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花型花色单一、花期短、花叶均赏品种稀缺是木兰科Magnoliaceae植物杂交育种的主要问题[1]。目前有关含笑属Michelia杂交亲和性的研究较少，而了解物种间亲和性关系是培育新品种的关键。有研究认为：在含笑属远缘杂交过程中存在不亲和现象[2−3]。王亚玲等[4]则发现含笑属内种间杂交大多表现亲和，而紫花含笑M. crassipes×金叶含笑M. foveolata则不亲和，但未对不亲和原因进行探究。金叶含笑隶属木兰科含笑属，其花淡黄白色，花被片内扣形成独特花型，叶背密被红褐色柔毛，是木兰科中珍稀的花叶共赏树种，也是木兰科优良的杂交亲本材料。紫花含笑是含笑属珍稀的紫色花色植物，含笑M. figo的花被片边缘有紫色条纹。本研究通过金叶含笑与紫花含笑和含笑的杂交育种研究，以期将三者的优良性状相结合，培育出花叶共赏新品种，提高金叶含笑利用价值，丰富含笑属种质资源，并探究不亲和的原因，以期提高含笑属杂交成功率，为含笑属远缘杂交育种提供理论依据。
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金叶含笑和紫花含笑来自湖南省长沙市湖南省科技示范园，含笑来自中南林业科技大学校园。
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于2021年和2022年4—5月，收集金叶含笑、含笑、紫花含笑的花粉，置于−20 ℃的冰箱保存。在授粉前进行花粉活力测定，确保各亲本的花粉活力在60%以上。培养基配方参考柴弋霞等[5]并改良，采用固体培养基。紫花含笑花粉活力测定所用培养基的配制方法：150 g·L−1 蔗糖 + 300 mg·L−1硼酸 + 300 mg·L−1氯化钙+ 8 g·L−1琼脂；含笑花粉活力测定所用培养基的配制方法：100 g·L−1 蔗糖 + 200 mg·L−1硼酸 + 300 mg·L−1氯化钙 + 8 g·L−1琼脂；作者通过预实验已筛选出金叶含笑花粉活力测定的最适培养基为50 g·L−1蔗糖 +200 mg·L−1硼酸 + 300 mg·L−1氯化钙 + 8 g·L−1琼脂。杂交组合 (♀×♂) ：含笑×金叶含笑、紫花含笑×金叶含笑、金叶含笑×含笑、金叶含笑×紫花含笑。每个组合授粉30~34朵花。
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授粉后，在当年9—12月，采集各杂交组合的果实，统计坐果率、结籽率、单个果序上的蓇葖膨大率、种子数、单个蓇葖内含种子数、形态异常种子占比和千粒重。
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用洗涤剂将杂交种子富含油脂的外种皮搓洗掉，经质量浓度为0.3%的高锰酸钾溶液消毒30 min，再用双蒸水(ddH2O)反复清洗，随后播种，统计各杂交组合种子的出苗率。
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参考柴弋霞等[5]的方法并改良，在母本花蕾期去除花被片及雄蕊，授予父本花粉并套袋，在授粉后2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d取下雌蕊放入FAA固定液中，待固定48 h以上后，用解剖针将雌蕊从雌蕊群柄上取下，进行体积分数为50%、30%、10%乙醇和蒸馏水逐级复水，每级复水15 min。复水后将雌蕊置于1 mol·L−1 氢氧化钠溶液中，60 ℃水浴软化3 h，随后用蒸馏水重复清洗3次，用质量分数为0.1%苯胺蓝避光染色12 h。由于金叶含笑花柱从中部至子房基部均密被银灰色短绒毛，采用常规压片时花粉管会被绒毛所覆盖，很难观察到花粉管的生长情况，因此在本研究中，将授粉12 h前的花柱切下，再将授粉12 h后各时间点的子房壁沿心皮背缝线和腹缝线方向削去直至漏出胚珠，软化后使截面呈透明。将上述处理后的材料常规压片后置于莱卡(Leica)荧光倒置显微镜下观察花粉管的生长情况。
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如图1所示：授粉2 h时，仅有极少量的花粉附着在含笑柱头表面且花粉未萌发(图1A)；4、6 h时，附着在含笑柱头表面的花粉数量逐渐增多，但同样未萌发(图1B和C)；8 h时，有少量花粉开始萌发，花粉管长度为花粉粒直径的1.5~2.0倍(图1D)；10 h时，萌发的花粉数量增加，花粉管长度为花粉粒直径的2.0~3.0倍，此时花粉管无汇聚现象(图1E)；1 d时，花粉大量萌发，花粉管长度生长至花粉粒直径的3.0倍以上，花粉管出现了明显的汇聚现象(图1F)；2 d时，花粉管生长至近花柱底部，即将进入子房(图1G)；4 d时，花粉管进入子房，生长至子房1/3~1/2处(图1H)；6 d时，有少数生长较快的花粉管进入胚珠(图1I)；8 d时，大多数花粉管在此时已进入胚珠(图1J)。但同时也出现了花粉管生长异常的现象：授粉4 d时，发现花柱道细胞和间隙间堆积了大量胼胝质(图1K和L)，阻碍了花粉管生长，这一现象也在4、8 d时出现；2 d时，花粉管应汇聚成束进入花柱，但有些花粉管在柱头表面生长杂乱无章(图1M)。在8 d时发现，花粉管在柱头表面萌发，但因花粉管内部堆积胼胝质而停止生长(图1N)。
图 1 含笑×金叶含笑花粉管生长情况
Figure 1. Pollen tube growth of M. figo×M. foveolate
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如图2所示：授粉2 h时，花粉未萌发(图2A)；4 h时，柱头表面的花粉数量增多，有极少数花粉在此时开始萌发(图2B)；6 h时，花粉萌发数量逐渐增多(图2C)；在8 h时，大量花粉萌发，花粉管生长至花粉粒直径的3倍以上，此时花粉管存在汇聚的趋势但还没有开始汇聚(图2D)；授粉后1 d，花粉管已汇聚成束，生长至柱头中部(图2E)；2 d时，花粉管生长至花柱底部(图2F)；4 d时，花粉管生长至子房约1/3处(图2G)；6 d时，花粉管生长至子房1/2处(图2H)；8 d时，大多数花粉管已进入胚珠(图2I)。该组合出现以下受精前障碍：授粉1 d时，出现花粉管生长杂乱且无汇聚现象。有的花粉萌发后，花粉管朝反方向生长(图2J)；8 d时，发现有的花粉粒仍未萌发、萌发的花粉管在柱头表面彼此间交错缠绕生长，未进入柱头(图2K)；花粉管在进入胚珠后，花粉管弯曲缠绕成团，阻碍受精(图2L)；4 d时，花粉管内部和先端有胼胝质堆积而使花粉管膨大，阻碍其进一步生长(图2M)。
图 2 紫花含笑×金叶含笑花粉管生长情况
Figure 2. Pollen tube growth of M. crassipes ×M. foveolata
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如图3所示：授粉2 h时，无花粉黏附在柱头表面(图3A)；4 h时，有少量花粉黏附在柱头表面，并开始萌发，花粉管长度为花粉粒直径的2~3倍(图3B)；6 h时，萌发的花粉数量增加，花粉管生长至花粉粒直径的4倍以上，生长较快的花粉管已开始汇聚成束(图3C)；8 h时，萌发的花粉数量显著增加，花粉管有明显汇聚成束的趋势(图3D)；10 h时，花粉管汇聚成束(图3E)；12 h时，汇聚成束的花粉管生长至近柱头下部(图3F)；1 d时，成束的花粉管生长至子房上部1/3处(图3G)；2 d时，成束的花粉管开始彼此分离，生长较快者已进入胚珠(图3H)；4 d时，多数花粉管已进入胚珠(图3I)；6 d时，花粉管逐渐向下生长，进入底部的胚珠(图3J)。6 d时，极个别的柱头表面仍存在大量未萌发的花粉，少数已萌发花粉的花粉管内存在胼胝质堆积(图3K)。
图 3 金叶含笑×含笑花粉管生长情况
Figure 3. Pollen tube growth of M. foveolata×M. figo
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如图4所示：授粉2 h后，仅有极少花粉黏附在柱头表面，无花粉萌发(图4A)；4 h时，黏附的花粉数量增加，已有少量花粉萌发，花粉管生长至花粉粒直径的2~3倍，少数生长较快的花粉管生长至花粉粒直径的4倍以上(图4B)；6 h时，黏附及萌发花粉数量大幅增加，花粉管生长至花粉粒直径的4倍以上(图4C)；8 h时，花粉管有汇聚成束的趋势(图4D)；10 h时，呈汇聚趋势的花粉管数量显著增加，汇聚趋势更加明显(图4E)；12 h时，花粉管汇聚成束(图4F)；1 d时，成束的花粉管生长至子房1/3~1/2处且花粉管开始彼此分离(图4G)；2 d时，花粉管继续向下延伸(图4H)；4 d时，多数花粉管已进入胚珠(图4I)。
图 4 金叶含笑×紫花含笑花粉管生长情况
Figure 4. Pollen tube growth of M. foveolata×M. crassipes
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如表1和图5所示：金叶含笑与含笑正反交的坐果率均较高，分别为75.0%和78.8%。金叶含笑与紫花含笑正反交坐果率相差极大，正交的坐果率很高，达80.0%，而反交则极低，只有6.7%。金叶含笑×紫花含笑与金叶含笑×含笑的果实在坐果率、蓇葖膨大率与种子数上无显著差异，金叶含笑×含笑的种子较金叶含笑×紫花含笑略大而饱满。含笑×金叶含笑的坐果率显著高于紫花含笑×金叶含笑，蓇葖膨大率与种子数同样高于紫花含笑×金叶含笑。
表 1 金叶含笑在不同杂交组合中的结实情况
Table 1. Fruit and seed setting status of M. foveolata in different cross combinations
杂交组合 (♀×♂) 坐果率/% 结籽率/% 单个果序蓇葖
膨大率/%种子数/粒 单个蓇葖内
含种子数/粒形态异常
种子占比/%千粒重/g 种子萌发率/% 金叶含笑×含笑 75.0 a 50.3±13.4 a 90.5±8.8 a 300.7±79.2 a 4.8±1.1 a 9.6±5.8 a 25.1 90.6 金叶含笑×紫花含笑 80.0 a 36.6±9.6 b 87.6±7.1 a 287.5±47.9 a 4.4±0.6 a 16.1±9.2 a 21.8 78.1 含笑×金叶含笑 78.8 a 27.3±9.0 bc 49.4±15.7 b 24.1±9.7 b 1.1±0.2 b 0.0±0.0 b 107.7 87.5 紫花含笑×金叶含笑 6.7 b 18.4±1.4 c 27.3±4.6 c 13.0±1.4 b 1.1±0.0 b 0.0±0.0 b 113.3 92.9 说明：不同字母表示不同杂交组合间差异显著(P＜0.05)。 
图 5 金叶含笑各杂交组合的结实情况
Figure 5. Fruit setting of M. foveolata in different cross combinations
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于2021年和2022年9—12月采集各杂交组合的种子。含笑×金叶含笑与紫花含笑×金叶含笑的种子经低温沙藏处理后于翌年1月播种，种子在3月初至4月初开始陆续萌发。金叶含笑×含笑与金叶含笑×紫花含笑的种子属于薄皮种子，很容易因失水、氧化而失去活性，因此采用即采即播的方式，种子在翌年2月中旬陆续萌发。由表1所示：各杂交组合的种子出苗情况良好，萌发率较高，均在75.0%以上，其中最高的为紫花含笑×金叶含笑杂交组合的种子，萌发率高达92.9%。
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杂交障碍分为受精前障碍与受精后障碍。受精前障碍主要表现为：花粉在柱头上不能萌发；即使花粉在柱头表面萌发，但花粉管不能伸入柱头；花粉管可以穿过柱头在花柱中生长但生长受阻，不能进入子房到达胚囊；花粉管虽能达到胚囊，但不能完成双受精[6]。受精后障碍主要表现为受精后的合子不分裂或原胚发育异常或早期发育停止；胚乳发育异常或胚乳与胚发育不协调，最终导致胚体发育异常而降解；可获得种子但种子不能发芽或发芽后成株前夭亡或不能正常开花和结果[7]。
本研究中含笑×金叶含笑杂交的坐果率较高，达78.8%。平均每个果序上有49.4%的蓇葖膨大，当果序上有极少数蓇葖膨大时依然可以实现坐果。然而结籽率却较低，仅为27.3%，平均单个蓇葖内含种子数为1.1个，含笑的每心皮内含2枚胚珠，有近一半的胚珠没有成功受精或受精后胚发育异常。综合分析，在荧光显微观察中发现的花柱道细胞和间隙间堆积了大量胼胝质，阻碍了花粉管的生长；花粉管在柱头表面杂乱生长，导致花粉管无法汇聚成束进入花柱道，最终停止生长；花粉管内部和先端有胼胝质堆积，形成胼胝质塞，使花粉管生长受阻等障碍与结实情况，认为上述杂交障碍并不影响坐果，而是影响结籽。王亚玲[8]发现花粉管两型性在木兰科植物中广泛存在，绝大多数花粉是短花粉管型，极少数是长花粉管型，而只有长花粉管能完成受精。香港木兰M. championii的花粉大量萌发，在花柱道汇聚成束后，随着花粉管生长，越靠近胚珠的花粉管neng数量越少，仅有少数花粉管能到达胚珠。这种现象与本研究中含笑和紫花含笑的胚珠附近未见明显的花粉管分离现象相似。因此推测：可能是由于花粉的生理特性加上胼胝质阻碍花粉管进入胚珠完成受精，进而影响结籽率。也有研究发现木兰科植物存在大孢子发生和雌配子体发育异常的现象[9−11]，这会对木兰科植物结实产生影响。
金叶含笑×紫花含笑坐果率与结籽率显著高于紫花含笑×金叶含笑，可见金叶含笑作母本时表现亲和，而作父本时亲和性较差。目前已有许多学者发现杂交亲和性具有单向性[12−14]。在王亚玲[8]研究中，紫花含笑×金叶含笑的坐果率为0，判定紫花含笑和金叶含笑杂交不亲和。本研究证实该杂交组合坐果率虽然很低，但仍可以结实。产生差异的原因可能是由于王亚玲仅对7朵花进行杂交试验，样本量过少。虽然在紫花含笑×金叶含笑中出现花粉在柱头表面未萌发，花粉管在柱头表面盘旋生长，未进入柱头，花粉管内部、先端堆积胼胝质而变得膨大，生长受阻，花粉管在胚珠内弯曲缠绕成团，阻碍受精等不亲和现象，但经观察发现绝大多数金叶含笑的花粉管已到达紫花含笑胚珠部位。杨占辉等[15]在鸢尾Iris spp.杂交试验中发现鸢尾花粉在柱头表面缠绕扭曲，但对花粉管伸长影响不大，最终都可见花粉管进入胚珠。何兴波等[16]发现‘风味玫瑰’Prunus domestica × P. armeniaca ‘Fengweimeigui’自交的花粉管在胚珠附近时，花粉管先端出现团状胼胝质，阻碍花粉管进入胚珠。张赛阳等[17]发现杂交石竹Dianthus hybridus的花粉管即使可以从珠孔进入胚囊，但在珠孔附近卷曲盘绕生长，并堆积胼胝质，阻碍双受精。在紫花含笑×金叶含笑杂交1个月后，紫花含笑的雌蕊群上仅有极少数雌蕊膨大，但未落果。在2个月时大多数雌蕊的颜色由绿色转为黄色，随后脱落。当下层雌蕊脱落时会连带上层膨大的雌蕊一起脱落，果实脱落率高达93.34%。王亚玲[8]发现没有完成双受精的香港木兰雌蕊会在授粉后10 d左右开始凋落。也有学者认为：在授粉后子房生长停滞并大量落果，是胚胎发育不良引起的[18−19]。吴美娇等[20]发现百合Lilium spp.花粉管在受精前无明显障碍，但在受精和胚胎发育过程中出现不同程度的胚败育现象。综合分析，推测紫花含笑×金叶含笑杂交不亲和主要是由受精后障碍引起的，因此，需要对受精情况和胚胎发育进一步研究。
在金叶含笑×含笑与金叶含笑×紫花含笑中均存在形态异常的种子，大多数为空瘪的种子。在2个组合中形态异常种子占比分别为9.6%和16.1%，而反交则均为饱满的种子，王亚玲[8]发现：在香港木兰授粉后部分合子出现败育，如果胚乳核继续发育，最后可以形成无胚种子。同时也存在受精胚乳核败育，胚乳没有形成营养丰富的胚乳核细胞，而是形成海绵状物质。目前已有许多方法用于克服受精前障碍，如蒙导法、重复授粉法等。贺丹等[21]研究发现：延迟授粉法可以减缓甚至克服母本柱头或花柱对异源花粉萌发及花粉管生长的抑制，克服受精前障碍，提高育种效率。对于杂交胚早期败育可采用胚抢救的方法[22−23]。因此，在今后研究中可对紫花含笑×金叶含笑的杂交胚采取胚抢救的方法克服不亲和障碍。
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金叶含笑与含笑正反交均亲和，金叶含笑花粉管与含笑花柱道内的胼胝质堆积，但不影响坐果率，只对结籽率有一定影响。金叶含笑与紫花含笑表现为单向杂交亲和，金叶含笑×紫花含笑亲和性较强，紫花含笑×金叶含笑亲和性较差是由受精后障碍所引起的。
Compatibility between Michelia foveolata and two Michelia species
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摘要:
目的 探明金叶含笑Michelia foveolata与含笑M. figo和紫花含笑M. crassipes的杂交亲和性。 方法 以金叶含笑与含笑和紫花含笑作正反交授粉，于授粉2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d后，通过荧光显微镜观察花粉管的生长情况。同时展开金叶含笑与含笑和紫花含笑的正反交杂交试验，统计结实情况。 结果 ①金叶含笑与含笑正反交的坐果率分别为75.0%和78.8%；②金叶含笑×紫花含笑坐果率(80.0%)显著高于紫花含笑×金叶含笑坐果率(6.7%)；③含笑×金叶含笑花粉萌发较紫花含笑×金叶含笑晚2 h，花粉管在生长速度上无明显差异，均在8 d时进入胚珠；④以金叶含笑作母本的组合无明显杂交障碍，花粉管均在2~6 d内进入胚珠，种实发育良好；⑤含笑×金叶含笑存在花粉管在柱头表面杂乱生长、花粉管内部和先端有胼胝质堆积、花柱道细胞及间隙有大量胼胝质堆积等受精前障碍，虽不影响坐果，但对结籽有影响；⑥紫花含笑×金叶含笑存在受精前障碍和受精后障碍，受精前障碍包括花粉在柱头表面未萌发、花粉管在柱头表面盘旋生长未进入柱头、花粉管内部和先端堆积胼胝质而变得膨大，使花粉管生长受阻、花粉管在胚珠内弯曲缠绕成团，阻碍受精作用。但受精后障碍可能是影响落果的重要原因。 结论 金叶含笑与含笑正反交均表现亲和；金叶含笑×紫花含笑的亲和性程度高，紫花含笑×金叶含笑亲和性程度低。图5表1参23 Abstract:Objective This study is aimed to investigate the compatibility of Michelia foveolata with M. figo and M. crassipes. Method On the one hand, fluorescence microscope was used to observe the pollen tube growth after 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 1 d, 2 d, 4 d, 6 d and 8 d. On the other hand, the reciprocal cross test was carried out of M. foveolata with M. figo and M. crassipes respectively to calculate the fruit and seed setting status. Result (1) The fruit setting rates of the reciprocal cross of M. foveolata and M. figo were 75.0% and 78.8% respectively. (2) The fruit setting rate of M. foveolata × M. crassipes (80.0%) was significantly higher than that of M. crassipes × M. foveolata (6.7%). (3) The pollen germination of M. figo × M. foveolata was 2 h later than that of M. crasspies × M. foveolata and pollen tubes entered ovule on 8 d with no significant difference in growth rate. (4) There was no obvious hybridization barriers in the combination of M. foveolata as mother, and the pollen tube entered the ovule successively within 2 to 6 days with well developed fruit and seeds. (5) There were some pre-fertilization barriers, such as disarranged growth of pollen tube on stigma surface, callose accumulation in pollen tube, and callose accumulation in style channel cells and interstitial space and it was speculated that callose accumulation in style channel as the main cause of pre-fertilization barriers does not affect fruit setting, but has an effect on seed setting. (6) There were pre-fertilization and post-fertilization barriers in M. crassipes×M. foveolata. Pre-fertilization barriers include the failure of pollen to germinate on the stigma surface, the growth of pollen tubes in circles on the stigma surface, without entering the stigma, the expansion of pollen tubes due to the accumulation of callose inside and at the apex and the pollen tube becoming twisted and entangled within the ovule. However, post-fertilization barriers may be an important factor affecting fruit fall. Conclusion The reciprocal cross of M. foveolata and M. figo shows good compatibility with the compatibility degree of M. foveolata × M. crassipes being high, while the compatibility degree of M. crassipes×M. foveolata being low. [Ch. 5 fig. 1 tab. 23 ref.] -
Key words:
- Michelia foveolata /
- cross-compatibility /
- pollen tube /
- fruit setting rate /
- seed setting rate
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山麦冬Liriope spicata为百合科Liliaceae多年生草本植物，在园林绿化中多栽培于林下或林缘半阴处，掩饰裸露土壤，起到补充绿地改善不良景观的作用。山麦冬属Liriope植物只有8种，中国栽培6种，其中包含3个特有种，但山麦冬属植物分布广泛，除极寒地区及高海拔地区外，中国各省均有分布，其地理分布受人为栽培引种因素影响很大，没有特定的地理分布规律[1]。山麦冬成熟时果实表皮由绿转黑，9月结果后观果时期可长达整个冬季，且其花葶较长多矗立于叶子的上方，易于观察，具有很高的园林应用价值。目前，针对山麦冬成熟过程中呈色物质及调控基因尚未报道，但花青素合成途径在植物中是保守的，合成途径中上游合成基因是决定植物组织能否积累花青素的关键[2]，而下游修饰基因的表达常与花青素的积累一致，是加深果色花色的关键基因[3-5]。此外，花青素的积累还受转录因子的调控，其中以MYB转录因子与bHLH转录因子最为常见[6]。
用于基因表达定量分析的方法比较多，其中实时荧光定量PCR(RT-qPCR)由于定量准确、成本低且高通量，被广泛应用于基因表达水平研究。但其结果常受RNA质量、反转录效率、引物特异性、初始样品量及扩增效率等因素的影响[7-8]，需要引入1个或多个表达稳定的内参基因(reference genes, RGs)来评估目的基因的相对表达[9]。在植物学研究中，曾以肌动蛋白(actin，ACT)[10-12]、组蛋白(histone)[11]、蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PP2A)[13]、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)[12]、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme, UBC)[14-15]以及18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA，18S)[16]等基因作为内参基因。但是常见的内参基因也并非适用于任何研究，且目前还未见山麦冬内参基因的报道。鉴于此，本研究基于山麦冬转录组数据，对山麦冬果实发育中稳定表达的内参基因进行研究，为提高果色转变关键基因RT-qPCR分析的准确性提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
在浙江农林大学资源圃，选取生长环境相同，且植株生长状况良好、长势整齐的山麦冬，随机均匀采集15~20株山麦冬植株的各一簇花葶的上、中、下部分果实，基于山麦冬果实生长特性，采集山麦冬幼果期(2020年9月)及成熟期(2020年11月) 2个时期样品，果实从花葶中取下后立即存于−80 ℃冰箱备用。设置3次生物学重复。
1.2 总RNA提取及cDNA合成
使用天根离心柱型RNA试剂盒(天根生物科技有限公司)从每个时期样本中提取总RNA。采用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。总RNA的纯度和质量浓度采用NanoDrop ONE微量核酸蛋白浓度测定仪(Therm，美国)测定。总RNA样本质量浓度均高于4×10−5 ng·L−1以上，总RNA纯度[D(260)/D(280)]为1.9~2.1。cDNA的合成使用PrimerScript™ RT Master Mix cDNA (Perfect Real Time)反转录试剂盒，所有样本总RNA加入量按照3×10−5 ng·L−1稀释至同一质量浓度，cDNA置于−20 ℃冰箱保存。
1.3 候选内参基因的筛选及RT-qRCR
基于已获得的山麦冬转录组数据及京都基因与基因组百科全书(KEGG)注释，筛选了多条通路的基因作为内参基因参考库，包括参与山麦冬果实运输和分解代谢的基因(SLC36等)，参与代谢过程的基因(PP2C、MGL、PDP、G6PD等)，参与信号传导与转运的基因(AUX、GPR107、CNNM等)，参与细胞过程的基因(CFL等)，参与植物免疫的基因(Trx等)，参与遗传信息处理的基因(UGT、PP2A、EF1-α等)共1 648个，参考前人对内参基因的筛选阈值稍作修改后[11-13]，以每千个碱基转录每百万映射读取的片段(FPKM)高于5的基因(低表达的难以检测)、变异系数＜0.1、变化倍数＜0.2为筛选条件，得到前15个候选内参基因(表1)。
表 1 山麦冬15个候选的内参基因Table 1 15 candidate reference genes of L. spicata基因名 基因注释 变异
系数变化
倍数基因名 基因注释 变异
系数变化
倍数SLC36 solute carrier family 36 0.003 0.001 CFL cofilin 0.061 0.178 PP2C protein phosphatase 2C 0.007 0.019 UGT UDP-glucose: glycoprotein glucosyltransferase 0.064 0.184 Trx-1 thioredoxin 0.037 0.107 PP2A protein phosphatase 2A 0.064 0.185 MGL monoacylglycerol Lipase 0.043 0.123 EF1-α elongation factor 1-alpha 0.067 0.193 AUX auxin influx carrier 0.050 0.144 G6PD-1 glucose-6-phosphate dehydrogenase 0.068 0.197 GPR107 G protein-coupled receptor 107 0.056 0.161 G6PD-2 glucose-6-phosphate dehydrogenase 0.045 0.130 PDP pyruvate dehydrogenase phosphatase 0.058 0.169 Trx-2 thioredoxin 1 0.065 0.186 CNNM cation transport mediators 0.061 0.177 根据转录组获得的核酸序列信息，利用primer 5软件设计引物，并交由杭州有康生物技术有限公司合成(表2)。利用TB Green染料(Takara)预反应，体积20 μL，并使用LightCycler® 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(罗氏，瑞士)进行RT-qPCR。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s；60 ℃退火延伸30 s，40个循环。实验设置3次生物学重复。扩增效率(cDNA稀释浓度梯度为5−1、5−2、5−3、5−4、5−5)计算公式为E=[10(−1/K)–1]×100%，其中：E为扩增效率，K为斜率。15个候选内参基因的扩增效率为91.7%~108.0%(表2)。
表 2 15个候选内参基因的引物序列和扩增子特征Table 2 Primer sequences and amplicon characteristics of 15 candidate reference genes基因名 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 产物长度/bp 扩增效率/% 相关系数 SLC36 GTAAGTTTCGCCGAGTGCTT ACTGCAGTAGCAGACCAGTT 148 91.7 0.982 PP2C TGGGCCATGATGTTCCAGAT AGTACACGCAGTCTTCACCT 77 94.8 0.999 Trx-1 TTGTTGGCACCCACAAGTTT CATTCGTGCCACTCCAACAT 72 102.0 0.999 MGL AATGCCTTCACTGGAACAGC GCCGCCAAGTGAGTAAACAA 138 101.0 0.994 AUX TGCAGAGAAACCACCCTTCT CCGAATCCAAATCCGACCAC 99 91.7 0.949 GPR107 ACAGGTGATTGCGAACATCG CTTCGACGTCTCCTTCAACG 166 105.0 0.906 PDP GACGGAGGTCGGTTGGATTT CTGCACATGCATCATCACGA 124 96.2 0.976 CNNM GCTGCACTAACTCCAGCTTC GGCACAACTGTGGTCAACAT 86 96.8 0.999 CFL CGAGGAGAACTGCCAGAAGA GTTGGATCGGTCGCTTGTAG 153 107.0 0.992 UGT TGGAAGCATCCTCACTTGACT TGTCTTCAAATTAGGGTTAGCGA 83 93.5 0.994 PP2A GAGTCGGAGAGGTCGAAGAG GCGGAGCAATTCCTACCATC 121 99.2 0.975 EF1-α CAAGCGTCCCACTGACAAG CCAGGCTTGAGGATACCAGT 111 101.0 0.998 G6PD-1 GATGCAACAGGCCAGAAGAG AGTGCAAACAGTGCAGGAAA 104 97.9 0.996 G6PD-2 ATAACGTTGCCCTCTCCACA ATCCAACTGCAATCCAAGCC 107 108.0 0.999 Trx-2 GTGGTGCACCGTCAGTAAAC CGCTGTGGTTGATGTCTCTG 113 96.0 0.992 1.4 内参基因的稳定性分析及验证
通过4种方法分析内参基因的稳定性：ΔCt值法[17]、geNorm[18]、NormFinder[19]和BestKeeper[20]。利用Excel 2010计算4种方法对候选内参基因几何平均数的排名，综合筛选最适的内参基因。同时根据前期转录组数据筛选了10种目的基因，涵盖花青素合成通路上下游基因以及调控基因。这10种基因在转录组数据加权共表达分析中属于中枢基因，表达量高、与花青素相关性强，且在果实成熟过程中显著上调。目的基因包括C4H、CHS、MT、UFGT、MYB、bHLH，上述基因引物序列及扩增子特征见表3，最后利用SPSS 19.0与Graphpad Prism 8.0分析及作图。
表 3 10个目的基因的引物序列和扩增子特征Table 3 Primer sequences and amplicon characteristics of 10 target genes基因名 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 产物长度/bp 扩增效率/% 相关系数 C4H TCTTTGATCACGGCTTGCAG ATGAGATCGACACCGTCCTC 88 109.0 0.992 CHS-1 TGCATTGCACCAGTAGTAGC GCCCTCCTGATCTCCTCAAC 122 104.0 0.995 CHS-2 TTGTTGGCACCCACAAGTTT CATTCGTGCCACTCCAACAT 82 91.7 0.997 MT CCACCGAGAGCAAGAACAAC GGGTACACACTGGTCTCCAA 112 96.2 0.999 UFGT-1 AGCAAGGTGTTGAAGGAGGA AAATTCCGAACCGAGCTTCC 110 91.7 0.935 UFGT-2 CGACGGATCCCATTCGACTA CGCCGCTCCTCCTATTAAC 57 92.9 0.996 MYB-1 GCAAGATCAGGTCCTCCTCA CAAAGTACGTGGCGAAGGAG 162 107.0 0.975 MYB-2 ATGGGAAGATGGTGGCCTTT GAAGGGTGCACAGCTTCAG 70 91.7 0.986 MYB-3 CGAGGAGAACTGCCAGAAGA GGTGCTTGTTGAGAGAGCTG 172 105.0 0.996 bHLH TGCTTAGCAATGGCAACAGG GGCTGCTGACCAGAAGATTG 123 101.0 0.998 2. 结果与分析
2.1 山麦冬候选内参基因的表达量分析
15个候选内参基因的溶解曲线均为单一峰(图1)，琼脂糖凝胶电泳检测后出现与预期大小一致的单一条带(图2)。该结果表明引物具有良好的特异性。
图 2 15个候选内参基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Figure 2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of the fifteen reference genes根据原始循环阈值(Ct)分布发现：所有候选内参基因的Ct为15.53~28.81，Ct越高，基因的表达量越低，反之表达量越高。本研究中，EF1-α基因表达量最高，PP2C基因表达量最低，其余基因表达量介于两者之间。此外，由箱线图(图3)跨度可初步判定内参基因的稳定性。PP2C、Trx-1、AUX、PP2A、PDP基因的Ct跨度广，不稳定，而GPR107、CNNM、EF1-α、G6PD-2、Trx-2基因最为稳定，其中GPR107、CNNM、G6PD-2基因的Ct中位数与平均数接近，即上述基因相对表达量离散程度低，表达更稳定。然而对原始Ct分析内参基因稳定性的不足，还需引入其他的方法。
2.2 内参基因的稳定性分析
利用ΔCt法、geNorm、NormFider和BestKeeper对15个候选内参基因的稳定性进行分析(表4)。
表 4 4种方法评价15个候选内参基因表达的稳定性Table 4 Expression stability of 15 candidate reference genes evaluated by 4 methods内参基因 ΔCt geNrom NormFinder Beatkeeper 标准差 基因平均表达值 基因稳定值 标准差 变异系数 相关系数 SLC36 2.632 0.854 0.173 0.569 2.523 0.671 PP2C 2.321 0.927 0.416 0.828 3.070 0.824 Trx-1 2.663 1.130 0.510 0.852 3.964 0.832 MGL 2.673 1.007 0.493 0.885 3.918 0.918 AUX 2.652 1.094 0.598 1.063 4.430 0.882 GPR107 2.617 0.817 0.167 0.489 2.253 0.728 PDP 2.737 1.390 0.831 0.642 2.571 0.462 CNNM 2.615 0.847 0.157 0.468 2.015 0.721 CFL 2.274 1.094 0.346 0.532 3.038 0.781 UGT 2.613 0.923 0.237 0.517 2.418 0.651 PP2A 2.693 1.054 0.568 1.057 4.671 0.511 EF1-α 2.127 0.895 0.286 0.393 2.347 0.687 G6PD-1 2.763 1.204 0.692 0.469 2.065 0.009 G6PD-2 2.636 0.880 0.334 0.290 1.323 0.750 Trx-2 2.663 0.989 0.465 0.417 1.790 0.487 ΔCt法是在原始Ct值的基础上，计算每个基因所有样本与其他基因的Ct值之差，并计算其标准差。一般平均标准差越低，基因稳定性越高。该方法中，EF1-α、PP2C、CFL、CNNM是山麦冬果实发育阶段最稳定的内参基因；PDP、G6PD-1、PP2A是最不稳定的内参基因。
geNorm软件通过平均表达值来描述候选内参基因的稳定性，同时还能计算归一化因子之间的两两变异(Vn/n+1，其中n为可使RT-qPCR结果准确的最少基因数目)。该方法中，所有基因的平均表达值都在1.5以下(稳定内参基因的临界值)，即该方法判定下的所有基因都可作为内参基因，其中GPR107(0.817)与CNNM(0.847)基因的平均表达值最低，说明最稳定。同时PDP、G6PD-1基因的平均表达值最高，分别为1.390、1.204，最不稳定，这与ΔCt法判定结果一致。此外，利用geNorm计算2个归一化基因的Vn/n+1，确定适合量化果实生长过程的最优内参基因数目。geNorm首先计算2个最稳定的候选内参基因的归一化因子值，然后将剩余候选内参基因按其表达稳定性下降的顺序依次相加。如果基因之间的Vn/n+1大于或等于0.15，则进行RT-qPCR分析时应该再添加1个基因才能达到可靠的结果，一旦Vn/n+1低于0.15，就不需要添加额外的基因[21]。由图4可见：从V4/5开始Vn/n+1小于0.15，即需要使用4个内参基因才能得到可靠的RT-qPCR结果。
图 4 精确归一化的最佳内参基因数量Figure 4 Optimal number of control genes for accurate normalizationNormFinder软件可分析候选内参基因的两两变异性，其中稳定值越小，候选内参基因越稳定。CNNM与GPR107基因的稳定值最小，分别为0.157、0.167，即CNNM与GPR107基因最稳定，这与geNorm分析结果一致；此外，对最差的内参基因评价也与上述2种方法一致：PDP、G6PD-1、AUX是量化果实发育阶段最不适合的内参基因。
Bestkeeper与geNorm、NormFinder软件不同，需导入原始Ct值平均数，计算候选内参基因在所有样品中的标准差、变异系数、相关系数。一般地，稳定的内参基因拥有低的标准差、变异系数及高的相关系数。在Bestkeeper评价中，与geNorm、NormFinder分析结果一致，CNNM与PDP基因分别还是最稳定与最不稳定的内参基因。除此之外，还发现G6PD-2为该方法中最稳定的内参基因，其标准差与变异系数最低，分别为0.290、1.323，相关系数为0.750。
最后通过几何平均数对这4种方法的分析结果进行综合性排序(表5)。根据表5的排名与geNorm推荐的内参基因数目，筛选CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2作为标准化山麦冬果实RT-qPCR的最优内参组合，PDP为最差内参基因，通过4种算法得出的结果也与最初候选内参基因原始Ct值分布箱线图分析结果一致。
表 5 15个候选内参基因的综合排名Table 5 Comprehensive ranking of reference genes for normalization基因名 几何平均数 排名 基因名 几何平均数 排名 CNNM 2.340 1 PP2C 6.557 9 GPR107 2.913 2 MGL 8.572 10 EF1-α 3.162 3 AUX 10.602 11 G6PD-2 3.722 4 Trx-1 11.199 12 SLC36 5.350 5 G6PD-1 11.977 13 UGT 5.826 6 PP2A 12.368 14 CFL 5.925 7 PDP 14.491 15 Trx-2 6.160 8 2.3 内参基因稳定性的验证
为验证内参基因的有效性，选择10种花青素合成结构基因与调控基因作为目的基因。用单一内参基因：最优内参(CNNM)、最差内参(PDP)，及2种内参组合：排名前2位的内参基因(CNNM、GPR107)和排名前4位的内参基因(CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2)进行归一化。从图5可见：在山麦冬果实花青素合成过程中，使用4种内参方式归一化时，所有的目的基因都上调表达，但变化倍数稍有不同。在山麦冬果实成熟期，使用PDP基因作为内参时，所有目的基因相对表达量均显著高于其他3类，特别是对转录因子bHLH基因的量化时产生严重偏差，使用PDP基因与CNNM+GPR107+EF1-α+G6PD-2基因组合作为内参，bHLH基因的相对表达量分别为6.28与15.70，两者差异高达2.5倍。然而，当使用最优内参基因CNNM进行标准化时，除UFGT基因外，CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2内参组合无显著差异，使用CNNM基因标准化时，UFGT相较幼果期上调表达50.71倍，使用4种内参组合时，UFGT上调72.49倍。此外，本研究还分析了候选内参排名前2位的基因(CNNM、GPR107)作为目的基因的表达量，发现选用2种内参基因与geNorm软件推荐使用4种内参基因，在10个目的基因中均无显著差异。
图 5 不同内参基因归一化后10个目的基因的相对表达量Figure 5 Relative expression levels of ten target genes after normalized by different reference genes从图6可见：利用最差内参PDP得到的目的基因表达量与4种内参基因组合得到的目的基因表达量相关系数为0.868 6 (P＜0.01)，当使用最优基因CNNM作为内参时，与4种内参组合相关系数可达0.991 6 (P＜0.01)。对2种内参组合与geNorm推荐的4个数目内参组合比较发现：通过这2种方法标准化得到的目的基因相关性可达0.999 9 (P＜0.01)，即仅使用CNNM、GPR107基因作为双内参也可达到geNorm软件推荐的4个内参数目组合的效果。
图 6 不同内参基因标准化后10种目的基因表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis for relative expression levels of ten target genes after normalized by different reference genes3. 讨论
山麦冬作为一种优良的地被园林植物及药用植物，研究多集中于提高栽培技术及块茎产量，而针对园林观赏应用的研究较少。在本研究之前没有山麦冬内参的研究报道，作为沿阶草族植物，其近源种也仅有麦冬Ophiopogon japonicus抗逆性研究中曾以微管蛋白基因(tubulin)[22]及Actin [23]作为参考基因。但这2类基因在前期转录组筛选中由于变异系数及变化倍数在候选内参中就已经被排除。本研究根据几何平均数的综合排名，推荐使用内参基因CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2作为研究山麦冬花青素合成的最优内参组合。EF1-α、G6PD-2属于常见的内参基因，在植物生长发育、抗逆反应、代谢合成中已被广泛应用[24-25]。基于前期转录组数据，新型内参基因CNNM、GPR107也可作为RT-qPCR分析的内参基因，CNNM编码过渡金属转运蛋白，可参与多种金属吸收、排除及区分化[26]，GPR107编码G蛋白偶联受体107，广泛存在于细胞表面的膜蛋白，可参与植物体多种细胞信号转导及调控机制保守[27]。上述2种基因在山麦冬果实中表达稳定，其相对表达量平均值与中位数相近，离散程度低，且表达量适中，符合内参基因的标准。在观赏植物中，由于新型内参基因稳定性强于传统内参基因，常被选用标准化目的基因的表达。例如，在异型花柱连翘Forsythia suspensa中，转录组中变化微小的未知基因是研究花开放最适合的内参基因[28]；太行花Taihangia rupestris花器官有复杂的性别决定机制，鉴定两性花与雄性花的内参基因是编码铁硫簇组装蛋白、3-巯基丙酮酸硫转移酶与跨膜蛋白50的新型内参基因[11]。SmDnaJ基因在旱柳Salix matsudana各种非生物胁迫下表达最为稳定[29]。bHLH在观赏百合Lilium oriental×Trumpet hybrid体胚诱导、体胚发育中表达最稳定[30]，但bHLH是植物颜色育种中的重要靶基因，并不适合作为本研究的内参基因候选，这也证实了不同目标性状需采用不同的内参基因，没有一种内参基因是普适的。
花青素合成路径在植物中是保守的，其中MYB转录因子与bHLH转录因子可形成二元复合体，激活花青素合成酶基因[31-32]。大量研究表明：MYB、bHLH转录因子基因与花青素合成酶基因在紫色系植物组织发育过程中协同上调[3, 33-34]。为验证内参基因的结果，挑选了10个在山麦冬花青素合成调控网络的中枢基因(相关性强且表达量高)作为验证，其中包括转录因子与结构基因(C4H、CHS、MT、UFGT、MYB、bHLH)，这10种基因在4种归一化方法下表达模式均显著上调，但趋势稍有不同，选用较差内参PDP标准化结果偏差最大，在山麦冬成熟黑果中所有基因都显著高于其他基因。尽管最优内参基因CNNM对目的基因的归一化可以达到与4种内参组合很高的相关系数，但对UFGT基因的量化存在显著差异，而UFGT基因作为花青素合成通路的下游修饰，对花青素积累至关重要，特别是在山麦冬这类组织颜色深即富含花青素的类型[2, 35]，例如在葡萄Vitis vinifera果皮[36]、玫瑰Rosa rugosa [37]、紫皮石刁柏Asparagus officinalis[33]中UFGT都被验证为关键基因，因此仅选用单一基因作为研究山麦冬果皮花青素积累的内参是不合适的，继而在CNNM基因基础上又引入GPR107来规避单内参基因的误差，该内参组合与geNorm推荐的内参组合相关系数最高，在10种目的基因的验证结果中与4种内参组合均无显著差异，且选用双内参组合比4种内参组合可操作性强，因此判定使用CNNM、GPR107作为双内参即可得到可靠的RT-qPCR结果。双内参组合联合使用可以减少实验因素对基因表达的影响，且结果更为准确。暴露于UV-B辐射下的番茄Lycopersicon esculentum幼苗不同组织都应选用特定的内参组合，例如叶中选用肌动蛋白基因与微管蛋白基因，而根中选用微管蛋白与UV-B抗性位点基因更加适合[38]；UBQ和EF1-α基因由于表达稳定，可作为内参基因用于鹅掌草Anemone flaccida各器官的不同发育阶段[39]。
4. 结论
本研究基于转录组数据筛选了15个候选内参基因，分析其在山麦冬果实不同时期的表达稳定性。经过10种目的基因验证后，表明以CNNM、GPR107基因作为组合是山麦冬果实花青素生物合成研究的最佳内参基因，而常用的内参基因却并不适用于本研究，这为筛选新型内参基因提供了新思路。
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图 5 金叶含笑各杂交组合的结实情况
Figure 5 Fruit setting of M. foveolata in different cross combinations
表 1 金叶含笑在不同杂交组合中的结实情况
Table 1. Fruit and seed setting status of M. foveolata in different cross combinations
杂交组合 (♀×♂) 坐果率/% 结籽率/% 单个果序蓇葖
膨大率/%种子数/粒 单个蓇葖内
含种子数/粒形态异常
种子占比/%千粒重/g 种子萌发率/% 金叶含笑×含笑 75.0 a 50.3±13.4 a 90.5±8.8 a 300.7±79.2 a 4.8±1.1 a 9.6±5.8 a 25.1 90.6 金叶含笑×紫花含笑 80.0 a 36.6±9.6 b 87.6±7.1 a 287.5±47.9 a 4.4±0.6 a 16.1±9.2 a 21.8 78.1 含笑×金叶含笑 78.8 a 27.3±9.0 bc 49.4±15.7 b 24.1±9.7 b 1.1±0.2 b 0.0±0.0 b 107.7 87.5 紫花含笑×金叶含笑 6.7 b 18.4±1.4 c 27.3±4.6 c 13.0±1.4 b 1.1±0.0 b 0.0±0.0 b 113.3 92.9 说明：不同字母表示不同杂交组合间差异显著(P＜0.05)。 
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