Floral syndrome and breeding system of Stewartia rostrata

研究地浙江农林大学东湖校区(30°15′28″N，119°43′35″E)海拔101.3 m，属于中亚热带季风气候，四季分明，年平均气温为16.1 ℃，全年降水量为1 628.6 mm，年降水日为154 d，无霜期为236 d。研究地周边地带性植被为亚热带常绿阔叶林。选择3 a生长柱紫茎为材料，株高为2.5~3.0 m。研究时间为2021年4—6月。

于花蕾期随机选取30朵花挂牌标记，每天16:00观察直至单花开放；开花当天及开花第2天8:00—18:00连续观察，每隔2 h定点观测1次并拍照，之后每天观测1次。观察花的开花动态，记录单花结构、花朵大小和形状、雄雌蕊位置形态变化、花瓣颜色、苞片颜色、萼片颜色、花药开裂时间等，直至花部萎蔫^[9]。

于盛花期，在15株植株上随机选取30朵发育良好的花，测定花部结构参数，记录花冠直径、苞片长宽、花瓣长宽、萼片长宽、子房直径及长度等数据。

随机采集当天开放花朵的花粉，设置5种蔗糖质量浓度(0、5、10、15、20 g·Ｌ⁻¹)处理，于25 ℃下培养6 h后观察并统计花粉萌发率。

随机采集当天开放花朵的花粉，分别采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法、碘-碘化钾(I₂-KI)染色法，筛选最适蔗糖质量浓度培养6 h后测定花粉活力，以加热致死的花粉作对照，每个处理3次重复。在光学显微镜下随机选取3个视野统计着色花粉数，每个视野花粉数不少于100粒^[10]。

选取开放前1 d至开放后第3天的花朵，每个阶段选取10朵，测定最适蔗糖质量浓度培养下的花粉活力，以加热致死的花粉为对照。在光学显微镜下观察统计花粉萌发率，每视野内花粉数不少于100粒。

随机选取开放前1 d至开放后7 d的花朵，将柱头放在凹面载玻片上，完全浸泡于质量分数3%的过氧化氢(H₂O₂)溶液中，30 min后在体式显微镜下观察，若有气泡产生则表明柱头有活性，反之则无^[11]。

随机选取不同植株的20朵即将开放的花蕾，记录每朵花的雄蕊数。随机选取1个花药，用解剖针将花药捣碎，蒸馏水定容至1 mL，吸取1 µL液体在光学显微镜下统计花粉数量；每朵花选取3个花药，重复3次，取平均数乘雄蕊数再乘1 000得出单花花粉量。解剖相对应的子房，统计胚珠数^[12]。根据CRUDEN^[13]标准，计算花粉胚珠比(单花花粉总数/单花胚珠数，P/O)；并由此判断长柱紫茎繁育系统类型。

按照DAFNI^[14]标准，通过杂交指数(OCI)评判繁育系统类型。用游标卡尺测定花冠直径；观察记录花药开裂时间与柱头可授期，雌雄蕊是否同时成熟；记录花药与柱头之间的相对空间关系。

随机选择5株长柱紫茎，于晴天9:00—17:00连续观察访花昆虫。每株长柱紫茎选择10朵花，每2 h观察1次，每天观察5次，记录访花昆虫的种类和访花时间^[15]。

长柱紫茎居群花期为5月初至5月中下旬，约17 d (2021年5月1—17日)，单花花期2 d。5月1日该居群的第1朵花开放，5月8日单日开花最多，占总开花数的15%，达到盛花期，5月13日进入末花期。

长柱紫茎单花开放过程分为花蕾期(苞片、萼片包裹花蕾)、初展期(花药、柱头显露)、盛放期(花瓣平展)、凋落期(花瓣枯萎)及坐果期(子房膨大结实) 5个过程(图1)。具体的，①花蕾期(图1A和B)，苞片、萼片呈绿色，紧紧包裹花蕾。临近开放时，绿色的苞片和萼片从基部向边缘转为紫红色，同时向外伸展，逐渐显现出花苞。花苞顶部受光影响，呈现红斑。②初展期(图1C)，单花花瓣展开，花药和柱头显露，弯曲的花丝慢慢伸展高出柱头。③盛放期(图1D)，花瓣完全平展，雄蕊高于柱头伸展，柱头反向弯曲，呈5裂。④凋落期(图1E和F)，花瓣枯萎、脱落，开放24~32 h后，花药逐渐由橘黄色变为淡棕色，花冠极易掉落，柱头萎蔫，萼片和苞片逐渐收缩，花朵直径变小。⑤坐果期(图1G和H)，子房膨大，萼片和苞片再逐渐展开，由红色转为绿色，果实由绿色转为棕色，逐渐木质化。

Figure 1.  Flowering dynamics of S. rostrata

长柱紫茎的平均单花直径为(50.2±11.7) mm (表1)，花瓣5枚，白色，边缘裂状，有1~3枚花瓣带红斑(图1K)；每花具1对叶状苞片(图1J-1)，披针叶形，开花时基部由绿色转为紫红色；萼片5枚(图1J-2)；雄蕊50~84枚，长17~19 mm，花丝黄色呈线形，基部连合成短管，花丝的连合处不及花丝长度的1/3(图1J-4)，花药橘黄色，干后变为淡棕色；雌蕊1枚，长14~16 mm，柱头呈5裂(图1J-5)，花朵盛开时花丝高于柱头；子房5室，每室4枚胚珠，稀2~3枚，中轴胎座。

在无蔗糖培养基下，长柱紫茎花粉萌发率仅为13.7%；随着培养基蔗糖质量浓度的增加，花粉萌发率增大，在15 g·L^−１出现峰值，为69.3%。当蔗糖质量浓度为20 g·L^−１时，花粉萌发率降至33.3%。因此，15 g·L^−１的蔗糖培养基为最适培养基(图2)。

Figure 2.  Effects of different sucrose concentrations on pollen viability

采用I₂-KI染色，活力较强的花粉会呈现蓝黑色，但在操作时，易混入杂质，视野中观察到的蓝黑色不够明显，不利于计数。采用TTC染色，有活力的花粉会呈现红色；但观察到大部分花粉未变红，说明TTC染色不利于测定长柱紫茎的花粉活力。因此，TTC染色法和I₂-KI染色法均不适合长柱紫茎花粉活力的测定。实际研究中，与TTC染色法和I₂-KI染色法相比，花粉离体培养下，花粉会萌发较长的花粉管，更有利于观察。

采用15ｇ·L^−１的蔗糖培养基培养花粉，由图3可知：开放前1 d，花粉萌发率较高，为49.3%，开花当天花粉活力最高，为65.0%。之后花粉活力逐渐下降，到第3天，已降至11.7%。

Figure 3.  Pollen germination rate of S. rostrata tested in different time

由图4可知：开放前1 d长柱紫茎花药尚未开裂，柱头合拢，呈白色，可授性弱。开放1~2 d，柱头逐渐张开，具有较强可授性，之后可授性逐渐增强。到第3天柱头开始萎蔫，由白色转变为棕黄色，可授性强。在开放的第4天，柱头完全展开，向外反卷呈5裂，呈棕黄色、萎蔫皱巴的状态，此时花粉活性最强。之后，柱头可授性逐渐下降，到第7天，柱头基本失去可授性。

Figure 4.  Changes in stigma receptivity of S. rostrata during flowering process

根据统计结果，长柱紫茎花粉数为(1 618 666.7±254 775.4)粒，胚珠数为(18.6±2.4)枚，花粉/胚珠比(P/O)为2 108.0~195 525.0，平均为87 025.1。依照CRUDEN的标准，判断长柱紫茎的繁育系统属于专性异交。

依照DAFNI的评判标准，测算长柱紫茎的杂交指数。长柱紫茎成熟花朵的花冠直径平均为50.24 mm，大于6 mm，记为3。雌雄蕊在成熟时间上一致，记为0；在花蕾期，长柱紫茎的柱头高于雄蕊，当花朵完全盛开时，雄蕊高于雌蕊，柱头和花药存在空间分离，记为1。因此，OCI结果为4，说明长柱紫茎的繁育类型属于以异交为主，需要传粉者，部分自交亲和。

长柱紫茎上观察到的访花昆虫有熊蜂Bombus sp.、中华蜜蜂Apis cerana、黑带食蚜蝇Episyrphus balteatus、叶甲Chrysomelidae和日本弓背蚁Camponotus japonicus等，有效传粉者主要为熊蜂，其他种类出现频率低或进行无效传粉(图5)。长柱紫茎的开花高峰为7:00—11:00，昆虫的访花时间也集中在这段时间。黑带食蚜蝇在同一朵花上同一部位停留超过20 s，舔食花蜜，但数量较少，传粉作用不佳(图5A)。熊蜂单次访花时间为2~5 s，访花频率很高，在较短时间内频繁地在多朵花间逗留。访花时喜欢头部向下，整个身体钻入花冠筒，身上的绒毛黏附花粉量大，与柱头接触面积大，可有效传粉(图5B)。中华蜜蜂与熊蜂行为相似，但出现频率不及熊蜂，且体积小，能够黏附到的花粉少(图5C)。叶甲外壳光滑，花粉难以黏附。偶见1只在花冠上停留较长时间，与柱头未进行有效接触，传粉贡献小(图5D)。日本弓背蚁的足部和腹部会黏附花粉，徘徊逗留，偶尔实现有效传粉(图5E)。

Figure 5.  Insect visitors of S. rostrata

花部特征包含花部构成(结构、颜色、气味等)和开放式样(开花数目、大小及类型等)，因此可以从花部特征、开放式样解析植物与传粉者的生态依存关系。植物为了与传粉者的行为习惯相适应而使其花部形态结构、颜色等逐步进化^[16]。对于蜂类，白色和黄色是可见花色。长柱紫茎花冠白色，平均直径达(50.2±11.7) mm，花丝黄色，颜色耀眼，同时平展的花冠为传粉昆虫提供停靠点，符合蜂媒花特征，此类花部特征与四川牡丹Paeonia decomposita一致^[17]。同一物种内不同个体或居群间花色差异即花色多态性，传粉者的偏好因为花色差异造成访花频率的差异^[18]。长柱紫茎的白色花瓣上常出现红色，推测是为适应单一的传粉媒介而进化出的特征，以便增加对其他类昆虫的吸引力，从而提高传粉效率^[19]。

在强大的选择压力下，很多植物形成了“大量、集中开放”的开花模式，有利于吸引访花昆虫在短时间大量、密集表达访花行为，从而增加传粉机会^[20]。长柱紫茎花期为5—6月，属于浙江的梅雨季节，阴雨天气极大地减少了传粉昆虫的活动。长柱紫茎集中开花，持续开花时间短，日均开花数量多，有利于提高繁殖成功率。此开花式样呈现的特征与山茶科Theaceae濒危植物金花茶Camellia nitidissima的研究结果一致^[21]。长柱紫茎的有效传粉者主要为熊蜂，在阴雨天气熊蜂频繁地在同一植株上访花，且开花植株又少，原生境植株间相距较远，不利于花粉在植株间传播，结果增加同株异花授粉的可能性，降低接受花粉的质量，从而影响长柱紫茎的结实率。

参照CRUDEN^[13]所述标准，长柱紫茎的繁育系统为专性异交。长柱紫茎P/O极高，达87 025.1，意味着长柱紫茎更加趋向于远交；但根据DAFNI^[14]的标准，长柱紫茎OCI为4，判断其繁育系统为异交为主，部分自交亲和，需要传粉者。长柱紫茎开花后雄蕊逐渐伸长，最后花药高于柱头，且花蕾期有花药散粉现象，因此长柱紫茎的花部特征增加了自花授粉的可能性。在自然界中，绝大部分被子植物倾向于自交与异交结合的混合交配模式，只有极少数利用单一交配模式完成授粉^[22]。综合得出：长柱紫茎的繁育系统属于倾向于异交的混合交配系统，当其异株(异花)授粉受阻时，可表现为自交亲和，自交是长柱紫茎适应长期阴雨环境的繁殖保障策略，此种混合交配系统与流苏树Chionanthus retusus相似^[23]。

有效的传粉过程包含大量有活力的花粉、可授期的柱头及有效传粉媒介^[24]三大要素。长柱紫茎平均雄蕊数为(64.9±11.8)枚，单花平均花粉量多达(1 618 666.7±254 775.4)粒，为传粉昆虫提供丰厚的报酬，且花粉黏附力强，易被传粉昆虫携带，为异交授粉提供了充足的物质保障，故花粉数量不是其繁殖受限的原因。柱头可授期长，达7 d，在第3和第4天达到最强活力，为实施人工授粉的最佳时期。柱头5裂增加传粉表面积和柱头可授期长为异花授粉提供了基本保障，有利于提高传粉效率和结实率，此现象与陈雄伟等^[25]观测紫背天葵Begonia fimbristipula的结果一致。当天开花的花朵保持最强活力(65.0%)，随着开花时间增加，花粉活力显著下降，到第2天仅38.3%，第3天降至11.7%。观察发现长柱紫茎大多数花朵寿命很短，开花损失率高，花粉强活力和较强柱头可授性仅1 d的相遇期，严重影响花朵的传粉效率。无论授粉与否，长柱紫茎在开花24~32 h后，花冠和雄蕊都存在易脱落的现象，脱落后花粉迅速失活，大大减少了受精的可能性^[26]。推测已授粉花朵脱落可能与营养资源限制有关，减少繁殖成本^[27]；未授粉花朵可能通过短寿命减小花展示程度，从而减少同株异花传粉的概率^[28]。

P/O是衡量植物对雄性资源分配量的指标^[29]，高P/O值可能是对传粉效率低造成柱头接受的花粉量少、质量低的补偿^[30]，多样化的传粉媒介有利于提高授粉成功率。长柱紫茎授粉受限可能与传粉者的种类、数量有关。长柱紫茎的主要传粉昆虫熊蜂，飞行距离远，访花频率高，多朵花之间穿梭，携带花粉量大，有效地进行异花传粉，但其他昆虫传粉效率较低，有效传粉媒介单一。长柱紫茎花粉离开花朵后迅速失活，不利于传粉昆虫远距离完成植株之间的传粉，因此居群间的基因不能充分交流^[31]。

综上所述，长柱紫茎花冠白色和花丝黄色，与蜂类传粉特性相适应，为典型蜂媒花；传粉受阴雨天气影响，集中开花模式是对恶劣天气的有效适应，但传粉昆虫单一。开花24~32 h，花冠和雄蕊都极易脱落从而导致花粉迅速失活。以上因素限制了长柱紫茎的繁殖。集中开花模式、花粉量大、柱头5裂及可授期长等花部特征是长柱紫茎维持繁殖成功的基本保障。长柱紫茎繁育系统属于以异交为主，需要传粉者，当其授粉受阻时，可表现为自交亲和，自交是长柱紫茎适应长期阴雨天气的繁殖策略。