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土壤盐渍化是一个全球性的热点问题，是农业发展所面临的主要危机之一[1]。目前，全世界约有20%的灌溉土地受到盐胁迫影响，中国约有3 460万hm2盐渍土地[2]。果树盐碱地栽培的研究也是国内外关注的重点[3]。盐胁迫下，植物细胞内自由基的产生与清除的动态平衡被打破，造成氧化胁迫，加速膜脂过氧化，有害物质积累，引起代谢紊乱[4]。褪黑素(melatonin，MEL)又称松果素，1958年被LERNER[7]从牛松果体中首次提取出来，其化学成分为N-乙酰基-5-甲氧基色胺。大量研究表明，褪黑素是一种吲哚类激素，具有植物生长调节物质的功能，同时还具有抵抗胁迫的生物刺激物质的功能，对高温、低温、紫外及电离辐射、重金属和化学污染、生物氧化等生物和非生物胁迫都有一定的抵抗作用[8]。目前，有关猕猴桃Actinidia耐盐性的研究已有一些报道[9-10]，但关于外源褪黑素对盐胁迫下猕猴桃生长及抗逆生理特性的研究还比较少。猕猴桃为猕猴桃科Actinidiaceae猕猴桃属多年生藤本植物。猕猴桃果实为典型的浆果，主要是以含维生素C高，适口和特异的风味见著。猕猴桃在全球都具有极好的经济发展前景，是一种重要的果树资源[5]。前人研究表明，猕猴桃一般既不耐离子胁迫也不耐渗透胁迫[6]。因此，提高猕猴桃对盐碱地的耐性，保证猕猴桃在盐胁迫下能够维持正常的生理水平，对获得理想的产量和品质有重要意义。本研究以野生美味猕猴桃Actinidia deliciosa实生苗为材料，研究了外源褪黑素对氯化钠胁迫下其实生苗体内的活性氧代谢和渗透调节物质的影响，为合理利用褪黑素缓解美味猕猴桃栽培中的盐害问题提供理论基础。
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于2016年1月将采于陕西秦岭的美味猕猴桃种子4 ℃层积2个月，然后在培养箱中变温处理2周，光暗周期为8 h/16 h，昼夜温度为25 ℃/4 ℃。之后25 ℃恒温培养至种子萌芽。将发芽的种子播种到育苗盘中，上面覆盖2 mm的营养土，于人工气候室中培养，光暗周期为12 h/12 h，昼夜温度为25 ℃/20 ℃。当实生苗长到2~3片真叶时，选取长势一致的实生苗移到装有珍珠岩的花盆中，3株·盆-1。移苗后注意保湿遮阴，浇营养液。
当美味猕猴桃实生苗长至9~10片叶时，进行试验处理。选择整齐一致的壮苗分成5组，其中3组分别连续5 d根灌0.1 μmol·L-1褪黑素溶液，其余2组根灌相同体积的清水。在最后一次根灌褪黑素溶液的第2天开始进行盐胁迫处理。任选1组根灌清水的猕猴桃实生苗作为空白对照(ck)，即继续根灌清水，其余2组猕猴桃实生苗均根灌100 mmol·L-1的氯化钠溶液，连续根灌12 d，处理期间适当补充1/2Hoagland营养液。各处理分别表示为：①ck。清水处理。②S1。氯化钠(100 mmol·L-1)。③S2。褪黑素(0.1 μmol·L-1)+氯化钠(100 mmol·L-1)。10盆·处理-1，重复3次。氯化钠胁迫处理浓度和试验处理天数均根据预备试验确定。在氯化钠浇灌处理后的第0，3，6，9，12天分别采取根基向上第3~5片真叶，将叶片在液氮速冻后，置于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于测定生理指标。
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脯氨酸采用酸性茚三酮法测定[11]。丙二醛(malondialdehyde，MDA)参照硫代巴比妥酸法[12]。过氧化氢参照郝建军等[13]的方法。可溶性糖、可溶性蛋白质参照李合生等[11]的方法。超氧化物歧化酶(SOD)的活性采用GIANNOPOLITIS等[14]的方法。过氧化氢酶(CAT)活性采用改良后的KATO等[15]的方法。过氧化物酶(POD)活性采用SCEBBA等[16]的方法。抗坏血酸(AsA)参考KAMPFENKEL等[17]的铁离子(Fe3+)还原法。
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所有数据输入Excel表格，计算平均数和标准差，并利用SPSS 22.0对所有数据进行显著性分析。
1.1. 植物材料培养与处理
1.2. 测定项目及方法
1.3. 数据处理
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逆境条件下，植物体内丙二醛质量摩尔浓度的高低能够反映出细胞膜的损伤程度，是膜脂过氧化的主要产物。图 1显示：在未经氯化钠处理前，各个处理间的丙二醛没有显著的差异。氯化钠胁迫至6 d时，S1处理和S2处理的丙二醛质量摩尔浓度达最高值，较对照植株上升490.32%和262.81%。氯化钠胁迫6 d后，丙二醛开始下降，但仍高于ck。此外，随着氯化钠胁迫时间的增加，S1处理和S2处理的过氧化氢质量摩尔浓度逐渐上升，在12 d时达最大值。胁迫12 d，S1处理较ck处理增加了83.90%，而S2处理仅增加了27.40%。由此推测，外源褪黑素可显著缓解盐碱逆境条件下丙二醛和过氧化氢的积累，保护细胞膜的完整性，降低膜脂过氧化程度，从而提高美味猕猴桃的耐性，减轻盐胁迫对植物的伤害程度。
Figure 1. Effects of exogenous melatonin on MDA content and H2O2 content in kiwifruit under NaCl stress
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由图 2可知：S1处理和S2处理的脯氨酸的质量分数在0~3 d显著上升，上升幅度为53.74%和58.87%，3~12 d则开始逐渐下降，但仍维持较高水平，且S2处理显著高于S1处理。美味猕猴桃叶片的可溶性糖质量分数随氯化钠胁迫时间的延长逐渐升高，胁迫12 d时达最高值，且S2处理的可溶性糖均高于S1处理。由此可推测：外源褪黑素的施加有利于促进植物体内游离脯氨酸和可溶性糖的增加，增强细胞内渗透势能力，以达到提高植物抵抗逆境的能力。美味猕猴桃叶片中可溶性蛋白质质量分数变化差异不明显。氯化钠胁迫后，ck处理的质量分数变化不明显，而S1和S2的可溶性蛋白质呈先降低后升高的趋势，0~3 d时降低，分别降低了8.08%和2.10%，随后开始逐渐上升。氯化钠胁迫12 d时，S1处理和S2处理可溶性蛋白质高于对照，分别为6.22 mg·g-1和6.39 mg·g-1。可见，外源褪黑素处理可以缓解盐胁迫下美味猕猴桃蛋白质的降解。
Figure 2. Effects of exogenous melatonin on proline, soluble sugar and soluble protein in kiwifruit under NaCl stress
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超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的大小代表了清除细胞内活性氧能力的高低，是植物逆境条件下保护细胞的重要酶类。由图 3可知：SOD和POD活性的变化模式相似，均呈先升高再降低的趋势。氯化钠胁迫0~6 d，S1处理和S2处理的SOD和POD活性逐渐上升，S1处理SOD活性上升6.26%，S2上升6.88%；POD活性则显著增加，分别增加156.61%和180.66%。6~12 d时活性逐渐降低，12 d时SOD活性低于ck，POD活性仍保持较高水平，且S2的SOD和POD活性均高于S1。所以，可认为外源褪黑素激活了氯化钠胁迫下美味猕猴桃体内的SOD和POD活性，增强了植物体内活性氧的清除能力，有效稳定了膜质透性，增强了美味猕猴桃的抗盐性。
Figure 3. Effects of exogenous melatonin on SOD, POD, CAT activity in kiwifruit under NaCl stress
CAT具有清除植物体内过氧化氢的作用，也是植物酶促防御系统的重要组分。在开始氯化钠浇灌处理的当天(0 d)，ck，S1，S2处理的美味猕猴桃实生苗叶片中CAT活性差异不显著。0~3 d，S1处理和S2处理的CAT活性显著升高，分别增加了92.08%和164.36%。3~12 d，植株体内CAT活性逐渐下降，且逐渐低于0 d的活性，分别降低35.64%和15.84%。由此可以推测：外源褪黑素激活了美味猕猴桃体内CAT活性，CAT活性的增加提高了美味猕猴桃清除过氧化氢的能力，有效缓解了氯化钠胁迫诱导的膜脂过氧化，提高了美味猕猴桃的耐盐性。
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由图 4可知：与对照(ck)植株相比，在盐胁迫前3 d，S1处理和S2处理抗坏血酸(AsA)显著降低，而随着盐胁迫时间的增长，又开始逐渐上升，并维持较高水平，12 d时达最大值，分别上升56.58%和90.49%。这表明：外源褪黑素可以有效增加美味猕猴桃体内的抗坏血酸，增强植物清除活性氧的能力，从而提高美味猕猴桃的耐盐性。
Figure 4. Effects of exogenous melatonin on AsA in kiwifruit under NaCl stress
2.1. 外源褪黑素对氯化钠胁迫下美味猕猴桃叶片膜脂过氧化程度的影响
2.2. 外源褪黑素对氯化钠胁迫下美味猕猴桃叶片渗透调节物质的影响
2.3. 外源褪黑素对氯化钠胁迫下美味猕猴桃叶片的抗氧化酶活性的影响
2.4. 外源褪黑素对氯化钠胁迫下美味猕猴桃叶片非酶抗氧化剂的影响
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盐胁迫是限制植物生长和作物产量的重要环境因素。盐胁迫对植物组织和器官的生长发育具有显著的影响[18]。目前，关于褪黑素和植物耐盐性关系的研究还不多。本研究表明：外源褪黑素可有效缓解美味猕猴桃体内丙二醛(MDA)和过氧化氢的积累，增加体内脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白质，增强SOD，POD，CAT活性，提高抗坏血酸。
游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白质是植物体内的3个重要渗透调节物质，能够增加植物细胞在高温、盐碱等逆境条件下的功能蛋白数量，保持细胞原生质体与环境之间的渗透平衡和结构完整性保护膜系统稳定性，提高植物抵抗逆境的能力。脯氨酸能够提高细胞原生质的亲水性，具有减少可溶性蛋白质沉淀或增加蛋白质可溶性的作用，增强植物组织细胞的持水性，防止植物细胞脱水，保护细胞质膜的完整性[19]。植物在遭受逆境时，叶片可溶性蛋白质合成速率会发生变化，而可溶性蛋白质含量变化可以反映蛋白质合成、变性和降解多方面信息。已有研究表明：氯化钠胁迫会使番茄Lycopersicon esculentum幼苗[20]和狼尾草Penniseturn alopecuroides[21]体内的脯氨酸显著上升，可溶性蛋白质下降，而外源褪黑素的施加可以提高番茄幼苗和狼尾草体内的脯氨酸和可溶性糖。本研究表明：氯化钠胁迫可导致美味猕猴桃苗体内脯氨酸显著积累，并随着氯化钠胁迫时间延长一直保持较高水平，这是植物的自我保护机制，而外源褪黑素预处理会进一步增加脯氨酸，说明褪黑素增强了这种保护机制。由此可以推测：外源褪黑素预处理可有效地提高盐胁迫下美味猕猴桃的脯氨酸，维持较低的细胞渗透势，减少水分流失，从而提高美味猕猴桃的耐盐性。氯化钠胁迫下，美味猕猴桃实生苗体内可溶性蛋白质先下降后上升，可能是由于刚经受胁迫时，美味猕猴桃体内由于胁迫产生的活性氧破坏了蛋白质的稳定性或影响了蛋白质合成的生理代谢途径，随后美味猕猴桃自我保护机制的启动使蛋白质发生回升，而褪黑素预处理可以减少氯化钠胁迫下美味猕猴桃蛋白质的降解，猜测是由于褪黑素促进了美味猕猴桃实生苗体内热激蛋白质的合成，保护了体内蛋白质免受破坏。可溶性糖也是重要的渗透调节物质，在植物遭受逆境时大量合成，维持细胞内渗透势，保护膜系统稳定性，因此也具有重要作用。氯化钠胁迫会导致植物体内可溶性糖显著增加[22-23]。本研究表明：美味猕猴桃实生苗体内可溶性糖在盐胁迫过程中显著增加，外源褪黑素的施加可进一步显著提高可溶性糖。由此可推测，褪黑素通过提高可溶性糖，增强维持细胞内的渗透势，从而达到提高美味猕猴桃抵抗逆境的能力。
活性氧(ROS)作为信号转导途径的第二信使参与植物生长和建成[24]。正常情况下植物体内ROS的产生和消除处于动态平衡状态，这种平衡状态主要由抗氧化物酶和抗氧化物质调节。而当植物处于逆境条件时，体内的活性氧系统被打破，产生大量ROS，导致负氧离子(O2-)，氢氧根(OH-)等自由基的大量累积，自由基启动膜脂过氧化作用，膜透性增大，破坏膜结构的完整性，进而引起蛋白质变性，DNA损伤，碳水化合物的氧化、色素的降解以及酶活性受损，甚至细胞死亡[25]。
本研究显示：氯化钠胁迫条件下，美味猕猴桃实生苗叶片中丙二醛(MDA)和过氧化氢均显著上升，且随氯化钠盐胁迫时间延长，均维持较高水平。用外源褪黑素预处理可有效缓解美味猕猴桃体内丙二醛和过氧化氢的积累。这可能是由于外源褪黑素预处理有效地缓解了活性氧的产生速率，降低了活性氧对细胞膜的伤害[26-27]。另外，褪黑素具有一定抗氧化能力和在细胞培养中被证明具有保护膜(细胞核和血浆膜)完整性的功能[28-29]。
植物体内清除活性氧的重要保护酶是SOD，POD和CAT，能够有效地分解植物体内的活性氧自由基，使植物免受伤害。本研究表明：SOD，POD和CAT的活性随着氯化钠胁迫时间的延长呈先上升后下降的趋势，而外源褪黑素预处理能够显著增加美味猕猴桃实生苗的SOD，POD和CAT活性，提高美味猕猴桃实生苗清除活性氧的能力，这与王丽英[31]研究褪黑素预处理对黄瓜Cucumis sativus幼苗SOD，POD和CAT活性影响的变化趋势一致。由此可以推测：外源褪黑素可能作为抗氧化剂增强抗氧化物酶相关基因的表达来提高抗氧化酶活性，从而增强清除细胞内活性氧的能力，提高美味猕猴桃耐盐性。
除此以外，抗坏血酸(AsA)也是关键的非酶促抗氧化剂，除了参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环外，也可直接清除负氧离子(O2-)和过氧化氢等活性氧[30]。本研究表明：外源褪黑素预处理显著提高了美味猕猴桃实生苗体内抗坏血酸，且随着氯化钠盐胁迫时间的延长，增长越显著。由此推测：外源褪黑素预处理可以有效提高美味猕猴桃实生苗体内抗坏血酸，增强清除活性氧能力，抑制脂质过氧化，从而提高美味猕猴桃耐盐性。综上所述，外源褪黑素预处理美味猕猴桃实生苗，能有效减弱氯化钠胁迫对其活性氧代谢和渗透调节物质的影响，提高美味猕猴桃的耐盐性。
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