu, WANG Qinghui, et al. Preparation of walnut oil microemulsion and its stability [J]. Storage and Process, 2020, 20(5): 100 − 106. [18] 杨晨, 韩瑞, 孔凡, 等. 牡丹籽油微乳液的制备及其性质研究[J]. 中国油脂, 2021, 46(6): 59 − 64, 70. YANG Chen, HAN Rui, KONG Fan, et al. Preparation and properties of peony seed oil microemulsion [J]. China Oils and Fats, 2021, 46(6): 59 − 64, 70. [19] 蔡程晨, 朱式业, 熊武国, 等. 猕猴桃籽油微乳液的制备及货架期预测[J]. 食品与机械, 2019, 35(4): 127 − 132. CAI Chengchen, ZHU Shiye, XIONG Wuguo, et al. Preparation of kiwi fruit seed oil micro-emulsion and its shelf life prediction [J]. Food &Machinery, 2019, 35(4): 127 − 132. [20] 朱加进, 叶璐, 常成, 等. 南极磷虾油W/O型微乳液制备及稳定性研究[J]. 中国食品学报, 2017, 17(10): 80 − 87. ZHU Jiajin, YE Lu, CHANG Cheng, et al. Preparation and stability study of krill oil microemulsion [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2017, 17(10): 80 − 87. [21] ZHANG Xu, XIE Yi, XU Fen, et al. Growth of BaWO4 fishbone-like nanostructures in W/O microemulsion [J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2004, 274(1): 118 − 121. [22] KE W T, LIN S Y, HO H O, et al. Physical characterizations of microemulsion systems using tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS) as a surfactant for the oral delivery of protein drugs [J]. Journal of Controlled Release, 2005, 102(2): 489 − 507. [23] LI Xiangcun, HE Gaohong, XIAO Gongkui, et al. Synthesis and morphology control of ZnO nanostructures in microemulsions [J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2009, 333(2): 465 − 473. [24] 国家卫生健康委员会. 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准: GB2760—2014[S]. 北京: 中国标准出版社, 2014. National Health Commission. National Standard for Food SafetyStandard for Use of Food Additives: GB2760−2014[S]. Beijing: China Standard Press, 2014. [25] 丛方地, 王海风, 张媛媛, 等. 大蒜油的预乳化及分散性研究[J]. 日用化学工业, 2015, 45(9): 495 − 499. CONG Fangdi, WANG Haifeng, ZHANG Yuanyuan, et al. Study on garlic oil pre-emulsion and therefore dispersion [J]. China Surfactant Detergent &Cosmetics, 2015, 45(9): 495 − 499. [26] 季文长, 张宇航, 戴各生, 等. 大蒜油有效成分的定量和定性分析[J]. 深圳大学学报(理工版), 1989, 6(3): 47 − 50. JI Wenchang, ZHANG Yuhang, DAI Gesheng, et al. Determination Ⅱof garlic oil composition by UV and FTIR [J]. Journal of Shenzhen University (Science and Engineering), 1989, 6(3): 47 − 50. [27] 邓伶俐, 余立意, 买尔哈巴·塔西帕拉提, 等. 纳米乳液与微乳液的研究进展[J]. 中国食品学报, 2013, 13(8): 173 − 180. DENG Lili, YU Liyi, Maierhaba Taxipalati, et al. The research progress on nanoemulsionand microemulsion [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2013, 13(8): 173 − 180. [28] 郑华名. 载大蒜素微胶囊的制备及其控释性能的研究[D]. 武汉: 武汉大学, 2014. ZHENG Huangming. Preparation and Controlled Release Characterization of Allicin-load Microcapsule[D]. Wuhan: Wuhan University, 2014. [29] 肖小年, 周洁, 易孜成, 等. 大蒜油自微乳的制备及其初步稳定性[J]. 南昌大学学报(理科版), 2020, 44(1): 42 − 48. XIAO Xiaonian, ZHOU Jie, YI Zicheng, et al. Preparations and preliminary stability evaluation of garlic oil self-microemulsifying drug delivery system [J]. Journal of Nanchang University (Natural Science), 2020, 44(1): 42 − 48. [30] 崔绮嫦, 吴克刚, 莫镕弛, 等. 溶剂和微乳化的稀释效应对食用植物精油抗菌活性的影响[J]. 中国食品学报, 2020, 20(3): 195 − 203. CUI Qichang, WU Kegang, MO Rongchi, et al. Dilution effect of solvent and micro emulsification on the antibacterial activity of plant essential oils [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2020, 20(3): 195 − 203. [31] 肖小年, 盛丹梅, 周洁, 等. 大蒜油自微乳的抑菌作用[J]. 中国食品学报, 2021, 21(12): 73 − 80. XIAO Xiaonian, SHENG Danmei, ZHOU Jie, et al. Inhibitory effect of garlic oil self-microemulsion on bacteria [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2021, 21(12): 73 − 80. -
-
链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20220336
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 488
- HTML全文浏览量: 108
- PDF下载量: 32
- 被引次数: 0
