Inhibitory effect of succinic acid, cinnamic acid and vanillic acid from Pontederia cordata on Microcystis aeruginosa

铜绿微囊藻属于蓝藻门Cyanophyta色球藻科Chroococcaceae微囊藻属Microcystis，购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，编号为FACHB-315。铜绿微囊藻培养于BG-11培养液，培养温度(25±1) ℃、光暗比12 h/12 h，光照强度2 500 lx，定时震荡3次·d⁻¹，培养至对数增长期时用于实验。

在梭鱼草根状茎中分离鉴定出11种有机酸类化感物质，选择抑藻效果较强的丁二酸、肉桂酸、香草酸，采用其标准品模拟进行抑藻实验，标准品纯度≥99.5%。上述化学试剂与二甲亚砜均由国药集团化学试剂有限公司生产。

依据预实验结果，丁二酸、肉桂酸的质量浓度梯度分别设置为0 (对照)、20、40、50、60、80、100 mg·L⁻¹，香草酸的质量浓度梯度设置为0 (对照)、20、40、60、80、100、120和150 mg·L⁻¹，吸取上述物质各100 μL分别添加至100 mL铜绿微囊藻藻液中[D (650)=0.15]。所有处理均重复3次。每24 h采用紫外分光光度计测定藻细胞D (650)，计算抑藻率。

根据前期研究结果^[11]，将丁二酸和肉桂酸以1∶1的质量浓度比例二维混合，丁二酸和香草酸、肉桂酸和香草酸均以1∶2的质量浓度比例二维混合，丁二酸、肉桂酸和香草酸以1∶1∶2的质量浓度比例三维混合。设置混合后的质量浓度梯度为0 (对照)、20、40、60、80、100 mg·L⁻¹，吸取上述物质各100 μL分别添加至100 mL铜绿微囊藻藻液中[D(650)=0.15]。所有处理均重复3次。每24 h测定藻细胞D (650)，计算抑藻率。

各处理对铜绿微囊藻生长抑制率的计算公式为：I_R=(1−N/M)×100%。其中：I_R为抑制率；N为第t天处理组的藻细胞D(650)；M为第t天对照组的藻细胞D(650)；I_R为正值表示抑制藻细胞生长，负值表示促进藻细胞生长。采用Excel 2010和SPSS 19.0进行计算和统计分析。在方差分析显著的基础上，用Duncan法进行比较检验。

采用SPSS 19.0软件，通过概率单位法(Probit过程)计算各个化感物质联合作用于藻类72 h的C_E50^[12]。

采用毒性单位法^[13]和相加指数法^[14]对有机酸类化感物质抑制铜绿微囊藻生长的效应进行评价。①毒性单位法(U_T)。规定混合物中第i组分的毒性单位为：U_Ti=C_i/C_{L50, i}。其中：C_i为混合物中i组分的质量浓度，C_{L50, i}为i组分单独作用时的半致死质量浓度。M与M₀为评价毒性效应的相加指数，对于一个N组分的混合物来说，混合物的毒性单位U_Tmix等于各组分毒性单位之和(M)，即：$M = {U_{{\rm{Tmix}}}} = \sum\limits_{i = 1}^N {{U_{{\rm{T}}i}}}$。若令，M₀=M/(U_Ti)_max，则当M=1时，为相加作用；当M＞M₀时，为拮抗作用；当M＜1时，为协同作用；当M=M₀时，为无相加或独立作用；当M₀＞M＞1时，为部分相加作用，其中(U_Ti)_max表示混合物中各组分毒性单位的最大值。②相加指数法(AI)。相加指数法(AI)是在毒性单位概念的基础上提出的，定义如下：当M=1时，I_A=M−1；当M＜1时，I_A=1/M−1；当M＞1时，I_A=1−M。其中，I_A为相加指数。I_A的评价标准如下：当I_A=0时，为简单的相加作用；当I_A＜0时，为拮抗作用；当I_A＞0时，为协同作用。

通过方差分析和多重对比(图1)可知：处理质量浓度与处理时间对3种化感物质抑藻效果均有显著影响(P＜0.05)。丁二酸、肉桂酸、香草酸单一作用于铜绿微囊藻时，初期均呈现出“低促高抑”的现象，香草酸尤为显著。处理第1天时，低质量浓度(≤60 mg·L⁻¹)丁二酸、肉桂酸及香草酸处理均能够在不同程度上促进铜绿微囊藻的生长。不同质量浓度肉桂酸、丁二酸、香草酸对铜绿微囊藻的生长均具有显著差异(P＜0.05)，随着质量浓度升高，抑藻能力逐渐增强。香草酸低质量浓度处理对铜绿微囊藻的生长几乎没有抑制作用，肉桂酸低质量浓度处理抑藻效果最佳，20 mg·L⁻¹处理7 d时抑藻率达77.86%。3种有机酸处理随着时间的延长抑藻作用整体先上升后稳定。60、80 mg·L⁻¹的香草酸处理以及20、40 mg·L⁻¹的丁二酸处理的抑制率随时间延长呈先上升后下降的趋势，肉桂酸所有处理抑藻率均随时间上升，处理7 d时各质量浓度抑藻率最大差值仅为7.56%。处理第7天，丁二酸、肉桂酸质量浓度为100 mg·L⁻¹、香草酸质量浓度为150 mg·L⁻¹时抑藻率达到最高，分别为87.42%、85.42%和86.95%。

Figure 1.  Effects of cinnamic acid (A), succinic acid (B), vanillic acid (C) on the growth of M. aeruginosa

由图2可见：当丁二酸、肉桂酸和香草酸以二维方式联合作用于铜绿微囊藻时，各处理组抑藻效果随着处理质量浓度的升高及处理时间的延长而逐渐升高，差异达极显著水平(P＜0.01)。丁二酸+肉桂酸不同质量浓度处理均具有抑藻效果，而低质量浓度丁二酸+香草酸与肉桂酸+香草酸处理在实验前期具有促进铜绿微囊藻生长的作用，20 mg·L⁻¹处理中肉桂酸+香草酸第5天抑藻率最高，为20.73%。丁二酸+香草酸处理实验期间各质量浓度抑藻率始终差异显著(P＜0.01)。随着时间延长，丁二酸+香草酸与丁二酸+肉桂酸抑藻率呈先上升后稳定的趋势，肉桂酸+香草酸呈先上升后下降的趋势。处理第7天，丁二酸+肉桂酸、丁二酸+香草酸质量浓度为100 mg·L⁻¹时，其抑藻率最高，分别为92.78%、84.81%；处理第6天，肉桂酸+香草酸质量浓度为100 mg·L⁻¹，其抑藻率最高，为77.94%。

Figure 2.  Effects of combined succinic acid, cinnamic acid and vanillic acid on the growth of M. aeruginosa

当3种有机酸以三维方式联合作用于铜绿微囊藻时，处理质量浓度和处理时间对抑藻率的影响差异达到极显著水平(P＜0.01)。20 mg·L⁻¹的处理仅在第1天对铜绿微囊藻的生长具有抑制效果，其他质量浓度处理均具有明显的抑藻效果，40 mg·L⁻¹处理在第2天抑制率达46.37%，为最大，60、80 mg·L⁻¹处理在第3天抑制率最大，为53.45%和61.76%，处理第7天，处理质量浓度为100 mg·L⁻¹时，其抑藻率最高，为89.99%。随着时间延长，40、60、80 mg·L⁻¹处理抑制效果先上升后下降，100 mg·L⁻¹处理抑藻率上升且2~4、6~7 d差异不显著。

经肉桂酸、丁二酸和香草酸分别处理72 h时，对铜绿微囊藻的半致死质量浓度分别为52.95、54.32和106.00 mg·L⁻¹，此时这3种有机酸类化感物质抑藻能力大小为肉桂酸＞丁二酸＞香草酸。丁二酸+肉桂酸、丁二酸+香草酸、肉桂酸+香草酸、丁二酸+肉桂酸+香草酸处理在实验第72小时的半致死质量浓度分别为51.03、78.69、52.84和59.04 mg·L⁻¹，此时这3种有机酸类化感物质联合作用的抑藻能力大小依次为丁二酸+肉桂酸＞肉桂酸+香草酸＞丁二酸+肉桂酸+香草酸＞丁二酸+香草酸。此外，由表1和表2可知：采用毒性单位法和相加指数法对铜绿微囊藻联合作用的评价结果均是协同作用。

本研究发现：利用丁二酸、肉桂酸、香草酸单独作用于铜绿微囊藻初期均会导致抑制率出现“低促高抑”的现象，刘晓宇等^[15]、YAN等^[16]研究中也观察到了相似的现象，这可能是因为低质量浓度的丁二酸、肉桂酸、香草酸可以一定程度上改变藻细胞膜透性，使细胞更易从外界获得营养物质^[17]。然而，较高质量浓度有机酸则会明显抑制铜绿微囊藻的生长，研究期间观察到的藻液颜色逐渐变淡可以证明，可能是较高质量浓度有机酸超过了藻细胞膜的承受阈值，导致藻细胞膜结构被破坏，细胞膜破裂，细胞内溶物大量外渗^[18]。

为获得在生存环境中的竞争优势，植物往往向环境中分泌多种化感物质。陈国元等^[7]研究发现：黄菖蒲水浸提液中含有丁酸、辛酸、戊酸等，均被证实具有较强抑藻能力。NAKAI等^[19-20]从穗花狐尾藻中提取的鞣花酸、没食子酸儿茶酚均能抑制铜绿微囊藻的生长。INDERJIT等^[21]认为，几乎所有的化感作用都是多种化感物质联合作用的结果，这种联合作用可以强化化感作用效果。同时，结构类似的同类化感物质联合作用抑藻存在协同或相加效应^[22-23]。本研究中，丁二酸属于脂肪酸类，肉桂酸与香草酸为酚酸类，3种化感物质以二维、三维方式联合对铜绿微囊藻生长的抑制作用均表现为协同效应，与倪利晓等^[12]在酚酸与不饱和脂肪酸联合作用对铜绿微囊藻生长影响上的研究结果类似，表明脂肪酸与酚酸化感物质联合处理能够有效增强其对铜绿微囊藻的抑制效果。本研究证实3种化感物质单一及联合作用抑藻能力从高到低依次为丁二酸+肉桂酸、肉桂酸+香草酸、肉桂酸、丁二酸、丁二酸+肉桂酸+香草酸、丁二酸+香草酸、香草酸。肉桂酸、丁二酸单一作用时抑藻效果最好，二者联合作用抑藻能力最强。肉桂酸抑藻效果强于丁二酸，二者分别与香草酸联合时，肉桂酸+香草酸的抑藻效果更佳。由此说明单一作用时抑藻效果较好的化感物质进行联合作用时抑藻效果也相对较好。丁二酸+肉桂酸+香草酸抑藻效果明显弱于丁二酸、肉桂酸单一及联合作用单一作用时抑藻效果，可能是香草酸抑藻能力最差，在联合作用时会削弱整体的抑藻效果。这与GAO等^[23]的研究结果相一致，表明抑藻活性较差的化感物质会削弱梭鱼草根状茎有机酸化感物质联合抑藻效果。丁二酸、肉桂酸单一作用时抑藻能力相当，但二者分别与香草酸联合作用时，表现为肉桂酸+香草酸的抑藻效果远低于丁二酸+香草酸，这可能是因为同种类的化感物质联合抑藻效果更佳。

半抑制质量浓度表示一定时间铜绿微囊藻被半数抑制的毒物质量浓度。高云霓等^[8]发现：香草酸处理72 h对铜绿微囊藻的EC₅₀约60 mg·L⁻¹；张庭廷等^[24]发现：肉桂酸处理6 d对铜绿微囊藻与蛋白核小球Chlorella pyrenoidosa混合体系的半抑制质量浓度为89.34 mg·L⁻¹，与本研究结果存在明显的差异，这可能与植物种类、藻类初始质量浓度、处理时间等因素有关。同时，梭鱼草根状茎分泌的丁二酸、肉桂酸、香草酸含量明显低于其对铜绿微囊藻的半抑制质量浓度，这与NAKAI等^[6]的结论相一致。即便水体中可检测到的化感物质很低，但其控藻效果极佳，这可能与植物化感作用方式有关。低剂量持续作用可能是水生植物抑藻作用的重要机理^[25]。除此之外，通过不同联合作用，在降低单个物质作用剂量以达到更好的抑藻效果可能是植物化感抑藻作用的重要机制^[12]。但是，多种化感物质共同作用于藻类时，其作用机理比单一种类化感物质更为复杂^[26]。这也是自然条件下植物释放化感物质作用于藻类的方式，化感物质的种类、质量浓度及环境条件等均会影响联合作用效果，因此联合处理对藻生长的作用机制值得进一步探究。同时，3种化感物质的抑藻效果显著，具有开发为抑藻剂的潜质，但其作为抑藻制剂的生态安全性也有待深入研究。

除此之外，一些研究表明自然界中梭鱼草化感物质含量虽然远低于实验室所得半抑制质量浓度，但仍然能有效抑制藻类。张景雯等^[9]研究发现：共培养条件下梭鱼草植株在试验期间对重度污染水的铜绿微囊藻平均抑制率超过70%。田如男等^[11]通过共培养以及种植水处理的方式，证实梭鱼草均能有效控制铜绿微囊藻、斜生栅藻Scenedesmus obliqnus和小球藻Chlorella vulgaris的生长。表明梭鱼草具有控制水华的能力，存在开发为净化水体植物的潜力，所以有关梭鱼草在自然水体中的控藻方式及应用方法值得进一步探索。