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谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPXs）是一种重要的过氧化物分解酶，能清除活性氧，阻止脂膜氧化，起到保护细胞免受氧化胁迫的作用，具有重要的生理功能[1]。自CRIQUI等[2]从烟草Nicotiana tabacum中获得GPX基因后，先后从柑橘Citrus[3]，番茄Lycopersicon esculentum[4]，水稻Oryza sativa[5]，香蕉Musa nana[6]，荷花Nelumbo nucifera[7]，枣Ziziphus jujube[8]等植物中获得GPX基因。近年来，对于植物GPXs的研究主要集中在生物胁迫和非生物胁迫（如高温、低温、干旱、重金属毒害、耐盐等）方面，尤其是GPXs在非生物胁迫中的功能作用，证实了GPX基因与植物抗逆性紧密相关。在非生物胁迫下，GPX基因在转录水平发生变化，参与相关氧化还原途径[9]。如苹果Malus MdGSTU1提高苹果的耐盐能力[10]，过量表达NtGPX基因提高烟草的抗冻性[11]，番茄LePHGPX基因的过量表达提高植株耐高温能力[12]。研究人员对拟南芥Arabidopsis thaliana GPX基因的功能研究取得较大进展，新的GPX被不断发掘（拟南芥目前已知8个），对其中7个GPX基因的研究证实，全部对非生物胁迫有应答反应，转基因可提高植物抵御胁迫的能力[13]，如AtGPX3能显著增强植株的抗旱性[14]，AtGPX1具有抗高温下的氧化胁迫能力[15]。目前虽有多种植物GPX基因被发现，并开展相关功能研究，但主要集中于单子叶和双子叶植物，对裸子植物的研究较少。马尾松Pinus massoniana属裸子植物松科Pinaceae松属Pinus植物，是中国南方重要的用材林树种[16]，但在马尾松生长过程中常受到病虫害的危害，给林业经济带来严重损失，制约了马尾松人工林的健康发展。本研究在高通量测序分析基础上结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术，获得谷胱甘肽过氧化物酶基因，对其进行生物学分析，利用实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术研究其不同组织、不同抗性材料、不同时间表达模式，为探求马尾松虫害防御机制提供依据。
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植物材料包括抗虫马尾松品种‘松韵’‘Songyun’和对照GC101无性系，材料选自广西马尾松桐棉种源，采自广西马尾松种质资源库。该库栽植于2007年，树龄8年生，栽植株行距为4 m × 4 m，根、茎、叶、花、果采自普通马尾松无性系，雌雄球花样品采自2015年2月，其他组织采自2015年4月。日变化叶和茎的材料采自2015年5月，采样时间分别在当日的7：00，10：00，13：00，16：00，19：00，所有样品采摘后放入液氮中保鲜，带回实验室存放于-80 ℃冰箱中备用。
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实验所有样品的RNA采用多酚多糖植物RNA提取试剂盒（天根公司）进行提取，具体步骤按说明书进行。提取完成后进行凝胶电泳检查质量，参照M-MLV逆转录酶合成cDNA，进行凝胶检查和浓度测定（采用核酸定量仪）后备用。根据前期马尾松转录组测序结果中PmGPX的部分cDNA序列进行比对，根据获得的序列在2端设计特异引物，3′端引物（5′-ATGGCATCCTCTTTCGCAGCATCT-3′），5′端引物（5′-TGCAGCAAGCAGATTCTGTATATCC-3′）。以不同组织等量混合cDNA为模板进行扩增。设定退火温度为56.0 ℃，具体聚合酶链式反应（PCR）扩增体系和参数参照Taq DNA聚合酶说明书进行操作，扩增产物经凝胶电泳检查获得目的条带后，用胶回收试剂盒进行回收纯化，连接、转化后进行菌液PCR检查正确后测序。
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采用在线SOSUI和Plant-mPLoc亚细胞定位，利用Proteomics Server，SignalP 4.1 Server，SOPMA，TargetP 1.1 Server，DAS软件分析基因等电点、信号肽、二级结构、亲水性和跨膜结构，利用Motif Scan和SMART分析基因的功能结构域。将PmGPX基因完整氨基酸序列在美国生物技术信息中心（NCBI）进行覆盖率和同源性比较，利用DNAMAN软件构建PmGPX与其他植物的进化树。
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根据马尾松内参基因筛选结果[17]，利用UBI4基因和CYP基因作为内参基因，内参引物分别为UBI4F: AGCTCCGACACCATTGATAA，UBI4R: CCAAAGTACGTCCAT CTTCCA，CYPR: CAAGGGTTCGTCGTTCCAC，CYPF: GGCAAACTTCTCGCCGTA，同时设计PmGPX基因引物，PmGPX1F: TCAAACTCCCCGTCTTATGG，PmGPX1R：GCTCCAACTGAATCCT TGC。参照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Prefect real-time）试剂盒，构建qRT-PCR体系和扩增程序，其中退火为58 ℃，采用45个循环作熔解曲线。设生物学重复3个·样品-1，根据2-ΔΔCt法[18]计算相对表达量。
1.1. 实验材料
1.2. 实验方法
1.2.1. RNA提取及PmGPX克隆
1.2.2. 序列分析
1.2.3. 基因表达模式分析
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对马尾松不同抗虫材料高通量测序比对发现，有个基因在抗虫材料中大量表达（log2.Fold_1.1491），该基因在KEGG代谢途径中只参与谷胱甘肽代谢（glutathione metabolism）和花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）途径。这2个途径中只有该基因上调表达，通过对序列在NCBI进一步比对，确定为谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase）基因。通过进行扩增、比对，获得了该基因完整开放阅读框（ORF）序列，命名为PmGPX。该基因完整开放阅读框（ORF）共包括741 bp，编码246个氨基酸（图 1）。
Figure 1. cDNA and amino acid sequence of PmGPX
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利用生物信息学软件对PmGPX编码的氨基酸序列进行分析，结果显示：该基因不含信号肽，有6个丝氨酸（Ser）和1个色氨酸（Try）磷酸化位点，2个糖基化位点；二级结构预测中：α-螺旋占30.49%，随机卷曲占38.62%，延伸链占20.33%，β-转角占10.57%；该基因等电点为8.29，蛋白分子量为27.08，在113~117个氨基酸处存在1个跨膜结构，亚细胞定位于叶绿体。
对PmGPX蛋白进行功能结构域显示，具有3个N-糖基化位点，4个N-酰基化位点，2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，4个蛋白激酶c磷酸化位点，二硫键氧化还原酶结构域、硫氧还蛋白结构域、固氮铁蛋白、抗氧化蛋白AhpC/TSA家族结构域、谷胱甘肽过氧化物酶结构域，以及谷胱甘肽氧化酵素活性部位和信号位点（图 1）。
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PmGPX核酸序列进行比对发现，序列同源性在62%~100%，相似度在74%~94%，与白云杉Picea glauca和北美云杉Picea sitchensis相似度最近，与葡萄Vitis vinifera，烟草，龙眼Dimocarpus longan等植物相似度为74%~78%。氨基酸序列比对发现，序列同源性在64%~100%，除与北美云杉相似度在91%外，与其他相似度为58%~81%，大部分为64%~80%，与山嵛菜Eutrema yunnanense，亚麻芥Camelina sative，菜豆Phaseolus vulgaris的相似度低，总体上除与针叶类同源性较高外，其他都较低。但对谷胱甘肽过氧化物酶保守域同源性比对时发现，PmGPX氨基酸序列与其他植物具有很高的同源性，特别是在3个特征性结构域G1，G2，G3高度保守，PmGPX构成GPX催化三联体的3个氨基酸（Cys119，Gln150，Trp209），具有植物GPX蛋白活性中心的3个保守半胱氨酸（Cys）残基Cys119，Cys148，Cys167（图 2）。
Figure 2. Multiple sequence alignment of amino acid of the PmGPX proteins isolated
采用邻接法（neighbor-joining method）对20个植物的GPX基因构建进化关系树，马尾松与北美云杉聚为一类，并且与大叶藻的同源关系较近，与山嵛菜，亚麻芥，菜豆，无油樟Amborella trichopoda，小米Setaria italica和玉米Zea mays的同源关系较远。推测马尾松PmGPX基因与针叶植物，尤其是与云杉的该基因在进化过程是相似的，而与其他植物则存在较大差异，单子叶植物玉米、香瓜Cucumis melo同源关系较远，双子叶植物间相对的分化较小（图 3）。
Figure 3. Amino acid sequences cladogram analysis between PmGPX and other GPX
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实时荧光定量对根、茎、叶、花、果中PmGPX基因的表达特征进行分析表明，PmGPX基因在所有组织中都有表达，但表达量存在明显的差异。PmGPX基因主要表达于针叶和茎中，在针叶中的表达量要高于其他组织，在嫩叶中的表达量为根中表达量的33.45倍，针叶成熟度的不同表达量差异也明显，嫩叶中表达量是成熟叶的2.72倍。PmGPX基因在不同成熟茎中的表达量差异不明显，虽仅次于在叶中的表达量，但相差11.04倍，在根、雌雄花、果等4个组织中的表达量相差不大，表达量均较少（图 4）。
Figure 4. Expression of PmGPX gene in different organs by fluorescent quantitative RT-PCR
为进一步研究PmGPX基因在不同材料1 d内的变化模式，采用qRT-PCR进行分析, 结果如图 5所示。在嫩叶和老叶中，2个材料PmGPX基因表达变化趋势相似，都是“升—降—升”模式。在嫩叶中抗虫材料在10：00时表达量达到最大值，是7：00表达量的2.65倍，而对照中该基因从7：00-16：00的表达量变化不大，只有到19：00时才达到峰值。老叶中2种材料的表达规律一致，不同的是PmGPX在抗虫材料中的表达要高于对照，在13：00时表达量要高于对照。从茎中的表达模式分析，PmGPX在不同成熟茎和不同抗性材料中的变化趋势一致，随时间推移，表达量不断上升。不同的是在嫩茎中前4个时间点，2种材料的表达量基本相同，在19：00时抗虫材料的表达量才出现明显的上升。而在老茎抗虫材料中PmGPX的表达量始终高于对照，在13：00时两者的表达量相差3.48倍。
Figure 5. Expression of PmGPX gene in resistant and susceptible varieties of Pinus massoniana by qRT-PCR
2.1. 基因全长获得
2.2. PmGPX基因序列分析
2.3. PmGPX蛋白同源性及进化
2.4. PmGPX基因表达分析
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在马尾松抗虫材料转录组测序差异分析发现，在谷胱甘肽代谢存在唯一大量上调表达的基因，并且参与了花生四烯酸代谢途径，通过克隆比对确定为谷胱甘肽过氧化物酶基因，命名为PmGPX。该基因与针叶植物云杉同源性较高，在谷胱甘肽过氧化物酶保守域与其他植物同源性也较高，说明植物GPX基因在进化过程中虽然N端序列发现了改变，但在GPX基因功能结构域中的变化不大。另外，在PmGPX序列具有GPX中3个保守的特征性结构域，及GPX蛋白活性中心的3个保守半胱氨酸（Cys）残基。目前已知的植物GPX的活性位点由Cys作为催化残基来代替动物体内的硒代半胱氨酸[6, 19]，马尾松PmGPX也在Cys119处替代了动物PHGPXs中的硒代半胱氨酸残基，进一步证明PmGPX是GPX的家族成员。
PmGPX存在二硫键氧化还原酶结构域、硫氧还蛋白结构域、谷胱甘肽过氧化物酶结构域等功能结构域，在植物体内GPXs是含有巯基的过氧化物酶类，通过催化GSH来减少过氧化氢或有毒化合物，起到解毒和保护细胞免受破坏[20-21]。
MILLA等[13]推测拟南芥中的GPX基因分布于3条染色体上，定位在叶绿体、线粒体、胞质等亚细胞器中，如AtGPX2定位于细胞质。本研究PmGPX预测定位于叶绿体中，推测AtGPX1与抵御光氧化胁迫有关。活性氧在植物细胞代谢中主要来源于叶绿体、线粒体，亚细胞定位与功能有直接关系，马尾松PmGPX发挥的作用可能与光合或产生活性氧有关。
本研究中马尾松PmGPX在所有组织中均有表达，与已有研究结果一致，说明PmGPX在马尾松生长过程中起到清除细胞内活性氧（ROS）的作用[13]，但PmGPX基因在叶和茎中的表达最高，这与拟南芥[13]和油菜Brassica napus[22]的研究结果一致，而香蕉MaGPX在花和根中表达量较高[6]，白菜Brassica pekinensis BrGPX6a在早期子叶胚中的表达量较高，在成熟胚中表达较低[23]。不同植物或同一植物GPX在不同组织中的表达均有所差别，可能与不同组织中活性氧的分布有关联[7, 13, 24]。由于PmGPX基因在叶中，尤其是嫩叶中的表达量最高，而在雌雄花和根中表达量极低，进一步验证了该基因亚细胞定位于叶绿体的可能。
PmGPX基因在不同抗性材料同一组织中的表达模式基本一致，主要区别在于抗性品种PmGPX基因表达量始终高于对照，并且随时间延长，表达量提升速度和达到峰值的时间均比对照要早。从选出的抗逆性材料来看，耐铝小麦Triticum sestivum和水稻品种，在受到铝胁迫后GPX活性明显提高，而对照则出现下降趋势[25-26]，同样耐盐品种在盐胁迫下，本身含有或能够迅速提高植株的抗氧化能力，对照则较低[27]。从非生物胁迫下，香蕉MaGPX在盐、干旱等胁迫下表达量上升[7]，拟南芥AtGPX1表达量的上升，会提高抵御光氧化胁迫[15]。
目前，有关GPX基因在植物抗虫功能的研究还较少，马尾松PmGPX基因在抗虫材料中的高表达，现有研究表明：植物中GSH合成和酶活性提高，能够增加植物对多种胁迫的抵抗能力，相反在环境胁迫下GPXs的mRNA水平也会提高，在谷胱甘肽代谢中GPX基因表达量提高，能够提高氧化谷胱甘肽量，从而转化成GSH，提高植物抵御环境胁迫的能力[28-29]。马尾松PmGPX在抗虫材料中高表达，提高了防御虫害的能力，另外，PmGPX基因在抗虫材料花生四烯酸代谢中高量表达，推测该基因可能提高该途径15-oxoETE和5-oxoETE代谢物含量，从而提高丙酮含量，提高了防御抗虫的能力，但通过何种信号传导途径参与来起作用[14]，有利于抵御虫害次生代谢物质的产生，起到抗虫效果还有待进一步研究。
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