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花型花色单一、花期短、花叶均赏品种稀缺是木兰科Magnoliaceae植物杂交育种的主要问题[1]。目前有关含笑属Michelia杂交亲和性的研究较少，而了解物种间亲和性关系是培育新品种的关键。有研究认为：在含笑属远缘杂交过程中存在不亲和现象[2−3]。王亚玲等[4]则发现含笑属内种间杂交大多表现亲和，而紫花含笑M. crassipes×金叶含笑M. foveolata则不亲和，但未对不亲和原因进行探究。金叶含笑隶属木兰科含笑属，其花淡黄白色，花被片内扣形成独特花型，叶背密被红褐色柔毛，是木兰科中珍稀的花叶共赏树种，也是木兰科优良的杂交亲本材料。紫花含笑是含笑属珍稀的紫色花色植物，含笑M. figo的花被片边缘有紫色条纹。本研究通过金叶含笑与紫花含笑和含笑的杂交育种研究，以期将三者的优良性状相结合，培育出花叶共赏新品种，提高金叶含笑利用价值，丰富含笑属种质资源，并探究不亲和的原因，以期提高含笑属杂交成功率，为含笑属远缘杂交育种提供理论依据。
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金叶含笑和紫花含笑来自湖南省长沙市湖南省科技示范园，含笑来自中南林业科技大学校园。
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于2021年和2022年4—5月，收集金叶含笑、含笑、紫花含笑的花粉，置于−20 ℃的冰箱保存。在授粉前进行花粉活力测定，确保各亲本的花粉活力在60%以上。培养基配方参考柴弋霞等[5]并改良，采用固体培养基。紫花含笑花粉活力测定所用培养基的配制方法：150 g·L−1 蔗糖 + 300 mg·L−1硼酸 + 300 mg·L−1氯化钙+ 8 g·L−1琼脂；含笑花粉活力测定所用培养基的配制方法：100 g·L−1 蔗糖 + 200 mg·L−1硼酸 + 300 mg·L−1氯化钙 + 8 g·L−1琼脂；作者通过预实验已筛选出金叶含笑花粉活力测定的最适培养基为50 g·L−1蔗糖 +200 mg·L−1硼酸 + 300 mg·L−1氯化钙 + 8 g·L−1琼脂。杂交组合 (♀×♂) ：含笑×金叶含笑、紫花含笑×金叶含笑、金叶含笑×含笑、金叶含笑×紫花含笑。每个组合授粉30~34朵花。
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授粉后，在当年9—12月，采集各杂交组合的果实，统计坐果率、结籽率、单个果序上的蓇葖膨大率、种子数、单个蓇葖内含种子数、形态异常种子占比和千粒重。
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用洗涤剂将杂交种子富含油脂的外种皮搓洗掉，经质量浓度为0.3%的高锰酸钾溶液消毒30 min，再用双蒸水(ddH2O)反复清洗，随后播种，统计各杂交组合种子的出苗率。
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参考柴弋霞等[5]的方法并改良，在母本花蕾期去除花被片及雄蕊，授予父本花粉并套袋，在授粉后2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d取下雌蕊放入FAA固定液中，待固定48 h以上后，用解剖针将雌蕊从雌蕊群柄上取下，进行体积分数为50%、30%、10%乙醇和蒸馏水逐级复水，每级复水15 min。复水后将雌蕊置于1 mol·L−1 氢氧化钠溶液中，60 ℃水浴软化3 h，随后用蒸馏水重复清洗3次，用质量分数为0.1%苯胺蓝避光染色12 h。由于金叶含笑花柱从中部至子房基部均密被银灰色短绒毛，采用常规压片时花粉管会被绒毛所覆盖，很难观察到花粉管的生长情况，因此在本研究中，将授粉12 h前的花柱切下，再将授粉12 h后各时间点的子房壁沿心皮背缝线和腹缝线方向削去直至漏出胚珠，软化后使截面呈透明。将上述处理后的材料常规压片后置于莱卡(Leica)荧光倒置显微镜下观察花粉管的生长情况。
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如图1所示：授粉2 h时，仅有极少量的花粉附着在含笑柱头表面且花粉未萌发(图1A)；4、6 h时，附着在含笑柱头表面的花粉数量逐渐增多，但同样未萌发(图1B和C)；8 h时，有少量花粉开始萌发，花粉管长度为花粉粒直径的1.5~2.0倍(图1D)；10 h时，萌发的花粉数量增加，花粉管长度为花粉粒直径的2.0~3.0倍，此时花粉管无汇聚现象(图1E)；1 d时，花粉大量萌发，花粉管长度生长至花粉粒直径的3.0倍以上，花粉管出现了明显的汇聚现象(图1F)；2 d时，花粉管生长至近花柱底部，即将进入子房(图1G)；4 d时，花粉管进入子房，生长至子房1/3~1/2处(图1H)；6 d时，有少数生长较快的花粉管进入胚珠(图1I)；8 d时，大多数花粉管在此时已进入胚珠(图1J)。但同时也出现了花粉管生长异常的现象：授粉4 d时，发现花柱道细胞和间隙间堆积了大量胼胝质(图1K和L)，阻碍了花粉管生长，这一现象也在4、8 d时出现；2 d时，花粉管应汇聚成束进入花柱，但有些花粉管在柱头表面生长杂乱无章(图1M)。在8 d时发现，花粉管在柱头表面萌发，但因花粉管内部堆积胼胝质而停止生长(图1N)。
图 1 含笑×金叶含笑花粉管生长情况
Figure 1. Pollen tube growth of M. figo×M. foveolate
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如图2所示：授粉2 h时，花粉未萌发(图2A)；4 h时，柱头表面的花粉数量增多，有极少数花粉在此时开始萌发(图2B)；6 h时，花粉萌发数量逐渐增多(图2C)；在8 h时，大量花粉萌发，花粉管生长至花粉粒直径的3倍以上，此时花粉管存在汇聚的趋势但还没有开始汇聚(图2D)；授粉后1 d，花粉管已汇聚成束，生长至柱头中部(图2E)；2 d时，花粉管生长至花柱底部(图2F)；4 d时，花粉管生长至子房约1/3处(图2G)；6 d时，花粉管生长至子房1/2处(图2H)；8 d时，大多数花粉管已进入胚珠(图2I)。该组合出现以下受精前障碍：授粉1 d时，出现花粉管生长杂乱且无汇聚现象。有的花粉萌发后，花粉管朝反方向生长(图2J)；8 d时，发现有的花粉粒仍未萌发、萌发的花粉管在柱头表面彼此间交错缠绕生长，未进入柱头(图2K)；花粉管在进入胚珠后，花粉管弯曲缠绕成团，阻碍受精(图2L)；4 d时，花粉管内部和先端有胼胝质堆积而使花粉管膨大，阻碍其进一步生长(图2M)。
图 2 紫花含笑×金叶含笑花粉管生长情况
Figure 2. Pollen tube growth of M. crassipes ×M. foveolata
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如图3所示：授粉2 h时，无花粉黏附在柱头表面(图3A)；4 h时，有少量花粉黏附在柱头表面，并开始萌发，花粉管长度为花粉粒直径的2~3倍(图3B)；6 h时，萌发的花粉数量增加，花粉管生长至花粉粒直径的4倍以上，生长较快的花粉管已开始汇聚成束(图3C)；8 h时，萌发的花粉数量显著增加，花粉管有明显汇聚成束的趋势(图3D)；10 h时，花粉管汇聚成束(图3E)；12 h时，汇聚成束的花粉管生长至近柱头下部(图3F)；1 d时，成束的花粉管生长至子房上部1/3处(图3G)；2 d时，成束的花粉管开始彼此分离，生长较快者已进入胚珠(图3H)；4 d时，多数花粉管已进入胚珠(图3I)；6 d时，花粉管逐渐向下生长，进入底部的胚珠(图3J)。6 d时，极个别的柱头表面仍存在大量未萌发的花粉，少数已萌发花粉的花粉管内存在胼胝质堆积(图3K)。
图 3 金叶含笑×含笑花粉管生长情况
Figure 3. Pollen tube growth of M. foveolata×M. figo
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如图4所示：授粉2 h后，仅有极少花粉黏附在柱头表面，无花粉萌发(图4A)；4 h时，黏附的花粉数量增加，已有少量花粉萌发，花粉管生长至花粉粒直径的2~3倍，少数生长较快的花粉管生长至花粉粒直径的4倍以上(图4B)；6 h时，黏附及萌发花粉数量大幅增加，花粉管生长至花粉粒直径的4倍以上(图4C)；8 h时，花粉管有汇聚成束的趋势(图4D)；10 h时，呈汇聚趋势的花粉管数量显著增加，汇聚趋势更加明显(图4E)；12 h时，花粉管汇聚成束(图4F)；1 d时，成束的花粉管生长至子房1/3~1/2处且花粉管开始彼此分离(图4G)；2 d时，花粉管继续向下延伸(图4H)；4 d时，多数花粉管已进入胚珠(图4I)。
图 4 金叶含笑×紫花含笑花粉管生长情况
Figure 4. Pollen tube growth of M. foveolata×M. crassipes
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如表1和图5所示：金叶含笑与含笑正反交的坐果率均较高，分别为75.0%和78.8%。金叶含笑与紫花含笑正反交坐果率相差极大，正交的坐果率很高，达80.0%，而反交则极低，只有6.7%。金叶含笑×紫花含笑与金叶含笑×含笑的果实在坐果率、蓇葖膨大率与种子数上无显著差异，金叶含笑×含笑的种子较金叶含笑×紫花含笑略大而饱满。含笑×金叶含笑的坐果率显著高于紫花含笑×金叶含笑，蓇葖膨大率与种子数同样高于紫花含笑×金叶含笑。
表 1 金叶含笑在不同杂交组合中的结实情况
Table 1. Fruit and seed setting status of M. foveolata in different cross combinations
杂交组合 (♀×♂) 坐果率/% 结籽率/% 单个果序蓇葖
膨大率/%种子数/粒 单个蓇葖内
含种子数/粒形态异常
种子占比/%千粒重/g 种子萌发率/% 金叶含笑×含笑 75.0 a 50.3±13.4 a 90.5±8.8 a 300.7±79.2 a 4.8±1.1 a 9.6±5.8 a 25.1 90.6 金叶含笑×紫花含笑 80.0 a 36.6±9.6 b 87.6±7.1 a 287.5±47.9 a 4.4±0.6 a 16.1±9.2 a 21.8 78.1 含笑×金叶含笑 78.8 a 27.3±9.0 bc 49.4±15.7 b 24.1±9.7 b 1.1±0.2 b 0.0±0.0 b 107.7 87.5 紫花含笑×金叶含笑 6.7 b 18.4±1.4 c 27.3±4.6 c 13.0±1.4 b 1.1±0.0 b 0.0±0.0 b 113.3 92.9 说明：不同字母表示不同杂交组合间差异显著(P＜0.05)。 
图 5 金叶含笑各杂交组合的结实情况
Figure 5. Fruit setting of M. foveolata in different cross combinations
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于2021年和2022年9—12月采集各杂交组合的种子。含笑×金叶含笑与紫花含笑×金叶含笑的种子经低温沙藏处理后于翌年1月播种，种子在3月初至4月初开始陆续萌发。金叶含笑×含笑与金叶含笑×紫花含笑的种子属于薄皮种子，很容易因失水、氧化而失去活性，因此采用即采即播的方式，种子在翌年2月中旬陆续萌发。由表1所示：各杂交组合的种子出苗情况良好，萌发率较高，均在75.0%以上，其中最高的为紫花含笑×金叶含笑杂交组合的种子，萌发率高达92.9%。
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杂交障碍分为受精前障碍与受精后障碍。受精前障碍主要表现为：花粉在柱头上不能萌发；即使花粉在柱头表面萌发，但花粉管不能伸入柱头；花粉管可以穿过柱头在花柱中生长但生长受阻，不能进入子房到达胚囊；花粉管虽能达到胚囊，但不能完成双受精[6]。受精后障碍主要表现为受精后的合子不分裂或原胚发育异常或早期发育停止；胚乳发育异常或胚乳与胚发育不协调，最终导致胚体发育异常而降解；可获得种子但种子不能发芽或发芽后成株前夭亡或不能正常开花和结果[7]。
本研究中含笑×金叶含笑杂交的坐果率较高，达78.8%。平均每个果序上有49.4%的蓇葖膨大，当果序上有极少数蓇葖膨大时依然可以实现坐果。然而结籽率却较低，仅为27.3%，平均单个蓇葖内含种子数为1.1个，含笑的每心皮内含2枚胚珠，有近一半的胚珠没有成功受精或受精后胚发育异常。综合分析，在荧光显微观察中发现的花柱道细胞和间隙间堆积了大量胼胝质，阻碍了花粉管的生长；花粉管在柱头表面杂乱生长，导致花粉管无法汇聚成束进入花柱道，最终停止生长；花粉管内部和先端有胼胝质堆积，形成胼胝质塞，使花粉管生长受阻等障碍与结实情况，认为上述杂交障碍并不影响坐果，而是影响结籽。王亚玲[8]发现花粉管两型性在木兰科植物中广泛存在，绝大多数花粉是短花粉管型，极少数是长花粉管型，而只有长花粉管能完成受精。香港木兰M. championii的花粉大量萌发，在花柱道汇聚成束后，随着花粉管生长，越靠近胚珠的花粉管neng数量越少，仅有少数花粉管能到达胚珠。这种现象与本研究中含笑和紫花含笑的胚珠附近未见明显的花粉管分离现象相似。因此推测：可能是由于花粉的生理特性加上胼胝质阻碍花粉管进入胚珠完成受精，进而影响结籽率。也有研究发现木兰科植物存在大孢子发生和雌配子体发育异常的现象[9−11]，这会对木兰科植物结实产生影响。
金叶含笑×紫花含笑坐果率与结籽率显著高于紫花含笑×金叶含笑，可见金叶含笑作母本时表现亲和，而作父本时亲和性较差。目前已有许多学者发现杂交亲和性具有单向性[12−14]。在王亚玲[8]研究中，紫花含笑×金叶含笑的坐果率为0，判定紫花含笑和金叶含笑杂交不亲和。本研究证实该杂交组合坐果率虽然很低，但仍可以结实。产生差异的原因可能是由于王亚玲仅对7朵花进行杂交试验，样本量过少。虽然在紫花含笑×金叶含笑中出现花粉在柱头表面未萌发，花粉管在柱头表面盘旋生长，未进入柱头，花粉管内部、先端堆积胼胝质而变得膨大，生长受阻，花粉管在胚珠内弯曲缠绕成团，阻碍受精等不亲和现象，但经观察发现绝大多数金叶含笑的花粉管已到达紫花含笑胚珠部位。杨占辉等[15]在鸢尾Iris spp.杂交试验中发现鸢尾花粉在柱头表面缠绕扭曲，但对花粉管伸长影响不大，最终都可见花粉管进入胚珠。何兴波等[16]发现‘风味玫瑰’Prunus domestica × P. armeniaca ‘Fengweimeigui’自交的花粉管在胚珠附近时，花粉管先端出现团状胼胝质，阻碍花粉管进入胚珠。张赛阳等[17]发现杂交石竹Dianthus hybridus的花粉管即使可以从珠孔进入胚囊，但在珠孔附近卷曲盘绕生长，并堆积胼胝质，阻碍双受精。在紫花含笑×金叶含笑杂交1个月后，紫花含笑的雌蕊群上仅有极少数雌蕊膨大，但未落果。在2个月时大多数雌蕊的颜色由绿色转为黄色，随后脱落。当下层雌蕊脱落时会连带上层膨大的雌蕊一起脱落，果实脱落率高达93.34%。王亚玲[8]发现没有完成双受精的香港木兰雌蕊会在授粉后10 d左右开始凋落。也有学者认为：在授粉后子房生长停滞并大量落果，是胚胎发育不良引起的[18−19]。吴美娇等[20]发现百合Lilium spp.花粉管在受精前无明显障碍，但在受精和胚胎发育过程中出现不同程度的胚败育现象。综合分析，推测紫花含笑×金叶含笑杂交不亲和主要是由受精后障碍引起的，因此，需要对受精情况和胚胎发育进一步研究。
在金叶含笑×含笑与金叶含笑×紫花含笑中均存在形态异常的种子，大多数为空瘪的种子。在2个组合中形态异常种子占比分别为9.6%和16.1%，而反交则均为饱满的种子，王亚玲[8]发现：在香港木兰授粉后部分合子出现败育，如果胚乳核继续发育，最后可以形成无胚种子。同时也存在受精胚乳核败育，胚乳没有形成营养丰富的胚乳核细胞，而是形成海绵状物质。目前已有许多方法用于克服受精前障碍，如蒙导法、重复授粉法等。贺丹等[21]研究发现：延迟授粉法可以减缓甚至克服母本柱头或花柱对异源花粉萌发及花粉管生长的抑制，克服受精前障碍，提高育种效率。对于杂交胚早期败育可采用胚抢救的方法[22−23]。因此，在今后研究中可对紫花含笑×金叶含笑的杂交胚采取胚抢救的方法克服不亲和障碍。
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金叶含笑与含笑正反交均亲和，金叶含笑花粉管与含笑花柱道内的胼胝质堆积，但不影响坐果率，只对结籽率有一定影响。金叶含笑与紫花含笑表现为单向杂交亲和，金叶含笑×紫花含笑亲和性较强，紫花含笑×金叶含笑亲和性较差是由受精后障碍所引起的。
Compatibility between Michelia foveolata and two Michelia species
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摘要:
目的 探明金叶含笑Michelia foveolata与含笑M. figo和紫花含笑M. crassipes的杂交亲和性。 方法 以金叶含笑与含笑和紫花含笑作正反交授粉，于授粉2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d后，通过荧光显微镜观察花粉管的生长情况。同时展开金叶含笑与含笑和紫花含笑的正反交杂交试验，统计结实情况。 结果 ①金叶含笑与含笑正反交的坐果率分别为75.0%和78.8%；②金叶含笑×紫花含笑坐果率(80.0%)显著高于紫花含笑×金叶含笑坐果率(6.7%)；③含笑×金叶含笑花粉萌发较紫花含笑×金叶含笑晚2 h，花粉管在生长速度上无明显差异，均在8 d时进入胚珠；④以金叶含笑作母本的组合无明显杂交障碍，花粉管均在2~6 d内进入胚珠，种实发育良好；⑤含笑×金叶含笑存在花粉管在柱头表面杂乱生长、花粉管内部和先端有胼胝质堆积、花柱道细胞及间隙有大量胼胝质堆积等受精前障碍，虽不影响坐果，但对结籽有影响；⑥紫花含笑×金叶含笑存在受精前障碍和受精后障碍，受精前障碍包括花粉在柱头表面未萌发、花粉管在柱头表面盘旋生长未进入柱头、花粉管内部和先端堆积胼胝质而变得膨大，使花粉管生长受阻、花粉管在胚珠内弯曲缠绕成团，阻碍受精作用。但受精后障碍可能是影响落果的重要原因。 结论 金叶含笑与含笑正反交均表现亲和；金叶含笑×紫花含笑的亲和性程度高，紫花含笑×金叶含笑亲和性程度低。图5表1参23 Abstract:Objective This study is aimed to investigate the compatibility of Michelia foveolata with M. figo and M. crassipes. Method On the one hand, fluorescence microscope was used to observe the pollen tube growth after 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 1 d, 2 d, 4 d, 6 d and 8 d. On the other hand, the reciprocal cross test was carried out of M. foveolata with M. figo and M. crassipes respectively to calculate the fruit and seed setting status. Result (1) The fruit setting rates of the reciprocal cross of M. foveolata and M. figo were 75.0% and 78.8% respectively. (2) The fruit setting rate of M. foveolata × M. crassipes (80.0%) was significantly higher than that of M. crassipes × M. foveolata (6.7%). (3) The pollen germination of M. figo × M. foveolata was 2 h later than that of M. crasspies × M. foveolata and pollen tubes entered ovule on 8 d with no significant difference in growth rate. (4) There was no obvious hybridization barriers in the combination of M. foveolata as mother, and the pollen tube entered the ovule successively within 2 to 6 days with well developed fruit and seeds. (5) There were some pre-fertilization barriers, such as disarranged growth of pollen tube on stigma surface, callose accumulation in pollen tube, and callose accumulation in style channel cells and interstitial space and it was speculated that callose accumulation in style channel as the main cause of pre-fertilization barriers does not affect fruit setting, but has an effect on seed setting. (6) There were pre-fertilization and post-fertilization barriers in M. crassipes×M. foveolata. Pre-fertilization barriers include the failure of pollen to germinate on the stigma surface, the growth of pollen tubes in circles on the stigma surface, without entering the stigma, the expansion of pollen tubes due to the accumulation of callose inside and at the apex and the pollen tube becoming twisted and entangled within the ovule. However, post-fertilization barriers may be an important factor affecting fruit fall. Conclusion The reciprocal cross of M. foveolata and M. figo shows good compatibility with the compatibility degree of M. foveolata × M. crassipes being high, while the compatibility degree of M. crassipes×M. foveolata being low. [Ch. 5 fig. 1 tab. 23 ref.] -
Key words:
- Michelia foveolata /
- cross-compatibility /
- pollen tube /
- fruit setting rate /
- seed setting rate
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榧树Torreya grandis是红豆杉科Taxaceae榧属Torreya中国特有的植物，呈片状分布于浙江、福建、江西、湖南、安徽等省的丘陵地带[1]。榧树雌雄异株，稀同株，种内变异十分丰富[2]。香榧T. grandis ‘Merrillii’是雌性榧树的一个优良栽培类型，其结实所需花粉来自雄性榧树天然居群。然而雄株因不结实而往往遭受随意砍伐，数量大幅度减少[3]。近年来随着香榧产业的发展，人们认识到充分优质的授粉对雌株种实产量及品质影响极大，日益重视在香榧丰产造林中配置授粉雄株的作用。因此，对榧树雄株开展调查与选优是提高香榧产量及质量的重要因素之一。表型性状多样性是植物多样性最直观的反映，是衡量生物多样性的重要指标，也是了解遗传变异的重要线索[4]。在板栗Castanea mollissima[5]、樱桃Cerasus pseudocerasus[6]、椰枣Phoenix dactylifera[7]、李Prunus divaricata[8]、玉米Zea mays[9]等物种中都开展了表型性状多样性研究。榧树雌雄异株，天然杂交，且生长地理环境存在差异，使得天然群体内榧树变异十分丰富[10]。近年来对榧树的研究主要集中在病害[11]、生物学特性[12]、栽培管理技术[13]、分子标记[14]等方面。由于香榧具有极高的经济价值，研究多集中在雌性香榧上，而雄性榧树的研究鲜见报道。董雷鸣等[15]探讨榧树雄株若干性状的变异发现：叶片与雄球花各指标均有较大的变异系数，且不同来源的花粉对香榧幼果坐果率有显著影响，表明榧树雄株具有很大的选育潜力。本研究以来自5个雄性榧树天然居群的121个单株为研究材料，对叶片、雄球花等10个表型性状指标进行多样性分析，并在此基础上初选雄性榧树优株，为今后雄性榧树资源保护、授粉树配置及新品种选育提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
浙江省与安徽省是榧树主要的天然分布区。榧树目前主要生产与利用的是其种子，野生雄株天然居群除采种外受到的人为干扰较少。本研究在基本呈野生状态的雄性榧树天然居群开展，分布点分别为浙江省淳安县半夏村(淳安)、杭州市临安区洪岭村(临安)、杭州市富阳区洞桥村(富阳)、浙江嵊州市榆树村(嵊州)及安徽省黄山市呈坎村(黄山)开展。在分布点的雄性榧树林中各选取10~30株生长旺盛，彼此间距不小于50 m，无病虫害，树龄50~200 a的实生雄性榧树作为研究对象，用于试验观测与采样，同时利用全球卫星定位系统(GPS)定位采样点(表1)。各单株采集新鲜叶片即时装入加硅胶的自封袋中，带回实验室置于−80 ℃冰箱保存。各单株采集20个带雄球花的1年生幼枝，枝条底部用湿纸巾包裹后置于采样袋，带回实验室进行水培。
表 1 5个雄性榧树天然居群的地理位置及采样数Table 1 Geographic locations of five natural populations in T. grandis居群 采样数量/株 样品编号 纬度(N) 经度(E) 海拔/m 淳安 17 CA01~CA17 29°55′20″ 119°12′06″ 320~430 临安 24 LA01~LA24 29°59′30″ 119°12′32″ 305~360 富阳 24 FY01~FY24 30°05′47″ 119°38′42″ 360~410 嵊州 24 SZ01~SZ24 29°42′28″ 120°33′22″ 280~420 黄山 32 HS01~HS32 29°57′52″ 118°14′18″ 350~500 1.2 方法
1.2.1 叶片性状测定
各单株选取20个叶片，用游标卡尺测量(精确至0.01 mm)叶宽和叶长，并计算叶形指数(叶宽/叶长)；用托盘天平(PB1502-L，瑞士)称取叶质量。
1.2.2 雄球花表型性状测定
各单株随机选取30个雄球花，用游标卡尺测量雄球花横径、纵径，并计算花形指数(球花横径/纵径)，同时用托盘天平称取雄球花质量。
1.2.3 雄球花水培及散粉时间观察
各单株选取3个雄球花数量较多且长势良好的枝条插入水中，置于浙江农林大学校园，培养条件设置为温度20 ℃，湿度75%，光强400 μmol·m−2·s−1，二氧化碳摩尔分数520 μmol·mol−1，2 d更换1次水，每天定期观察并记录花枝散粉情况。当雄球花的小孢子叶松散，颜色变黄，花粉囊纵裂，部分花苞散出黄色花粉时记为始花期，直至完全散粉。大约3 d时间。
1.2.4 花粉得率测定
每个单株各选30个即将散粉(即各小孢子叶松散，花苞颜色变黄，花粉囊开始纵裂)的雄球花，置干燥玻璃培养皿中，放置在室内干燥桌面上，使雄球花自然散粉。待雄球花完全开放，抖落所有花粉，收集花粉称量，计算花粉得率。花粉得率=[花粉质量/(花粉质量+撒粉后球花质量)]×100%。
1.2.5 花粉生活力测定
在全程避光的条件下，用荧光染料反应法(fluorescein diaectate reaction，二乙酸荧光素染色)测定花粉生活力[16]。随机观测3个不同视野，统计有活力花粉(呈绿色)数量和花粉总数(绿色和黑色)。花粉生活力=(有活力花粉数量/花粉总数)×100%。
1.3 数据处理
运用Excel和SPSS 17.0对各指标进行数据统计和方差分析、t检验及相关性分析等。
2. 结果与分析
2.1 雄性榧树叶片与雄球花表型性状的差异显著性分析
方差分析表明：叶片性状的叶长在居群间有显著差异(P＜0.05)，雄球花性状的花粉得率在居群间呈极显著性差异(P＜0.01)，其他指标均无显著差异(表2)。t检验分析结果显示：在居群内单株间10个表型性状均差异极显著(P＜0.01)，表明雄性榧树表型性状的变异可能主要来源于居群内。
表 2 雄性榧树5个居群叶片与雄球花相关指标的方差分析Table 2 ANOVA in leaf- and male flower-associated parameters among five natural populations in T. grandis指标 平方和 自由度 均方 F P 指标 平方和 自由度 均方 F P 叶质量 0.000 4 0.000 0.434 0.784 球花横径 0.354 4 0.089 0.310 0.871 叶宽 0.298 4 0.075 0.792 0.533 球花纵径 2.138 4 0.543 0.421 0.793 叶长 51.915 4 12.979 2.498 0.046* 花形指数 0.010 4 0.003 0.240 0.915 叶形指数 0.002 4 0.001 0.820 0.515 花粉得率 0.170 4 0.043 4.980 0.001** 球花质量 0.001 4 0.000 0.686 0.603 花粉生活力 0.095 4 0.024 0.355 0.840 说明：*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01) 多重比较分析发现：叶长在5个居群间差异显著(P＜0.05)，5个居群中淳安居群的叶片平均最长(18.99 mm)，显著长于其他居群；嵊州与黄山居群的叶片最短，且2个居群间无显著差异；临安与富阳居群的叶片长度居中，2个居群间无显著差异(图1A)。花粉得率在5个居群间差异极显著(P＜0.01)，嵊州和富阳居群的花粉得率较高，显著高于其他居群，且2个居群间无显著差异；而淳安与临安居群花粉得率最低且无显著差异(图1B)。
图 1 雄性榧树5个居群叶长(A)和花粉得率(B)的变化Figure 1 Varieties among five natural populations in the leaf length(A) and pollen yield(B) in T. grandis数值为平均值±标准差；图柱上方不同字母表示不同居群间差异显著(P＜0.05)变异系数与性状的离散程度呈正相关，变异系数越大表明个体间的差异越大，多样性越丰富，选择的潜力就越大[17]。本研究表明：同一性状在不同居群中变异系数不同；同一居群中不同性状的变异系数也存在差异。5个雄性榧树居群间叶片的变异程度由大到小依次为叶质量、叶长、叶形指数、叶宽；雄球花的变异程度由大到小依次为花粉生活力、花粉得率、球花质量、球花纵径、球花横径、花形指数。花粉生活力的变异最为丰富，5个居群的花粉生活力为51.70%~58.51%，变异系数为39.04%~45.40%，平均值为42.36%；其次是花粉得率(31.03%~37.77%)，平均达34.13%；叶宽和球花横径变异系数较小，分别为10.82%和12.13%(表3)。
表 3 5个雄性榧树居群叶片与雄球花指标的极值与变异Table 3 Extreme values and variation in the parameters of leaves and male flowers of five natural populations in T. grandis居群 叶质量 叶宽 最大值/g 最小值/g 平均值±标准差/g 变异系数/% 最大值/mm 最小值/mm 平均值±标准差/mm 变异系数/% 淳安 0.024 0.015 0.018±0.003 14.06 3.794 2.267 2.941±0.336 11.42 临安 0.025 0.012 0.018±0.003 19.44 3.775 2.400 2.901±0.345 11.90 富阳 0.023 0.013 0.017±0.003 15.36 3.422 2.344 2.850±0.281 9.86 嵊州 0.029 0.013 0.018±0.004 20.34 3.254 2.186 2.791±0.334 11.97 黄山 0.026 0.012 0.017±0.003 16.68 3.340 2.385 2.829±0.253 8.96 居群 叶长 叶形指数 最大值/mm 最小值/mm 平均值±标准差/mm 变异系数/% 最大值 最小值 平均值±标准差 变异系数/% 淳安 22.319 16.124 18.99±1.82 9.58 0.174 0.137 0.155±0.012 7.91 临安 25.475 13.650 18.41±2.84 15.45 0.228 0.107 0.161±0.029 18.27 富阳 25.139 15.360 18.05±2.51 13.93 0.205 0.130 0.159±0.015 9.68 嵊州 22.082 13.399 17.17±2.17 12.64 0.243 0.135 0.164±0.023 13.97 黄山 20.800 14.000 17.28±1.88 10.90 0.192 0.139 0.165±0.015 9.06 居群 球花质量 球花横径 最大值/g 最小值/g 平均值±标准差/g 变异系数/% 最大值/mm 最小值/mm 平均值±标准差/mm 变异系数/% 淳安 0.071 0.038 0.056±0.010 18.71 4.883 3.267 4.288±0.440 10.26 临安 0.078 0.032 0.058±0.014 24.51 5.344 2.947 4.369±0.594 13.61 富阳 0.089 0.034 0.054±0.014 25.96 6.283 3.714 4.452±0.551 12.37 嵊州 0.093 0.033 0.052±0.016 31.49 5.975 3.589 4.321±0.542 12.54 黄山 0.089 0.033 0.053±0.014 27.06 6.147 3.640 4.330±0.514 11.86 居群 球花纵径 花形指数 最大值/mm 最小值/mm 平均值±标准差/mm 变异系数/% 最大值 最小值 平均值±标准差 变异系数/% 淳安 6.937 4.425 5.671±0.718 12.66 0.893 0.656 0.760±0.060 7.84 临安 7.890 4.166 5.988±1.100 18.37 0.872 0.555 0.740±0.090 12.11 富阳 8.555 4.768 6.121±1.016 16.59 0.928 0.602 0.736±0.088 11.91 嵊州 10.884 4.458 5.900±1.423 24.12 0.938 0.434 0.753±0.110 14.57 黄山 9.889 4.516 5.907±1.146 19.40 0.854 0.588 0.745±0.083 11.04 居群 花粉得率 花粉生活力 最大值/% 最小值/% 平均值±标准差/% 变异系数/% 最大值/% 最小值/% 平均值±标准差/% 变异系数/% 淳安 26.38 5.82 17.00±5.28 31.03 92.71 21.61 58.51±25.05 42.80 临安 32.19 8.32 17.38±6.11 35.16 97.26 19.34 51.70±21.52 41.62 富阳 45.12 11.54 23.31±8.12 34.84 92.55 16.73 52.19±22.40 42.93 嵊州 41.39 10.23 25.08±7.99 31.85 92.08 11.09 56.70±25.74 45.40 黄山 36.56 8.72 20.67±7.81 37.77 94.30 23.90 56.56±22.08 39.04 居群差异体现了居群对当地环境的不同适应状况，数值大小反映了不同居群对不同环境的适应性[18]。基于叶片的表型指标分析发现：5个天然居群的变异系数临安(16.27%)最大，其次是嵊州(14.73%)，淳安(10.74%)最小；而雄球花是嵊州(26.82%)和黄山(26.42%)的变异系数较高，淳安(19.49%)最小。本研究中榧树雄株的生殖器官花的变异系数大于营养器官叶。
2.2 雄球花散粉时间的变异
榧树雄株的散粉时间不仅与遗传有关[15]，也与地域气候、环境差异有关。榧树的雌雄花期不集中，且雄株花期比雌株早[19]，散粉时间一般在4月中旬[20]。因此在新造林中要配置适当花期的雄性授粉树，满足雌花充分受粉的要求[15]。
经温室水培雄球花枝观测统计，雄球花散粉时间在4月7−17日，散粉周期约10 d。中花型所占比例最大(47株)，占总样本数的38.84%，散粉时间在4月11−15日；晚花型比例最小(30株，24.79%)，散粉时间在4月15−17日(表4)。5个居群中，淳安、临安、黄山这3个居群的中花型偏多，分别有11、13、13株，而富阳和嵊州的早花型略多，花期为4月7−11日(表4)。
表 4 5个天然居群榧树雄株散粉期比较Table 4 Pollen availability of male flowers in T. grandis居群 花期 花期类型 株数/株 群内比例/% 居群 花期 花期类型 株数/株 群内比例/% 淳安 4月9−17日 早 2 11.76 嵊州 4月7−15日 早 17 70.84 中 11 64.71 中 5 20.83 晚 4 23.53 晚 2 8.33 临安 4月9−17日 早 6 25.00 黄山 4月7−17日 早 7 21.87 中 13 54.17 中 13 40.63 晚 5 20.83 晚 12 37.50 富阳 4月7−15日 早 12 50.00 中 5 20.83 晚 7 29.17 2.3 雄性榧树叶片表型性状间的相关性分析
叶质量、叶长与叶形指数均呈极显著负相关(P＜0.05)，而其他指标间均为显著正相关(P＜0.05)(表5)。这与董雷鸣等[15]的研究结果一致。
表 5 雄性榧树叶片各指标之间的相关系数Table 5 Correlation coefficients among indexes of leaves in male T. grandis指标 叶质量 叶宽 叶长 叶形指数 叶质量 1 叶宽 0.381** 1 叶长 0.804** 0.476** 1 叶形指数 −0.626** 0.376** −0.513** 1 说明：**表示差异极显著(P＜0.01) 球花质量与球花大小及花粉得率呈显著正相关(P＜0.05)，球花大小与花粉得率均显著正相关(P＜0.05)，花粉活力与花粉得率呈极显著正相关(P＜0.01)，而球花质量和球花纵径都与花形指数呈极显著负相关，其他指标间相关性不显著(表6)。
表 6 榧树雄球花及各指标间的相关系数Table 6 Correlation coefficients among indexes of male flowers in T. grandis指标 球花
质量球花
横径球花
纵径花形
指数花粉
得率花粉
生活力球花质量 1 球花横径 0.735** 1 球花纵径 0.788** 0.693** 1 花形指数 −0.412** −0.020 −0.701** 1 花粉得率 0.209* 0.238* 0.296* −0.164 1 花粉生活力 0.103 0.010 0.035 −0.081 0.441** 1 说明：*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01) 2.4 雄性榧树优株的初选
花粉会对植株坐果率高低、果实大小以及产量等产生直接影响[21−22]。筛选适宜的雄性优株可以提供香榧基地授粉雄株不足、香榧树体坐果率低的现状，从而促进香榧产业健康发展。营养器官叶片受环境影响较大，因而榧树可基于生殖器官的性状初选核心种质[23]。本研究主要依据榧树雄株散粉时间、花粉生活力、花粉量的多少等综合进行雄株优株的筛选。早花类型中表现较好的优株有富阳居群的雄9、嵊州居群的雄5以及黄山居群的雄23，花粉生活力分别高达92.55%、92.08%、90.01%，花粉得率也在20%以上；中花类型表现最佳的优株有临安居群的雄22、嵊州居群的雄1，花粉活力均在90%以上，花粉得率也不低；而晚花类型中，淳安居群的雄3、临安居群的雄18以及黄山居群的雄1花粉生活力分别为92.71%、92.61%、91.65%，共初选36个单株作为优良授粉树，占所有供试材料的29.75%(表7)。
表 7 雄性榧树优株的初选Table 7 Screening of male elite trees in T. grandis居群 开花类型 编号 花粉生活力/% 花粉得率/% 花形指数 淳安 早花型 CA09 65.35 26.38 0.656 中花型 CA07 76.97 21.95 0.790 CA10 82.59 21.70 0.736 CA15 87.36 19.27 0.736 CA16 85.91 15.74 0.754 晚花型 CA01 86.00 22.19 0.743 CA03 92.71 19.98 0.826 CA17 82.05 22.16 0.735 临安 早花型 LA03 66.86 18.92 0.764 中花型 LA13 87.31 32.19 0.802 LA22 97.26 20.05 0.653 晚花型 LA17 87.00 20.98 0.818 LA18 92.61 23.91 0.850 富阳 早花型 FY03 70.56 34.28 0.782 FY06 81.58 32.29 0.822 FY09 92.55 23.02 0.605 FY14 85.04 30.23 0.660 FY19 69.44 33.37 0.602 晚花型 FY01 84.07 33.24 0.671 嵊州 早花型 SZ02 89.09 34.48 0.750 SZ05 92.08 38.23 0.725 SZ13 66.39 20.71 0.730 SZ16 86.05 30.28 0.799 SZ17 82.96 25.74 0.588 SZ24 88.63 25.67 0.766 中花型 SZ01 91.53 23.79 0.859 黄山 早花型 HS21 68.89 35.01 0.754 HS23 90.01 30.98 0.764 HS28 62.25 29.76 0.607 中花型 HS13 81.59 23.91 0.751 HS15 68.19 21.01 0.745 HS18 89.42 20.76 0.797 HS19 81.83 23.92 0.850 晚花型 HS02 91.65 25.67 0.705 HS04 87.61 21.98 0.595 HS29 87.16 24.81 0.801 3. 结论与讨论
本研究发现：在居群间，叶片与雄球花的10个表型指标，只有叶长和花粉得率差异显著，而居群内，单株间10个指标均差异极显著，表明居群内的变异比居群间更加丰富。该结果与刘浩凯等[24]研究雌性榧树居群遗传多样性的结果基本一致。因此，为配置香榧授粉树的榧树雄株选育可选择优良单株。
变异系数是衡量各观测性状变异程度的一个统计指标。本研究各指标的相对极差和变异系数的变化趋势完全不同，表明榧树雄株表型性状存在丰富的表型多样性。经过长期的自然选择，不同数量性状对环境形成了不同的适应能力。相关分析表明：雄性榧树的大部分表型性状相关性达显著或极显著水平，说明这些性状在环境适应中表现出相互调节的作用。
雄性榧株以提供花粉为主要利用目的，花粉得率和花粉生活力在居群间和个体间变异大，且比较稳定，不仅有利于选择，选择结果也相对可靠。本研究显示：雄球花各指标变异系数大，球花大小与花粉得率呈显著正相关，直接影响花粉得率。因此优株初选应从花粉生活力、花粉得率及球花大小等综合考虑。基于上述指标初步筛选出36个优良雄性单株，其中8个单株的花粉生活力在90%以上。在今后的育种工作中，这些雄性优株应是优先考虑的对象。本研究所有单株的花粉得率最高值为38.23%，与董雷鸣等[15]的研究结果类似。
居群内的变异主要受遗传因素的影响，而居群间的变异则与遗传和环境2个因素相关[25]。由于榧树雄株不结果，以往人为破坏严重，部分地区的雄株资源已濒临绝迹，雌雄比例严重失调。易官美等[26]对榧树资源分布进行调查发现：雌雄株比例在江西岩泉自然保护区为4∶1，在福建建瓯玉山镇居群为29∶1；在安徽居群为19∶1；在浙江诸暨赵家镇居群为99∶1。因此，加强雄性榧树资源保护刻不容缓，需加大种质资源调查与收集力度，建立雄性榧树优株资源库。
本研究仅对雄性榧树的表型多样性进行初步研究，后续的研究将扩大居群选择的范围及居群个数，并结合分子生物学从DNA水平深入揭示雄性榧树天然居群的遗传变异特点和规律。
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图 5 金叶含笑各杂交组合的结实情况
Figure 5 Fruit setting of M. foveolata in different cross combinations
表 1 金叶含笑在不同杂交组合中的结实情况
Table 1. Fruit and seed setting status of M. foveolata in different cross combinations
杂交组合 (♀×♂) 坐果率/% 结籽率/% 单个果序蓇葖
膨大率/%种子数/粒 单个蓇葖内
含种子数/粒形态异常
种子占比/%千粒重/g 种子萌发率/% 金叶含笑×含笑 75.0 a 50.3±13.4 a 90.5±8.8 a 300.7±79.2 a 4.8±1.1 a 9.6±5.8 a 25.1 90.6 金叶含笑×紫花含笑 80.0 a 36.6±9.6 b 87.6±7.1 a 287.5±47.9 a 4.4±0.6 a 16.1±9.2 a 21.8 78.1 含笑×金叶含笑 78.8 a 27.3±9.0 bc 49.4±15.7 b 24.1±9.7 b 1.1±0.2 b 0.0±0.0 b 107.7 87.5 紫花含笑×金叶含笑 6.7 b 18.4±1.4 c 27.3±4.6 c 13.0±1.4 b 1.1±0.0 b 0.0±0.0 b 113.3 92.9 说明：不同字母表示不同杂交组合间差异显著(P＜0.05)。 
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