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黄薇Heimia myrtifolia是千屈菜科Lythraceae黄薇属Heimia落叶丛生灌木，原产于巴西，南亚、东亚地区有零星分布，在中国的上海、浙江、广西等地也有引种栽培[1]。黄薇喜温暖湿润且阳光充沛的环境，不耐干旱，夏季开花，花色金黄，花量丰富，可作为园林绿篱、花坛花境背景应用，点缀和美化植物景观，还可以净化城市水质，具有较高的园林价值和应用前景[2]。目前，国内外主要在黄薇的分类和应用[3]、叶内酚类化合物[4]、类黄酮组分[5]、非生物胁迫的抵御机制[6−8]、叶绿体基因组分析[9]等方面进行了研究，但关于黄薇的分子生物学方面的研究则十分匮乏。
实时荧光定量PCR (RT-qPCR)具有灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，近年来已成为研究基因表达分析的常用方法[10]，在分子生物学领域，RT-qPCR对深入研究植物基因表达调控机制、发现新基因、细胞因子表达分析、预测基因功能、医学诊断以及食品药品检测等至关重要[11]。在实际的应用过程中，为了确保RT-qPCR结果的准确性，需要引用一个表达量稳定的内参基因作为参照，而内参基因的稳定性也会影响RT-qPCR结果的准确性[12−13]。因此，筛选到适宜的内参基因是进行RT-qPCR表达分析时的重要前提[14]。目前暂未见黄薇内参基因筛选的相关研究，这严重制约了对黄薇目标基因的定量分析。因此，本研究基于黄薇转录组数据，对不同组织及不同干旱胁迫下黄薇的内参基因进行研究，为提高不同组织及不同干旱胁迫下基因RT-qPCR分析的准确性提供依据。
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材料取自浙江农林大学风景园林与建筑学院人工气候室内生长健壮、长势一致的黄薇1年生扦插苗。采样时选取黄薇盛花期的根、茎、叶、花，以及模拟自然条件下的对照组 (土壤相对含水量为65%~75%，ck)和4个干旱胁迫处理组 (T1、T2、T3、T4土壤相对含水量分别为45%~60%、30%~45%、15%~30%、10%~15%)的成熟叶片。采样后立即将样品置于液氮中速冻，并保存在−80 ℃冰箱备用。
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样品总RNA的提取按诺唯赞公司的RNA isolater Total RNA Extraction Reagent (RC401-01) 试剂盒使用方法进行。利用质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，使用紫外分光光度计测定浓度。总RNA纯度D(260)/D(280)为1.8~2.4，D(260)/D(230)为1.5~2.4。使用Reverse Transcriptase M-MLV试剂(Takara)合成cDNA的第1链，反转录程序为：37 ℃，15 min (反转录过程)；85 ℃，5 s (反转录酶的失活过程)，4 ℃冰箱保存。最后将cDNA产物于−20 ℃储存备用。
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基于黄薇转录组数据(序列号：PRJNA804698)，选取9个基因作为候选内参基因：延伸因子1α蛋白基因(elongationfactors-1α, EF-1α)、α-微管蛋白基因(α-tubulin, TUA)、亲环蛋白基因(cyclophilin, CYP)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphat dehydrogenase, GAPDH)、18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA, 18S RNA)、泛素化酶基因(ubiquitin-conjugating enzyme, UBC)、β-维管蛋白基因(tubulin, TUB)、肌动蛋白基因(actin, ACT)和伴侣蛋白基因(chaperone protein, DNA J)。基于转录组数据，选择与纤维素合成和干旱胁迫相关的差异表达基因CSLD、SOD基因，验证内参基因对基因表达量的影响。利用Primer 5软件，设计候选内参基因的荧光定量PCR引物，并由杭州有康生物技术有限公司合成。
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以所有试样的cDNA为模板依次稀释5个浓度梯度(5−1、5−2、5−3、5−4、5−5)，设3次重复，制作9个内参基因的标准曲线。反转录产物cDNA稀释10倍，RT-qPCR反应使用诺唯赞公司出品的SYBR®Primix Ex TaqTM试剂盒(Q712)。荧光定量反应在Roche LightCycler 480Ⅱ荧光定量仪上进行，反应体系为20 μL：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix荧光染料10 μL、cDNA模板2 μL、上下游引物各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL。PCR扩增反应程序为：预变性95 ℃，10 s；PCR反应95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，共40个循环。采集溶解曲线荧光信号进行分析，反应体系为：从60 ℃到95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。
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使用Excel 2016统计基因的Ct值，用Origin 9.1制图。采用geNorm[15]、NormFinder[16]、BestKeeper[17]软件以及在线分析软件RefFinder (
https://www.heartcure.com.au/reffinder/ )，综合分析不同情况下最稳定的内参基因。 -
所得RNA产物D(260)/D(280)为1.8~2.2，D(260)/D(230)为1.8~2.4，电泳条带清晰(图1A)，说明提取的总RNA质量良好，无明显降解，满足后续实验要求。9个候选内参基因琼脂糖凝胶电泳检测后出现与预期大小一致的单一条带(图1B)，说明引物不存在二聚体，可进行特异性扩增。根据结果绘制标准曲线并计算斜率，如表1显示：候选基因的线性相关系数R2＞0.990，引物扩增效率为95.6%~109.7%。综上，候选内参基因的扩增效率、产物特异性都符合RT-qPCR的条件，可用于后续的分析。
图 1 黄薇总RNA琼脂糖凝胶电泳分析(A)和RT-qPCR扩增产物特异性(B)
Figure 1. Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA (A) and specificity of products amplified by RT-qPCR (B) in H. myrtifolia
表 1 黄薇候选内参基因引物信息
Table 1. Primer information of candidate reference gene in H. myrtifolia
基因 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 扩增大小/bp 退火温度/℃ 扩增效率/% R2 EF-1α TGGTTTTGAGGCTGGTATCTCC TTTGCTTGACACCAAGGGTGA 80 56.5 95.6 0.998 TUA TCTCTGCCTTGACCGAGTGA ACCACCAACGGCACTGAAAA 82 56.5 96.6 0.998 CYP ACCCCGACTCGTCCTACAAG TCGGTGTTCCGCTCCAAATG 130 58.0 106.8 0.999 GAPDH AGAAGGTCGTCATTTCTGCCC TGGTTGTGCAGCTAGCGTTG 114 57.5 108.4 0.999 18S RNA CAGGGCCTAGGATTTCGTCC GCCTTCAATCTTAGTCGTGGC 113 58.5 100.5 0.992 UBC GACCTGATGACACTCCCTGG TCACAGTTGGTGGTTTGTTCG 87 57.5 99.1 0.999 TUB GGGTGCTGAGCTTATTGATGC TGAGCAATGTCCCCATGCCT 131 57.5 96.8 0.996 ACT AGGGAATGCCTTTTGATTGATCC AAACATAAGCTCCACTGCCCTC 102 57 109.7 0.999 DNA J CGGAGCTATCACCCCGATG CGGCCTCACCATACCTGTCA 127 59.5 100.2 0.997 CSLD TACCTTGTCCCTTTCGGCG TCAGCGTCCTCATCCCGATA 149 57.4 95.1 0.997 SOD GTTGACGCAAGACGAGGGA CCGTTGGTCGTGTCACCAT 108 57.3 96.0 0.997 -
根据Ct表示不同条件下基因的相对表达量，Ct越小，表达丰度越高[18]。所有样品中，9个候选内参基因的Ct为21.12~33.74 (图2)，其中平均表达量最高的基因为GAPDH，Ct平均值为25.01；18S RNA的Ct平均为29.90，其表达量最低。EF-1α基因的表达水平变化最小，Ct为23.97~29.06；18S RNA的Ct为26.64~33.47，表达变化最大。从Ct的大小和变化情况来看，GAPDH基因的表达相对稳定且丰度最高，可初步评价候选内参基因的表达水平和稳定性。
图 2 9个候选内参基因的Ct值
Figure 2. Ct values of the 9 candidate reference genes
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geNorm软件根据平均稳定值M来判定结果，M越小，基因表达越稳定，反之越不稳定[19]。使用2−ΔΔCt法计算内参基因的表达量：在黄薇不同组织中，候选内参基因的表达稳定性从高到低依次为CYP=GAPDH、18S RNA、UBC、DNA J、ACT、EF-1α、TUB、TUA (图3A)。在全部样品和干旱胁迫中，黄薇GAPDH和UBC基因最稳定，TUB基因最不稳定(图3B和图3C)。geNorm软件还可以根据成对变异值，分析最适的内参基因数目，软件默认的配对差异值(Vn/Vn+1，V为配对变异指数，n为可使RT-qPCR结果准确的最少基因数目)为0.15[20]。当Vn/Vn+1＞0.15，需要加入第n+1基因；当Vn/Vn+1＜0.15，不需要引入新的基因。黄薇在不同组织和干旱胁迫下(图3D)，除不同组织中V2/V3＜0.15外，其余情况均大于0.15。该现象可能是因为在不同组织和胁迫处理下，黄薇基因的表达量变化差异大，但软件说明书上也提出Vn/Vn+1最大值设定为0.15并非总是必须的[21]。
图 3 geNorm分析9个候选内参基因的表达稳定值和配对变异值
Figure 3. Stable expression values and paired variation values of nine candidate reference genes were analyzed by geNorm
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NormFinder软件按照2−ΔΔCt法计算稳定性，其中表达稳定值越小，候选内参基因越稳定[22]。结果表明(表2)：在不同组织中，GAPDH和CYP基因表达最稳定，TUA基因最不稳定。在不同干旱胁迫处理下，GAPDH基因是最稳定的内参基因，TUB基因最不稳定。在黄薇的全部样品中，最稳定的内参基因是GAPDH基因，这与geNorm软件得出的结果相同。
表 2 NormFinder分析内参基因的表达稳定值
Table 2. Expression stability values of nine candidate reference genes calculated by the NormFinder
基因 不同组织 干旱胁迫 全部样品 表达稳定值 排序 表达稳定值 排序 表达稳定值 排序 GAPDH 0.069 2 0.142 1 0.359 1 UBC 0.593 5 0.452 3 0.578 2 EF-1α 0.904 6 0.800 5 0.862 3 TUA 1.483 9 0.239 2 0.910 4 CYP 0.069 1 0.611 4 0.911 5 DNA J 0.579 4 1.479 6 1.094 6 18S RNA 0.494 3 1.542 8 1.366 7 ACT 1.095 7 1.507 7 1.390 8 TUB 1.294 8 1.816 9 1.505 9 -
BestKeeper软件以内参基因的标准差(SD)和变异系数(CV)为基准，其数值越小越稳定[23]。从表3可见：在不同组织中，GAPDH基因的CV±SD为2.65 ± 0.69，排名第一，最稳定；在干旱胁迫和全部样品中，EF-1α基因的CV±SD分别为1.97±0.53和2.58±0.71，表达最稳定。综合不同条件下的分析结果，EF-1α基因被鉴定为最稳定的内参基因。
表 3 BestKeeper分析内参基因的表达稳定值
Table 3. Expression stability values of nine candidate reference genes calculated by the BestKeeper
基因 不同组织 干旱胁迫 全部样品 CV±SD 排序 CV±SD 排序 CV±SD 排序 EF-1α 3.46 ± 0.95 2 1.97 ± 0.53 1 2.58 ± 0.71 1 GAPDH 2.65 ± 0.69 1 3.78 ± 0.94 4 3.59 ± 0.91 2 UBC 3.73 ± 1.04 4 4.32 ± 1.18 5 4.21 ± 1.16 3 TUB 3.47 ± 1.06 3 6.14 ± 1.86 9 4.98 ± 1.51 4 TUA 6.65 ± 1.89 8 3.52 ± 0.95 3 5.26 ± 1.45 5 ACT 5.03 ± 1.46 5 6.11 ± 1.84 8 5.72 ± 1.69 6 CYP 6.36 ± 1.99 6 3.34 ± 0.96 2 6.11 ± 1.83 7 DNA J 7.31 ± 2.18 9 6.11 ± 1.81 7 6.81 ± 2.03 8 18S RNA 6.57 ± 2.05 7 5.68 ± 1.64 6 7.61 ± 2.28 9 -
上述3种软件的结果存在一定的差异，使用在线分析软件RefFinder，整合上述分析结果并进行综合分析。由表4显示：不同组织中，最稳定的内参基因是GAPDH和CYP，最不稳定的内参基因是TUA；在干旱胁迫下，最稳定的内参基因是GAPDH和TUA，最不稳定的内参基因是TUB。在全部样本中，最稳定的内参基因为GAPDH，最不稳定的内参基因为18S RNA。
表 4 RefFinder分析内参基因的表达稳定值
Table 4. Expression stability of candidate reference genes ranked by RefFinder
排序 不同组织 干旱胁迫 全部样品 基因 表达稳
定值基因 表达稳
定值基因 表达稳
定值1 GAPDH 1.41 GAPDH 1.19 GAPDH 1.19 2 CYP 2.11 TUA 1.86 UBC 2.11 3 18S RNA 3.57 EF-1α 3.34 EF-1α 2.45 4 UBC 4.76 UBC 3.41 TUA 4.28 5 TUB 4.76 CYP 4.00 CYP 5.23 6 EF-1α 5.05 ACT 6.70 DNA J 6.45 7 ACT 5.12 DNA J 6.96 ACT 6.73 8 DNA J 5.44 18S RNA 7.20 TUB 6.84 9 TUA 9.00 TUB 9.00 18S RNA 7.45 -
为验证候选内参基因的稳定性，采用RT-qPCR技术，根据筛选的稳定内参基因，对干旱胁迫下的靶基因CSLD和SOD的表达模式进行验证。CSLD基因是一种纤维素合成酶的结构蛋白，在茎中的表达量一般较高[24]。SOD基因属于抗氧化酶功能基因，在植物遭遇干旱胁迫时上调表达以抵御外界伤害[25]。从图4可见：在不同组织中，GAPDH和CYP基因在单独和组合校正下，CSLD均在茎中表达量最高，在其他组织中表达变化不大。但使用TUA作内参基因时，CSLD在茎中的表达量最低，在叶片中表达却最高。干旱胁迫下，使用GAPDH和基因组合GAPDH+TUA时，SOD基因在T3处理表达量最高，表达趋势大致相同；而利用TUB基因进行验证时，SOD基因在T2处理表达量最高，与其他结果差异较大。以上结果进一步验证了GAPDH基因作为内参基因的稳定性与可靠性。
图 4 不同组织和干旱胁迫下CSLD (A)和SOD基因(B)利用不同内参基因的表达分析
Figure 4. Expression analysis for CSLD gene (A) and SOD gene (B) using different reference genes in different tissues and drought stress
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RT-qPCR技术是一种分析基因表达量的研究工具，而使用相对定量法检测的可靠性，极大依赖内参基因的稳定性[26]。理想的内参基因在不同条件下，基因的表达变化较小，常用的内参基因一般都是维持植物生命活动必须的看家基因[27]。本研究基于黄薇转录组数据，筛选了9个常用内参基因(EF-1α、TUA、CYP、GAPDH、18S RNA、UBC、TUB、ACT、DNA J)，其中，GAPDH在不同组织和干旱胁迫下都较稳定，最不稳定的是18S RNA。geNorm和NormFinder结果中，得出的最适内参基因组合为GAPDH + UBC，BestKeeper得出最佳基因为EF-1α，但GAPDH的稳定值排名综合也较靠前。3个筛选软件得出的结果基本一致，但也存在一定的差异，这可能是由于算法的不同所导致的[28]。与本研究结果不同的是，张海洋等[29]探究了菠菜Spinacia oleracea在不同胁迫处理下稳定的内参基因，3个软件的结果一致，在氯化钠和高温胁迫下，G6PD的表达稳定性最好，聚乙二醇胁迫下ELF1B的表达稳定性最好。王蕊等[30]研究了不同发育时期大豆Glycine max在不同组织、不同非生物胁迫下稳定表达的最适内参基因，4个软件在全部组织及全部胁迫中综合分析结果均一致，在全部组织中最适内参基因为ACT，全部胁迫中最适内参基因为EF-1α。
非生物胁迫会改变植物正常的代谢过程，筛选在胁迫处理下稳定表达的内参基因，有利于后续开展目的基因的鉴定，以便进一步了解目的基因的功能[31]。目前已有大量研究筛选不同非生物胁迫下的最佳内参基因。如紫鸭跖草Tradescantia pallida在不同浓度的铜离子胁迫下，最佳内参基因组合为18S RNA + TUB + UBI[32]。马铃薯Solanum tuberosum在干旱和渗透胁迫条件下，EF-1α和sec3基因表达最稳定[33]。上述结果与本研究的结果存在一定差异，说明不同植物在不同非生物胁迫下最适内参基因也在变化，特定条件下的最适内参基因仍需通过试验筛选。
Screening and validation of reference genes in Heimia myrtifolia in different tissues and under drought stress
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摘要:
目的 为黄薇Heimia myrtifolia不同组织及不同干旱胁迫下基因表达分析筛选最适内参基因。 方法 选取黄薇盛花期的根、茎、叶、花，以及5种不同干旱处理的叶片作为实验材料，借助RT-qPCR技术对黄薇转录组数据筛选的9个候选内参基因进行分析，并利用软件geNorm、BestKeeper、NormFinder和RefFinder综合评价候选基因的表达稳定性。最后选取2个与胁迫相关的基因CSLD和SOD，对所选内参基因进行验证。 结果 geNorm、BestKeeper和NormFinder分析得出的候选内参基因排序存在一定差异。利用RefFinder对上述3个软件的结果综合分析得出：在不同组织中，最稳定的内参基因为GAPDH，最不稳定的内参基因为TUA；在干旱胁迫中，最稳定的内参基因为GAPDH，最不稳定的内参基因为TUB。在全部样本中，最稳定的内参基因为GAPDH，最不稳定的内参基因为18S RNA。对不同组织和干旱胁迫下的CSLD和SOD基因表达模式进行验证表明：上述2个基因与筛选所得内参基因的表达量和变化趋势均较为一致。 结论 在不同组织和干旱处理后，GAPDH是最适合黄薇基因表达的内参基因。图4表4参33 Abstract:Objective The objective is to study the gene expression of Heimia myrtifolia in different tissues and under different drought stress. Method The root, stem, leaf, and flower of H. myrtifolia at full flowering stage and 5 leaves under different drought treatments were selected as experimental materials, and 9 candidate internal reference genes screened from the transcriptome data were analyzed by RT-qPCR. The software geNorm, BestKeeper, NormFinder, and RefFinder were used to comprehensively evaluate the expression stability of candidate reference genes. Finally, 2 stress-related genes CSLD and SOD were selected to verify the selected internal reference genes. Result GeNorm, BestKeeper, and NormFinder showed some differences in the ranking of candidate internal parameters. By using the online software RefFinder to comprehensively analyze the results of the above 3 software, it was concluded that GAPDH was the most stable internal reference gene and TUA was the most unstable in different tissues. In drought stress, GAPDH was the most stable internal reference gene and TUB was the least stable. In all samples, the most stable reference gene was GAPDH, and the most unstable one was 18S RNA. The expression patterns of CSLD and SOD genes in different tissues and under drought stress were verified, which showed that the expression levels and change trends of the above 2 genes were consistent with those of the selected internal reference genes. Conclusion GAPDH is the best internal reference gene for gene expression of H. myrtifolia in different tissues and under drought treatment. [Ch, 4 fig. 4 tab. 33 ref.] -
在城市化快速发展的背景下，城镇建设用地的扩张导致生态空间衰减、系统结构失衡、生态功能下降等问题凸显[1]，生态环境面临多重压力和干扰，引起的景观生态风险值得关注。绿色空间是城镇地域范围内对于改善区域生态环境、维持生态系统物质能量循环具有重要作用的生态空间，是由耕地、林地、草地、水域等不同土地单元镶嵌而成的复合生态系统[2−4]。当前，国内外学者对绿色空间的研究主要集中在绿色空间结构与功能[5]、景观格局动态演化[6−7]及生态环境效益[8−9]等方面。景观生态风险评价用于评估自然或人为因素干扰对生态系统及其组分产生不利影响的可能性及损失[10]，基于景观格局指数构建景观生态风险评价模型能够定量揭示生态环境健康程度及风险压力的时空分布特征[11]。现有研究主要集中于景观生态风险的静态分析，对时空动态分析视角下景观生态风险演变特征的分析相对薄弱，且研究尺度集中在城市[12−13]、城市群[14−15]、流域[16−17]等典型地区，对具有特殊地域特征的苏南水网地区的研究相对较少。
苏南水网地区位于经济发达、人口密集的长江三角洲，河流、湖荡众多，水系纵横交错，形成了独特的地域生态空间特征。随着城镇建设用地的迅速扩张，苏南水网地区绿色空间日趋破碎化，生态系统稳定性下降。本研究以苏南水网地区江苏省昆山市为研究对象，利用2000、2010、2020年土地利用数据，定量测度其绿色空间景观格局变化引起的景观生态风险，并探究景观生态风险时空演变特征，依据风险等级转移变化特征划定绿色空间管控分区，提出分区调控策略，为优化水网地区空间景观布局，保护地区生态安全，合理开发绿色空间资源提供理论依据，也为地区景观生态风险管理提供决策支持。
1. 研究区概况与数据来源
1.1 研究区概况
昆山市位于长江三角洲地区江苏省苏州市东部，31°06′~31°32′N，120°48′~121°09′E，全市下辖周庄镇、锦溪镇、淀山湖镇等10个镇，总面积为931 km2。根据《昆山市统计年鉴》，2000—2020年昆山市户籍总人数增加47.3万人，城镇化率由57.31%提升至78.95%，国内生产总值(GDP)增长4 075.96亿元，经济建设水平居于全国经济百强县首位。昆山市境内地势平坦，属北亚热带季风性湿润气候，四季分明，雨量充沛。境内河港纵横交错，湖荡星罗棋布，水域面积占16.4%，包含白莲湖、傀儡湖、明镜荡等湖荡，水网地区风貌特征明显。
1.2 数据来源及处理
采用2000、2010、2020年3期 Landsat TM/OLI 遥感影像，数据集来源于地理空间数据云平台(
http://www.gscloud.cn/ )，空间分辨率为30 m×30 m。利用ENVI 5.3软件对各期遥感影像数据进行校准、图像拼接裁剪等处理。参考中国科学院土地利用/土地覆盖分类系统及GB/T 21010—2017《土地利用现状分类》相关标准，结合苏南水网地区地域特点，将研究区划分为耕地、林地、草地、水域、建设用地和未利用地等6类土地利用类型，其中耕地、林地、草地和水域为绿色空间，建设用地和未利用地为非绿色空间。对解译后的土地利用类型数据进行精度验证，Kappa系数均＞0.85，符合解译精度要求。2. 研究方法
2.1 风险小区的划分
为了便于景观生态风险指数的空间化表达，本研究基于ArcGIS的渔网分析功能划分景观生态风险小区。依据研究区面积大小及数据精度，采用等间距采样的方法将研究区划分为1.5 km×1.5 km正方形格网，共划分景观生态风险样本小区489个(图1)，利用 Fragstats 4.2软件计算各个样本小区内的生态风险指数，作为每个风险小区中心点的景观生态风险值。
2.2 景观生态风险评价模型
景观格局指数是反映景观结构组成和空间配置特征的定量指标[18]。基于景观格局指数的生态风险评价方法能够有效评估生态系统受到外部干扰的强弱和内部抵抗力的大小[19]。根据相关研究成果[20−21]，依据景观格局与生态风险之间的关联，选取景观干扰度指数($ {E}_{i} $)、景观脆弱度指数($ {V}_{i} $)和景观损失度指数($ {R}_{i} $)来构建景观生态风险评价模型。
各景观格局指数计算方法及生态学含义详见表1。
表 1 景观格局指数及计算方法Table 1 Landscape pattern index and their calculation methods指数名称 计算方法 生态学含义 土地利用生态风险指数
(IERk)${I_{{\text{ER}}k}} = \displaystyle \sum \limits_{i = 1}^N \dfrac{{{A_{ki}}}}{{{A_k}}} \times {R_i} $ Aki为第k个风险小区内土地利用类型i的面积；Ak为第k个风险小区的面积；Ri为第i类景观的景观损失度指数 景观损失度指数(Ri) Ri=Ei×Vi Ei为景观干扰度指数，Vi为景观脆弱度指数 景观干扰度指数($ {E}_{i} $) $ {E}_{i}={aC}_{i}+{bN}_{i}+{cD}_{i} $ 表示不同类型景观生态系统所受外界干扰的程度，主要与人类的开发活动有关。其中：$ a、b、c $分别为$ {C}_{i} $、$ {N}_{i}{\mathrm{、}D}_{i} $的权重，且$ a+b+c= $1，参考前人研究[11, 22]，将$ a、b、c $分别赋值为0.5、0.3和0.2 景观破碎度指数($ {C}_{i} $) $ {C}_{i}=\dfrac{{n}_{i}}{{A}_{i}} $ 表示景观被分割的破碎化程度，值越大表明景观破碎程度越高 景观分离度指数($ {N}_{i} $) $ {N}_{i}=\dfrac{A}{2{A}_{i}}\sqrt{\dfrac{{n}_{i}}{A}} $ 表示某一景观类型中不同斑块间的分离程度，值越大表明景观空间分布越离散，景观结构稳定性越低。$ {n}_{i} $为景观类型$ i $的斑块个数；$ {A}_{i} $为景观类型$ i $的面积；$ A $为景观总面积 景观优势度指数($ {D}_{i} $) $ {D}_{i}=\dfrac{\left(\dfrac{{n}_{i}}{N}+\dfrac{{q}_{i}}{Q}\right)}{4}+\dfrac{{A}_{i}}{2A} $ 表示斑块在景观中的地位，值越大代表斑块对景观格局演变影响越大。$ {q}_{i} $为景观类型$ i $斑块出现的样方数；$ Q $为样方总数；$ N $为斑块总数 景观脆弱度指数($ {V}_{i} $) $ {V}_{i}={I}_{{\mathrm{LS}}}\times \left(1-{I}_{{\mathrm{LA}}}\right) $ 表示不同景观类型抵抗外界干扰的敏感程度。其中：ILS为景观敏感度指数，可通过景观干扰度指数和景观易损度指数相乘而得，景观易损度指数根据前人研究成果[23−24]，结合研究区实际情况赋以权重：未利用地为6，水域为5，耕地为4，草地为3，林地为2，建设用地为1；ILA为景观适应度指数，由斑块丰富密度指数、香农多样性指数、香农均匀度指数相乘而得。3种指数均由Fragstats软件计算而得 3. 结果与分析
3.1 昆山市绿色空间演变特征分析
3.1.1 绿色空间面积组成对比分析
通过ArcGIS软件对遥感影像图进行分类处理，得到昆山市2000、2010和2020年3个时期土地利用类型图(图2)，并统计得到各土地利用类型面积与占比(表2)。从分析结果来看：2000—2020年昆山市各绿色空间类型面积发生了较大变化，其中耕地面积下降明显，减少20 203.11 hm2，占比下降21.70%；水域面积在2000—2010年小幅增加，占比上升2.24%，2010—2020年水域面积明显下降，减少了
5905.17 hm2，占比下降6.34%；林地面积共减少72.90 hm2，而草地面积则增加了143.64 hm2，两者在绿色空间中占比很小。总体而言，研究期间昆山市绿色空间总面积明显减少，反映了建设用地扩张不断侵占市域内的绿色空间，以耕地面积的缩减最为突出。
图 2 2000—2020年昆山市土地利用类型示意图Figure 2 Land use type map of Kunshan City from 2000 to 2020表 2 2000—2020年昆山市各用地类型面积变化Table 2 Changes in the area of various land types in Kunshan City from 2000 to 2020土地利用类型 2000年 2010年 2020年 面积/hm2 百分比/% 面积/hm2 百分比/% 面积/hm2 百分比/% 绿色空间 耕地 68 884.11 73.98 51 240.51 55.03 48 681.00 52.28 林地 122.85 0.13 112.59 0.12 49.95 0.05 草地 36.36 0.04 78.66 0.08 180.00 0.19 水域 15 156.36 16.28 17 247.87 18.52 11342.70 12.18 合计 84 199.68 90.43 68 679.63 73.75 60253.65 64.70 非绿色空间 建设用地 8 833.95 9.49 24 386.49 26.19 32828.04 35.26 未利用地 81.36 0.09 48.96 0.05 33.39 0.05 合计 8 915.31 9.58 24 435.45 26.24 32861.43 35.31 3.1.2 绿色空间面积转移矩阵分析
为了进一步揭示昆山市绿色空间用地类型的时空演变规律，本研究采用土地利用转移矩阵对昆山市各用地类型之间的转移方向和转换数量进行分析，结果如表3所示。2000—2020年昆山市各绿色空间类型转移存在明显差异：耕地净转出量最大，总量达33 918.84 hm2，主要流向建设用地，转出面积达26 327.86 hm2，转出贡献率为77.62%，反映出建设用地侵占耕地现象普遍；水域面积整体呈现先小幅增加后逐渐减少的趋势，其中2000—2010年水域面积小幅增加了2 091.51 hm2，主要由耕地转入，2010—2020年，水域面积持续减少，主要向耕地和建设用地转出，转出总面积为7 150.64 hm2。总体来看，2000—2020年昆山市绿色空间类型转移以耕地和水域的转出为主，均主要转向建设用地。这反映出昆山市在经济社会快速发展下人为开发建设活动对绿色空间侵占现象较为明显，耕地和水域等绿色空间面临较大生态压力。
表 3 2000—2020年昆山市地类转移矩阵Table 3 Land class transfer matrix in Kunshan City from 2000 to 2020时间段 土地利用类型 绿色空间/hm2 非绿色空间/hm2 转出合
计/hm2面积变化
合计/ hm2耕地 林地 草地 水域 建设用地 未利用地 2000—2010 绿色空间 耕地 46 613.56 41.62 71.57 6 168.10 15 825.59 6.48 68 726.91 −17 577.88 林地 46.23 41.28 0.07 29.54 5.62 0.00 122.74 −10.60 草地 14.15 0.00 0.16 15.64 6.29 0.11 36.36 42.30 水域 3 464.97 28.70 5.97 10 742.95 853.90 2.02 15 098.51 2 033.98 非绿色空间 建设用地 975.40 0.53 0.90 174.01 7 672.25 0.20 8 823.28 15 544.60 未利用地 34.72 0.00 0.00 2.25 4.23 40.15 81.36 −32.40 转入合计 51 149.03 112.14 78.66 17 132.48 24 367.89 48.96 92 889.16 − 时间段 土地利用类型 绿色空间/hm2 非绿色空间/hm2 转出合
计/ hm2面积变化
合计/ hm2耕地 林地 草地 水域 建设用地 未利用地 2010—2020 绿色空间 耕地 39 356.15 8.54 127.00 1 161.04 10 502.27 6.64 51 161.64 −2 650.12 林地 65.13 25.78 0.13 17.69 3.57 0.00 112.30 −62.47 草地 2.17 0.00 1.46 0.00 74.73 0.30 78.66 101.34 水域 6 482.98 14.97 37.18 9 906.54 667.66 6.89 17 116.24 −5 812.93 非绿色空间 建设用地 2 592.59 0.53 14.22 217.65 21 538.87 1.19 24 365.05 8 439.75 未利用地 12.50 0.00 0.00 0.38 17.71 18.37 48.96 −15.57 转入合计 48 511.52 49.82 180.00 11 303.31 32 804.80 33.39 92 882.85 − 说明：−表示无此项。 3.2 昆山市绿色空间景观生态风险时空演变分析
3.2.1 绿色空间景观格局指数时序变化
运用Fragstats软件计算得到昆山市2000、2010、2020年各绿色空间类型景观格局指数。统计结果表明：2000—2020年昆山市绿色空间景观格局发生了较大变化(表4)。①研究期间耕地破碎度和分离度指数显著上升，表明建设用地快速扩张，促使耕地空间分布趋于离散，破碎化程度加剧，景观优势度不断降低，受外界干扰程度增加。景观损失度逐年上升。②水域破碎度指数先下降后上升，总体呈上升趋势，景观优势度降低，且水域周边城镇较为密集，易受人为活动干扰，使景观脆弱程度不断增加，损失度上升。③林地破碎度、干扰度、脆弱度指数均先下降后上升，总体呈下降趋势，表明林地斑块分布逐渐聚集，景观结构稳定性提升。④草地破碎度指数先上升后下降，表明草地斑块在空间上趋于集聚与整合，抗外界干扰能力提高，景观脆弱度与损失度有所降低。
表 4 2000—2020年昆山市绿色空间景观格局指数变化Table 4 Change of green space landscape pattern index in Kunshan City from 2000 to 2020土地利用类型 年份 斑块数量 斑块面积/hm2 破碎度 分离度 优势度 干扰度 脆弱度 损失度 耕地 2000 1378 68 884.11 0.020 0.973 0.647 0.431 0.082 0.035 2010 4401 51 240.51 0.086 0.987 0.602 0.459 0.087 0.040 2020 4667 48 681.00 0.096 0.992 0.597 0.465 0.088 0.041 林地 2000 494 122.85 4.021 1.000 0.092 2.329 0.222 0.516 2010 355 112.59 3.153 1.000 0.076 1.892 0.180 0.340 2020 172 49.95 3.443 1.000 0.046 2.031 0.193 0.392 草地 2000 56 36.36 1.540 1.000 0.025 1.075 0.153 0.165 2010 195 78.66 2.479 1.000 0.017 1.551 0.221 0.343 2020 123 180.00 0.683 1.000 0.047 0.651 0.093 0.060 水域 2000 4128 15 156.36 0.272 1.000 0.417 0.520 0.124 0.064 2010 3566 17 247.87 0.207 1.000 0.399 0.483 0.115 0.056 2020 3770 11 342.70 0.332 1.000 0.365 0.539 0.128 0.069 3.2.2 绿色空间景观生态风险时空分布格局
基于景观生态风险评价指标计算结果，在ArcGIS 10.2中利用克里金插值法对昆山市生态风险值进行空间插值，得到昆山市绿色空间景观生态风险空间分布图，使用自然断点法将景观生态风险值(IERk)划分为5个等级：低生态风险(0＜IERk≤0.026)、较低生态风险(0.026＜IERk≤0.031)、中生态风险(0.031＜IERk≤0.037)、较高生态风险(0.037＜IERk≤0.041)和高生态风险(IERk＞0.041)，结果如图3，并统计得到不同景观生态风险等级的面积及占比(表5)。
图 3 2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险空间分布示意图Figure 3 Spatial distribution of ecological risks in green space landscape of Kunshan City from 2000 to 2020表 5 2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险等级面积及比例Table 5 Area and proportion of landscape ecological risk level of green space in Kunshan City from 2000 to 2020年份 低风险区 较低风险区 中等风险区 较高风险区 高风险区 面积/hm2 比例/% 面积/hm2 比例/% 面积/hm2 比例/% 面积/hm2 比例/% 面积/hm2 比例/% 2000 1 116.90 25.66 1 830.87 42.06 918.09 21.09 345.15 7.93 141.48 3.25 2010 642.78 19.94 1 210.41 37.55 745.56 23.13 409.32 12.70 215.82 6.69 2020 452.70 15.93 961.02 33.81 692.64 24.37 455.58 16.03 280.26 9.86 2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险整体呈上升趋势，呈现“南北高，中间低”的空间分布特征。高、较高风险区面积明显上升，面积占比分别增加8.10%、6.61%，主要分布于淀山湖、白莲湖等湖荡密集地区，且不断向湖荡周围辐射扩张。该区域绿色空间类型以水域为主，由于围网养殖等人为活动对水域干扰程度加大，景观损失度逐年增加，使区域风险等级不断升高。中风险区面积小幅上升，面积占比增加3.28%，集中分布于渡头村、双洋潭等地区，并逐步沿较高风险区外围向四周扩散，区域内耕地、水域交错分布，受人为活动干扰较大，生态稳定性下降。较低、低风险区面积明显缩减，占比分别减少8.25%和9.73%，主要分布于研究区中部白渔潭村、荣家厍及北部范潭村、横泾等地区，且分布逐渐变得零散破碎，人为开发建设活动频繁，绿色空间不断减少，抗干扰能力减弱，景观生态风险值有增强趋势。
3.2.3 绿色空间景观生态风险等级空间变化
借助景观生态风险等级变化分布(图4)分析2000—2020年期间研究区各风险等级的变化情况。①风险等级升高区域的面积为21 503.12 hm2，占绿色空间总面积的36.69%，其中较低风险区域上升为中风险的区域面积最大，为6 413.09 hm2，其次为中风险区域上升为较高风险区域。主要分布在白莲湖、明镜荡、汪洋荡等地区，区域内湖荡、耕地镶嵌分布，城镇建设用地的扩张使生态斑块破碎化程度加剧，生态结构和功能受到损害，生态系统稳定性和恢复力下降。②风险等级基本不变区域的面积为31 026.25 hm2，占绿色空间总面积的52.61%，其中较低风险区域面积最大，为13 102.74 hm2。主要分布在白渔潭村、荣家厍、范潭村片区等。该区域生态环境相对较好，生态系统结构和整体格局较为完整，对外界干扰具备一定的抵御能力，可维持基本的生态功能。③风险等级降低区域的面积为5 241.88 hm2，占绿色空间总面积的10.70%，其中中风险区域下降为较低风险区域面积最大，为2 925.90 hm2，其次为较低风险区域下降为低风险区域。在空间上集中在大渔新村、朱家湾村、黄家埭等地区。区域内具有较好的生态基底，生态斑块间连续性较强且受经济建设活动干扰较小，生态系统稳定性提高，能够提供较好的生态服务效益。
图 4 2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险等级变化示意图Figure 4 Change of landscape ecological risk level of green space in Kunshan City from 2000 to 20203.3 基于景观生态风险评价的昆山市绿色空间分区调控策略
基于2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险等级变化特征，将风险等级升高、不变和降低的区域分别划定为重点修复区、协调缓冲区和优化利用区。依据《苏州市“十四五”生态环境保护规划》《昆山市生态环境保护“十四五”规划》《昆山市国土空间总体规划(2021—2035)》等规划政策，结合调控分区的景观生态风险水平，提出有针对性的空间分区调控策略。
3.3.1 重点修复区实施生态保育，降低绿色空间生态风险
重点修复区为景观生态风险等级升高的区域，主要表现为较低风险向中风险、中风险向较高风险转移。片区内绿色空间破碎度增加，生态系统稳定性下降，景观生态风险水平不断上升。应加强生态保育与生态修复，对淀山湖、白莲湖等主要核心水域开展生态治理与修复工程，提升水域生态涵养功能；系统梳理、串通河网水系，在河网沿线严格管控开发强度大的建设活动；对破碎的绿色空间斑块进行整合，特别是南部长白荡、明镜荡等水域密集地区，着力提升水网景观的连通性和抗干扰能力，维护绿色空间的完整性与稳定性。
3.3.2 协调缓冲区加强缓冲区建设，筑牢绿色空间生态安全屏障
协调缓冲区为景观生态风险等级基本不变的区域，片区内绿色空间生态稳定性较强，能够抵御一定程度的外界干扰，景观生态风险维持在稳定水平。这些区域可作为生态缓冲地，提升绿色空间抗风险能力。通过强化河流水系、滨水绿带等生态廊道结构连通性[25]，串联湖荡、农田大型生态斑块，构建水陆联动的网络化生态空间格局；加强傀儡湖、阳澄湖等生境敏感区的缓冲区建设，构建区域生态安全屏障，维护生态保护网络边界，增强区域景观生态风险缓冲能力。
3.3.3 优化利用区优化生态建设，发挥绿色空间生态效益
优化利用区为景观生态风险等级降低的区域，主要表现为中风险向较低风险、较低风险向低风险转换。片区内绿色空间生态系统结构较为完整，对外界干扰具有较强的适应能力，景观生态风险水平有所下降。应依托片区内良好的生态优势，适度优化建设，提升水网空间活力，维护生态系统的稳定性。首先明确生态保护红线边界，保护绿色空间健康稳定发展；其次对绿色空间进行分级分类管控，加强对城市生态森林公园、夏驾河湿地公园等核心生态资源的保护与管理，定期监测与评估生态用地的环境状况；同时在生态保护基础上优化建设，结合黄家埭等地区独特的水网空间优势开展科普教育、休闲游憩等服务，提升绿色空间的生态效益。
4. 讨论与结论
4.1 讨论
本研究表明：绿色空间用地类型转变与景观生态风险具有关联性。研究期间昆山市南部水域及周边地区由于城镇用地扩张，耕地、水域等绿色空间面积持续减少，生态系统结构稳定性下降，景观生态风险等级呈上升趋势。这与于淑会等[26]、陈斌等[27]的研究结论一致。水网地区以纵横交错的河流、湖荡为主体，水域面积较大，易受外界城镇建设用地扩张的干扰而破碎化，景观脆弱度高。本研究结果表明：水域范围内的景观生态风险指数普遍较高。这与何钊全等[28]对延安市的研究存在一定差异。延安市地处黄土丘陵区，林地和耕地是优势景观类型，受经济发展和建设用地扩张影响较大，林地、耕地破碎化程度加剧，抗干扰能力下降，景观损失度增加，使林地与耕地的景观生态风险值较高。
本研究在快速城镇化背景下，基于景观生态风险评价，加强绿色空间分区规划调控，对提升区域生态安全水平，优化国土空间结构，促进区域可持续发展具有一定理论指导意义。但研究仍存在一定局限性：①研究侧重从景观空间结构变化视角来评价绿色空间景观生态风险状况，对社会、经济等层面影响因素研究不足，还需进一步完善景观生态风险影响因素和驱动机制研究。②生态过程具有复杂性和抽象性，其具体演变过程很难做到定量表述。需要对生态风险展开多尺度分析，深入探讨景观格局生态风险和生态过程的耦合关系，为区域风险管理提供更加科学的依据。
4.2 结论
①2000—2020年昆山市绿色空间总面积持续减少，其中耕地面积缩减最多；水域面积先小幅增加后持续减少，总体呈减少趋势；林地、草地面积占比较小，维持相对平稳。研究区用地类型转换主要表现为耕地和水域转向建设用地。②2000—2020年昆山市绿色空间景观格局变化特征明显，耕地空间分布在建设用地扩张影响下趋于分散，破碎化程度加大，损失度增加；水域破碎度指数先下降后上升，总体破碎度呈增大趋势，景观受外界干扰增加；林地破碎度、干扰度和脆弱度呈下降趋势，斑块分布呈集聚态势；草地破碎度指数先上升后下降，总体破碎度呈下降趋势，空间分布趋于集聚，景观损失度降低。③2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险等级总体呈上升趋势，其中高风险区、较高风险区面积显著扩大，占比分别增加8.10%、6.61%，空间分布上主要集中在南部淀山湖、白莲湖等水域密集地区，并有进一步向外围蔓延发展的趋势；较低风险区、低风险区面积缩减明显，占比分别下降8.25%和9.73%；景观生态风险以低风险等级向更高一级转变为主，绿色空间受人工建设干扰生态风险不断增强。④依据景观生态风险等级变化特征将研究区划分为重点修复区、协调缓冲区和优化利用区。
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图 1 黄薇总RNA琼脂糖凝胶电泳分析(A)和RT-qPCR扩增产物特异性(B)
Figure 1 Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA (A) and specificity of products amplified by RT-qPCR (B) in H. myrtifolia
图 3 geNorm分析9个候选内参基因的表达稳定值和配对变异值
Figure 3 Stable expression values and paired variation values of nine candidate reference genes were analyzed by geNorm
图 4 不同组织和干旱胁迫下CSLD (A)和SOD基因(B)利用不同内参基因的表达分析
Figure 4 Expression analysis for CSLD gene (A) and SOD gene (B) using different reference genes in different tissues and drought stress
表 1 黄薇候选内参基因引物信息
Table 1. Primer information of candidate reference gene in H. myrtifolia
基因 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 扩增大小/bp 退火温度/℃ 扩增效率/% R2 EF-1α TGGTTTTGAGGCTGGTATCTCC TTTGCTTGACACCAAGGGTGA 80 56.5 95.6 0.998 TUA TCTCTGCCTTGACCGAGTGA ACCACCAACGGCACTGAAAA 82 56.5 96.6 0.998 CYP ACCCCGACTCGTCCTACAAG TCGGTGTTCCGCTCCAAATG 130 58.0 106.8 0.999 GAPDH AGAAGGTCGTCATTTCTGCCC TGGTTGTGCAGCTAGCGTTG 114 57.5 108.4 0.999 18S RNA CAGGGCCTAGGATTTCGTCC GCCTTCAATCTTAGTCGTGGC 113 58.5 100.5 0.992 UBC GACCTGATGACACTCCCTGG TCACAGTTGGTGGTTTGTTCG 87 57.5 99.1 0.999 TUB GGGTGCTGAGCTTATTGATGC TGAGCAATGTCCCCATGCCT 131 57.5 96.8 0.996 ACT AGGGAATGCCTTTTGATTGATCC AAACATAAGCTCCACTGCCCTC 102 57 109.7 0.999 DNA J CGGAGCTATCACCCCGATG CGGCCTCACCATACCTGTCA 127 59.5 100.2 0.997 CSLD TACCTTGTCCCTTTCGGCG TCAGCGTCCTCATCCCGATA 149 57.4 95.1 0.997 SOD GTTGACGCAAGACGAGGGA CCGTTGGTCGTGTCACCAT 108 57.3 96.0 0.997 
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表 2 NormFinder分析内参基因的表达稳定值
Table 2. Expression stability values of nine candidate reference genes calculated by the NormFinder
基因 不同组织 干旱胁迫 全部样品 表达稳定值 排序 表达稳定值 排序 表达稳定值 排序 GAPDH 0.069 2 0.142 1 0.359 1 UBC 0.593 5 0.452 3 0.578 2 EF-1α 0.904 6 0.800 5 0.862 3 TUA 1.483 9 0.239 2 0.910 4 CYP 0.069 1 0.611 4 0.911 5 DNA J 0.579 4 1.479 6 1.094 6 18S RNA 0.494 3 1.542 8 1.366 7 ACT 1.095 7 1.507 7 1.390 8 TUB 1.294 8 1.816 9 1.505 9
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表 3 BestKeeper分析内参基因的表达稳定值
Table 3. Expression stability values of nine candidate reference genes calculated by the BestKeeper
基因 不同组织 干旱胁迫 全部样品 CV±SD 排序 CV±SD 排序 CV±SD 排序 EF-1α 3.46 ± 0.95 2 1.97 ± 0.53 1 2.58 ± 0.71 1 GAPDH 2.65 ± 0.69 1 3.78 ± 0.94 4 3.59 ± 0.91 2 UBC 3.73 ± 1.04 4 4.32 ± 1.18 5 4.21 ± 1.16 3 TUB 3.47 ± 1.06 3 6.14 ± 1.86 9 4.98 ± 1.51 4 TUA 6.65 ± 1.89 8 3.52 ± 0.95 3 5.26 ± 1.45 5 ACT 5.03 ± 1.46 5 6.11 ± 1.84 8 5.72 ± 1.69 6 CYP 6.36 ± 1.99 6 3.34 ± 0.96 2 6.11 ± 1.83 7 DNA J 7.31 ± 2.18 9 6.11 ± 1.81 7 6.81 ± 2.03 8 18S RNA 6.57 ± 2.05 7 5.68 ± 1.64 6 7.61 ± 2.28 9
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表 4 RefFinder分析内参基因的表达稳定值
Table 4. Expression stability of candidate reference genes ranked by RefFinder
排序 不同组织 干旱胁迫 全部样品 基因 表达稳
定值基因 表达稳
定值基因 表达稳
定值1 GAPDH 1.41 GAPDH 1.19 GAPDH 1.19 2 CYP 2.11 TUA 1.86 UBC 2.11 3 18S RNA 3.57 EF-1α 3.34 EF-1α 2.45 4 UBC 4.76 UBC 3.41 TUA 4.28 5 TUB 4.76 CYP 4.00 CYP 5.23 6 EF-1α 5.05 ACT 6.70 DNA J 6.45 7 ACT 5.12 DNA J 6.96 ACT 6.73 8 DNA J 5.44 18S RNA 7.20 TUB 6.84 9 TUA 9.00 TUB 9.00 18S RNA 7.45
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