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芒萁Dicranopteris dichotoma为里白科Gleicheniaceae芒萁属Dicranopteris多年生常绿蕨类植物,分布于长江中下游及长江以南、西南等亚热带低山丘陵区,被视为亚热带森林分布地区退化植被的“标志种”[1-3]。近年来,从更新扩散后生物量的分布[4]、对生境因子的响应[5]到对光强的生态适应性,学者们对芒萁进行了广泛研究。自然条件下,芒萁分布于马尾松Pinus massoniana,杉木Cunninghamia lanceolata单优群落和疏灌草丛的下层及其群落外缘,形成单优草本层片[6-7]或成为马尾松人工林草本层的优势种[8];易在马尾松人工林1 200~1 600 m2的林窗下扩散定居[9],常在毛竹Phyllostachys edulis林呈聚集分布[10],是生态适应性较强的物种。芒萁对土壤氮、磷等多种元素吸收利用率低,有较强的耐荫性,还能忍耐一定的强光生境[11-12];通过灰分测定,可证实其偏阳性的特性[13-14]。光强和光的可利用性是蕨类植物形态、生理适应性和分布最重要的影响因子[15]。揭示芒萁对光强的生态适应机制,需要从光补偿点和光饱和点加以判断,也需在强光与弱光胁迫条件下分析芒萁叶片抗氧化酶活性和可溶性蛋白质变化的响应特征[16-18]。研究发现:全光与过度遮阳处理会导致8个容器苗树种光合速率下降[19],中等强度遮阳亦会使强耐荫大豆Glycine max失去耐荫能力[20],持续弱光胁迫使马铃薯Solanum tuberosum苗期植株对强光和弱光的利用能力同时下降,对强光的利用范围变窄[21]。理论上,抗氧化酶活性对环境胁迫抗性有一定的阈值,抵抗性强的植物具有更高的抗氧化酶活性[22]。当生长于暖性单优针叶群落下层、疏灌草丛或撂荒地,由弱光生境变化为全光生境的时候,芒萁必然受到弱光或强光的抑制影响。因此,为研究芒萁对光强的生态适应范围和光强对芒萁的抑制效应,提出如下假设:①芒萁对光强生态适应范围较大,表现为光饱和点较高和光补偿点较低;②芒萁气体交换参数(净光合速率、蒸腾速率、气孔导度)的响应过程,以中度遮阳处于最高水平、胞间二氧化碳摩尔分数处于较低水平;③抗氧化保护酶活性的变化能够表征芒萁对光抑制缓冲胁迫能力的大小,强光与弱光条件都能诱发芒萁叶片活性氧的增加。为验证上述3个假设,本研究以盆栽芒萁为试验材料,模拟不同类型群落下层的光强环境,比较分析不同光强条件下芒萁光合生理响应与抗氧化保护酶活性的变化特征,为进一步探究芒萁扩散定居的生态现象提供参考。
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于2016年6月5日,从杭州市临安区玲珑山(30°13′05″N,119°40′23″E)海拔160 m处,选择长势良好且高度基本一致的芒萁幼苗100株,栽植在40 cm × 21 cm × 17 cm的长方形花盆中。栽培基质为马尾松单优群落下层表土,栽种1株·盆-1,放置于3层遮阳网下缓苗。缓苗期间正常浇水,待芒萁幼苗成活后,于8月6日搬至不同光照强度的遮阳大棚内,每个处理15盆,保证幼苗间互无遮阳干扰。于11月3日开始光响应进程测定,并取样用于酶活性的分析。
遮阳大棚位于浙江农林大学东湖校区(30°15′28″N,119°43′35″E),分别覆盖1层、2层、3层的黑色尼龙网,并以自然全光为对照(ck)。各处理随机选择3盆盆栽芒萁,选择南侧的功能叶用于光合响应、保护酶活性等测定。为准确分析不同遮阳强度下光强的减弱程度,于2016年11月初,选择2个晴天从8:00-18:00时,隔2 h利用光量子仪测定光量子通量密度,并与全光对照处理比较。各处理测定数据30个,其中遮阳大棚选3个测点,各测点测定数据10个。测定分析结果如表 1所示。
处理 透光率/% 对照组(ck) 100 1层遮阳网(L1) 35.96 ± 0.04 2层遮阳网(L2) 13.00 ± 0.01 3层遮阳网(L3) 4.75 ± 0.01 Table 1. Light transmittance under different shadings treatments
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光合指标与气体交换参数的测定:利用Li-6400XT光合测定仪在晴天的8:00-11:30,对盆栽芒萁叶片的净光合速率进行测定。设定光强梯度依次为2 000,1 500,1 200,1 000,800,500,300,100,50,30,10,0 μmol·m-2·s-1。测定前,让待测叶片在饱和光(1 500 μmol·m-2·s-1)下照射20 min,使叶片充分活化。测定已设定光强下的净光合速率(Pn),气孔导度(Gs),蒸腾速率(Tr)和胞间二氧化碳摩尔分数(Ci)等参数,重复3次,计算平均值。采用光合助手软件(Photosynthesis)拟合盆栽芒萁的光响应曲线,利用非直角双曲线模型[23]获得光补偿点(PLC),光饱和点(PLS),最大净光合速率(Pnmax),表观量子效率(AQY)和暗呼吸速率(Rd)。
抗氧化酶、可溶性蛋白质与丙二醛(MDA)的测定[24]:各处理选择幼苗3株进行测定,磨样2个·株-1,各重复3次。称取0.5 g叶样,研磨离心后提取上清液,直接用于可溶性蛋白质、MDA和抗氧化酶活性的测定。可溶性蛋白质(μg·g-1)参照考马斯亮蓝G-250染色法,MDA(mmol·g-1)采用硫代巴比妥酸比色法,过氧化物酶(POD)活性(16.67 nkat·g-1·min-1)采用愈创木酚显色法,过氧化氢酶(CAT)活性(16.67 nkat·g-1·min-1)采用紫外吸收法。超氧化物歧化酶(SOD)活性(16.67 nkat·g-1)采用试剂盒测定,货号:A001-1,南京建成生物工程研究所。
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运用Excel进行数据处理,利用Origin 9.1绘图,借助SPSS 19.0软件,采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)对数据进行差异显著检验。
1.1. 材料与试验方案
1.2. 测定分析方法
1.3. 数据处理
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由表 2可见:随光照强度增加,盆栽芒萁的最大净光合速率、光饱和点、光补偿点、暗呼吸速率和表观量子效率均呈先增加后下降的变化特征,其中2层遮阳处理下均出现了最大值,对照处理下均最小。说明全光条件下盆栽芒萁出现了光胁迫抑制现象,2层遮阳环境下比较适合于盆栽芒萁的生长。
处理 Pnmax/ (μmol·m-2·s-1) PLS /(μmol·m-2·s-1) PLC /(μmol·m-2·s-1) Rd/ (μmol·m-2·s-1) AQY ck 4.85 ± 0.24 c 606.06 ± 84.93 d 6.12 ±1.49 d 0.29 ± 0.15 b 0.02 ± 0.02 b L1 6.38 ± 0.23 b 851.06 ± 88.91bc 27.61 ±2.83 b 0.60 ± 0.04 b 0.06 ± 0.00 a L2 8.17 ± 0.48 a 979.20 ± 150.61a 34.67±1.10 a 1.44 ± 0.19 a 0.06 ± 0.01 a L3 5.44 ± 0.38bc 920.22 ± 53.93bc 13.84 ± 1.19 c 1.37 ± 0.19 a 0.04 ± 0.01b 说明:同列不同字母表示芒萁盆栽幼苗在不同光照间差异显著(P < 0.05) Table 2. Photosynthetic parameters of potted Dicranopteris dichotoma under different light treatments
在3种遮阳强度下,L3的光补偿点最低,由L2的34.669 μmol·m-2·s-1降低到13.843 μmol·m-2·s-1,并与L1和L2差异显著(P<0.05),说明遮光处理后叶片通过降低光补偿点以适应弱光环境。在不同遮阳条件下,L2和L3的暗呼吸速率与对照差异显著(P<0.05),L1与ck无显著差异(P>0.05);与ck相比,L1,L2和L3的暗呼吸速率分别升高了2.07%,4.97%和4.74%。表观量子效率为L1,L2与ck差异显著(P<0.05),而L3与ck差异不显著(P>0.05)。可见,在全光和弱光条件下盆栽芒萁捕获光量子的能力较强。
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由图 1可知:当光合有效辐射<300 μmol·m-2·s-1时,随着光合有效辐射的增加,3种遮阳处理和ck的盆栽芒萁的净光合速率呈快速增加,其中L1和L2近似于线性增加,L3的增加速率减缓,ck的增加速率最小;当光合有效辐射在300~800 μmol·m-2·s-1时,3种遮阳处理与ck的盆栽芒萁净光合速率增加趋缓;当光合有效辐射在200~2 000 μmol·m-2·s-1时,不同遮阳处理与ck的净光合速率大小依次为:L2>L1>L3>ck。
Figure 1. Gas exchange parameters of potted Dicranopteris dichotoma under different light treatments
分析图 1可知:全光下的净光合速率最低,表明盆栽芒萁受到了光抑制;与全光相比,L2可显著提高盆栽芒萁的净光合速率。盆栽芒萁叶片气孔导度对光合有效辐射的响应基本一致,但在L3的蒸腾速率和气孔导度随光强增加的变化不明显,可能是弱光下植物气孔的调节功能会减弱,表现在对光强变化的不敏感。随着光合有效辐射的增加,各处理下芒萁的净光合速率、蒸腾速率和气孔导度呈增加趋势,胞间二氧化碳摩尔分数则减小,并在光合有效辐射为0时均最大,呈现L2>L1>L3的规律。随着光照强度的增加,ck的净光合速率下降,而蒸腾速率、胞间二氧化碳摩尔分数上升,L1,L2和L3的净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳摩尔分数变化均同向。可见强光使得气孔导度降低,并使得二氧化碳滞留导致胞间二氧化碳摩尔分数增高。因此判断胞间二氧化碳摩尔分数是制约盆栽芒萁叶片净光合速率的主要因素之一,全光下净光合速率下降的主要原因是发生了由气孔因素向非气孔限制因素的转变,透光率大约35.96%时,会出现临界点。
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渗透调节物质和膜脂过氧化作用与植物受逆境胁迫的程度有关,通常可溶性蛋白质和MDA越高,说明植物受到胁迫的程度越高。由图 2可知:盆栽芒萁的可溶性蛋白质随光强的增加变化显著,其大小依次为ck>L1>L2>>L3,表明当光胁迫逐渐减弱后,盆栽芒萁叶片可溶性蛋白质不断下降,光强的增加是导致可溶性蛋白质合成和积累的重要因素之一。在3种遮阳强度下,盆栽芒萁叶片MDA随遮阳强度的增加呈上升趋势,但均低于对照组,且L1,L2和L3的MDA分别比ck减少了86.21%,38.53%和34.68%,表明遮阳后盆栽芒萁叶片的膜脂过氧化损伤较轻,而全光条件下的盆栽芒萁膜脂过氧化严重,推测此时盆栽芒萁叶片活性氧的产生超出了细胞的清除能力。可见,全光下的盆栽芒萁可溶性蛋白质与MDA皆显著高于遮阳处理(P<0.05),表明此变化属于盆栽芒萁有效适应强光环境的一种生理生态对策。
Figure 2. Change of soluble protein content and MDA contentof potted Dicranopteris dichotoma under different light treatments
抗氧化酶系统是植物受环境胁迫时的重要防御系统,其中超氧化物歧化酶(SOD)能保护细胞免受氧化胁迫。过氧化物酶(POD)能反映植物对环境的适应性,过氧化氢酶(CAT)是清除过氧化氢的重要酶。从图 3可知:经不同遮阳处理后,各处理间盆栽芒萁叶片SOD活性的差异不显著(P>0.05),但均高于对照处理;相反,各处理间POD和CAT的活性差异显著(P<0.05),且均低于对照处理。遮光后,盆栽芒萁叶片的SOD活性随遮阳强度的增加呈下降趋势,POD活性呈上升趋势,CAT则出现先降后升,推测是CAT的存在抑制了SOD的活性,也可能POD和CAT活性的增加是对SOD活性降低的补偿协调[25]。3种遮光处理下,POD与CAT活性都在L3下达最大值,与其他处理差异达显著水平(P<0.05),推测盆栽芒萁不仅在全光下受到光胁迫的伤害,弱光也能促使抗氧化酶的变化。