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叶绿体基因组为植物质体遗传体系之一，是由大单拷贝区(LSC)、小单拷贝区(SSC)以及穿插在它们之间的一对碱基组成相同、排列方向相反的反向重复区(IR)构成的环状双链四分体，通常编码约130个主要与光合作用以及叶绿体自身复制相关的基因[1−2]。叶绿体基因组是研究植物物种鉴别、进化生物学和遗传多样性的新思路，并且已有较多的应用实例。SONG等[3]比较了27种安息香属Styrax植物的叶绿体基因组序列，筛选出6个高突变序列，其中ycf1b和trnT-trnL是安息香属物种鉴别的特异性DNA条形码。LIU等[4]利用叶绿体基因组序列探讨了11种燕麦属Avena植物的系统进化关系，支持燕麦属的单系性，并且认为该属包括2个遗传支系。JO等[5]基于饲料作物大花野豌豆Vicia bungei的叶绿体简单重复序列(SSR)开发出232个分子标记，并将其中39个分子标记应用于野豌豆属Vicia中7个物种的遗传多样性分析。
了哥王Wikstroemia indica是瑞香科Thymelaeaceae荛花属Wikstroemia常绿灌木植物，全株有毒，分布于中国广东、广西、海南、福建、湖南、浙江、云南、贵州、四川以及台湾等大部分省区，多见于海拔1 500 m以下开旷的林下或石山上，野生时一般分布在山坡灌木丛中或路边、村边等[6]。了哥王的干燥根及根皮可入药，能清热解毒、消肿散结、止痛，多用来治疗支气管炎、肺炎、乳腺炎等多种炎症以及跌打损伤[7]，已被开发成了哥王片、了哥王胶囊、了哥王颗粒、祛伤消肿酊等制剂。了哥王含有黄酮、木质素、香豆素、甾体、挥发油等化学成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理活性[8−9]。了哥王根叶煮汁可作杀虫剂，茎皮纤维可以制作高级纸张和人造棉[6]。了哥王还是一种观赏性园林植物[10]。因此，了哥王具有较高的药用、经济和社会价值。
了哥王原以野生采收为主要来源，随着市场需求的快速增加，了哥王遭到过度开采，不少产地的野生蕴藏量急剧下降，出现资源匮乏甚至枯竭的情况[11]。本研究分析了哥王叶绿体基因组序列的结构和基因组成、密码子偏好性、SSR等特征，比较了哥王与近缘植物的叶绿体基因组序列差异，并基于叶绿体基因组探究了哥王的进化位置，旨在为了哥王的品种鉴定、育种栽培、遗传背景和系统进化等资源保护和可持续利用提供科学依据。
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了哥王植株于2022年6月采自广西壮族自治区钦州市钦北区，经广东医科大学天然药物研究与开发重点实验室吴科锋研究员鉴定。取了哥王植株的新鲜叶片，使用北京康为世纪生物科技公司生产的磁珠法植物DNA提取试剂盒提取了哥王的总DNA，随后采用美国Illumina公司生产的NexteraXT DNA测序文库制备试剂盒构建了哥王的叶绿体基因组测序文库。
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通过美国Illumina公司的Novaseq 6000高通量测序平台完成了哥王叶绿体基因组测序。测得的原始序列经滤除试剂盒附带的接头序列和含有无法确定碱基的劣质序列后，获得合格的可分析读序。采用SPAdes软件对可分析读序进行序列拼接，并运用plastid genome annotator软件对序列中含有的基因进行功能注释。拼接和注释后的了哥王叶绿体基因组序列和基因信息提交至GenBank保存(序列登记号为OQ831641)，并提交到OGDRAW在线工具(
https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html )绘制物理图谱。 -
参照黄琼林[12]的研究，采用CodonW v1.3软件计算了哥王叶绿体基因组全部密码子的相对同义密码子使用情况(RSCU)值，评价其使用频率，RSCU＞1为高频使用密码子。参照吴民华等[13]的研究，使用MISA软件(
https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/ )检索了哥王的SSR，分析其类型、组成基序、数量和分布等特点。 -
利用IRscope在线软件(
https://irscope.shinyapps.io/irapp/ )比较了哥王与同属植物细轴荛花W. nutans (MW393702)、荛花W. canescens (MW073911)、头序荛花W. capitate (MW073909)以及同科植物长柱瑞香Daphne championii (MT648376)叶绿体基因组IR边界(即IR贴近相邻LSC或SSC的碱基)的位置差异。采用设置为Shuffle-LAGAN模式的mVISTA软件(https://genome.lbl.gov/vista/index.shtml )进行前述5种瑞香科植物叶绿体基因组的多重序列比对，明确它们之间的碱基差异。 -
为探究了哥王在荛花属和瑞香科内的进化关系，在GenBank中下载已公开发布的瑞香科及其相关类群菱科Trapaceae、桃金娘科Myrtaceae植物叶绿体基因组序列，并以与了哥王亲缘关系较远的单子叶植物高良姜Alpinia officinarum的叶绿体基因序列作为外群，将所有下载序列与本研究测得的了哥王叶绿体基因组序列一起提交到MAFFT软件进行多重比对及对齐，随后导入设置为GTRGAMMA模型的RAxML软件构建系统进化树。
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如图1所示：了哥王叶绿体基因组由位于1~86 347 bp的LSC、86 348~112 805 bp的IRA、112 806~123 407 bp的SSC和123 408~149 864 bp的IRB依顺时针排列而成，呈现为149 864 bp的环状双链四分体分子。了哥王叶绿体基因组的GC含量较低，仅为37.5%。
图 1 了哥王叶绿体基因组
Figure 1. Chloroplast geome of W. indica
从表1可见：了哥王叶绿体共有124个基因，包括79个蛋白质编码基因、8个核糖体RNA基因和37个转运RNA基因。这些基因中有14个基因(trnK-UUU、rps16、trnG-UCC、atpF、rpoC1、trnL-UAA、trnV-UAC、petB、petD、rpl16、rpl2、ndhB、trnI-GAU、trnA-UGC)含有1个内含子，1个基因(ycf3)存在2个内含子；17个基因(ndhB、rps7、rpl2、rpl23、ycf1、ycf2、rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23、trnI-CAU、trnL-CAA、trnV-GAC、trnI-GAU、trnA-UGC、trnR-ACG、trnN-GUU)具有2个拷贝。
表 1 了哥王叶绿体基因组基因组成和功能注释
Table 1. Gene composition and annotation in W. indica chloroplast genome
基因类别 基因功能 基因名称 蛋白质编码基因 ATP合成酶 atpA, atpB, atpE, atpF1, atpH, atpI 细胞色素b/f复合物 petA, petB1, petD1, petG, petL, petN NADH脱氢酶 ndhB1*, ndhD, ndhE, ndhF, ndhH, ndhK 光合系统Ⅰ psaA, psaB, psaC, psaI, psaJ 光合系统Ⅱ psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbH, psbI, psbJ, psbK, psbL, psbM, psbN, psbT, psbZ 核糖体蛋白质小亚基 rps2, rps3, rps4, rps7*, rps8, rps11, rps12#, rps14, rps15, rps161, rps18, rps19 核糖体蛋白质大亚基 rpl21*, rpl14, rpl161, rpl20, rpl22, rpl23*, rpl32, rpl33, rpl36 RNA 聚合酶 rpoA, rpoB, rpoC11, rpoC2 假定叶绿体阅读框 ycf1*, ycf2*, ycf32, ycf4 其他基因 matK, rbcL, cemA, accD, ccsA, clpP 核糖体RNAs rrn4.5*, rrn5*, rrn16*, rrn23* 转运RNAs trnH-GUG, trnK-UUU1, trnM-CAU, trnI-CAU*, trnV-UAC1, trnF-GAA, trnL-UAA1, trnT-UGU, trnS- GGA, trnfM-CAU, trnG-GCC, trnS-UGA, trnT-GGU, trnE-UUC, trnY-GUA, trnD-GUC, trnC-GCA, trnR-UCU, trnG-UCC1, trnS-GCU, trnQ-UUG, trnW-CCA, trnP-UGG, trnL-CAA*, trnV-GAC*, trnI-GAU1*, trnA-UGC1*, trnR-ACG*, trnN-GUU*, trnL-UAG 说明：上标1表示含有1个内含子，上标2表示含有2个内含子，#表示反式剪接基因，*表示双拷贝基因。 -
通过CodonW软件，在了哥王叶绿体基因组的编码区共找到24 180个密码子，包括24 100个氨基酸编码密码子和80个终止密码子。如图2所示：61种氨基酸编码密码子编码20种氨基酸，终止密码子有3种。编码相同氨基酸的多种密码子即称为同义密码子，除了甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)外，其余18种氨基酸均有2~6种同义密码子。除了AUG (单独编码Met)和UGG (单独编码Trp)的RSCU为1外，有30种密码子的RSCU＞1，为高频使用密码子；其余32种密码子的RSCU＜1，属于低频使用密码子。在30种高频使用密码子中，有29种的第3位碱基是A/T，表明了哥王叶绿体基因组偏好使用A/T结尾的密码子。
图 2 了哥王叶绿体基因组密码子的RSCU值
Figure 2. RSCU value of all codon in W. indica chloroplast genome
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以设定的参数通过MISA软件查找，在了哥王叶绿体基因组中发现93个SSR，由72个单核苷酸、11个二核苷酸、4个三核苷酸、5个四核苷酸以及1个五核苷酸组成(表2)。在各类SSR中，A/T、AT/AT、AAT/ATT、AAAT/ATTT、AATAG/ATTCT分别是优势基序，数量依次是72、9、3、3、1个，分别占单核苷酸的100.0%、二核苷酸的81.2%、三核苷酸的75.0%、四核苷酸的60.0%和五核苷酸的100.0%。可见，由A/T及组合形成的基序数量最多，分别包括72个单核苷酸、9个二核苷酸、3个三核苷酸、4个四核苷酸，共占SSR总数的94.6%。因此，了哥王以A/T及组合形成的SSR居多，与其叶绿体基因组低GC含量的情况相符。在分布区域上来看，了哥王SSR主要分布在LSC，而SSC和IR较少；从所有位置上来看，这些SSR主要位于基因间隔区(IGS)，基因内含子次之，编码区(CDS)则最少。说明了哥王叶绿体SSR分布广泛且不均匀，多态性较为丰富。
表 2 了哥王叶绿体基因组SSR位点的统计
Table 2. Summaries of SSR loci in W. indica chloroplast genome
类型 重复基序 数量 分布区域 所在位置 LSC SSC IR IGS Intron CDS 单核苷酸 A/T 72 56 8 8 48 14 10 二核苷酸 AT/AT 9 9 0 0 5 3 1 AC/GT 1 1 0 0 1 0 0 AG/CT 1 1 0 0 1 0 0 三核苷酸 AAT/ATT 3 1 0 2 1 2 0 AAG/CTT 1 1 0 0 0 1 0 四核苷酸 AAAT/ATTT 3 2 1 0 1 1 1 AATC /ATTG 1 0 1 0 0 0 1 AATT/AATT 1 1 0 0 0 0 1 五核苷酸 AATAG/ATTCT 1 1 0 0 1 0 0 合计 93 73 10 10 58 21 14 说明：LSC为大单拷贝区；SSC为小单拷贝区；IR为反向重复区；IGS基因间隔区；Intron为内含子；CDS为编码区。 -
叶绿体基因组的2个IR在邻近LSC、SSC的位置形成边界，分别称作JLB (IRB-LSC)、JSB (IRB-SSC)、JSA (IRA-SSC)和JLA (IRA-LSC)。如图3所示：了哥王等4种荛花属植物的JLB均处于rpl19和rpl2之间的IGS，瑞香属Daphne植物长柱瑞香的JLB则在rpl16内。了哥王的JSB在ycf1内，细轴荛花的JSB在ycf1和rpl132之间的IGS，其余植物的JSB则在ndhF内。了哥王和细轴荛花的JSA都在ycf1内，且都在距离该基因5′端的1 085 bp处，其余植物的JSA则在rpl132和trnL之间的IGS。了哥王等4种荛花属植物的JLA均落在rpl2和trnH之间的IGS，长柱瑞香的JLA则位于rps3和trnH之间的IGS。由此可见，了哥王与其他4种植物的IR边界存在较为明显的差异(尤其是JSB)，说明叶绿体基因组在了哥王等瑞香科植物进化过程中发生了不同程度的IR扩张和收缩。
图 3 瑞香科5种植物叶绿体基因组IR边界的差异分析
Figure 3. IR boundaries divergence of chloroplast genomes from 5 Thymelaeaceae plants
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如图4所示：了哥王与细轴荛花的序列相似度最高，仅在psbE-petL、atpF-atpH等IGS看到少量的碱基突变，并且编码区的序列完全一致。了哥王与另外2种荛花属植物荛花、头序荛花有着较明显的序列差异，几乎所有的IGS、内含子等非编码区序列均可见碱基突变，而且psbA、trnK-UUU、rpoC2、rpoC1、rpoB、accD、rpoA等多个基因也可见变异。了哥王与不同属的长柱瑞香则存在更加显著的序列差异，说明叶绿体基因序列差异与物种的亲缘关系密切相关。
图 4 瑞香科5种植物叶绿体基因组的多重序列比对
Figure 4. Multiple alignment of chloroplast genome sequences from 5 Thymelaeaceae plants
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从图5可见：在科水平上，瑞香科、菱科、桃金娘科均形成独立的分支，并与外群高良姜分开。在瑞香科内，沉香属Aquilaria、荛花属和瑞香属各自形成分支，其中荛花属与瑞香属聚在一起，说明这2个属的亲缘关系更近。在荛花属内，9个物种大致聚成3个类群，类群Ⅰ包括荛花和互生叶荛花Wikstroemia canescens，类群Ⅱ含有小黄构W. micrantha、革叶荛花W. scytophylla和一把香W. dolichantha，类群Ⅲ则有了哥王、细轴荛花、北江荛花W. monnula、河朔荛花W. chamaedaphne和头序荛花。了哥王与细轴荛花最先聚成一个分支，表明它们具有最近的亲缘关系。
图 5 了哥王等植物的系统进化树
Figure 5. Phylogenetic tree among various plants including W. indica
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研究发现：了哥王叶绿体基因组由LSC、SSC和两者之间的一对IR形成，呈现为陆生植物叶绿体基因组典型的环状双链四分体结构[14−15]。了哥王叶绿体基因组长度为149 864 bp，也介于被子植物叶绿体基因组110~160 kb范围内[16]。了哥王叶绿体基因组的GC含量为37.5%，与被子植物如瑞香科瑞香属[17]、豆科Leguminosae和蝶形亚科Papilionoideae[18]、兰科Orchidaceae[19]等物种的叶绿体基因组普遍存在的较低GC含量相符。叶绿体基因组作为执行光合作用的细胞器，容易受到光照等自然因素造成的选择压力的影响，在长期的进化过程中，叶绿体基因组可能发生了碱基替换和基因重组，导致其GC含量降低。此外，较低GC含量的DNA更容易解链，推测可以促进叶绿体基因组的重组，从而更好适应自然选择。在基因数量和组成上，了哥王叶绿体基因组共有124个基因，以与光合作用相关的基因及叶绿体自身复制所需的基因为主，也符合被子植物叶绿体基因组的基因构成[20]。因此，了哥王叶绿体基因组具有植物叶绿体基因组的共性特征。
植物在自然选择、碱基突变的作用下会形成一套与其自身进化相适应的常用密码子，以执行编码氨基酸或终止氨基酸翻译的功能。本研究在了哥王叶绿体基因组发现30种高频使用密码子(RSCU＞1)，包括29种氨基酸编码密码子和1种终止密码子，这些高频使用密码子比其他同义密码子更常被使用。除了编码亮氨酸(Leu)的UUG，其他高频密码子的末位碱基都是A/T。而且，在编码Leu的6种同义密码子中，UUG是使用频率较高的密码子(RSCU=1.26)，排第3位，最高的是UUA (RSCU=1.84)，其次是CUU (RSCU=1.30)。由此可见，了哥王叶绿体基因组编码20种氨基酸以及终止密码子最常用都是末位碱基为A/T的密码子，具有一定的密码子使用偏好性。相同的密码子偏好性也出现在金银花大毛花Lonicera japonica ‘Damaohua’[21]、高良姜[12]、菠萝Ananas comosus[22]等植物中。
SSR为一种具有丰富多态性的显性DNA标记，是研究植物品种鉴别、多样性分析以及构建遗传图谱、辅助分子育种的有效手段。利用MISA软件对了哥王叶绿体SSR进行定位和统计，发现了哥王含93个叶绿体SSR，且以A或T碱基及其组成的基序，尤其是polyA或polyT单核苷酸为优势类型，以分布在LSC和IGS为主，与北陵鸢尾Iris typhifolia[23]、露兜树Pandanus tectorius[13]、闭鞘姜Helenia speciosa [24]等植物的SSR特点相同。
IR被认为是叶绿体基因组中序列最为保守的区域，但IR经常会发生扩张和收缩，从而引起IR乃至整个叶绿体基因组长度的变化。因此，IR边界是比较物种叶绿体基因组差异的重要指标。本研究发现：了哥王与细轴荛花同属近缘植物的IR边界特别是SSC和IRB之间的JSB具有明显的不同。并且全序列比对显示：了哥王与细轴荛花同属近缘植物在IGS (如psbE-petL、atpF-atpH)等非编码区具有碱基变异。这些结果提示叶绿体基因组序列可以为了哥王及其近缘物种的鉴别提供依据。此外，系统进化树也直观地展示了了哥王的进化位置及其与相关近缘植物的亲缘关系，聚类效果良好。
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本研究结果表明：了哥王叶绿体基因组为149 864 bp的环状双链四分体分子，GC含量为37.5%，含124个基因；偏好使用以A/T结尾的密码子；SSR以polyA或polyT单核苷酸为主。了哥王与细轴荛花具有最近的亲缘关系。
Analysis on chloroplast genome of Wikstroemia indica
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摘要:
目的 阐明药用植物了哥王Wikstroemia indica的叶绿体基因组结构特点及系统进化地位，为了哥王的资源保护和可持续利用提供科学依据。 方法 采用Illumina测序平台进行了哥王叶绿体基因组测序，并通过生物信息技术和软件进行序列拼接、注释以及比对和系统进化分析。 结果 了哥王叶绿体基因组全长为149 864 bp，由86 347 bp的大单拷贝区(LSC)、10 601 bp的小单拷贝区(SSC)以及穿插在它们之间均为26 458 bp的一对反向重复区(IR)构成，具有环状双链四分体结构，包含124个基因。在了哥王叶绿体基因组中共找到64种24 180个密码子，其中30种为高频使用密码子，高频使用密码子中又有29种是以A/T结尾；搜索到93个简单重复序列(SSR)，其中单核苷酸重复居多(72个)，且以A或T及两者组合形成的基序为优势基序。了哥王与近缘植物的叶绿体基因组IR边界存在较为明显的变异。序列比较和系统进化树显示了哥王与同属细轴荛花W. nutans具有最高的序列同源性。 结论 了哥王叶绿体基因组具有植物叶绿体基因组的典型结构，有密码子使用偏好性，含多态性较为丰富的SSR，且与细轴荛花的亲缘关系最近。图5表2参24 Abstract:Objective This study is aimed to clarify the structure traits of chloroplast genome and phylogenetic status of medicinal plant Wikstroemia indica, providing a scientific basis for the resource protection and sustainable utilization of W. indica. Method An Illumina high-throughput sequencing platform was employed to acquire the chloroplast genome sequence which was then assembled, annotated, compared and analyzed using bioinformatics technologies and software. Result The chloroplast genome of W. indica was an annular quadripartite molecule with a length of 149 864 bp and composed of a large single copy (LSC, 86 347 bp), a small single copy (SSC, 10 601 bp) and a couple of inverted repeat (IR, 26 458 bp) and 124 genes were annotated in the chloroplast genome. In the chloroplast genome there were a total of 24 180 codon, which were divided into 64 types of which 30 types of codon were used frequently and 29 of them ended with A/T. Altogether 93 chloroplast simple sequence repeat (SSR) were identified from the chloroplast genome with Mononucleotide being the predominate type taking up a number of 72 and the motifs formed by A/T contributing the most and obvious variations were observed in IR boundary between W. indica and closely related plants whereas sequence alignment and phylogenetic tree revealed that W. indica shared high sequence identity with W. nutans. Conclusion The chloroplast genome of W. indica exhibited typical structure of plant chloroplast genome, and possessed codon preference and several SSRs with rich polymorphism. Additionally, the chloroplast genome of W. indica showed the closest similarity to W. nutans. [Ch, 5 fig. 2 tab. 24 ref.] -
换锦花Lycoris sprengeri为石蒜属Lycoris球根花卉，春初出叶，叶片为带状，宽约1.0 cm，长约30.0 cm，叶顶钝圆；秋初开花，花茎高约60.0 cm，伞形花序4~6朵，6片倒披针形花瓣，长约4.5 cm，宽约1.0 cm；花多淡紫红色，花被顶端蓝色，花色花型丰富，是石蒜属特殊的复色花卉[1]。
目前，换锦花的花色性状改良主要以传统的种间杂交和选择育种为主，分子标记育种为辅的育种模式。徐炳声等[2]利用杂交授粉技术，以换锦花为母本，中国石蒜L. chinensis为父本，选育出粉白色的秀丽石蒜L.× elegans；张定成等[3]在安徽和淮南发现三倍体和二倍体野生换锦花资源，表明换锦花可能是由其他石蒜属植物杂交而来。然而换锦花生长周期长，在自然状态下授粉率低且结实少，种子萌发率低，制约了换锦花传统育种研究。为了克服传统杂交育种的缺陷，不少研究者利用现代分子生物学技术探索换锦花花色分子育种性状改良的有效手段[4−6]。花色苷生物合成途径是类黄酮生物合成的一个分支途径，主要由结构基因和调控基因共同调控，花色苷积累受光照、温度和水分等多种因素的影响，植物受到强光、低温、氮亏缺等逆境协迫时会大量合成花色苷以增强自身抗性[7]，花色苷的生物合成也受到植物体自身生长发育过程的影响[8]。大量研究表明：R2R3-MYB 是花色苷生物合成的重要调控因子，常与bHLH和WD40形成MBW复合体结合到结构基因启动子序列上共同调控葡萄Vitis vinifera、风信子Hyacinthus orientalis、苹果Malus pumila花色素苷的生物合成[9]。许振渊等[10]和侯朔等[11]克隆了换锦花R2R3-MYB转录因子LsMYB4和LsMYB5基因，周洋丽等[12]通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究发现LsMYB4和LsMYB5是换锦花花青素合成的抑制性转录因子。周洋丽[13]和薛惠敏等[14]成功克隆了换锦花LsANS、LsF3'H、LsUFGT1和LsUFGT2基因启动子序列，为研究换锦花花色形成的调控机制和遗传改良提供基础。为进一步探讨换锦花花色形成的调控网络，本研究根据换锦花花瓣(红色部分和蓝色部分)转录组信息筛选到与换锦花花色形成相关的差异R2R3-MYB转录因子LsMYB7并进行生物信息学分析，通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究该基因调控花色苷积累的相关功能，结果可为通过基因工程手段改良换锦花的花色奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
2019年8—9月于浙江农林大学石蒜属植物种质资源圃采集换锦花花瓣，取换锦花小花苞(2.0~3.5 cm)、大花苞(4.5~6.0 cm)、盛花期和败花期4个不同花发育时期(图1A)和不同花色无性系H1、H2、H3、H4和H5盛花期花瓣(图1B)，液氮速冻后于−80 ℃冰箱保存备用。
图 1 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系盛花期(B)Figure 1 Different stages of flower development (A) and peak flowering stage in different clonal plants (B)1.2 方法
1.2.1 换锦花花瓣总RNA提取和cDNA第1链的合成
采用RNAiso plus法提取换锦花花瓣总RNA[15]，参照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。
1.2.2 换锦花LsMYB7基因cDNA序列的PCR扩增
根据转录组测序信息设计LsMYB7基因 cDNA序列特异引物LsMYB7-F：CAAGCAGTGGTCTCAACA和LsMYB7-R：AGAACAGCACTACTAAAGGT，参照Premix PrimeSTAR HS的PCR扩增体系扩增目的基因cDNA序列，PCR扩增反应程序为94 ℃变性30 s；58 ℃ 退火30 s；72 ℃延伸90 s，32个循环，72 ℃延伸10 min，质量浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，于凝胶成像系统(Bio-RAD)观察拍照；采用Hingene琼脂糖凝胶回收试剂盒(杭州麦克德勒科技有限公司)回收目的DNA，于−20 ℃保存备用。
1.2.3 目的基因连接和转化
参照pEASY-Blunt Zero Cloning Kit说明书将目的基因LsMYB7序列连接到pEASY-Blunt载体，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞；在含有氨苄青霉素(Amp)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚 β-D-半乳糖苷(X-Gal)的LB培养基(Luria-Bertani medium)上培养过夜，挑取阳性克隆于LB液体(含50 mg·L−1 Amp)培养基中，37 ℃振荡培养，PCR检测呈阳性的菌液送浙江有康生物科技有限公司测序；采用质粒DNA提取试剂盒(杭州创试生物科技有限公司)提取目的序列重组质粒DNA，于−20 ℃保存。
1.2.4 LsMYB7及花色形成相关基因的表达
采用Primer 5.0设计LsMYB7基因和花色形成相关基因(LsCHS、LsF3H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2)的RT-qPCR引物(表1)，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。参照SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)方法，于CFX96TM荧光定量 PCR 仪(BIO-RAD)进行RT-qPCR验证。RT-qPCR体系(20.0 uL)：cDNA(＜100 ng) 1.6 uL，正反引物各0.8 uL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 uL，RNase Free ddH2O 6.8 uL。RT-qPCR程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循环40次。以LsGADPH为内参基因[15]，2−ΔΔCt方法计算实时荧光各基因的相对表达量，重复3次。
表 1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primers for fluorescence RT-qPCR引物 正向(5′→3′) 反向(5′→3′) LsGADPH AGGGTTTGATGACCACCGTGCA ACAGCCTTGGCAGCTCCAGTAC LsMYB7 GCGCGGAGTTCTTGGCTCTGAT TCTGGCACCGTTCTCATCACGC LsCHS CAAGACATGGTGGTGGTCGAGGTC CGAGGAGTTTGGTGAGCTGGTAGTC LsF3H AACCGAGGACGCAACGGAATGC ACCATCTTCATCGCAGCCACCA LsANS CGTGCCAGGTCTCCAGGTCTTCTA TCGAGAGTGTCACCGACGTGAACTA LsUFGT1 GGTGGTGAAGGATGAGGAAGGTAGG GTTGAACCGCTCGAACCGCAATC LsUFGT2
LsF3'HGCGTAGCCTTCTCCTTCCTCACCT
TTGTACAGCCATGCACAGAATCCGCCATGAATCGCTTCACCTCCTC
GCAACCAAGGCAAGAAATCA说明：引物参考文献[16]。 1.2.5 换锦花花瓣花色苷的HPLC测定
参照刘跃平等[17]方法提取并用高效液相色谱(HPLC)测定换锦花花瓣花色苷质量浓度。精密称量换锦花花瓣干粉0.040 0 g，加入2 mL体积分数为1%甲醇/HCl提取溶液，振荡混匀；20 ℃超声提取30 min；12 000 r·min−1，离心15 min，取上清液；0.45 μm滤膜过滤；梯度洗脱：流动相为甲醇(A)-体积分数为1%的甲酸水(B)，0~20 min(A体积分数从5%升至60%)，20~25 min(A体积分数从60%升至100%)，25~30 min(A体积分数保持100%)，流速1 mL·min−1，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 uL；以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷等3个花色苷为标准品。每样3个生物学重复。
1.2.6 亚细胞定位
采用XbaⅠ和BamHⅠ分步酶切法酶切亚细胞定位载体pAN580，再采用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit (杭州霆喜生物科技有限公司)将LsMYB7基因序列连接到pAN580上，并转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，在含有50 g·L−1Amp的LB培养基上进行筛选，挑选阳性克隆进行菌液PCR检测，成功构建pAN580-LsMYB7亚细胞定位载体，采用无内毒素质粒提取试剂盒(AxyPrep)提取pAN580-LsMYB7重组载体质粒DNA；聚乙二醇法(PEG 4000)转化烟草Nicotiana tabacum原生质体，用激光共聚焦荧光显微镜观察拍照。
1.2.7 VIGS沉默载体构建
采用双酶切法构建VIGS沉默载体pTRV2-LsMYB7：利用Primer 5.0设计长为400 bp的LsMYB7基因cDNA序列插入片段引物pTRV-LsMYB7-F: TACCGAATTCTCTAGAGAGGACAACATGCTACAATCCC和pTRV-LsMYB7-R：GCTCGGTACCGGATCCGCTCGAATCGCTAACATCCG；用限制性内切酶XbaI和BamHI分别双酶切VIGS载体(pTRV2)与LsMYB7基因的插入序列，T4 DNA连接酶连接载体与目的序列，转化大肠埃希菌DH5α，并在含有50 g·L−1 卡那霉素(Kan)的LB固体培养基筛选，提取pTRV2-LsMYB7重组质粒DNA。
1.2.8 换锦花花瓣瞬时转化
采用微量注射法转化换锦花花苞[12]，将重组质粒pTRV2-LsMYB7、pTRV2和pTRV1质粒DNA转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，于YEP液体培养基(50 mg·L−1 Rif和50 mg·L−1 Kan)中，28 ℃，220 r·min−1振荡培养12~14 h；4 000 r·min−1, 离心10 min，去上清液；加入侵染液(10 mmol·L−1 MES + 200 μmol·L−1 AS + 10 mol·L−1 MgCl2，pH 5.6±0.03)重悬后的菌液D(600)=0.8~1.0；将pTRV1与pTRV2空载体、pTRV2-LsMYB7农杆菌液按照体积比1∶1混合均匀，室温黑暗静置4~6 h；使用1 mL注射器，吸取1 mL混合农杆菌菌液。选取3~4 d的换锦花花苞，在花苞基部缓慢注射混合根癌农杆菌菌液，充分侵染换锦花花苞，侵染5 d后采集花瓣用于LsMYB7和花色形成相关结构基因的表达分析(见1.2.4和表1)。
1.2.9 数据统计分析与作图
采用Excel 2020 统计和整理数据，采用SPSS 20.0 对数据进行差异显著性分析，采用Graphpad 8.0作图。
2. 结果与分析
2.1 LsMYB7 基因的克隆和序列分析
以换锦花花瓣的cDNA为模板，采用RT-qPCR技术扩增获得长度为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列(图2)。该cDNA序列含有1个825 bp的开放阅读框(ORF)，编码274个氨基酸，分子量为6.84 kD，蛋白分子式为C2402H3981N825O982S258，理论等电点(pI)为5.04，不稳定系数为43.43，总体亲水性(GRAVY)为0.936。
2.2 LsMYB7氨基酸序列同源性分析
通过与美国国家生物技术信息中心(NCBI)搜索的其他植物MYB氨基酸同源序列进行比对，发现换锦花LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3[18](图3)，属于R2R3-MYB类转录因子。与茶Camellia sinensis KAF5956278.1、狭叶油茶Camellia lanceoleosa KAI8015846.1、粗柄象腿蕉Ensete ventricosum RRT35038.1/RWV93016.1、椰子Cocos nucifera XP_KAG1363931.1、番红花Crocus sativus QBF29477.1、香根鸢尾Iris pallida KAJ6804060.1/KAJ6829988.1、河岸葡萄Vitis riparia XP_034676575.1和拟南芥Arabidopsis thaliana等其他植物的同源性为44.52%~60.57%，其中，与茶KAF5956278.1的同源性最高达60.57%，其次是香根鸢尾 KAJ6804060.1/KAJ6829988.1(59.32%)，与拟南芥AtMYB44(Q9FDW1.1)、AtMYB70(AEC07437.1)、AtMYB73(O23160.1)和AtMYB77(Q98N12.1)的同源性为44.52%~47.44%，且同源部分均集中在N端的R2R3 DNA结合结构域，而C端的同源性较低。
图 3 LsMYB7与其他植物的R2R3-MYB氨基酸同源序列比对Figure 3 Comparison of R2R3-MYB amino acid homologous sequences between LsMYB7 and other plants, R2R3-MYB2.3 LsMYB7系统进化与功能预测
从NCBI数据库下载拟南芥(AtMYB 16条)、换锦花(LsMYB 2条)和石蒜L. radiata (LrMYB 2条) R2R3-MYB氨基酸序列进行比对并构建系统进化树(图4)。参考拟南芥MYB基因家族的分类方法[19]，LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB S22亚家族的AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77 聚为一类，由于拟南芥S22亚家族参与调控拟南芥的生长和发育过程，响应高盐、干旱低温等非生物胁迫反应，同一亚族基因的功能相似，结合花色基因表达分析，推测LsMYB7可能通过响应干旱和高温等调控换锦花花瓣花色苷的形成。
图 4 LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB蛋白系统进化树Figure 4 Phylogenetic tree between LsMYB7 and R2R3-MYB from A. thaliana2.4 换锦花花瓣花色苷质量浓度
利用HPLC分别测定换锦花4个花发育时期和5个不同花色无性系(H1、H2、H3、H4和H5)盛花期花瓣的花色苷质量浓度(图5A和5B)，结果表明：换锦花花瓣花色苷的主要成分为矢车菊素，含有少量的天竺葵素和飞燕草素，说明花色苷的种类和质量浓度决定换锦花花色的多样性。随着换锦花花器官的生长发育，花瓣花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度呈逐渐下降的趋势，小花苞时期矢车菊素质量浓度大约是败花期的3倍，说明换锦花花瓣花色苷的积累可能主要在花瓣发育的早期完成(图1A和5A)；在浅色换锦花无性系H4和H5中，矢车菊素质量浓度明显低于深色换锦花无性系H1、H2和H3(图1B和5B)。因此，从换锦花不同花发育时期和不同花色无性系花瓣颜色和花色苷质量浓度来看，矢车菊素对换锦花花瓣的颜色影响最大，矢车菊素质量浓度越高，换锦花花瓣的颜色就越深。
图 5 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系(B)花瓣的花色苷质量浓度Figure 5 Anthocyanin contents in petals of different stages of flower development (A) and different clones (B) of L. sprengeri2.5 换锦花LsMYB7和花色形成相关基因的表达
2.5.1 在换锦花不同发育时期的表达
利用RT-qPCR对LsMYB7和换锦花花色形成相关基因(LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS和LsUFGT1、LsUFGT2)在换锦花不同发育时期花瓣中的表达进行分析，结果(图6)表明：LsMYB7与LsCHS和LsF3'H基因的表达随着换锦花花苞发育呈逐渐上升趋势，LsC4H、LsCHS、LsUFGT1、LsUFGT2、LsF3'H和LsMYB7在败花期大量表达，LsF3H则在花苞发育前期几乎无表达，盛花期开始大量表达，而在败花期表达量开始下降；LsANS、LsUFGTs等花色苷合成的后期基因在盛花期的表达最低。其中LsCHS和LsF3'H基因的表达与花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度正好相反(图5A)。
图 6 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同花发育时期的表达Figure 6 Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower development stages2.5.2 在换锦花不同花色无性系花瓣中的表达
LsMYB7和换锦花花色形成关键基因LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2在换锦花不同花色无性系中的表达差异显著(图7)。2个花色苷合成的前期基因LsC4H和LsCHS及后期基因LsANS在淡色的无性系换锦花花瓣中表达量高。LsF3H在蓝色为主的H3无性系中表达量达到最高。LsMYB7在H1和H4中表达量比较高。LsMYB7基因的表达与LsCHS和LsF3'H基因的表达正好相反，而与不同花色无性系花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度基本一致，这一结果与不同花发育时期的基因表达结果一致。因此，LsMYB7可能对LsCHS和LsF3'H基因的表达有一定的调控作用。
图 7 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同无性系中的表达Figure 7 Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower clones2.6 换锦花LsMYB7基因的亚细胞定位
通过双酶切法构建亚细胞定位载体pAN580-LsMYB7，转化烟草原生质体，于激光共聚焦荧光显微镜观察，LsMYB7荧光信号定位在细胞核中(图8)，说明LsMYB7基因为转录因子基因，在细胞核中起转录调控的作用。
2.7 LsMYB7基因沉默后对换锦花花瓣花色苷形成相关基因表达的影响
构建LsMYB7的VIGS基因沉默载体pTRV2-LsMYB7，通过微量注射法转化换锦花花苞，LsMYB7 基因沉默后，换锦花同朵花中一半花瓣明显变短，且颜色变深(图9A)；对LsMYB7和花色苷形成相关基因在换锦花花瓣中的表达进行分析(图9B和C)，与ck (空载)相比，LsMYB7基因换锦花花瓣中的表达量明显下降，同时，花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达量极显著下降(P＜0.01)，而LsF3H基因的表达量反而上升，LsC4H基因表达变化不大，说明LsMYB7转录因子可能参与调控花瓣的生长发育，且对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达起正调控作用，而对LsF3H基因的表达起负调控作用。
图 9 LsMYB7基因沉默后表型变化及花色苷形成相关基因的表达Figure 9 Phenotype and relative expression levels of LsMYB7 and genes related to anthocyanin biosynthesis after LsMYB7 silencedA.表型变化；B. LsMYB7基因的表达；C. 花色苷形成相关基因的表达**表示差异极显著(P＜0.01)3. 讨论
植物R2R3-MYB转录因子广泛参与调控次生代谢、细胞形态发生、激素刺激、环境胁迫应答、分生组织形成和细胞周期等过程[20]。根据C-末端的不同，拟南芥R2R3-MYB基因家族可分成22个不同的亚族，其中，拟南芥S4、S5、S6和S7亚族基因参与花青素和类黄酮类化合物生物合成途径的结构基因的转录调控[18, 21−22]，换锦花LsMYB4、LsMYB5和拟南芥S4亚族基因聚为一类。通过花青素形成相关基因表达和VIGS基因沉默技术研究表明，LsMYB4和LsMYB5对花青素生物合成基因的表达有负调控的作用[10−12]。
S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70主要参与拟南芥响应高盐、干旱、低温等非生物胁迫反应，其中，AtMYB73基因启动子中含有ABA响应元件ABRE及干旱胁迫和热胁迫顺式作用元件。AtMYB73突变体atmyb73在干旱胁迫处理下，ABA 下游基因ABI2、ABI5 的表达水平均较野生型明显增强。外源 ABA 处理野生型和突变体种子、幼苗，获得了与干旱胁迫处理类似的结果[23−24]。本研究结果表明：LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3，属R2R3-MYB类转录因子，且R2和R3的保守结构域与其他植物高度同源，系统进化树分析结果显示LsMYB7和S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70聚为一类，推测LsMYB7可能与S22亚族基因有相似的功能。
本研究中，LsMYB7基因的表达与换锦花花色苷形成相关基因LsCHS、Ls4CL2和LsUFGT2的表达趋势一致，推测LsMYB7可能参与换锦花花瓣花色苷的生物合成。而LsMYB7属于拟南芥S22亚族，未见该亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70参与花色苷的生物合成的转录调控。已有报道认为AtMYB73/44能够参与调控拟南芥对干旱胁迫的响应[25−26]，而干旱胁迫可诱导植物细胞合成和积累花色苷。花色苷的光化学性质、亚细胞积累位点及在植物器官、组织中的空间分布决定了花色苷能强化植物的耐旱性，其中，花色苷提高植物细胞在干旱胁迫下的抗氧化能力可能是花色苷强化植物耐旱性的主要原因[27]。有研究表明：干旱胁迫可激活紫麦Triticum aestioum ‘Guizi 1’、甘薯Ipomoes batats等植物花色苷合成相关基因表达，通过提高花青素含量抵御干旱胁迫[28−29]。本研究中LsMYB7 基因沉默后，花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达明显下降，说明LsMYB7可能直接或间接调控花色苷的积累，而LsMYB7与S22亚族基因聚为一类，由于换锦花开花季为夏末秋初的8—9月，此时多为高温和干旱季节，因此推测LsMYB7可能通过对干旱胁迫响应来调控花色苷形成相关基因的表达，大量积累花色苷。这一研究结果与云南文山辣椒Capsicum annuum、番茄Lycopersicon esculentum的研究[30−31]相似，因此，植物可以通过干旱胁迫激活与花色苷合成相关基因的表达水平促进花色苷积累，进而提高抗旱能力。
4. 结论
本研究通过RT-qPCR获得长为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列，开放阅读框(ORF) 825 bp，编码274个氨基酸，LsMYB7为R2R3-MYB转录因子家族，定位于细胞核，与其他植物R2R3-MYB有较高的同源性。系统进化分析表明LsMYB7和参与调控干旱等非生物胁迫响应的S22亚族基因聚为一类；LsMYB7基因主要在败花期和花色苷含量较高的H1无性系中表达，与花色苷合成相关基因的表达趋势一致；LsMYB7基因沉默后，换锦花部分花瓣明显变短，颜色变深，LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2等花色苷形成相关基因的表达显著下调，因此，LsMYB7参与调控换锦花花瓣的生长发育，且通过对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2花色苷形成相关基因的表达调控花色苷的积累。此外，LsMYB7可能通过响应干旱胁迫激活花青素合成相关基因表达促进花色苷积累，进而提高换锦花的抗旱能力，LsMYB7调控花色苷积累抵御干旱的机制需要进一步研究。
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图 2 了哥王叶绿体基因组密码子的RSCU值
Figure 2 RSCU value of all codon in W. indica chloroplast genome
图 3 瑞香科5种植物叶绿体基因组IR边界的差异分析
Figure 3 IR boundaries divergence of chloroplast genomes from 5 Thymelaeaceae plants
图 4 瑞香科5种植物叶绿体基因组的多重序列比对
Figure 4 Multiple alignment of chloroplast genome sequences from 5 Thymelaeaceae plants
表 1 了哥王叶绿体基因组基因组成和功能注释
Table 1. Gene composition and annotation in W. indica chloroplast genome
基因类别 基因功能 基因名称 蛋白质编码基因 ATP合成酶 atpA, atpB, atpE, atpF1, atpH, atpI 细胞色素b/f复合物 petA, petB1, petD1, petG, petL, petN NADH脱氢酶 ndhB1*, ndhD, ndhE, ndhF, ndhH, ndhK 光合系统Ⅰ psaA, psaB, psaC, psaI, psaJ 光合系统Ⅱ psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbH, psbI, psbJ, psbK, psbL, psbM, psbN, psbT, psbZ 核糖体蛋白质小亚基 rps2, rps3, rps4, rps7*, rps8, rps11, rps12#, rps14, rps15, rps161, rps18, rps19 核糖体蛋白质大亚基 rpl21*, rpl14, rpl161, rpl20, rpl22, rpl23*, rpl32, rpl33, rpl36 RNA 聚合酶 rpoA, rpoB, rpoC11, rpoC2 假定叶绿体阅读框 ycf1*, ycf2*, ycf32, ycf4 其他基因 matK, rbcL, cemA, accD, ccsA, clpP 核糖体RNAs rrn4.5*, rrn5*, rrn16*, rrn23* 转运RNAs trnH-GUG, trnK-UUU1, trnM-CAU, trnI-CAU*, trnV-UAC1, trnF-GAA, trnL-UAA1, trnT-UGU, trnS- GGA, trnfM-CAU, trnG-GCC, trnS-UGA, trnT-GGU, trnE-UUC, trnY-GUA, trnD-GUC, trnC-GCA, trnR-UCU, trnG-UCC1, trnS-GCU, trnQ-UUG, trnW-CCA, trnP-UGG, trnL-CAA*, trnV-GAC*, trnI-GAU1*, trnA-UGC1*, trnR-ACG*, trnN-GUU*, trnL-UAG 说明：上标1表示含有1个内含子，上标2表示含有2个内含子，#表示反式剪接基因，*表示双拷贝基因。 
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表 2 了哥王叶绿体基因组SSR位点的统计
Table 2. Summaries of SSR loci in W. indica chloroplast genome
类型 重复基序 数量 分布区域 所在位置 LSC SSC IR IGS Intron CDS 单核苷酸 A/T 72 56 8 8 48 14 10 二核苷酸 AT/AT 9 9 0 0 5 3 1 AC/GT 1 1 0 0 1 0 0 AG/CT 1 1 0 0 1 0 0 三核苷酸 AAT/ATT 3 1 0 2 1 2 0 AAG/CTT 1 1 0 0 0 1 0 四核苷酸 AAAT/ATTT 3 2 1 0 1 1 1 AATC /ATTG 1 0 1 0 0 0 1 AATT/AATT 1 1 0 0 0 0 1 五核苷酸 AATAG/ATTCT 1 1 0 0 1 0 0 合计 93 73 10 10 58 21 14 说明：LSC为大单拷贝区；SSC为小单拷贝区；IR为反向重复区；IGS基因间隔区；Intron为内含子；CDS为编码区。
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