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铁皮石斛Dendrobium catenatum是兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium植物,其所含的石斛多糖成分具有抗氧化和抑制癌细胞等药用活性,使其具有重要的经济价值[1-6]。铁皮石斛在野外多附生于高大乔木或山石上,适宜其生长环境条件通常为海拔800~1 600 m,树冠透光率约60%,大气相对湿度60%~75%,日间温度20~25 ℃,夜间温度10~13 ℃,日温差为10~15 ℃,年均降水量为1 100~1 500 mm。目前,铁皮石斛已实现规模化人工种植,常采用温室控温控湿栽培于树皮土壤复合基质等方式[2, 7-9]。据2018年统计,中国人工栽培铁皮石斛的面积已经超过6 667 hm2,产量超1万t[10]。不同的生长环境对铁皮石斛的有效成分会产生影响,一般野外环境更利于铁皮石斛积累有效的次生代谢物[2, 7-11]。因此,近年来越来越多的栽培基地采用模拟野外生长环境,将铁皮石斛附生于立木表面进行栽培[7-8]。众多研究发现:植物内生菌对于宿主植物的营养代谢、抗逆适生和抵御病虫害等方面都发挥重要作用[12-16]。兰科植物通常与菌根真菌共生,铁皮石斛的多种内生真菌具有促进组培植株生长的作用,如镰刀菌属Fusarium内生真菌可产生赤霉素促进铁皮石斛生物量和氮磷养分的积累等[6, 17-20]。此外,分离自铁皮石斛的内生细菌被发现可诱使铁皮石斛种子萌发,具备固氮、解磷等功能[10, 20-21]。挖掘铁皮石斛内生菌资源,深度解析菌群结构与宿主植株的内在关联,对于植株种质选育、栽培方式改进、产量及品质提升等都具有积极意义。本研究探讨了铁皮石斛2种人工栽培方式(温室土壤基质培养和露天立木培养)对铁皮石斛内生细菌菌群结构的影响,并对铁皮石斛根、茎、叶各部多糖质量分数与内生细菌种类分布之间的潜在联系进行了分析,以期为开发具有促进铁皮石斛适生和营养等功能的内生细菌资源提供研究基础。
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2种栽培方式下,铁皮石斛各组织部位菌群测序结果分析显示,OTU数量、Shannon-Wiener和Simpson多样性指数,多呈现差异显著(OTU:栽培方式F1, 16=18.405, P=0.000 6;组织部位F3, 16=12.638, P=0.000 2。Shannon-Wiener指数:栽培方式F1, 16=2.504, P=0.133 1;组织部位F3, 16=6.017, P=0.000 6。Simpson指数:栽培方式F1, 16=84.739, P=0.000 1;组织部位F3, 16=34.673, P=0.000 1),说明栽培方式对铁皮石斛内生细菌群落结构产生重要影响,且内生细菌在植株上的分布呈组织特异性。如表 1所示:树培的植株除根部外,其他叶和茎部分OTU数量少于土培环境中的植株;不同组织部分中,叶部、花部的OTU菌群分布数量较少,根、茎、果的部分数量较多。多样性指数方面也呈相似规律。
栽培
方式部位 分类操单元
(OTU)Shannon-Wiener
指数Simpson指数 树培 根 630.67 ± 226.48 a 1.52 ± 0.59 a 0.94 ± 0.09 a 果 447.33 ± 57.84 b 1.58 ± 0.21b 0.92 ± 0.03 b 茎 122.67 ± 26.76 c 0.37 ± 0.20d 0.07 ± 0.04 c 叶 28.33 ± 6.81 c 0.03 ± 0.01 d 0.00 ± 0.00 c 土培 根 112.67 ± 24.19 c 0.34 ± 0.05d 0.06 ± 0.01 c 花 86.67 ± 19.55 c 0.24 ± 0.08d 0.04 ± 0.01 c 茎 310.67 ± 107.58 c 1.62 ± 0.91 c 0.37 ± 0.24 b 叶 73.00 ± 84.92 c 0.27 ± 0.34 d 0.07 ± 0.10 c 说明:数值为3个样品的平均值+标准差;同列不同字母表示差异显著(LSD统计方法,P<0.05) Table 1. Diversity of bacterial symbionts of Dendrobium catenatum under two cultivation methods
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由图 1可见:厚壁菌门Firmicutes(16.7%~34.9%)、拟杆菌门Bacteroidetes(8.7%~35.6%)、变形菌门Proteobacteria(15.9%~42.0%)、放线菌门Actinobacteria(2.6%~19.0%)在各组织部位相对丰度较高。厚壁菌门在土培的茎部占比最高(34.9%),与树培茎部(31.3%)相近。拟杆菌门在土培叶部最高(35.6%),为树培叶部(21.7%)的1.6倍。放线菌门在树培根部最高(19.0%),是土培根部(14.1%)的1.3倍。酸杆菌门Acidobacteria在树培果实部位占比最高,达10.9%,但在叶部和花苞部未检出。
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氮元素是植物生长所必需的大量元素,自然条件下常呈局部紧缺状态。红螺菌科Rhodospirillaceae中的固氮螺菌属Azospirillum,弗兰克菌科Frankiaceae中的弗兰克菌属Frankia,肠杆菌科Enterobacteriaceae中的肠杆菌属Enterobacter,假单胞菌科Pseudomonadaceae的假单胞菌属Pseudomonas和芽孢杆菌科Bacillaceae的芽孢杆菌属Bacillus中的部分种类有内生固氮功能。这些科属在铁皮石斛各组织中都有分布,除了红螺菌科和弗兰克菌科不存在于叶部。从2种栽培下铁皮石斛内生细菌功能上看,树培状态下具有这些固氮潜能的OTUs占比明显高于温室土培植株(图 2)。
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从图 3可见:栽培环境对组织内生细菌优势属(相对丰度大于1.0%)影响较大。栖水菌属Enhydrobacter在树培果中占优势,比例高达35.2%;甲醇杆菌属Methylobacterium在土培叶中为优势菌属,比例达35.8%;薄层菌属Hymenobacter仅在土培叶中分布,占9.9%。拟杆菌属Bacteroides、双歧杆菌属Bifidobacterium、韦荣球菌属Veillonella在各组织部位中多有分布,在树培根部、果实和土培叶部相对丰度较低;颤螺旋菌属Oscillospira在树培茎部分布较少;巨单胞菌属Megamonas在树培茎部相对较多,栖热菌属Thermus则在土培花苞内最多;不动杆菌属Acinetobacter则存在于树培和土培的茎部。
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如图 4所示:铁皮石斛茎中多糖质量分数显著高于叶部和根部。方差分析结果显示:2种栽培方式下铁皮石斛不同部位多糖质量分数呈极显著差异(根:F1, 4=11.15, P=0.029;茎:F1, 4=9.44, P=0.037;叶:F1, 4=39.31, P=0.003),说明栽培方式影响多糖在植株内的积累。通过韦恩图发现:不同栽培方式对根、茎、叶菌群结构有明显影响,其中根部和叶部影响大,共有的OTUs占24%~26%,而茎部共有部分占49%,这些OTUs的分布差异可能与多糖质量分数间存在一定关联。将2种栽培方式下根、茎和叶优势内生细菌属相对丰度(x自变量,x1~x53分别表示不同属)和各部多糖质量分数(y因变量)进行相关性分析,得逐步回归方程y=0.058+29.688x17-4.146x13-0.424x52-0.085x2(相关系数R2=0.999 8,P < 0.05)。方程中通过逐步回归筛选出的4个属的相对丰度与多糖质量分数最为密切(系数绝对值越大代表其相关性越高),其中:不动杆菌属(x17)影响最大,其次为假单胞菌属(x13)、薄层菌属(x52)和韦荣球菌属(x2)。