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香榧Torreya grandis ‘Merrillii’是红豆杉科Taxaceae榧树属Torreya的优质品种，其种子可食用，是著名的特色干果[1]；种仁含油率较高[2]，具有很高的经济价值[3]。随着各类栽培技术的开发，中国的香榧种植产业规模也在不断扩大，对于香榧植株及干果[4]的有关研究已经比较成熟，但对于香榧愈伤组织培养的研究还处在相对落后的阶段。
植物愈伤细胞的悬浮培养是一种通过调控细胞生长，快速获得大量细胞以及目的产物的技术，不受各类局限进行周年生产。建立好的培养体系以及优化培养条件，可以超过原有的生产方式[5]。王沐兰等[6]通过建立红豆杉Taxus chinensis高产悬浮细胞系，提高了紫杉醇的产量；赵文佳[7]诱导青钱柳Cyclocarya paliurus红色愈伤系，并利用细胞悬浮培养技术建立了花青素的生产体系。此外，国槐Sophora japonica[8]、南方红豆杉Taxus wallichiana[9]和落叶松Larix gmelinii[10]等植物的悬浮培养体系也已经建立。然而在香榧悬浮培养体系中，细胞生长动力学规律及最佳培养条件尚不清晰。
悬浮细胞的培养过程中需添加各类激素以促生长。赤霉素(GAs)是植物体内的一种重要激素，已被发现较多的种类，并按顺序命名为赤霉素A1 (GA1)、赤霉素A3 (GA3)等，在植物生长的各个环节都不可缺少[11−12]。在非生物胁迫或生物刺激下，外施赤霉素可以增加防御酶的数量或活性，进而影响植物抗性[13]。赤霉素还可对植物愈伤组织增殖过程中的褐化情况进行抑制，促进愈伤组织增殖[14]。
鉴于此，本研究通过优化香榧胚性愈伤组织悬浮培养基，探究其动力学特性，筛选最适合的培养条件，同时探究GA3处理下香榧胚性愈伤组织生长及差异基因表达的规律，为香榧愈伤组织的生长和遗传转化体系的构建提供科学依据。
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以浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室培育的香榧胚性愈伤组织为试验材料。使用SH液体培养基，其中添加脱落酸(ABA) 1.0 mg·L−1、水解酪蛋白(CH) 500.0 mg·L−1、蔗糖30.0 g·L−1、活性炭2.0 g·L−1和GA3 0.5 mg·L−1，设置pH 5.7，摇床转速为110 r·min−1，25 ℃暗培养。
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在100 mL的锥形瓶中添置30 mL的SH液体培养基(配方同1.1)，香榧胚性愈伤组织接种量为30 g·L−1，设置pH 5.7，转速为110 r·min−1，每3 d取样测定细胞鲜质量及细胞活力(氯化三苯四氮还原法，TTC)，即波长为485 nm处的吸光度。
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在100 mL锥形瓶中添置30 mL的SH液体培养基(配方及培养条件同1.1)，设置转接愈伤组织接种量为10、20、30、40、50 g·L−1；pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9；摇床转速为70、90、110、130、150 r·min−1。25 ℃摇床中振荡暗培养。每个处理设置3个重复，21 d时统计鲜质量，计算细胞增长率，细胞增长率=(收获量−接种量)/接种量×100%。
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超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑光化还原法测定；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定；过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法测定[15]。
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将香榧胚性愈伤组织接种于SH液体培养基中(配方及培养条件同1.1)，设置对照组(ck)和实验组(GA3+)，对照组培养基中不添加GA3，实验组培养基中施加GA3。18 d后收集材料，使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，按说明书提取RNA，分别设置3个生物学重复，使用分光光度计检测浓度与纯度。
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测序工作由北京诺禾致源科技有限公司完成，采用Illumina HiSeqTM 2000测序平台进行测序。由于香榧没有参考基因组，将聚类分析结果中最长的转录本作为参考序列单基因簇进行后续分析。
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采用RSEM软件将每个样品过滤后的数据(clean reads)在参考序列上做比对。采用DESeq分析差异表达基因(DEG)，以|log2Fc|＞1 (Fc为表达量的差异倍数)且P＜0.005为筛选条件[16]。将差异表达基因注释到基因本体论数据库(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)，并进行GO和KEGG富集分析。
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使用Primer 3.0 input在线软件设计引物(表1)，以TgActin为内参基因[16]。用Takara生物科技有限公司的反转录试剂将提取的RNA反转录成cDNA进行RT-qPCR验证，每个样品3个生物学重复。反应体系为10.0 μL，包括5.0 μL的TB GREEN，0.2 μL的上下游引物，0.4 μL的模板cDNA，4.2 μL的ddH2O。PCR反应程序为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s共39个循环。
表 1 差异表达基因RT-qPCR的特异性引物信息
Table 1. Gene-specific primer information for RT-qPCR
引物名称 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) XM_024662224.1 TCCAAGGGAAGGGGAACATC TCCCCGGATTGCAGAAGATT XM_027242615.1 TGTACCCTCCACCCTTTTCC TCTATCAGGGAGGGAGCAGA XM_020665027.1 TACGACCAGTCAGAGGCTTG AAACACCCACCGTCTTTGAC XM_002991298.2 CACGCCCAATTTTCACGAGA CGAAAACTAGGCAGGGCATC XM_022920293.1 TCGACCTTGAGACCTGGAAC TGATGGTGCAGCAAATCAGG TgActin TGGCATCTCTCAGCACATTCCA TGCCAACATCTCAAGCAAGCAC -
使用Excel处理数据，采用SPSS 26进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(邓肯法)，显著性水平为0.05，使用GraphPad Prism 9软件作图。
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香榧胚性愈伤组织悬浮培养时，细胞鲜质量变化呈“S”型曲线。在0~6 d鲜质量增加缓慢；7~18 d鲜质量快速增加；18 d时达到最高值，为44.81 g；18~21 d进入稳定期，鲜质量基本不再增加；21 d后细胞进入衰退期，鲜质量下降。同时，在培养周期内香榧胚性细胞活力在0~3 d时快速增长，并在3 d时达到最高值(0.32)，之后持续下降，并且随着培养时间的延长，变化趋势趋向平缓(图1)，表明9~12 d为香榧胚性愈伤组织悬浮培养的最佳继代时期。
图 1 培养过程中细胞鲜质量和活力的变化
Figure 1. Changes in fresh weight and viability of cells during incubation
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随着接种量的增加，胚性愈伤组织增长率呈先上升后下降的趋势。当愈伤组织接种量为10 g·L−1时，细胞增长率最低(21.78%)；当接种量为30 g·L−1时，细胞增长率显著升高(P＜0.05)，达到最高值，为49.94%。SOD、POD和CAT活性均随接种量的增加而呈先升高后降低的趋势。当接种量为30 g·L−1时，SOD、POD和CAT活性均最高，显著高于其他接种量时的酶活性(P＜0.05)(图2A)。
图 2 不同培养条件对香榧胚性愈伤组织液体悬浮培养的影响
Figure 2. Effect of different culture conditions on the liquid suspension culture of embryogenic callus of T. grandis ‘Merrillii’
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随着pH的增加，香榧悬浮细胞增长率呈先上升后下降的趋势。当培养基pH为5.7时，细胞鲜质量增殖效果最佳，细胞增长率最大，为22.95%，显著高于其他处理(P＜0.05)。SOD、POD和CAT活性均随接种量的增加而呈先升高后降低的趋势。在pH为5.7时，悬浮细胞SOD、POD和CAT活性均最大，显著高于其他处理(P＜0.05)(图2B)。
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随着转速的增加，香榧悬浮细胞增长率呈逐渐上升的趋势，当转速为70 r·min−1时，细胞增长率较低，为20.33%；当转速达110 r·min−1时，细胞增长率最大，为50.84%，显著高于其他处理(P＜0.05)。SOD、POD和CAT活性均随摇床转速的增加而呈先升高后降低的趋势。当转速为110 r·min−1时，SOD、POD和CAT活性最大，显著高于其他处理(P＜0.05)(图2C)。
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所有检测样品纯净碱基数均达6.66 Gb以上，质量为Q20 (每项碱基质量大于20的碱基数占总碱基数的比例)的碱基比例均大于97.47%，达Q30 (每项碱基质量大于30的碱基数占总碱基数的比例)以上的碱基比例大于92.70%，每个样本碱基GC含量为43.53%~44.45%，较为一致，且测序碱基平均错误率均在0.1%以下，表明转录组数据较为准确。
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本研究共筛选到428个差异表达基因，其中236个基因上调表达，192个基因下调表达(图3A)。对照组与实验组共有表达的基因数为46 831个，对照组特有表达的基因数为10 580个，实验组特有表达的基因数为8 308个(图3B)。
图 3 差异基因分析图
Figure 3. Differential gene analysis chart
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GO功能注释与分类统计发现：差异表达基因被归类到2个功能分类组中，其中：分子功能中有17个基因涉及水解邻糖基化合物的水解酶活性；生物过程中细胞壁组织或生物合成过程注释到10个差异基因(图3C)。
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将差异表达基因进行KEGG通路富集分析，对富集较多的前20个通路进行散点图绘制。差异基因富集最多的通路为苯丙烷生物合成；其次为淀粉和蔗糖代谢；再次为角质、木栓质和蜡的生物合成。而氰基氨基酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、丙酮酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等通路富集较少(图3D)。
本研究有8个与苯丙烷生物合成相关的差异基因被富集到且呈上调表达，4个与过氧化物酶(POX)相关；2个与莽草酸-O-羟基肉桂酰转移酶(HCT)相关；2个与咖啡酸-O甲基转移酶(COMT)相关(图4)。本研究表明：GA3处理会使得香榧胚性愈伤组织细胞增加对苯丙氨酸的合成与利用，调控HCT、COMT、POX活性的基因上调表达，促进了对香豆酰辅酶A参与合成咖啡酰莽草酸、愈创木酰木质素等产物的过程，同时生成酚类物质参与其他途径物质合成。该过程产生的酚类物质还可能参与清除部分愈伤组织和培养基产生的有害活性氧，提高香榧胚性愈伤组织的抗性[17−19]。
图 4 苯丙烷生物合成与木栓质合成相关通路及差异表达基因
Figure 4. Pathways and differentially expressed genes related to phenylpropanoid biosynthesis and suberin synthesis
本研究有3个与木栓质生物合成相关的差异基因被富集到且呈上调表达，其中1个与脂肪酸ω-羟化酶(CYPB6B1)相关，2个与脂肪酰辅酶A还原酶(FAR)相关(图4)。与对照组相比，GA3处理会使FAR与CYPB6B1上调表达，参与ω-羟基脂肪酸下游α,ω-二羧酸和α,ω-二醇合成途径，促进下游单酰基甘油酯的合成，共同参与形成木栓质单体或低聚物，同时产生酚类物质[20]。该过程可结合苯丙烷合成途径产生的酚类物质，促进木栓质单体或低聚物的合成，应对环境变化并进行调整[21−22]。
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RT-qPCR验证结果(图5)表明：5个基因与转录组测序结果呈现相同的表达趋势，2个基因上调表达，3个基因下调表达，说明转录组测序结果可靠。
图 5 差异表达基因的RT-qPCR验证
Figure 5. RT-qPCR validation of candidate genes
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植物细胞悬浮培养是一个持续变化的过程。在悬浮细胞培养过程中，接种量直接影响细胞的生长。细胞需要足够的空间和营养物质支持其增殖，选择适当的接种量对于细胞的生长至关重要。已有研究表明：落叶松胚性愈伤组织的最佳接种量为4 g·L−1[6]。油茶Camellia oleifera愈伤细胞悬浮培养的最佳初始接种量为33 g· L−1[23]。本研究中，胚性愈伤组织接种量为30 g·L−1，有利于香榧悬浮细胞的生长，此时细胞增长率最大。在细胞生长过程中，细胞内部很多起关键调控作用的酶对pH有一定的要求。陈继光等[24]研究表明：青钱柳在pH为5时细胞活力较强，细胞质量增量达最大，当pH达6时，细胞活力和质量增量都开始下降。本研究中，pH为5.7时，香榧胚性愈伤组织悬浮细胞抗逆性最强，细胞增长率最大。悬浮培养中摇床转速对细胞生长也有较大的影响。较低的转速会使愈伤组织堆积导致褐化[4]；转速较高时会使细胞间产生碰撞导致破裂死亡，只有合适的转速才能使得细胞快速增殖生长[25]。本研究表明：转速为110 r·min−1时，香榧悬浮细胞生长最快。悬浮培养过程中对多种条件进行优化，能显著提升细胞的生长能力及抗性。
植物细胞在离体悬浮培养过程中，还须通过外施激素来促进细胞的生长。赤霉素在植物体的生命过程中起着重要的作用。当植物体处于胁迫条件时，外源赤霉素可以有效缓解胁迫的危害[26]。有研究表明：加入外源GA3可以有效缓解牡丹Paeonia × suffruticosa愈伤组织的褐化，并且提高愈伤组织诱导率[14]。本研究表明：在差异基因的GO富集分析中，GA3处理后上调表达基因主要参与催化活性、氧化还原过程、氧化还原酶活性等过程，说明活性氧的清除是香榧胚性愈伤组织增殖发育时的一个重要过程。在代谢通路中，差异表达基因主要富集在苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢、木栓质合成等途径中。KEGG通路富集结果表明：苯丙烷生物合成途径中注释的差异表达基因最多，说明GA3处理后，香榧胚性愈伤组织的次级代谢途径产生了一定的变化。
苯丙烷代谢途径是植物体内多种防御性次生代谢产物(如黄酮类、木质素及水杨酸等)的主要来源[27]。有关木栓质相关合成途径的研究集中于植株根系以及部分受创伤部位[28]，对于其在植物愈伤组织内的合成与作用研究较少。本研究中，木栓质合成途径也有7个差异基因被显著富集，且呈上调表达。已有研究表明：细胞色素P450单加氧酶(CYP)家族与FAR主要参与木栓质的合成[29]。木栓质大分子的酚类组分已证明主要有阿魏酸、香豆酸等物质，通过苯丙烷生物合成途径产生，可继续生成木栓质单体中相应的底物物质，在一定程度上促进了木栓质单体的合成，影响细胞生长，以应对环境的胁迫[30]。这与本研究结果相似，推测外源GA3处理下香榧愈伤组织苯丙烷生物合成途径所产生的酚类物质不仅参与了活性氧的清除，还参与了木栓质单体的合成，对愈伤组织的生长及胁迫适应性产生一定的影响[31]。
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香榧胚性愈伤组织悬浮细胞生长曲线呈“S”型，接种后9~12 d为最佳继代时期，设置接种量为30 g·L−1，pH为 5.7，摇床转速为110 r·min−1，可获得生长良好的香榧胚性愈伤组织细胞，同时也可以提高悬浮细胞的抗氧化能力。通过转录组分析发现：外源GA3处理下香榧胚性愈伤组织细胞苯丙烷生物合成、木栓质生物合成等相关代谢通路为差异基因的主要参与部分，且其中部分调空愈伤组织形成、生长和发育的关键基因表达量产生变化，可能在香榧愈伤组织的生长发育、适应环境变化以及应对胁迫相关过程中发挥重要作用。
Suspension culture dynamics of embryogenic callus from Torreya grandis ‘Merrillii’ and its response to gibberellin
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摘要:
目的 以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’胚性愈伤组织为试验材料，对其悬浮细胞的生长以及悬浮培养动力学进行研究，探究香榧胚性愈伤组织对赤霉素的响应。 方法 以实验室培育的香榧胚性愈伤组织为试验材料，通过测定细胞活力、细胞鲜质量进行悬浮培养动力学的研究，优化培养条件，并对施加外源赤霉素A3 (GA3)的愈伤组织进行转录组分析。 结果 ①在培养周期内，悬浮细胞的鲜质量增长呈“S”型曲线，细胞活力在3 d时达最高值后平稳下降。②香榧悬浮细胞培养最佳继代周期为9~12 d，最佳接种量为30 g·L−1，培养基最佳初始pH为5.7，最佳摇床转速为110 r·min−1。③对外源GA3处理后的香榧胚性愈伤组织进行转录组分析，共获得差异表达基因428个，其中上调基因236个，下调基因192个。在差异基因的GO富集分析中，GA3处理后上调表达基因主要参与催化活性、氧化还原过程、氧化还原酶活性等，在KEGG代谢通路中，差异表达基因主要富集在苯丙烷类生物合成、木栓质生物合成等途径中。 结论 香榧胚性愈伤组织培养动力学分析能获得最佳接种时期，优化培养条件能提高其细胞增长率及抗逆性，外源GA3处理下的香榧胚性愈伤组织细胞中，苯丙烷生物合成、木栓质生物合成等代谢通路为差异基因主要参与部分，且部分关键基因表达量变化可能在香榧愈伤组织生长发育、适应环境及应对胁迫中发挥重要作用。图5表1参31 Abstract:Objective This study, with embryogenic callus from Torreya grandis ‘Merrillii’ employed as the experimental material, is aimed to investigate the growth and suspension culture dynamics of its suspension cells, explore the response of T. grandis ‘Merrillii’ embryogenic callus to gibberellin treatment. Method Using the embryogenic callus of T. grandis ‘Merrillii’ cultivated in laboratory as the experimental material, the suspension culture dynamics were studied by measuring cell viability and fresh cell weight, and the culture conditions were optimized before a transcriptome analysis was performed on the callus treated with exogenous GA3. Result (1) Within the culture cycle, the fresh weight growth curve of the suspension cells exhibited an “S” shaped pattern, with cell viability reaching its peak at 3 days and then gradually decreasing steadily. (2) The optimal subculture period for T. grandis ‘Merrillii’ suspension cells was determined to be 9 to 12 days, with an optimal inoculation rate of 30 g·L−1, an initial pH of 5.7 for the culture medium, and an optimal shaking speed of 110 r·min−1. (3) transcriptome analysis of T. grandis ‘Merrillii’ embryogenic callus treated with exogenous GA3 revealed 428 differentially expressed genes, including 236 upregulated and 192 downregulated genes whereas GO enrichment analysis of these differentially expressed genes showed that the upregulated genes after GA3 treatment were mainly involved in catalytic activity, oxidation-reduction processes, and oxidoreductase activity, and in the KEGG metabolic pathways, the differentially expressed genes were primarily enriched in phenylpropanoid biosynthesis and suberin biosynthesis. Conclusion The kinetic analysis of T. grandis ‘Merrillii’ embryogenic callus culture can identify the optimal inoculation period and optimizing the culture conditions can enhance cell growth rate and stress resistance. In embryogenic callus of T. grandis ‘Merrillii’ under exogenous GA3 treatment, metabolic pathways such as phenylpropanoid biosynthesis and suberin biosynthesis are the main participating parts of differentially expressed genes. Moreover, changes in the expression levels of some key genes may play an important role in the growth and development, environmental adaptation, and stress response of T. grandis ‘Merrillii’ callus. [Ch, 5 fig. 1 tab. 31 ref.] -
Key words:
- Torreya grandis ‘Merrillii’ /
- embryogenic callus /
- suspension culture /
- gibberellin
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除黑龙江、吉林、内蒙古和新疆4省(区)外，中国其余省(区、市)都有竹类生长和分布。据第8次(2009−2013年)森林资源清查，中国竹林面积达601 万hm2，占中国森林面积的3%，占世界竹林面积约20%[1]。在廊道旁、公园、古寺庙、风景区等地方种植竹子以增加景观优质性，是园林配置的一部分。竹林分布广，面积大，因此需要考虑竹林保护与防火等问题。有些竹种具有一定的防火能力，被作为防火植物使用，如毛竹Phyllostachys edulis、雷竹Ph. praecox等[2-3]。对于竹子的燃烧性能方面国内外研究较少，但是在森林可燃物的燃烧性和抗火性方面，国内外都进行了大量研究[4-9]。李树华等[10]认为：在火灾危险带种植刚竹Ph. sulphurea等植物可以减缓火势蔓延。钟安建等[11]对南昌城区15种园林树种的抗火性进行研究，认为珊瑚树Viburnum odoratissimum抗火性能最强，桂花Osmanthus fragrans抗火性能最差。金钱荣等[12]将木荷Schima superba选为防火功能较强的行道绿化树种。李世友等[13]对20种园林绿化植物的鲜枝叶进行燃烧试验及燃烧性排序。何忠华等[14]对12种园林树种的抗火性进行了综合评价，认为乐昌含笑Michelia chapensis抗火性最强。森林植物叶燃烧性研究方法可以为竹叶研究提供借鉴。张雨瑶等[15]对11种园林木本植物的新叶片和2种对比植物老活叶片进行了垂直燃烧实验，认为鹅掌楸Liriodendron chinense等燃烧性较强。氧指数试验法主要用于测定聚合材料的阻燃性能，如对于各种纺织品[16]、玻璃纤维增强塑料[17]、聚氯乙烯(PVC)管[18]、橡胶[19]等阻燃性能的测定，在森林可燃物研究方面的应用较少。本研究对17种园林竹鲜叶进行燃烧性比较，旨在分析园林竹鲜叶的易燃性差异，为竹林保护与防火提供依据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
以17种园林竹为研究对象(括号中数字为样品代号)，车筒竹Bambusa sinospinosa (1)、慈竹Neosinocalamus affinis (2)、灰金竹Phyllostachys nigra var. henonis (3)、灰香竹Chimonocalamus pallens (4)、料慈竹B. distegia (5)、龙竹Dendrocalamus giganteus (6)、绵竹B. intermedia (7)、青皮竹B. textilis (8)、沙罗单竹Schizostachyum funghomii (9)、秀叶箭竹Fargesia yuanjiangensis (10)、小佛肚竹B. ventricosa (11)、孝顺竹B. multiplex (12)、野龙竹D. semiscandens (13)、椅子竹D. bambusoides (14)、油竹B. surrecta (15)、云南甜龙竹D. hamiltonii (16)、紫竹Ph. nigra (17)。以5种常见易燃园林绿化用木本植物的老叶作对比，即阴香Cinnamomum burmanni (18)、桂花Osmanthus fragrans (19)、滇润楠Machilus yunnanensis (20)、蓝桉Eucalyptus globulus (21)、云南樟C. glanduliferum (22)。所有植物均栽植于西南林业大学校园内。由于新叶含水率呈动态变化，而老叶含水率相对稳定且易燃，故选老叶为实验样品。取叶时，选多株、不同枝条上外形和大小相似、质量相近的多片竹叶，于防火期采集健康的完整分枝，立刻带回实验室。
1.2 实验方法
采集同枝条上的老叶，分为2组，分别进行燃烧实验和含水率测定。燃烧实验前测定鲜叶质量、叶脉长度并在白纸上勾绘出鲜叶外形，实验在高浓度医用氧条件下进行，点火气体为丙烷气。将竹叶叶尖朝上、叶柄朝下放入试件夹中，点火器火焰长度为10~15 mm，从上朝下点火，用秒表记录竹叶燃烧时间。每种鲜叶重复6次实验。含水率(H)测定采用105 ℃烘干恒量法，取相对含水率。实验采用JF-3型氧指数测定仪进行。
1.3 数据获取及计算方法
叶片单位面积质量(W)、绝对线速率(V1)、绝对面积损失速率(V2)、绝对质量损失速率(V3)、相对线速率(V4)、相对面积损失速率(V5)和相对质量损失速率(V6)参照李世友等[6]、张雨瑶等[15]、郑永波等[20]和苏文静等[21]方法进行。
1.4 数据处理
运用SPSS 18.0软件，以平均V1、V2、V3、V4、V5、V6等6个指标进行因子分析，得到22种植物鲜叶的燃烧性能得分并排序。根据燃烧性能得分，应用聚类分析法划分等级。采用因子分析法对数据进行标准化处理，通过KMO值和Bartlett球体检验提取公因子，利用旋转法使因子变量更具有可解释性，计算因子变量得分。
2. 结果与分析
2.1 含水率、单位面积质量及燃烧速率
由表1可知：22种植物鲜叶的含水率和单位面积质量均差别较大，5种木本植物鲜叶单位面积质量均大于竹叶。单位面积质量最小、含水率较小的秀叶箭竹，燃烧速率最大。单位面积质量最大、含水率较大的云南樟，燃烧速率最小。含水率最大、单位面积质量较小的椅子竹，燃烧速率较小。含水率最小、单位面积质量中等的车筒竹，燃烧速率接近最大值。由此可见：鲜叶燃烧速率与单位面积质量、平均含水率有关。
表 1 22种植物鲜叶的含水率、单位面积质量及燃烧速率Table 1 Moisture content, mass per unit area and burning rate of fresh leaves of 22 plants speices代号 H/% W/(g·m−2) 绝对燃烧速率 相对燃烧速率 V1/(cm·s−1) V2/(cm2·s−1) V3/(g·s−1) V4/(%·s−1) V5/(%·s−1) V6/(%·s−1) 1 40.51 146 1.079 0.863 0.012 8.667 8.667 8.667 2 56.99 56 1.349 2.087 0.012 8.566 8.566 8.566 3 51.86 104 0.552 0.541 0.005 6.882 6.882 6.882 4 55.12 104 0.697 0.402 0.004 6.954 6.954 6.954 5 43.84 116 0.642 1.283 0.014 3.140 3.140 3.140 6 58.91 96 0.421 1.320 0.012 2.140 2.140 2.140 7 53.07 92 0.425 0.644 0.006 3.450 3.450 3.450 8 56.73 58 0.981 1.316 0.008 6.820 6.820 6.820 9 42.93 66 1.245 1.486 0.010 7.600 7.600 7.600 10 44.08 53 1.194 1.058 0.006 9.450 9.450 9.450 11 44.27 87 1.171 1.885 0.016 7.583 7.583 7.583 12 46.07 70 0.849 1.040 0.007 7.040 7.040 7.040 13 56.83 70 0.858 2.177 0.016 4.200 4.200 4.200 14 58.97 72 0.520 0.737 0.005 4.700 4.700 4.700 15 55.34 102 0.216 0.345 0.004 1.500 1.500 1.500 16 58.79 84 0.546 1.579 0.013 2.660 2.660 2.660 17 43.15 94 0.521 0.604 0.006 5.140 5.140 5.140 18 52.36 190 0.330 0.977 0.018 2.967 2.967 2.967 19 47.55 322 0.316 0.747 0.037 4.200 3.020 4.400 20 49.12 230 0.173 0.486 0.011 1.767 1.767 1.767 21 46.93 483 0.146 0.228 0.011 0.883 0.883 0.883 22 52.21 185 0.118 0.544 0.010 0.983 1.000 0.983 2.2 数据的标准化处理
由于所获得数据数值不同，单位不同，无法进行比较和计算，因此需要进行无量纲化处理。使用SPSS软件对数据进行标准化处理，结果如表2所示。
表 2 22种植物鲜叶燃烧性评价指标无量纲化后得分Table 2 Fresh leaf combustibility of 22 plants species evaluation index dimensionless points代号 V1 V2 V3 V4 V5 V6 1 1.108 53 −0.270 53 0.134 17 1.396 29 1.403 15 1.393 99 2 1.809 85 1.895 67 0.134 17 1.359 08 1.366 27 1.356 76 3 −0.260 34 −0.840 40 −0.849 73 0.738 69 0.751 40 0.735 89 4 0.116 30 −1.086 40 −0.990 29 0.765 21 0.777 69 0.762 44 5 −0.026 57 0.472 77 0.415 28 −0.639 89 −0.614 88 −0.643 72 6 −0.600 61 0.538 25 0.134 17 −1.008 29 −0.980 00 −1.012 41 7 −0.590 22 −0.658 11 −0.709 17 −0.525 68 −0.501 69 −0.529 43 8 0.853 98 0.531 17 −0.428 06 0.715 85 0.728 77 0.713 03 9 1.539 71 0.832 03 −0.146 95 1.003 20 1.013 56 1.000 61 10 1.407 24 0.074 57 −0.709 17 1.684 76 1.689 04 1.682 67 11 1.347 50 1.538 17 0.696 40 0.996 94 1.007 35 0.994 34 12 0.511 11 0.042 72 −0.568 62 0.796 90 0.809 09 0.794 14 13 0.534 49 2.054 95 0.696 40 −0.249 38 −0.227 85 −0.252 92 14 −0.343 46 −0.493 52 −0.849 73 −0.065 17 −0.045 29 −0.068 58 15 −1.133 09 −1.187 28 −0.990 29 −1.244 07 −1.213 68 −1.248 36 16 −0.275 92 0.996 62 0.274 72 −0.816 72 −0.790 14 −0.820 69 17 −0.340 86 −0.728 90 −0.709 17 0.096 92 0.115 36 0.093 65 18 −0.836 98 −0.068 78 0.977 51 −0.703 62 −0.678 05 −0.707 50 19 −0.873 34 −0.475 83 3.648 09 −0.249 38 −0.658 70 −0.179 18 20 −1.244 78 −0.937 74 −0.006 39 −1.145 71 −1.116 19 −1.149 92 21 −1.314 91 −1.394 34 −0.006 39 −1.471 38 −1.438 96 −1.475 84 22 −1.387 64 −0.835 09 −0.146 95 −1.434 54 −1.396 24 −1.438 97 2.3 KMO值和Bartlett球体检验
因子分析法并不能适用于任何情况，只有当样品数量大于评价指标数量时，才能得出KMO值和Bartlett球体检验结果，判断原始数据是否能够进行因子分析。对标准化后的数据进行KMO值和Bartlett球体检验，结果KMO值为0.625＞0.500，Bartlett检验接近0，说明指标具有相关性，适合做因子分析。
2.4 公因子提取
由表3可知：特征值大于1的公因子有2个，累积方差贡献率达到了89.623%，因此可用来描述22种园林植物鲜叶的燃烧性。
表 3 解释的总方差表Table 3 Interpretation of the total variance table成分 初始特征值 提取载荷平方和 旋转载荷平方和 总计 方差百分比/% 累积/% 总计 方差百分比/% 累积/% 总计 方差百分比/% 累积/% 1 4.114 68.567 68.567 4.114 68.567 68.567 4.084 68.070 68.070 2 1.263 21.056 89.623 1.263 21.056 89.623 1.293 21.553 89.623 3 0.591 9.843 99.466 4 0.031 0.515 99.981 5 0.001 0.019 100.000 6 1.887×10−8 3.145×10−7 100.000 2.5 因子旋转
采用最大方差法(varimax)进行因子旋转，目的是使公因子的相对负荷的方差之和最大，且保持原公共因子的正交性和公共方差总和不变。使每个因子的最大载荷变量数量最小，以简化对因子的解释。利用SPSS软件进行旋转，得到表4因子载荷矩阵。主成分1在绝对线速率(V1)、相对线速率(V4)、相对面积损失速率(V5)、相对质量损失速率(V6)上的载荷系数较大，体现了燃烧性能(f1)。主成分2在绝对面积损失速率(V2)、绝对质量损失速率(V3)的载荷系数较大，体现了燃烧性能(f2)。
表 4 旋转后因子载荷矩阵Table 4 Rotated factor load matrix评价指标 主成分 评价指标 主成分 1 2 1 2 V1 0.949 0.227 V4 0.981 −0.014 V2 0.480 0.718 V5 0.990 −0.600 V3 −0.224 0.850 V6 0.979 −0.007 2.6 计算因子得分
运用SPSS软件得出因子得分系数矩阵(表5)，因子得分模型可表示为：
表 5 因子得分系数矩阵Table 5 Component score coefficient matrix评价指标 主成分 评价指标 主成分 1 2 1 2 V1 0.224 0.125 V4 0.245 −0.066 V2 0.079 0.538 V5 0.250 −0.102 V3 −0.103 0.680 V6 0.244 −0.060 f1=0.224x1+0.079x2−0.103x3+0.245x4+0.250x5+0.244x6；
f2=0.125x1+0.538x2+0.680x3−0.066x4−0.102x5−0.060x6。
其中：xi为V1~V6的数值标准化后的数据，将表2的相关变量相应的代入上式中即得到22种植物鲜叶燃烧性公因子得分。再以各公因子的方差百分比作为权数计算22种植物鲜叶燃烧性综合评价得分。计算公式为：
F= λ1f1+ λ2f2=0.685 67f1+0.210 56f2。
其中：F为22种植物鲜叶的燃烧性能得分，λi为第i个公因子的方差百分比。得分大于0，说明该植物鲜叶的燃烧性能大于22种植物鲜叶燃烧性能的平均水平，反之则比较差；得分越高代表燃烧性能越好。
各植物鲜叶燃烧性能的最后得分及排名如表6所示。由表6可知：5种木本植物得分均小于0，且有2种燃烧性能得分排名最后，说明5种木本植物鲜叶的燃烧性能均低于平均水平。22种植物鲜叶的燃烧性能从大到小的顺序依次为慈竹、小佛肚竹、秀叶箭竹、沙罗单竹、车筒竹、青皮竹、孝顺竹、野龙竹、灰香竹、灰金竹、桂花、料慈竹、紫竹、椅子竹、云南甜龙竹、阴香、龙竹、绵竹、滇润楠、油竹、云南樟、蓝桉。其中，慈竹得分最高，说明最易燃，油竹得分最低，说明最难燃，但较云南樟、蓝桉易燃。具体来看，油竹的含水率较大、单位面积质量较大，在17种竹类中得分最低。秀叶箭竹含水率较小、单位面积质量最小，得分排在前列。蓝桉含水率较大、单位面积质量最大，得分排在最后。进一步说明了鲜叶的燃烧速率与单位面积质量、平均含水率有关。
表 6 22种植物鲜叶的燃烧性能得分及排序Table 6 Combustibility property score and rank of fresh leaves of 22 plants species代号 f1 f2 F 排序 代号 f1 f2 F 排序 1 1.245 11 −0.234 50 0.804 5 12 0.767 30 −0.482 73 0.424 7 2 1.546 36 1.026 31 1.276 1 13 0.031 05 1.700 27 0.379 8 3 0.510 85 −1.232 08 0.091 10 14 −0.072 37 −0.873 29 −0.233 14 4 0.609 57 −1.418 80 0.119 9 15 −1.157 88 −1.172 78 −1.041 20 5 −0.478 60 0.676 99 −0.186 12 16 −0.608 56 0.871 97 −0.234 15 6 −0.844 15 0.532 83 −0.467 17 17 0.014 46 −0.940 74 −0.188 13 7 −0.494 31 −0.792 39 −0.506 18 18 −0.807 66 0.681 30 −0.410 16 8 0.808 52 −0.063 17 0.541 6 19 −0.878 34 2.210 90 −0.137 11 9 1.168 40 0.310 35 0.866 4 20 −1.192 01 −0.405 70 −0.903 19 10 1.638 70 −0.650 80 0.987 3 21 −1.483 82 −0.585 92 −1.141 22 11 1.089 91 1.240 98 1.009 2 22 −1.412 53 −0.399 00 −1.053 21 2.7 聚类分析
应用SPSS软件对17种竹叶的燃烧性能得分进行聚类分析，由图1所示：17种园林竹鲜叶的燃烧性划为易燃和较易燃2个等级。其中，慈竹、小佛肚竹、秀叶箭竹、沙罗单竹、车筒竹、青皮竹、孝顺竹、野龙竹、灰香竹、灰金竹等易燃；料慈竹、紫竹、椅子竹、云南甜龙竹、龙竹、绵竹、油竹等较易燃。
3. 结论与讨论
对17种园林竹和5种易燃木本植物鲜叶燃烧性6个指标的因子分析可知：各植物得分差距较大，最高分与最低分之间相差2.417，说明22种植物鲜叶的燃烧性差距较大。与5种园林木本植物相比，竹叶均为易燃叶。料慈竹、椅子竹、云南甜龙竹、龙竹、紫竹、绵竹和油竹的鲜叶燃烧性能相对较低，尤其是油竹，比桂花、阴香和滇润楠还难燃。绝对线速率(V1)、相对线速率(V4)、相对面积损失速率(V5)和相对质量损失速率(V6)对其燃烧性影响较大。基于17种竹的燃烧性能得分，SPSS聚类分析将其划为易燃和较易燃2个等级，其中易燃竹种10种，较易燃竹种7种。
鲜叶的燃烧性受自身理化性质和生态学、生物学特性等多因素的综合影响。昆明地区旱季降雨稀少，园林竹浇水较为频繁，浇水周期、浇水量和浇水次数对竹叶的含水率造成一定影响。施肥也会影响竹子生理性能。研究表明施氮肥会提高大豆Glycine max的脂肪含量[22-23]；不同磷含量培养液处理下植株幼苗的株高、茎叶生物量和总生物量差异极其显著[24]；不同磷源处理下云南松Pinus yunnanensis幼苗体内磷含量明显不同[25]。施肥对植物化学成份的影响一定程度上也影响其燃烧性。本研究中的竹叶样品采自竹下较低部位；竹子受自身生长因素及光照等外部因素影响，不同空间部位的竹叶生长发育不均衡，也会导致竹叶不同的理化性质和生态学特性。以后的研究中，要尽量减少人工经营措施对实验取样的干扰，并且考虑不同空间部位对竹叶的作用，使样品更具有代表性。本研究根据竹叶的燃烧速率来分析燃烧性，而没有分析理化性质、生态学特性等对燃烧性的影响。因此，以上鲜叶的燃烧性排序及分类是在特定条件下得出的，能否适用于其他条件还需要进一步验证。
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图 1 培养过程中细胞鲜质量和活力的变化
Figure 1 Changes in fresh weight and viability of cells during incubation
图 2 不同培养条件对香榧胚性愈伤组织液体悬浮培养的影响
Figure 2 Effect of different culture conditions on the liquid suspension culture of embryogenic callus of T. grandis ‘Merrillii’
图 4 苯丙烷生物合成与木栓质合成相关通路及差异表达基因
Figure 4 Pathways and differentially expressed genes related to phenylpropanoid biosynthesis and suberin synthesis
表 1 差异表达基因RT-qPCR的特异性引物信息
Table 1. Gene-specific primer information for RT-qPCR
引物名称 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) XM_024662224.1 TCCAAGGGAAGGGGAACATC TCCCCGGATTGCAGAAGATT XM_027242615.1 TGTACCCTCCACCCTTTTCC TCTATCAGGGAGGGAGCAGA XM_020665027.1 TACGACCAGTCAGAGGCTTG AAACACCCACCGTCTTTGAC XM_002991298.2 CACGCCCAATTTTCACGAGA CGAAAACTAGGCAGGGCATC XM_022920293.1 TCGACCTTGAGACCTGGAAC TGATGGTGCAGCAAATCAGG TgActin TGGCATCTCTCAGCACATTCCA TGCCAACATCTCAAGCAAGCAC 
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