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樟树Cinnamomum camphora为高大常绿乔木，是优良的绿化树、行道树及庭荫树，其材质上乘，是制造家具的好材料，可提制樟脑和提取樟油，是南方珍贵用材和特用经济树种。樟树喜光，喜温暖湿润气候，对土壤要求不严，较耐水湿，存活期长，抗海潮风，在南方沿海地区极具应用价值，但它不耐干旱、瘠薄和盐碱土，土壤含盐量要求在2‰以内，这制约着它在南方沿海地区的引种栽培。国内外关于樟树的耐盐性研究较少，且主要集中在樟树对盐胁迫的生理响应上[1-3]，而对于如何提高樟树耐盐性方面，仅有研究表明施氮能缓解樟树盐胁迫带来的毒害[4]。光合作用是植物生长发育的基础，决定着植物的生产力，且对环境的变化较敏感。叶绿素荧光技术是近年来探测和分析植物光合功能的有效手段，光合色素和叶绿素荧光参数可以反映逆境对植物光合功能的影响，进而反映植物的耐受性。油菜素内酯（brassinosteroids，BRs）是一种广泛存在于植物中的甾醇类新型植物生长调节物质，在植物体内含量极低，但生理活性极高，植物经其低浓度处理便能表现出明显的生理效应[5]。它广泛参与植物各种生理过程，尤其在植物生长发育及其对逆境的响应等方面具有重要的调节作用[6]。关于外源BRs对植物抗盐性影响方面的研究已有一些报道：外源BRs可有效促进盐胁迫下植物种子萌发、幼苗生长[7-8]，提高叶片光合色素含量和光合能力[9]，增强抗氧化酶活性，降低膜脂过氧化产物丙二醛质量分数和质膜透性[10-11]，显著改善离子稳态和渗透调节能力[12]，且不同的BRs处理方式和浓度对盐胁迫下植物的调控效果存在差异[13-14]。这些研究都表明：BRs能不同程度地提高植物的耐盐性，但是BRs对盐胁迫下木本植物的研究却鲜有报道，BRs对盐胁迫下樟树幼苗的影响方面的研究更是未见报道。本实验主要研究BRs浸根处理对盐胁迫下樟树幼苗盐害指数、盐害率、相对含水率、光合色素和荧光参数的影响，揭示BRs对樟树幼苗光合功能的调节作用，为樟树耐盐能力的提高提供依据。
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2014年11月3日从南京林业大学校园内收集樟树种子，种子先用自来水加少许洗衣粉漂洗，除去不饱满的种子，用质量分数为15%过氧化氢（H2O2）处理30 min，将瓶口包纱布，自来水流动冲洗24 h倒掉；取出种子，用滤纸将其表面的水分吸干，放于45 ℃恒温培养箱中，培养24 h，取出后均匀放于沙床上，放入温度25 ℃，3 000 lx光照培养箱诱导发芽，待种子露白，播种于15 cm × 20 cm的育苗袋，置于南京林业大学江苏省句容市下蜀林场智能温室中。
油菜素内酯为24-表油菜素内酯（C28H48O6，分子量为480 kg·mol-1），粉末状，溶解于体积分数为95%的乙醇中，配制质量浓度为0.1，0.2，0.3 mg·L-1的BRs溶液。2015年5月2日，苗高超过50 cm，取大小、长势一致的苗木192株，分4组，48株·组-1，于上午8：00用蒸馏水将其表面冲洗干净，根部浸泡于0.1，0.2，0.3 mg·L-1的BRs溶液中48 h，以蒸馏水浸泡为对照，该溶液含有质量分数为0.02%吐温20（polyoxyethylenesorbitan monolaurate，Sigma Chemicals, 英国），取出定植于25 cm × 25 cm的花盆中，苗木的培养基质为m（土）:m（砂）=2:1。
每种BRs质量浓度处理下设置4个氯化钠浓度，分别为0，50，100，150 mmol·L-1，盐溶液加入Hoagland营养液，12株·处理-1。2015年6月13日用可调智能浇水控制器进行浇盐溶液。使用时探头插入土壤，将装置的土壤湿度值设置为40%，当探头探测到花盆内土壤湿度低于40%时装置会自动浇盐溶液。2015年8月15日统计盐害指数并采样。
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对全部植株进行观察统计，计算各处理的盐害指数和盐害率。盐害分级标准为0级：无盐害症状；1级：轻度盐害，有少部分（约1/5）叶片的叶尖、叶缘变黄；2级：中度盐害，有约1/2叶片叶尖、叶缘变黄；3级：重度盐害，大部分叶片叶缘、叶尖焦黄；4级：极重度盐害，叶片焦枯脱落、枝枯，最终死亡。盐害指数及盐害率计算公式为盐害指数（%）=∑（盐害级值×相应盐害级值株数）/（总株数×盐害最高级值）×100%；盐害率（%）=出现盐害症状株数/总株数×100%。
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采用蒸馏水浸泡及烘干称量法[16-17]测定。具体操作为取待分析新鲜植物叶片，称取鲜叶质量0.3 g左右，在蒸馏水中浸泡24 h后称其饱和鲜质量，105 ℃下杀青30 min后降至80 ℃烘干至恒量，称其干质量。用下面公式计算叶片相对含水量：
CRW（%）=[（原始鲜质量-烘干质量）/（饱和鲜质量-烘干质量）]×100%。
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采用容积比1:1的体积分数为95%乙醇和体积分数为85%丙酮混合溶液浸泡提取。取不同处理的植株上生长一致的新鲜叶片0.1 g，重复3次·处理-1，剪碎放入装有10 mL混合溶液的25 mL试管中，置暗处浸泡24 h，直到叶片发白，叶绿素全部浸提为止，浸泡过程中隔8 h振荡摇匀1次，保证叶绿素全部进入混合溶液中。浸提液分别在波长663，646和470 nm处测定吸光度D（λ）值。按下列公式计算：叶绿素a（Chla）质量分数=[12.7×D（663）-2.69×D（645）]×V/1 000W；叶绿素b（Chlb）质量分数=[22.9×D（645）-4.68×D（663）]×V/1 000W；类胡萝卜素（Car）质量分数=[（1 000×D（470）-3.27×叶绿素a质量分数-104×叶绿素b质量分数）/229]×V/1 000W。其中：V为提取液体积（mL），W为叶片质量（g），并计算叶绿素（Chl）总量=Chla质量分数+Chlb质量分数，Chla/b值，Car/Chl值[18]。
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利用叶绿素荧光成像系统（CFI）测定。随机选择3株·处理-1，选择成熟叶3片·株-1，鲜叶暗适应30 min后于荧光室中测定最大光化学效率（Fv/Fm），潜在光化学效率（Fv/Fo），有效光化学量子产量（Fv'/Fm'），实际光化学量子产量（ФPSⅡ），光化学猝灭系数（qP），非光化学猝灭系数（qN），测定过程中仪器光强设定为500 μmol·mol-1。
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用Excel 2003对实验数据进行统计，并用SPSS 19.0进行相关性分析，用Origin 8.5作图。
1.1. 实验设计与处理
1.2. 测定指标与方法
1.2.1. 盐害指数与盐害率的测定[15]
1.2.2. 相对含水率
1.2.3. 光合色素
1.2.4. 叶绿素荧光参数
1.3. 数据处理
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盐害指数和盐害率可以直观表现出樟树盐害状况。由表 1可以看出：随着氯化钠浓度的增加，樟树的盐害指数变大，经过BRs处理后，各氯化钠浓度下的盐害指数均显著减少，其中0.3 mg·L-1的BRs减少最显著，在50，10，150 mmol·L-1的氯化钠浓度下分别减少52.9%，45.3%，53.1%，而BRs对樟树的盐害率影响不大。
c氯化钠/
(mmcl • L-1)盐害指数/% 盐害率/% 对照 0.1 0.2 0.3 mg·L-1 对照 0.1 0.2 0.3 mg·L-1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 57.5 35.4 42.1 27.1 70 83.3 75.0 50.0 100 87.5 50.0 56.7 47.9 100 100.0 100.0 100.0 150 97.5 58.3 54.2 45.8 100 90.0 100.0 91.7 Table 1. Effects cf BRs cn the salt injury index and rate cf salt injury cf Cinnamomum camphora under NaCl stress
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相对含水率是反映植物体内水分状况的重要生理指标，也是反映植物抗逆性的可靠指标[19]。由图 1可以看出：50 mmol·L-1的盐胁迫对樟树的相对含水率影响不大，当氯化钠浓度达到100和150 mmol·L-1时，相对含水率显著降低。与对照相比，BRs处理过的樟树叶片，相对含水率在低氯化钠浓度下几乎不变，在高氯化钠浓度下，当BRs质量浓度为0.2和0.3 mg·L-1时显著升高。
Figure 1. Effects of BRs on the relative water content of Cinnamomun camphora leaf under NaCl stress
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由图 2可以看出：50 mmol·L-1氯化钠处理对樟树的光合色素几乎没有影响，此后随着氯化钠浓度的增加，Chla，Chlb，Chl，Car质量分数和chla/b均明显降低，而Car/Chl明显上升。BRs明显影响樟树盐胁迫下光合色素的质量分数；与对照相比，50 mmol·L-1氯化钠浓度下BRs明显降低了Chla/b，Chla，Chlb，Car和Chl质量分数；当氯化钠浓度继续加大到100 mmol·L-1时，与50 mmol·L-1盐胁迫相比，对照Chla/b，Chla，Chlb，Car和Chl质量分数降幅较大，Car/Chl升幅较大，而经过BRs处理过的樟树仅Chla/b下降显著，0.3 mg·L-1的BRs更促使樟树Chla，Chlb，Car和Chl质量分数不降反升，Chla/b也有小幅度上升，Car/Chl下降较大；当氯化钠浓度达到150 mmol·L-1时，与100 mmol·L-1的盐胁迫相比，经过BRs处理过的樟树Chla，Chlb，Car和Chl质量分数降幅比对照小很多，Chla/b反而上升，Car/Chl增幅小很多，Chla，Chlb，Chl质量分数和Chla/b超过对照，Car接近对照，Car/Chl远远低于对照。
Figure 2. Effects of BRs on the photosynthetic pigments of Cinnamomun camphora leaf under NaCl stress
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由图 3可以看出：樟树叶片的PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm和潜在光化学效率Fv/Fo随着氯化钠浓度的增加逐渐降低，与对照相比，100和150 mmol·L-1氯化钠浓度下，Fv/Fm和Fv/Fo有显著降低。当用BRs浸根处理后，不同BRs质量浓度对同一氯化钠浓度胁迫下的Fv/Fm和Fv/Fo影响不一样；樟树没受到胁迫时，BRs质量浓度越大，Fv/Fm和Fv/Fo越低；受到低盐胁迫时，BRs质量浓度对Fv/Fm和Fv/Fo影响不大；受到高盐胁迫时，BRs对Fv/Fm影响显著，100 mmol·L-1氯化钠浓度下，0.3 mg·L-1的BRs对应的Fv/Fm和Fv/Fo最高，150 mmol·L-1的盐浓度下，0.2 mg·L-1的BRs对应的Fv/Fm和Fv/Fo最高，0.2和0.3 mg·L-1 BRs处理的樟树叶片Fv/Fm和Fv/Fo随着氯化钠浓度的变化不显著。
Figure 3. Effects of BRs on the chlorophyll fluorescence parameters of Cinnamomun camphora leaf under NaCl stress
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图 3表明：有效光化学量子产量Fv'/Fm'和实际光化学量子产量ФPSⅡ有相似的变化趋势，当樟树没受到盐胁迫时，BRs降低了Fv'/Fm'和ФPSⅡ值，随着氯化钠浓度的增加对照的Fv'/Fm'和ФPSⅡ有明显的下降趋势，BRs减缓了这种下降趋势，且以质量浓度为0.2，0.3 mg·L-1的BRs减缓效果最好。当氯化钠浓度达到100 mmol·L-1以后，经过BRs处理过的樟树叶片Fv'/Fm'和ФPSⅡ值比对照高，氯化钠浓度为150 mmol·L-1时，经过0.2 mg·L-1的BRs处理的樟树Fv'/Fm'和ФPSⅡ值比对照分别高15.4%，4.9%。
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当樟树没受到盐胁迫时，BRs增加了光化学猝灭系数qP和非光化学猝灭系数qN的值，随着氯化钠浓度的增加，对照的qP逐渐加大，qN先增大后减少，当氯化钠浓度达150 mmol·L-1时，显著低于对照。经过0.3 mg·L-1的BRs处理过的樟树在氯化钠浓度为50 mmol·L-1时，qP和qN的值显著低于对照，当氯化钠浓度为100和150 mmol·L-1时，qP略高于对照，qN显著高于对照，0.2 mg·L-1的BRs对这2个氯化钠浓度处理下的qN也有显著增高作用。
2.1. BRs对盐胁迫下樟树盐害指数和盐害率的影响
2.2. BRs对盐胁迫下樟树叶片相对含水率的影响
2.3. BRs对盐胁迫下樟树叶片光合色素的影响
2.4. BRs对盐胁迫下樟树叶片荧光参数的影响
2.4.1. BRs对盐胁迫下樟树叶片Fv/Fm和Fv/Fo的影响
2.4.2. BRs对盐胁迫下樟树叶片Fv'/Fm'和ФPSⅡ的影响
2.4.3. BRs对盐胁迫下樟树叶片qP和qN的影响
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盐分对植物的危害主要是离子毒害、渗透胁迫，引起养分亏缺[20]。盐害指数是反映盐胁迫对幼苗伤害程度的一个重要指标。本研究中经过BRs处理过的樟树盐害指数显著低于对照，0.3 mg·L-1的油菜素内酯（BRs）处理的樟树在150 mmol·L-1的氯化钠浓度下，盐害指数为45.8%，远低于对照组在50 mmol·L-1盐浓度下的盐害指数，说明BRs减轻了樟树幼苗的盐害症状。研究证明，植物受盐胁迫越严重，其叶片吸水越困难，相对含水量也越低[21]。本研究中0.2和0.3 mg·L-1的BRs显著提高了樟树叶片相对含水量，显著减缓了相对含水量随着氯化钠浓度快速降低的趋势。
光合作用是植物最基本的生命活动，是植物合成有机物质和获取能量的根本源泉，它的强弱对于植物生长、产量及抗逆性都具有重要的影响。叶片光合色素含量是反映植物光合能力的一个重要指标，许多研究证实，环境因子的改变可以引起光合色素含量的变化，进而引起光合功能的改变[22]。色素是类囊体膜的重要组成成分，是光能的受体，其中叶绿素a有利于吸收长波光，叶绿素b有利于吸收短波光，类胡萝卜素既是光合色素，又是内源抗氧化剂，除在光合作用中具有一定的功能外，在细胞内还可吸收剩余能，猝灭活性氧，从而防止膜脂过氧化[23]。胡萝卜素/叶绿素比值的高低与植物忍受逆境的能力有关，叶绿素a/b比值的变化能反映叶片光合活性的强弱。本试验中，在高盐胁迫下，叶绿素a，叶绿素b，叶绿素总量，类胡萝卜素，叶绿素a/叶绿素b均明显降低，而类胡萝卜素/叶绿素比值明显上升，主要原因是高盐胁迫下叶绿素酶失活，使叶绿素分解[24]；另外，由于类胡萝卜素质量分数的降低，减少了对活性氧的猝灭，导致细胞内积累较多的氧自由基，破坏叶绿体膜结构，加速叶绿素的分解[25]，从而降低光合作用中光能的吸收和传递。经过BRs处理过的樟树在低盐浓度下虽然叶绿素a，叶绿素b，叶绿素总量，类胡萝卜素，叶绿素a/b均低于对照，但随着盐浓度的增加，却降低很小，胡萝卜素/叶绿素比值也并不升高，可能是由于BRs的作用提高了高盐胁迫下叶绿素酶的活性，促进了叶绿素的合成，还可能是由于BRs的作用，稳定了细胞内某些抗氧化酶类及抗氧化物质（如类胡萝卜素）的活性，使活性氧产生降低，减轻了叶绿体膜结构受损程度，使植物更有利于吸收光能，增强了植物的光合活性[26]，还有可能是BRs降低了高盐浓度对樟树叶片类囊体垛叠程度的削弱程度，缓解了叶片的光抑制，增强了抵抗氧化胁迫的能力[27]。
叶绿素荧光参数与光合作用中的各种反应密切相关，包含许多光合作用信息，极易受逆境的影响，它的变化可反映出逆境对光合作用某些过程的影响，是快速、灵敏、无损伤的研究和探测逆境条件下光合机构运转情况的理想方法[28]。Fv/Fm和Fv/Fo分别代表PSⅡ原初光能转化效率和PSⅡ的潜在活性，Fv/Fm（最大光能转化效率）在非胁迫环境下因植物种类的不同而异，但其降低程度是反应植物光合机构受环境胁迫损伤程度的重要指标[29]，Fv/Fo代表从Chla/b蛋白复合体LHCP到PSⅡ的光能传递能力[30]。本研究中，在高盐胁迫下，Fv/Fm和Fv/Fo均显著下降，此时PSⅡ产生伤害，PSⅡ的光化学活性及能量转化率下降，光合作用降低，经过BRs处理过的樟树叶片下降趋势变缓，且均高于对照组的Fv/Fm和Fv/Fo，这是由于BRs缓解了这种伤害，经过BRs处理过的樟树叶片光合机构比对照更不受盐胁迫影响，尤以质量浓度为0.2 mg·L-1效果最佳。
Fv'/Fm'为光适应下PSⅡ有效光化学量子产量，反映了在光适应条件下PSⅡ反应中心完全开放时的光化学效率[31]，ФPSⅡ为作用光下PSⅡ实际光化学效率[32]，能够反映PSⅡ反应中心原初光能捕获效率，是叶片用于光合电子传递的能量占所吸收光能的比例，常用于表示植物光合作用的电子传递量子产额，较高的ФPSⅡ值有利于提高植物的光能转化效率，促进碳同化的高效运转和有机物的积累[33]。本研究中，在100和150 mmol·L-1氯化钠浓度下，0.2和0.3 mg·L-1的BRs显著提高了樟树叶片的Fv'/Fm'和ФPSⅡ。这表明BRs能提高樟树高盐胁迫下叶片的光能转换效率。
光化学猝灭系数qP反映的是PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的份额，其值增加，说明PSⅡ的电子传递活性增高；其值下降，说明PSⅡ反应中心的开放比例和参与固定的能量减少[34]，非光化学猝灭系数qN反映的是PSⅡ天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的光能部分，非光化学能量耗散的提高，有助于耗散过剩的激发能，缓解环境对光合作用的影响[35]。研究结果显示：在高盐浓度下，樟树叶片的qN显著降低，而经过0.2和0.3 mg·L-1BRs处理过的樟树叶片qN却降幅很小，这表明BRs提高了樟树在高盐浓度下非光化学能量的耗散，使得过剩的激发能降低，从而缓解了高盐胁迫对其光合系统的影响。
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