Phenotypic diversity of male cones and the selection of superior plants among male populations in Torreya grandis

浙江省与安徽省是榧树主要的天然分布区。榧树目前主要生产与利用的是其种子，野生雄株天然居群除采种外受到的人为干扰较少。本研究在基本呈野生状态的雄性榧树天然居群开展，分布点分别为浙江省淳安县半夏村(淳安)、杭州市临安区洪岭村(临安)、杭州市富阳区洞桥村(富阳)、浙江嵊州市榆树村(嵊州)及安徽省黄山市呈坎村(黄山)开展。在分布点的雄性榧树林中各选取10~30株生长旺盛，彼此间距不小于50 m，无病虫害，树龄50~200 a的实生雄性榧树作为研究对象，用于试验观测与采样，同时利用全球卫星定位系统(GPS)定位采样点(表1)。各单株采集新鲜叶片即时装入加硅胶的自封袋中，带回实验室置于−80 ℃冰箱保存。各单株采集20个带雄球花的1年生幼枝，枝条底部用湿纸巾包裹后置于采样袋，带回实验室进行水培。

各单株选取20个叶片，用游标卡尺测量(精确至0.01 mm)叶宽和叶长，并计算叶形指数(叶宽/叶长)；用托盘天平(PB1502-L，瑞士)称取叶质量。

各单株随机选取30个雄球花，用游标卡尺测量雄球花横径、纵径，并计算花形指数(球花横径/纵径)，同时用托盘天平称取雄球花质量。

各单株选取3个雄球花数量较多且长势良好的枝条插入水中，置于浙江农林大学校园，培养条件设置为温度20 ℃，湿度75%，光强400 μmol·m⁻²·s⁻¹，二氧化碳摩尔分数520 μmol·mol⁻¹，2 d更换1次水，每天定期观察并记录花枝散粉情况。当雄球花的小孢子叶松散，颜色变黄，花粉囊纵裂，部分花苞散出黄色花粉时记为始花期，直至完全散粉。大约3 d时间。

每个单株各选30个即将散粉(即各小孢子叶松散，花苞颜色变黄，花粉囊开始纵裂)的雄球花，置干燥玻璃培养皿中，放置在室内干燥桌面上，使雄球花自然散粉。待雄球花完全开放，抖落所有花粉，收集花粉称量，计算花粉得率。花粉得率=[花粉质量/(花粉质量+撒粉后球花质量)]×100%。

在全程避光的条件下，用荧光染料反应法(fluorescein diaectate reaction，二乙酸荧光素染色)测定花粉生活力^[16]。随机观测3个不同视野，统计有活力花粉(呈绿色)数量和花粉总数(绿色和黑色)。花粉生活力=(有活力花粉数量/花粉总数)×100%。

运用Excel和SPSS 17.0对各指标进行数据统计和方差分析、t检验及相关性分析等。

方差分析表明：叶片性状的叶长在居群间有显著差异(P＜0.05)，雄球花性状的花粉得率在居群间呈极显著性差异(P＜0.01)，其他指标均无显著差异(表2)。t检验分析结果显示：在居群内单株间10个表型性状均差异极显著(P＜0.01)，表明雄性榧树表型性状的变异可能主要来源于居群内。

多重比较分析发现：叶长在5个居群间差异显著(P＜0.05)，5个居群中淳安居群的叶片平均最长(18.99 mm)，显著长于其他居群；嵊州与黄山居群的叶片最短，且2个居群间无显著差异；临安与富阳居群的叶片长度居中，2个居群间无显著差异(图1A)。花粉得率在5个居群间差异极显著(P＜0.01)，嵊州和富阳居群的花粉得率较高，显著高于其他居群，且2个居群间无显著差异；而淳安与临安居群花粉得率最低且无显著差异(图1B)。

Figure 1.  Varieties among five natural populations in the leaf length(A) and pollen yield(B) in T. grandis

变异系数与性状的离散程度呈正相关，变异系数越大表明个体间的差异越大，多样性越丰富，选择的潜力就越大^[17]。本研究表明：同一性状在不同居群中变异系数不同；同一居群中不同性状的变异系数也存在差异。5个雄性榧树居群间叶片的变异程度由大到小依次为叶质量、叶长、叶形指数、叶宽；雄球花的变异程度由大到小依次为花粉生活力、花粉得率、球花质量、球花纵径、球花横径、花形指数。花粉生活力的变异最为丰富，5个居群的花粉生活力为51.70%~58.51%，变异系数为39.04%~45.40%，平均值为42.36%；其次是花粉得率(31.03%~37.77%)，平均达34.13%；叶宽和球花横径变异系数较小，分别为10.82%和12.13%(表3)。

居群差异体现了居群对当地环境的不同适应状况，数值大小反映了不同居群对不同环境的适应性^[18]。基于叶片的表型指标分析发现：5个天然居群的变异系数临安(16.27%)最大，其次是嵊州(14.73%)，淳安(10.74%)最小；而雄球花是嵊州(26.82%)和黄山(26.42%)的变异系数较高，淳安(19.49%)最小。本研究中榧树雄株的生殖器官花的变异系数大于营养器官叶。

榧树雄株的散粉时间不仅与遗传有关^[15]，也与地域气候、环境差异有关。榧树的雌雄花期不集中，且雄株花期比雌株早^[19]，散粉时间一般在4月中旬^[20]。因此在新造林中要配置适当花期的雄性授粉树，满足雌花充分受粉的要求^[15]。

经温室水培雄球花枝观测统计，雄球花散粉时间在4月7−17日，散粉周期约10 d。中花型所占比例最大(47株)，占总样本数的38.84%，散粉时间在4月11−15日；晚花型比例最小(30株，24.79%)，散粉时间在4月15−17日(表4)。5个居群中，淳安、临安、黄山这3个居群的中花型偏多，分别有11、13、13株，而富阳和嵊州的早花型略多，花期为4月7−11日(表4)。

叶质量、叶长与叶形指数均呈极显著负相关(P＜0.05)，而其他指标间均为显著正相关(P＜0.05)(表5)。这与董雷鸣等^[15]的研究结果一致。

球花质量与球花大小及花粉得率呈显著正相关(P＜0.05)，球花大小与花粉得率均显著正相关(P＜0.05)，花粉活力与花粉得率呈极显著正相关(P＜0.01)，而球花质量和球花纵径都与花形指数呈极显著负相关，其他指标间相关性不显著(表6)。

花粉会对植株坐果率高低、果实大小以及产量等产生直接影响^[21−22]。筛选适宜的雄性优株可以提供香榧基地授粉雄株不足、香榧树体坐果率低的现状，从而促进香榧产业健康发展。营养器官叶片受环境影响较大，因而榧树可基于生殖器官的性状初选核心种质^[23]。本研究主要依据榧树雄株散粉时间、花粉生活力、花粉量的多少等综合进行雄株优株的筛选。早花类型中表现较好的优株有富阳居群的雄9、嵊州居群的雄5以及黄山居群的雄23，花粉生活力分别高达92.55%、92.08%、90.01%，花粉得率也在20%以上；中花类型表现最佳的优株有临安居群的雄22、嵊州居群的雄1，花粉活力均在90%以上，花粉得率也不低；而晚花类型中，淳安居群的雄3、临安居群的雄18以及黄山居群的雄1花粉生活力分别为92.71%、92.61%、91.65%，共初选36个单株作为优良授粉树，占所有供试材料的29.75%(表7)。

本研究发现：在居群间，叶片与雄球花的10个表型指标，只有叶长和花粉得率差异显著，而居群内，单株间10个指标均差异极显著，表明居群内的变异比居群间更加丰富。该结果与刘浩凯等^[24]研究雌性榧树居群遗传多样性的结果基本一致。因此，为配置香榧授粉树的榧树雄株选育可选择优良单株。

变异系数是衡量各观测性状变异程度的一个统计指标。本研究各指标的相对极差和变异系数的变化趋势完全不同，表明榧树雄株表型性状存在丰富的表型多样性。经过长期的自然选择，不同数量性状对环境形成了不同的适应能力。相关分析表明：雄性榧树的大部分表型性状相关性达显著或极显著水平，说明这些性状在环境适应中表现出相互调节的作用。

雄性榧株以提供花粉为主要利用目的，花粉得率和花粉生活力在居群间和个体间变异大，且比较稳定，不仅有利于选择，选择结果也相对可靠。本研究显示：雄球花各指标变异系数大，球花大小与花粉得率呈显著正相关，直接影响花粉得率。因此优株初选应从花粉生活力、花粉得率及球花大小等综合考虑。基于上述指标初步筛选出36个优良雄性单株，其中8个单株的花粉生活力在90%以上。在今后的育种工作中，这些雄性优株应是优先考虑的对象。本研究所有单株的花粉得率最高值为38.23%，与董雷鸣等^[15]的研究结果类似。

居群内的变异主要受遗传因素的影响，而居群间的变异则与遗传和环境2个因素相关^[25]。由于榧树雄株不结果，以往人为破坏严重，部分地区的雄株资源已濒临绝迹，雌雄比例严重失调。易官美等^[26]对榧树资源分布进行调查发现：雌雄株比例在江西岩泉自然保护区为4∶1，在福建建瓯玉山镇居群为29∶1；在安徽居群为19∶1；在浙江诸暨赵家镇居群为99∶1。因此，加强雄性榧树资源保护刻不容缓，需加大种质资源调查与收集力度，建立雄性榧树优株资源库。

本研究仅对雄性榧树的表型多样性进行初步研究，后续的研究将扩大居群选择的范围及居群个数，并结合分子生物学从DNA水平深入揭示雄性榧树天然居群的遗传变异特点和规律。