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森林生态系统是陆地生态系统的主体，在减缓全球变暖方面具有不可替代的作用[1]。净生态系统生产力(net ecosystem productivity, NEP)作为净初级生产力和异养呼吸的差值，是表征生态系统碳收支的重要指标，被广泛应用于定量描述森林生态系统碳源/汇的能力。然而，大气温室气体浓度的增加使大气持水能力不断增强，显著增加了暴雨发生的频率和强度[2−3]，已成为影响森林NEP最大的因子之一[4]。中国位于北半球中高纬度地区，跨越不同的气候带，不同地区气候条件、植被生长异质[5]，使得中国极端降水及森林碳汇具有明显的区域特征，并且NEP对极端降水的响应也不同。因此，开展区域碳源/汇分布及其对极端降水响应研究，对气候灾害预防和生态保护具有重要意义。
准确估算极端降水时空格局是研究森林NEP响应极端降水的前提。相对阈值法是评判极端降水的常用方法，充分考虑了降水的地区间差异和季节因素[6]，具有极端性弱、噪声低、显著性强等优点，可以更客观地分析极端降水的气候特征和变化趋势[7]。遥感观测协同生态过程模型不仅能估算森林NEP时空动态，更能帮助分析NEP对气候的响应机制，在区域NEP时空动态研究中具有显著优势[8]。InTEC模型是CHEN等[9]开发的融入森林年龄及干扰影响的生态系统模型，能更准确地模拟长期森林碳循环动态变化，在省域[10]和全国[11]尺度均得到了广泛应用。结构方程模型综合了方差、回归、路径和因子等统计分析方法，能模拟多因子的内在逻辑关系，综合评估因果联系和潜变量关系，已被广泛应用于生态学领域[12]。本研究以浙江省丽水市为研究区域，通过百分位阈值法分析1979—2079年极端降水时空演变特征，采用InTEC模型模拟不同情景下丽水市森林NEP时空格局，并构建结构方程定量分析丽水市森林NEP对极端降水的响应。研究结果将为丽水森林生态系统响应与适应全球气候变化提供理论支持，为维持和提升其植被碳汇功能提供依据。
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丽水市位于浙江省西南部(27°25′~28°57′N，118°41′~120°26′E)，森林面积为142.14 万hm2，森林覆盖率达82.27%，蓄积量为0.96 亿m 3，森林类型主要为亚热带针叶林、阔叶林和竹林等。林地的净初级生产力年总量与浙江省平均相比，所占比例较高[13]。丽水市地势西南高东北低，西南部以中山为主，东部以低山为主，中间有中山以及河谷盆地。全市主要气候类型为亚热带湿润季风气候，光照充足、四季分明、雨量丰沛。年均降水量为1 598.9 mm，多集中在3—9月，6月最多，是降水较为丰富的地区，也是极端气候事件多发的地区[14]。
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本研究利用百分位法描述极端降水时空特征，将月尺度的降水量从小到大排序，取其第95百分位值作为极端降水量阈值(mm·月−1)[15]。如果某月降水量超过这一阈值，则称该月发生了极端降水事件，累积该月降水量即为年极端降水量(mm·a−1)，并定义该年发生极端降水月数为极端降水频度(次·a−1)。最后，将极端降水量除以极端降水频度为极端降水强度(I)。
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本研究使用InTEC模型模拟丽水市1979—2079年森林生态系统NEP，主要包括气象、土壤、森林年龄、参考年净初级生产力、氮沉降、二氧化碳(CO2)浓度及森林分布信息等时空分布数据。
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1979—2015年丽水市气象数据来源于中国气象局国家气象中心丽水市地面日值气象数据(
https://data.cma.cn )，包括最高气温、最低气温、降水量、太阳辐射及相对湿度。通过反距离加权插值法获得空间分辨率为1 km的日尺度栅格气象数据，然后通过累计获得月尺度气象数据。2016—2079年气象数据则采用第5次国际耦合比较计划(Coupled Model Intercomparison Project Phase 5, CMIP5)的3种气候情景RCP 2.6、RCP 4.5和RCP 8.5获得，并通过最近邻法重采样到1 km分辨率。 -
利用最大似然法从Landsat5 TM数据中提取2004年丽水市针叶林、阔叶林、竹林等30 m分辨率森林分布信息。为了保持数据空间分辨率的一致性，采用局部平均法获取1 km森林丰度信息。具体步骤见文献[16]。
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土壤数据包括土壤粉粒百分比、砂粒百分比、黏粒百分比、土壤深度、土壤有效持水力、土壤容重以及土壤萎蔫点。其中前3个数据来源于联合国粮食和农业组织及国际应用分析学会共同开发的全球土壤数据库(HWSD 1.2，
https://iiasa.acat/Research/LUC/luc07/External-World-soil-database )。土壤容重使用Saxton改进的Brooks-Corey模型，结合土壤粉粒、砂粒、黏粒百分比来计算，土壤萎蔫点也根据粉粒、砂粒、黏粒百分比计算所得[17]。 -
根据浙江省森林资源清查小班数据提供的森林年龄信息，在对2004年浙江省森林资源样地清查年龄信息统计的基础上，利用克里金插值法得到2004年浙江省丽水市1 km分辨率的森林年龄空间分布数据。
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1979—1999年的CO2浓度数据来源于全球监测地球系统研究实验室(
https://www.esrl.noaa.gov/gmd/ccgg/trends )；2000—2079年RCP 2.6、RCP 4.5和RCP 8.5等3种情景下模拟的CO2浓度数据来自典型浓度路径(representative concentration pathways，RCPs)数据库(https://tntcat.iiasa.ac.at/RcpDb )，使用线性插值将10 a尺度的CO2浓度数据插值成年尺度。 -
氮沉降数据来源于全球格点大气总估计的无机氮、氮氢化合物和氮氧化物沉降量。1860、1993和2050年的氮沉降数据利用全球三维化传输模型(TM 3)模拟得到(
https://doi.org/10.3334/ORNLDAAC/830 )。本研究采用线性插值得到丽水市1979—2079年1 km空间分辨率的氮沉降数据。 -
本研究将2004年作为参考年校正初始的净初级生力值，使用BEPS模型模拟丽水市1 km分辨率净初级生力。具体模拟过程参考文献[18]。
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本研究利用最小二乘法计算线性回归模型的斜率来分析变量的时空演变特征(θ)。计算公式为：
$$ \theta = \frac{{n\displaystyle \sum\limits_{i = 1}^n {{x_i}{y_i} - \displaystyle \sum\limits_{i = 1}^n {{x_i}\displaystyle \sum\limits_{i = 1}^n {{y_i}} } } }}{{n\displaystyle \sum\limits_{i = 1}^n {{x_i}^2 - {{\left(\displaystyle \sum\limits_{i = 1}^n {{x_i}} \right)}^2}} }} 。 $$ (1) 式(1)中：n为年的总数；xi为年($ i $=1，2，…，50)；yi为第i年的变量值。θ＞0表示上升趋势，＜0表示下降趋势。
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偏最小二乘(partial least square, PLS)通径分析是结构方程模型估计方法，可用以分析多变量之间的线性统计关系，可以有效解决多变量复共线问题，适用于变量多重相关或样本容量较小的情况，能克服变量数据分布复杂和变量之间相关的问题[12]。本研究采用该方法定量分析气候因子对NEP影响的相对重要程度及NEP驱动因子的直接作用和间接作用，在SmartPLS 3.3.9软件中进行。
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通过百分位阈值法计算月尺度的极端降水和阈值的空间分布结果，以及极端降水强度的空间分布结果如图1所示。总体上，未来丽水市极端降水量及强度除RCP 2.6情景外，其他2种情景下均呈上升趋势，并且RCP 4.5情景下2个指标上升趋势面积达90%以上，但上升趋势不显著。丽水市历史极端降水阈值为(313.32±18.77) mm·月−1，随着辐射胁迫增加极端降水阈值逐步增加，最大达(364.28±11.87) mm·月−1，在空间上呈现由西南向东北递减的趋势。2016年之前丽水市所有地区极端降水量及强度均呈上升趋势，极端降水量平均值为481.73 mm·a−1。RCP 8.5情景下未来变化最明显，极端降水量均值达638.19 mm·a−1，比历史的年均极端降水量增加了156.46 mm·a−1，强度是历史的1.28倍。
图 1 历史(1979—2015年)及不同气候情景下未来(2016—2079年)丽水市极端降水的空间分布
Figure 1. Spatial distribution of extreme precipitation in Lishui City under historical (1979－2015) and future (2016－2079) climate scenarios
1979—2079年丽水市年极端降水累计次数的年际变化如图2所示。总体上，历史和未来极端降水增加趋势相近，分别为0.55与0.60，历史年极端降水次数增加量为20次·a−1，未来气候情景下年极端降水次数随辐射胁迫的增加而增加，至2079年累计发生次数分别较2016年增加33、35和36次·a−1，分别比历史次数增加了165%、175%、180%。
图 2 历史(1979—2019年)及不同气候情景下未来(2019—2079年)丽水市年极端降水累计次数的年际变化
Figure 2. Interannual changes of the cumulative number of extreme precipitation in Lishui City under historical (1979－2019) and different climate scenarios (2019－2079)
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1979—2079年丽水市森林NEP的年际变化如图3所示。由图3A可见：1979—2015年丽水市森林NEP整体呈显著增长趋势。1979—1988年表现为碳源，1986年NEP值历史最低，为−439.24 g·m−2·a−1，1989年开始从碳源转为碳汇，累计NEP增至2015年的6.8 Pg。由图3B~C可见：3种情景下2016—2079年丽水市森林NEP碳汇量呈下降趋势，RCP 8.5气候情景对比最不明显，RCP 2.6和RCP 4.5情景下森林碳汇从2064年开始已经表现为碳源。碳汇累积量在2064年之前一直处于增加状态，之后除了RCP 8.5情景继续增加外，其他2种情景已经停止增加甚至有下降的现象。3种情景下的NEP累积量相对于2015年分别增加了8.51、9.32、10.97 Pg。总体来说，1979—2079年间丽水市森林NEP呈先增加再减少的趋势，并且在RCP 8.5情景下减少最慢。
图 3 历史(1979—2015年)及不同气候情景下未来(2016—2079年)丽水市森林NEP的年际变化
Figure 3. Historical (1979－2015) and future (2016－2079) interannual changes of forest NEP in Lishui City under different climate scenarios
图4为1979—2079年丽水市NEP以及时空演变特征的空间分布结果。从历史来看，1988—1996年碳汇能力增强，NEP＜0的区域减少到9.74%，2015年时NEP＞0的区域已达100%，丽水所有区域在历史上森林碳汇上升趋势都比较高。3种气候情景下，2016—2031年丽水市整体表现为碳汇，超过50%的区域为300＜NEP＜500 g·m−2·a−1，主要分布在北部区域；2032—2047年森林全市碳汇能力下降，超过80%的区域为100＜NEP＜300 g·m−2·a−1；2048—2063年森林碳汇能力持续下降，RCP 2.6下降最明显，主要在西部区域；2064—2079年，依旧持续下降。RCP 8.5气候情景77.01%的区域集中在0＜NEP＜100 g·m−2·a−1，RCP 2.6和RCP 4.5情景下NEP＜0的区域增加到66.49%和65.46%，积累量有下降的现象，且下降趋势高值区主要分布在东部和北部。
图 4 1979—2015基准年以及不同气候情景下2016—2079年丽水市NEP的空间分布和时空演变特征
Figure 4. Spatial distribution of NEP and linear trend in Lishui City during 1979－2015 base year and 2016－
2079 under different climate scenarios -
分析图5可知：1979—2079年丽水市气候因子对NEP的通径系数绝对值最大的均为降水，可见降水是森林生态系统NEP变化的重要驱动因子。由图5A得出：气候变化对NEP变化的直接影响为0.64，对极端降水的直接影响为0.30，气候变化通过影响极端降水进而影响NEP的间接影响为0.11 (0.30×0.37=0.11)，极端降水对NEP的直接影响为0.37，因此1979—2015年丽水市极端降水对NEP产生积极影响。由图5B可知：在RCP 2.6情景下，2016—2079年丽水市气候变化对NEP变化的直接影响为0.66，对极端降水的直接影响为0.62，气候变化通过影响极端降水进而影响NEP的间接影响为0.01 (0.62×0.02=0.01)，极端降水对NEP的直接影响不显著。由图5C可知：在RCP 4.5情景下，2016—2079年丽水市气候变化对NEP变化的直接影响为0.93，对极端降水的直接影响为0.53，气候变化通过极端降水对NEP产生的间接影响为0.20 (0.53×0.37=0.20)，极端降水对NEP的直接影响为0.37，并且对NEP产生消极影响。由图5D可知：在RCP 8.5情景下，2016—2079年丽水市气候变化对NEP变化的直接影响为0.93，对极端降水的直接影响为0.62，气候变化通过影响极端降水进而影响NEP的间接影响为0.07 (0.62×0.12=0.07)，极端降水对NEP的直接影响为0.12，对NEP变化产生消极影响。
图 5 历史(1979—2015年)及不同气候情景下未来(2016—2079年)下极端降水对NEP的影响
Figure 5. Effects of extreme precipitation on NEP under historical (1979－2015) and different climate scenarios (2016－2079)
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本研究通过百分位阈值法研究了浙江省丽水市近百年的极端降水状况，结果表明：1979—2015年丽水市极端降水事件呈上升趋势，在丽水市东南部地区的上升趋势较大。RCP 2.6情景下，2016—2079年极端降水大部分呈下降趋势，RCP 4.5及RCP 8.5情景下，极端降水主要呈上升趋势，RCP 4.5情景相对于RCP 8.5情景的极端降水量、频数及强度增加更为明显。这与前人研究结果一致[19]。人类活动的加剧及地形影响，使浙江省温室气体增加，气温上升从而导致极端降水事件更容易发生[2−3]。极端降水在浙江西部及南部等地上升趋势较大的原因主要是由于南部及西部地区多丘陵山地，湿润气流遇到山脉等阻挡时被迫抬升，气温降低，容易形成地形雨。丽水位于浙江省西南部，全市多山地，比浙江的中部盆地和东北部冲积平原更容易发生极端降水事件，因此丽水市未来应加强洪涝灾害的预防。
长江流域及以南地区极端降水增多主要是由极端降水频数增加导致的[20]。本研究采用偏最小二乘法分析得知：1979—2079年极端降水频数对极端降水事件的通径系数大于极端降水强度对极端降水事件的通径系数，说明丽水市极端降水量的增加亦主要受极端降水频数的影响。另外，本研究是以年尺度分析极端降水事件变化。极端降水与季节有较强的相关性，并且极端降水的开始时间及持续时间都将直接或间接影响[7]丽水市气候的变化，因此，未来应将这些指标纳入丽水市极端降水变化特征的研究。
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本研究发现：1979—2015年期间，丽水市森林NEP从1989年由碳源逐渐转为碳汇，这主要是由于1989年前人为干扰严重，导致森林质量下降，1989年以后，随着退耕还林政策的实施，全省森林质量得到改善，森林面积、年龄逐渐增加，使得碳汇能力增强[21]。2016—2079年3种气候情景下，丽水市森林碳汇均呈下降趋势，主要是受到森林年龄继续增加及气候变化的影响[10]，其中随着未来极端降水事件的增加，森林NEP也呈下降趋势。
本研究通过InTEC模型模拟丽水市森林NEP的时空分布，虽然总体上精度较好，但仍然存在一些误差。首先，森林年龄对InTEC模型的模拟结果影响较大[10]。丽水市森林多属异龄林，森林资源清查的年龄数据为森林平均年龄，与森林实际情况有差别，通过空间插值后的数据也会存在误差。其次，本研究采用的3种气候情景的气象数据空间分辨率较低，通过线性插值生成的1 km分辨率气象数据对森林碳通量和极端降水空间解析不够细致，导致结果存在误差，但对长时间(百年尺度)碳通量演变和极端降水变化趋势仍具有一定参考价值。另外，本研究假设丽水市森林区域未来保持不变，然而实际上随着社会经济的发展，森林区域会发生改变，给模型模拟结果带来不确定性。因此，未来应进一步提高丽水森林空间分布、土壤、地形、气象等数据分辨率，更精确地模拟丽水市森林碳通量时空格局。
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偏最小二乘通径模型分析结果表明：降水是影响NEP变化的重要因子。1979—2015年极端降水对NEP产生了积极影响。这与WANG等[5]的研究结果一致，可能得益于植被对降水有一定程度的适应和抵抗能力，当极端降水超过阈值时，会对生态系统造成消极影响[4]。一方面可能导致植被根系严重缺氧、呼吸减慢，最终引起植被死亡；另一方面极端降水频次和强度会加剧土壤侵蚀，导致地表水土流失，造成颗粒和有机碳从陆地生态系统流向河流生态系统，从而改变生态系统碳源汇的大小和空间分布。可见，气候变化强度的增加对生态系统消极影响的也会变得严重[22]。虽然偏最小二乘通径分析因子间存在直接和间接影响，但受模型算法限制无法得到超过生态系统抵抗力和恢复力的阈值，未来可以通过极端降水和气候综合敏感性分析、多情景模拟比较，进一步揭示极端降水对NEP影响的阈值，阐明极端降水影响森林NEP的关键。
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浙江省丽水市历史、RCP 4.5及RCP 8.5情景下极端降水量、频数及强度均呈增加趋势，RCP 2.6呈下降趋势。极端降水事件上升趋势较高的地区主要位于丽水市南部和东南部地区。
1979—2015年丽水市森林NEP以18.44 g·m−2·a−1的速度增加，在1989年由碳源转变为碳汇。2016—2079年，3种气候情景下丽水市森林NEP均呈下降趋势，但碳汇总量呈上升趋势，说明在未来气候情景下，丽水市森林生态系统依然具有较高的碳汇潜力。
降水是影响NEP变化的重要驱动因子。虽然历史模拟显示极端降水对丽水NEP的影响为0.37，但未来气候变化情景下，除RCP 2.6情景不显著外，其余2种情景均对NEP产生显著消极影响，说明随着气候变化强度加剧，极端降水将对丽水市森林生态系统碳汇能力产生负面作用，应当积极采取森林经营措施，提高森林对极端气候事件抵抗力，使森林更好地服务实现“双碳”目标。
Spatiotemporal evolution of forest carbon sink in Lishui City and its response to extreme precipitation
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摘要:
目的 模拟并分析浙江省丽水市森林净生态系统生产力(NEP)时空演变趋势，揭示其对极端降水的响应机制，为丽水市森林固碳潜力时空评价提供科学依据。 方法 综合样地调查、遥感观测、InTEC模型，模拟3种气候情景(RCP 2.6、RCP 4.5和RCP 8.5)下1979—2079年丽水市森林NEP时空格局，分析极端降水时空特征，构建结构方程模型，探讨极端降水对NEP 的影响。 结果 ①1979—2015年丽水市极端降水频率和强度呈增加趋势。未来气候情景下除RCP 2.6之外，RCP 4.5和RCP 8.5极端降水量、频率和强度仍持续增加，其中莲都区、缙云县以及景宁畲族自治县等地区极端降水事件上升趋势较强。②1979—2015年森林NEP 呈增加趋势，增长速度为18.44 g·m−2·a−1。2016—2079年，3种气候情景下森林NEP 均呈下降趋势，但碳汇总量呈上升趋势，最大NEP 累积达10.97 Pg。③1979—2015年极端降水对NEP 产生积极影响，2016—2079年除RCP 2.6影响不显著，其他2种情景下极端降水对NEP均产生消极影响，但RCP 8.5情景下极端降水较RCP 4.5对NEP 的影响更小。 结论 丽水市森林碳汇能力较强，在未来气候情景下仍具有较高的碳汇潜力，然而极端降水对NEP的影响也不容忽视。图5参22 -
关键词:
- 极端降水 /
- 森林碳汇 /
- 净生态系统生产力(NEP) /
- InTEC模型 /
- 浙江省丽水市
Abstract:Objective The objective is to simulate and analyze the spatiotemporal evolution trend of forest net ecosystem productivity (NEP) in Lishui City, and reveal its response mechanism to extreme precipitation, so as to provide data support for spatiotemporal assessment of forest carbon sink potential in Lishui. Method The spatiotemporal pattern of forest NEP in Lishui from 1979 to 2079 was simulated under three climate scenarios (RCP 2.6, RCP 4.5, and RCP 8.5) by integrating plot survey, remote sensing observation and InTEC model. The spatiotemporal characteristics of extreme precipitation were analyzed and a structural equation model was constructed to explore the impact of extreme precipitation on NEP. Result (1) The frequency and intensity of extreme precipitation in Lishui during 1979－2015 showed an increasing trend. In the future climate scenario (except RCP 2.6), the extreme precipitation, frequency and intensity of RCP 4.5 and RCP 8.5 would continue to increase, with a higher trend of extreme precipitation events in areas such as Liandu District, Jinyun County and Jingning She Autonomous County. (2) Forest NEP showed an increasing trend from 1979 to 2015, with a growth rate of 20.18 g·m−2·a−1. From 2016 to 2079, forest NEP showed a downward trend under the three climate scenarios, but the total carbon sink showed an increasing trend, with the maximum NEP accumulation reaching 10.97 Pg. (3) From 1979 to 2015, extreme precipitation had positive effects on NEP, while it had negative impacts on NEP under the other two scenarios (RCP 4.5 and RCP 8.5) during 2016－2079, except for RCP 2.6 scenario under which extreme precipitation had no significant effect on NEP. However, extreme precipitation under RCP 8.5 had less impact on NEP than that under RCP 4.5. Conclusion Forests in Lishui demonstrate strong carbon sink capacity, and have high carbon sink potential under future climate scenarios. However, the impact of extreme precipitation on NEP should not be ignored. [Ch, 5 fig. 22 ref.] -
核桃Juglans regia 为胡桃科Juglandaceae胡桃属Juglans植物[1]，其种仁含油量高，有“木本油料之王”的称号[2]。同时，核桃木材坚实，是良好的硬木材料。作为重要的经济林树种，核桃大多种植于土壤贫瘠的山坡沟坎，不与粮争地[3]。然而，核桃树体高大，与其他果树相比对矿质营养元素需求量较高，大量元素与核桃产量和品质形成紧密相关[4]，因此，提高核桃树体对矿质元素的吸收能力对于提高核桃产量和品质至关重要[5]。研究表明：在核桃树各器官中种仁的氮素质量分数最高，核桃树吸收累积的矿质营养元素中氮素被商品核桃(种仁、硬壳)携走的比例也最高，叶片次之[6]。可见，氮素可能是提高核桃产量和品质的关键营养元素。然而，过量施用氮肥会导致严重的环境问题，因此，提高氮素利用效率是提高核桃产量与品质的重中之重[7]。
土壤中氮素主要分为无机氮和有机氮两大类，植物根系能够吸收利用的主要是无机氮，主要以硝态氮和铵态氮形式存在[8−9]。植物根系对无机氮转运调节途径可分为2种，即高亲和力(HATs)和低亲和力(LATs)的氮转运系统[10]，HATs 在外部铵态氮( ${\rm{NH}}_4^ +$)、硝态氮(${\rm{NO}}^ -_3 $)浓度低于 0.5 mmol·L−1时介导吸收大部分的无机氮，而 LATs 则是在 ${\rm{NH}}_4^ + $、${\rm{NO}}_3^ - $浓度高于 0.5或 1.0 mmol·L−1时介导吸收无机氮[10]。植物对铵态氮和硝态氮的吸收主要由铵转运蛋白和硝酸转运蛋白介导。土壤中同时含有植物可吸收利用的硝态氮和铵态氮时，由于植物吸收硝态氮需要先将其还原成铵态氮后才能进行同化利用，消耗的能量更多，所以植物对铵态氮表现出明显的偏好性，而且当植物受盐胁迫及活性氧的伤害时，铵态氮具有缓解作用，因此，介导植物对铵态氮吸收的铵转运蛋白在植物氮同化中起着重要作用[11]。铵转运蛋白基因主要有两大类族，分为AMT1和AMT2。在已知的铵转运蛋白中大部分 AMT1 家族的转运蛋白属于高亲和转运体[12]，如拟南芥Arabidopsis thaliana中有6个编码铵转运蛋白被鉴定，包括5个AMT1家族基因，1个AMT2家族基因。AMT1家族基因中，AtAMT1.1和AtAMT1.3对拟南芥根系铵态氮吸收的贡献率最高，为30%，AtAMT1.2、AtAMT1.5对拟南芥根系高亲和铵态氮吸收的贡献率略低于AtAMT1.1和AtAMT1.3[13]，AtAMT1.4在花粉中特异性表达[14]，在水稻Oryza sativa铵转运蛋白基因家族中AMT1家族有基因3个，其中OsAMT1.1和OsAMT1.2为高亲和力转运体[15]；而 AMT2 家族以低亲和为主，在拟南芥AMT2家族基因中AtAMT2.1 在低亲和范围内适度促进拟南芥根系对铵态氮吸收，主要在铵从根部到地上部运输中发挥作用[16]。AMT2 型蛋白通常在植物的不同组织中包括根、芽和叶中都有表达，如AtAMT2.1基因在拟南芥各器官中均有表达，主要表达在拟南芥的维管束及上皮层[17]，在拟南芥中AtAMT2.1与AtAMT1s之间还存在协同作用。此外，毛果杨Populus trichocarpa PtAMT2.1主要在叶片中，PtAMT2.2在叶柄中高表达。除此之外，玉米Zea mays[18]、番茄Lycopersicon esculentum [19]、欧洲油菜Brassica napus [20]等高等作物均鉴别出了AMT基因，但到目前为止，研究大多集中于高亲和的铵转运蛋白AMT1基因家族，对低亲和的铵转运蛋白AMT2基因家族的研究较少。因此，阐明AMT2的生物学功能和调控机制，对于提高核桃自身的氮效率和提高肥料利用效率都具有重要意义。
本研究以核桃JrAMT2过表达株系为供试材料，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及生理检测的方法鉴定JrAMT2基因在核桃植株体内的表达模式，进一步对核桃JrAMT2基因进行生物学功能分析，为核桃优良品种选育提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 植物材料
实验材料来自浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室保存的核桃野生型(WT)以及课题组2019年获得的核桃JrAMT2过表达阳性植株 [21]，其中JrAMT2基因构建于PCMBIA1300植物表达载体，载体抗性为卡那霉素(kanmycin，Kan)，利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3103菌株介导将构建好的35S::JrAMT2::GFP过表达载体转化到核桃野生型体细胞胚中，植物筛选标记为潮霉素(hygromycin，Hyg)。本研究所用核桃组培苗为野生型体胚和JrAMT2过表达阳性体胚经脱水萌发获得，温室苗则由上述组培苗经生根、炼苗、驯化获得。
1.2 实验方法
1.2.1 生物信息分析运用
SOPMA(
https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html )网站在线分析JrAMT2蛋白质二级结构，运用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )在线软件对JrAMT2 蛋白进行跨膜结构域的预测，通过 GSDS(http://gsds.gao-lab.org/ )软件在线分析JrAMT2基因结构。1.2.2 植株的培养
同一JrAMT2过表达阳性体胚萌出的植株为1个株系，选取3个核桃JrAMT2阳性株系，命名为JrAMT2-1、JrAMT2-2、JrAMT2-3，每个株系继代培养至50株以上，培养条件：温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养基为Driver&Kunivuki&McGranahan (DKW)培养基。
采用2步生根法获得核桃驯化植株，选取阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗作为实验材料。第1步进行根诱导，5~8 cm长的光生芽，转移到补充有10 mg·L−1吲哚丁酸钾(K-IBA)的DKW固体培养基，在黑暗中培养7 d，诱导根原基的发生；第2步，不定根诱导结束后将其转移到粗蛭石∶DKW培养基比例(体积比)为3∶2的固体培养基中，温度为25 ℃，湿度为75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养时间为21~28 d，形成不定根，获得核桃不同株系生根植株[22]。
核桃苗不定根形成后取出用清水冲洗，多菌灵浸泡，移栽到泥炭∶蛭石∶珍珠岩比例(体积比)为2∶1∶1的混合土中，将移栽驯化成活后获得的核桃再生植株在温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗的条件下培养[23]，获得核桃不同株系温室植株。
1.2.3 核桃JrAMT2基因阳性鉴定
选用阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗进行绿色荧光蛋白(GFP) 检测、PCR及RT-qPCR验证，引物见表1。从再生植株顶芽开始向下截取 1.5 cm，培养14 d 后观察植株表型，每个株系均5个生物学重复。选取植株顶芽、叶片、茎段混样提取DNA及RNA。 PCR 反应程序为：94 ℃预变性 2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火温度 30 s，68 ℃延伸 2 min，共 32 个循环；68 ℃延伸 7 min，PCR 反应产物进行质量分数为1.2%琼脂糖凝胶电泳。使用 The iQ5 Real-Time PCR Detection System 仪器进行RT-qPCR，测定转基因植株中JrAMT2的相对表达量。反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40 个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 15 s。通过 2−ΔΔCt方法计算定量结果[24]。
表 1 引物Table 1 Primers引物 序列(5′→3′) 用途 Actin-F GCCGAACGGGAAATTGTC 内参 Actin-R AGAGATGGCTGGAAGAGG 内参 QJrAMT2-F AGCAAATGGGGTTCCAGGTT 定量 QJrAMT2-R TGTCTCCCGCAGATAGAAGGTA 定量 GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 鉴定 GFP-R TTACTTGTACAGCTCGTCCA 鉴定 JrAMT2-F CATGAATACCACACCGGCCTA 鉴定 取核桃野生型及核桃JrAMT2过表达株系组培苗的根、茎、小叶，根纵切、茎横切临时切片分别放置于体视荧光显微镜(Carl Zeiss Stereo D13covery V12，Axio Cam MRc system)在明场和蓝光(488 nm)激发条件下利用 ZEN lite 成像软件连续拍照[25-26]。
1.2.4 生长参数、铵态氮和硝态氮测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，从顶尖向下剪取1.5 cm茎段，含2~4片复叶，培养14 d，每个株系均5个生物学重复，测量株高及节间数。选取长势相同的核桃野生型及JrAMT2过表达植株采用2步生根法驯化，移栽后用直尺测量统计不同株系生长0、20、40 d的株高、节间长、叶片长度及叶片宽度。
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，培养14 d，采用2步生根法获得核桃生根植株，植株分为地上部分及地下部分2个部分，清洗植株，分别测定地上部分及地下部分鲜质量，于105 ℃下杀青，80 ℃烘干至恒量，称取干质量。使用苏州科铭生物技术有限公司的植物铵态氮(ZATD-1-G)和植物硝态氮(ZXTD-1-G)试剂盒测定地上部分及地下部分铵态氮和硝态氮质量分数，每个株系均5个生物学重复。
1.2.5 植株叶绿体观察、叶绿素质量分数及叶绿素荧光测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，取顶尖向下第2节间处复叶。将该叶片置于0.35 mol·L−1氯化钠中研磨破碎至絮状，取悬液于高倍光学显微镜下观察，找到视野中单个完整的叶肉细胞，观察细胞中的叶绿体, 使用image J软件计算叶绿体表面积与单层细胞表面积比率。每个株系均5个生物学重复。
采用丙酮浸取法测定叶绿素质量分数。分别取0.1 g核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗长势一致的叶片，剪碎，置于15 mL离心管中，加入10 mL体积分数 80%丙酮溶液，于室温黑暗处浸提，直至管内材料褪色变白，以80%丙酮溶液为对照，测定663和646 nm处吸光值，每个株系均5个生物学重复。wt=[(wa+8wb)×Vt×(mFW×1 000)−1]，叶绿素 a 质量分数(wa) =20.3×D(646)，叶绿素 b 质量分数(Cb)=8.04×D(663)。其中：wt为叶绿素质量分数(mg·g−1)，Vt为提取液总体积(mL)，mFW为叶片鲜质量(g)，D(646)和D(663)分别为646和663 nm处的吸光度。
叶绿素荧光测定使用M-PEA(multi-function plant efficiency analyser)多功能植物效率分析仪(英国Hansatech公司)测定。选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系温室苗由上向下第3片叶片暗处理30 min，在饱和脉冲光(5 000 μmol·m−2·s−1) 下进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线) 的测定和绘制。参照SCHANSKE等[27]的方法分析叶绿素荧光诱导动力学参数(JIP-test)。
1.2.6 数据分析
利用SPSS 26软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(邓肯法)，显著性水平为0.05。使用GraphPad Prism 7.0软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 核桃JrAMT2基因生物信息学分析
核桃 JrAMT2基因的全长为 1 464 bp，起始密码子为 ATG，终止密码子为 TGA。经过美国国家生物技术信息中心(NCBI)在线序列比对显示：该基因的序列编码的氨基酸序列属于 Ammonium Transporter Family，编码487个氨基酸(图1)，蛋白分子量为52.458 kD，预测分子式为C2433H3715N601O646S23，含有7 418个原子，理论等电点为7.11，不稳定指数为35.61，脂溶指数为101.56，亲水性平均值为0.472。该段蛋白质中包含20种常见氨基酸：亮氨酸质量分数最高，达到11.7%，其次分别为甘氨酸11.1%，丙氨酸10.9%，缬氨酸8.6%，半胱氨酸质量分数最低，仅为1.0%。JrAMT2蛋白中分别含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys) (表2)。
表 2 JrAMT2基因氨基酸组成Table 2 Composition of JrAMT2 amino acids氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 丙氨酸 53 10.90 组氨酸 9 1.80 苏氨酸 27 5.50 精氨酸 11 2.30 异亮氨酸 25 5.10 色氨酸 18 3.70 天冬酰胺 16 3.30 亮氨酸 57 11.70 酪氨酸 17 3.50 天冬氨酸 15 3.10 赖氨酸 18 3.70 缬氨酸 42 8.60 半胱氨酸 5 1.00 甲硫氨酸 18 3.70 吡咯赖氨酸 0 0.00 谷氨酰胺 11 2.30 苯丙氨酸 24 4.90 晒半胱氨酸 0 0.00 谷氨酸 14 2.90 脯氨酸 24 4.90 甘氨酸 54 11.10 丝氨酸 29 6.00 对核桃JrAMT2蛋白跨膜区的预测结果表明：该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋，跨膜螺旋区段分别位于24~46、59~81、129~151、158~180、195~214、227~244、254~276、288~310、314~333、346~368和398~420，推测JrAMT2属于跨膜蛋白，并在N端存在信号肽(图2A)。
对JrAMT2 蛋白二级结构的预测结果显示：JrAMT2的氨基酸组成中有4种构象，其中 α- 螺旋有 201 个氨基酸，占比 43.12%；延伸链有 93个氨基酸，占比19.10%；β- 转角有 30个氨基酸，占比 6.16%；无规则卷曲有154个氨基酸，占比 31.62%。JrAMT2 铵转运蛋白主要由 α- 螺旋和无规则卷曲组成(图2B)。
对JrAMT2基因结构的分析显示：JrAMT2基因由4个外显子，3个内含子组成。与拟南芥AtAMT2基因相比，拟南芥基因结构多了1个外显子和1个内含子，与山核桃Carya cathayensis CcAMT2基因[28]、栓皮栎Quercus suber QsAMT2基因[29]相比，外显子和内含子数量相同，同源性较高(图2C)。
2.2 核桃JrAMT2过表达植株阳性验证
在成功构建35S::JrAMT2::GFP的过表达载体并通过农杆菌介导转化核桃体胚后，对同一无性系JrAMT2体胚经脱水萌发获得的再生植株进行阳性鉴定。利用PCR技术，以核桃JrAMT2过表达植株3个株系(JrAMT2-1、JrAMT2-2和JrAMT2-3) DNA为模板，进行外源GFP基因(729 bp)的PCR验证，检测到大小约为 750 bp的电泳条带，与GFP基因大小符合(图3A)；进行目的基因JrAMT2加外源GFP基因全长(2193 bp)的PCR验证，检测到大小为2000 bp的电泳条带，与目的基因大小符合(图3B)；以核桃JrAMT2过表达植株3个株系的cDNA为模板，利用实时定量PCR技术对JrAMT2基因表达量进行检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株3个株系JrAMT2基因相对表达量分别为野生型的10.58、12.80和14.94倍，显著上调(图3C)，表明核桃JrAMT2过表达植株中JrAMT2基因稳定表达。
图 3 PCR 和RT-qPCR 对核桃组培苗的JrAMT2基因的检测Figure 3 Detection of JrAMT2 gene in J. regia tissue culture seedlings by PCR and qRT-PCR对获得的过表达株系进行GFP荧光阳性鉴定，分别将核桃过表达及野生型幼苗(图4A)的小叶、茎、根置于荧光体视显微镜下在波长为488 nm蓝光激发下拍摄。结果显示：过表达植株的小叶、茎、根表面呈现均匀的绿色荧光，其中腋芽处荧光更明亮(图4B1~6)，野生型核桃幼苗的小叶、茎、根在荧光下拍摄无绿色荧光激发(图4B7~12)，说明JrAMT2蛋白在腋芽处积累。为进一步研究JrAMT2基因在核桃幼苗中的表达，对过表达株系及野生型组培苗的茎段进行横切，根进行纵切后，进行GFP荧光检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株茎段横切中呈现均匀的绿色荧光，其中在维管组织中荧光更明亮，野生型植株茎段横切面无绿色荧面光(图4B1~12)；核桃JrAMT2过表达植株根段纵切面中呈现均匀的绿色荧光，且在维管组织中荧光更明亮，野生型植株根段纵切面无绿色荧光(图4C1~8)。表明JrAMT2基因在核桃幼苗的根和茎中均可稳定表达，其中JrAMT2蛋白在根和茎的维管束组织中积累。
图 4 铵态氮转蛋白基因JrAMT2在核桃苗中稳定表达Figure 4 Stable expression of ammonium nitrogen transfer protein gene JrAMT2 in J. regia2.3 核桃JrAMT2基因的生物学功能分析
2.3.1 核桃JrAMT2过表达植株生长表型分析
为了进一步研究核桃JrAMT2基因的生物学功能，将3个JrAMT2过表达植株与野生型核桃植株培养14 d。结果表明：与野生型相比，核桃JrAMT2过表达植株均生长旺盛，株高显著增加，节间显著增长(P＜0.05，图5A)。3个JrAMT2过表达株系株高分别为3.87、4.23和4.12 cm，节间长分别为0.33、0.35和0.34 cm，野生型植株株高为3.30 cm，节间长为0.28 cm，与野生型相比，3个JrAMT2过表达株系株高分别增加了17.0%、28.0%和29.0% (图5B)，节间长分别增加了19.0%、25.0%和24.0% (图5C)。综上所述，JrAMT2过表达对核桃幼苗的生长有显著提高作用。
图 5 核桃JrAMT2过表达离体培养植株表型分析Figure 5 Phenotypic analysis of J. regia JrAMT2 overexpression plant in vitro culture对核桃JrAMT2过表达植株进一步驯化培养，成功获得核桃JrAMT2过表达温室苗。对其生长表型进行分析(图6A)，定植后培养40 d，核桃JrAMT2过表达温室苗的株高、节间长、叶片长度、叶片宽度增加显著高于野生型(P＜0.05)。培养至第20天时，与野生型相比，核桃JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加21.9%、26.0%和24.6% (图6B)，节间长分别增加41.2%、27.7%和26.3% (图6C)，叶片长度分别增加18.7%、16%和30.7% (图6D)，叶片宽度分别增加41.3%、48.2%和55.1% (图6E)；培养至第40天时，与野生型相比，JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加53.6%、68.2%和62.1%，节间长分别增加37.2%、50.3%和44.8%，叶片长度分别增加了27.8%、34.1%和49.3%，叶片宽度分别增加24.3%、19.5%和29.2%。综上所述，核桃JrAMT2过表达温室苗与野生型相比，株高、节间长、叶片大小均显著增加，进一步证明JrAMT2基因过表达加快了核桃的生长速度。
图 6 核桃JrAMT2过表达阳性温室苗性状分析Figure 6 Character analysis of J. regia JrAMT2 overexpression positive greenhouse seedlings2.3.2 核桃JrAMT2过表达植株对氮素吸收分析
为探究JrAMT2基因在核桃中是否存在差异表达，将核桃野生型及核桃JrAMT2过表达植株进行2步生根，获得核桃JrAMT2过表达生根植株，将其分为地上部分与地下部分。与野生型相比，核桃JrAMT2过表达生根植株地下部分不定根生长旺盛(图7A)。对核桃JrAMT2过表达植株地上部分及地下部分差异分析，分别提取3个核桃JrAMT2过表达株系生根植株地上部分及地下部分RNA，利用实时定量PCR技术，分析地上部分及地下部分JrAMT2基因表达的差异。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的11.94、12.70和15.06倍，地下部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的19.07、23.34和24.00倍(图7B)。对核桃野生型及3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分进行干质量和鲜质量测定。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分鲜质量和干质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加23.45%、33.67%和56.26%，干质量分别增加23.45%、43.89%和56.26%；3个JrAMT2过表达株系地下部分干质量和鲜质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加222.65%、199.24%和344.38%，干质量分别增加222.65%、199.24%和354.33%(图7C)。
图 7 核桃JrAMT2过表达植株氮素吸收分析Figure 7 Character analysis of the regenerated plants with expression of JrAMT2 in J. regia基于核桃JrAMT2过表达植株表型变化，本研究进一步测定核桃JrAMT2过表达植株对硝态氮及铵态氮吸收。结果表明：与野生型相比，核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分铵态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别增加59.1%、32.3%和55.1%，地下部分别增加68.1%、61.9%和114.1% (图7D)；核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分硝态氮质量分数显著降低(P＜0.05)，地下部分硝态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别降低10.1%、7.1%和13.6%，地下部分别增加63.5%、75.7%和70.3% (图7E)。综上所述，JrAMT2基因主要作用于核桃地下部分，且JrAMT2基因过表达促进植株地下部分对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部到地上部的运输。
2.3.3 核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光特性分析
对核桃JrAMT2过表达植株叶色与叶片细胞叶绿体进行观察。核桃JrAMT2过表达植株叶色与野生型相比颜色较深(图8A)，在显微镜下观察3个核桃JrAMT2过表达植株株系及野生型叶绿体特征发现，3个核桃JrAMT2过表达株系扩张的栅栏叶肉细胞中的叶绿体更致密(图8B)。进一步分析发现：对3个阳性株系进行总叶绿素质量分数测定，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿素质量分数显著高于野生型(P＜0.05)，野生型总叶绿素质量分数为3.53 mg·g−1，核桃JrAMT2过表达阳性植株3个株系总叶绿素质量分数分别为4.64、4.69和6.10 mg·g−1，与野生型相比分别增加了32.6%、34.0%和74.3% (图8C)；JrAMT2过表达株系叶绿体表面积在单层细胞表面积的占比显著高于野生型(P＜0.05)，野生型叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率为0.56，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿体表面积与单层细胞表面积的比值分别为0.67、0.68和0.69，与野生型相比分别增加了19.41%、21.18%和22.94% (图8D)。综上所述，JrAMT2基因过表达提高了叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率及核桃叶肉细胞内叶绿素的积累。
图 8 核桃JrAMT2过表达植株叶绿体及叶绿素质量分数分析Figure 8 Analysis of chloroplast and chlorophyll content in J. regia with JrAMT2 overexpression对3个核桃JrAMT2过表达株系进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线测定。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系的O (Fo点)相、K相降低，J点、I点、P (Fm)及J~P点振幅均提高，OJIP曲线较陡，表明JrAMT2基因一定程度上提高了叶片的活性(图9A)。与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系暗适应后的最大荧光强度(Fm)、最大量子产额(Fv/Fm)均提高，Fm分别提高了47.1%、45.9%、50.2%，Fv/Fm分别提高了15.6%、13.4%、14.7%，表明JrAMT2基因一定程度上提高了光系统Ⅱ(PSⅡ)的光化学效率(图9B)。计算归一化处理的OJIP曲线(Vt)[Vt =(Ft−Fo /(Fm−Fo)，Ft为任意时刻t的荧光值]，并计算相对荧光差异ΔVt[ΔVt = Vt处理−Vt对照，用ΔK、ΔJ值分别显示在300 μs和20 ms处的ΔVt值，表示放氧复活体的活性(OEC)]。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系ΔK、ΔJ值下降且＜0 (图9C)，表明JrAMT2基因一定程度上提升了核桃叶片PSⅡ供体侧及受体侧电子传递效率及放氧复活体的活性。
图 9 铵态氮转运蛋白JrAMT2基因表达对核桃叶绿素荧光的影响Figure 9 Effect of ammonium nitrogen transporter JrAMT2 gene on chlorophyll fluorescence of J. regia用JIP-test参数对OJIP曲线进行定量分析，结果显示：核桃3个JrAMT2过表达株系在t=0时的最大光化学效率(φPo)、反应中心捕获的光能用于${\rm{Q}}_{\rm{A}}^- $下游电子传递的量子产量(ΨEo)、吸收的能量用于电子传递的量子产量(φEo)上升，分别上升了14.62%、44.59%、65.80%；在J点的相对可变荧光强度(VJ)、最小荧光强度与最大荧光强度比值(Fo/Fm)、反应中心关闭净速率(dV/dto)下降，分别下降了31.03%、35.29%、49.34% (图9D)，表明JrAMT2基因一定程度上提高了PS反应中心的量子比率及产额；对单位PS反应中心比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在t=0 时的单位反应中心捕获的用于电子传递的能量(ETo/RC)、在t=0 时的单位反应中心传递到电子链末端的能量(REo/RC)无明显变化，在t=0 时单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、在t=0 时单位反应中心耗散的能量(DIo/RC)、在 t=0 时单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)显著下降，分别为36.43%、58.67%、27.22%，表明JrAMT2基因一定程度提高了核桃叶片反应中心活性和用于电子传递的能量份额，增强了电子传递能力(图9E)；对单位受光截面比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在 t=tFM(暗适应后达到最大荧光强度时间点)时的单位受光截面耗散的能量(DIo/CSm)无明显变化，在 t=tFM时单位受光截面吸收的能量(ABS/CSm)、在t=tFM时单位受光截面捕获的用于还原QA的能量(TRo/CSm)、在 t=tFM时单位受光截面捕获的用于电子传递的能量(ETo/CSm)、在t=tFM时单位受光截面传递到电子链末端的能量(REo/CSm)上升，分别上升了 47.79%、69.39%、145.10%、303.62%(图9F)，表明JrAMT2基因一定程度提高核桃叶片单位受光截面的电子传递的份额及电子传递效率。综上所述，JrAMT2基因过表达促进核桃的光合作用。
3. 讨论
氮素作为植物生长发育必不可少的营养元素，是核酸、蛋白质、酶、叶绿素、植物激素等的重要组成部分[30]。自然界中可供利用的氮素资源有限，作物高产就需要化肥的投入。中国的化肥投入总量逐渐升高，但化肥利用率很低，给自然环境带来极大的负担 [31−32]，因此合理使用化肥，提高作物对氮素的吸收效率是促进农业生态化发展的重要途径。铵转运蛋白基因AMTs是广泛存在于动物、植物、微生物中用于运输${\rm{NH}}_4^+ $的载体蛋白，从分子层面提高植物对氮素的利用具有重要意义。前人研究发现：在拟南芥中，氮饥饿能诱导AtAMT1.1、AtAMT2.1基因上调表达，并且AtAMT2基因的表达水平随着氮饥饿时间的延长而增加[33-34]。在充足或高氮条件下，观察到拟南芥中AtAMT2.1及水稻根中OsAMT1.2基因表达水平仍上调 [35-36]，其中氮素形态对AMT基因转录水平的调控也取决于AMT基因个体和植物物种。
本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行初步的功能验证，对JrAMT2基因进行生物信息学分析表明：JrAMT2蛋白中含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys)。该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋结构域，与李畅[36]预测的OsAMT2.1蛋白结构域特点相同，且与夏金泽等[37]研究的木薯Manihot esculenta MeAMT2.6基因的蛋白结构相似。AMT2 型蛋白通常在植物的各种组织中表达，包括根、芽和叶。前人研究发现：杜梨 Pyrus betulifolia PbAMT2基因在所有器官中均有表达，但在根部表达最高[38]。在拟南芥中发现：AtAMT2.1基因主要在维管组织中表达，在芽中的表达高于根[15]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行绿色荧光观察发现：JrAMT2蛋白在核桃苗整株均有表达，且在芽及根茎的维管束中荧光更明亮，说明与拟南芥相同，核桃JrAMT2蛋白在所有器官中表达，且主要在维管组织中表达。
在植物生长发育重要阶段充足的氮素营养供给可以促进其生长发育，增加产量，对植物外施氮素能增加植株株高及叶面积[39]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株生长性状分析发现：JrAMT2基因在核桃中过表达对植株生长发育有调控作用，主要表现在过表达植株株高、节间长显著增加。对过表达植株生根驯化结果显示：过表达植株生物量显著增加，根系发达。对核桃JrAMT2过表达植株移栽驯化，定植后植株生长速率显著高于野生型，主要表现在节间伸长快，叶面积增加。AMT2是具有铵吸收功能的铵转运蛋白，且在维管组织表达，暗示着该基因可能参与铵向木质部的装载，介导铵在植物中的长距离运输。研究发现：拟南芥AtAMT2.1除了对根吸收氮素有一定贡献外，主要作用于${\rm{NH}}_4^+ $从根部到茎部的运输[40]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株地上部分和地下部分基因表达测定发现：植株地下部分JrAMT2基因表达量显著高于地上部分，且植株地下部分生物量的增加显著高于地下部分，说明核桃JrAMT2基因主要在地下部分表达。对核桃JrAMT2过表达植株对铵态氮和硝态氮吸收测定结果表明：核桃JrAMT2过表达植株地上部分仅对铵态氮的吸收显著上调，地下部分对铵态氮与硝态氮的吸收均显著上调，说明JrAMT2基因促进植株对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部分到地上部分的运输。氮素营养还会通过影响叶绿素合成和叶绿素荧光参数的变化来参与光能的利用和调控[41]。有研究表明：水稻OsAMT2.1基因敲除株系的光合特性与野生型相比出现下降趋势，同样说明了AMT2基因对植物光合作用有调控作用[36]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数变化的测定结果显示：JrAMT2基因显著提高了核桃的叶绿体表面积与单层细胞表面积比率、叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数中叶片放氧复活体活性、量子产额、电子传递效率。
4. 结论
JrAMT2作为铵态氮转运基因，促进核桃对铵态氮和硝态氮的吸收，且介导铵态氮从根部到茎部的运输，对核桃生长发育、光合作用等有积极作用，对研究核桃高效利用氮素及良种的筛选有重要意义。
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图 1 历史(1979—2015年)及不同气候情景下未来(2016—2079年)丽水市极端降水的空间分布
Figure 1 Spatial distribution of extreme precipitation in Lishui City under historical (1979－2015) and future (2016－2079) climate scenarios
图 2 历史(1979—2019年)及不同气候情景下未来(2019—2079年)丽水市年极端降水累计次数的年际变化
Figure 2 Interannual changes of the cumulative number of extreme precipitation in Lishui City under historical (1979－2019) and different climate scenarios (2019－2079)
图 3 历史(1979—2015年)及不同气候情景下未来(2016—2079年)丽水市森林NEP的年际变化
Figure 3 Historical (1979－2015) and future (2016－2079) interannual changes of forest NEP in Lishui City under different climate scenarios
图 4 1979—2015基准年以及不同气候情景下2016—2079年丽水市NEP的空间分布和时空演变特征
Figure 4 Spatial distribution of NEP and linear trend in Lishui City during 1979－2015 base year and 2016－
2079 under different climate scenarios -
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