Analysis and comprehensive evaluation of phenotypic variations in seed and fruit traits of different cultivars of Lycium barbarum

试验材料为宁夏农林科学院枸杞科学研究所种质资源圃保存的14个品种果用宁夏枸杞(表1)，其中N1~N10为红果宁夏枸杞(简称红果)，NQ4、NQ5、NQ19、NQ20为黄果宁夏枸杞(均由红果宁夏枸杞变异而来，简称黄果)。宁夏枸杞通过人工杂交选育获得，树龄均为5年生，成熟果实采自树冠中上部，每种枸杞随机选取30个无病虫害果实，放置于−20 ℃冰箱冷冻保存。本研究聚焦宁夏主栽红果及黄果枸杞，因黑果枸杞在本地栽培规模较小且品种有限，故未纳入。所选14个品种覆盖当地主流商业化品系，可为区域良种选育提供直接参考。

每个枸杞品种随机采摘30个成熟果实，确保果实无病虫害且成熟度一致。使用电子天平(精度为0.001 g)测量单果质量(g)，游标卡尺(精度为0.01 mm)测量果长(果实纵径，mm)和果宽(果实横径，mm)。果柄长度和果柄粗度分别使用游标卡尺测量，果柄长度从果实基部至果柄末端，果柄粗度为果柄中部的直径。果形指数=果实纵径/果实横径。变异系数(C_V)为：C_V=(σ/μ)×100%，其中σ为标准差，μ为平均值^[21]。采用SC-10色差仪(深圳市三恩时科技有限公司)测定果实色度。每种枸杞随机选取30个果实，测定其亮度(L*)、红绿值(a*)、黄蓝值(b*)和总色差(ΔE*)。L*取值0~100，值越大表示亮度越高；a*为红绿轴，正值表示红色倾向，负值表示绿色倾向；b*为黄蓝轴，正值表示黄色倾向，负值表示蓝色倾向；ΔE*为总色差，反映果实颜色与标准色的差异。每个果实测定3次，取平均值作为最终结果。

质地剖面分析是利用力学方法来模仿人体口腔咀嚼食物的过程，测定内容包括硬度、弹性、咀嚼性、黏性、凝聚性、回复性等质构指标^[22−23]。使用TA.XT Plus质构仪测定果实质构特性，包括硬度(N)、弹性(形变恢复比率)、黏聚性、胶着性(N·m)和咀嚼性(J)的测定。每种枸杞随机选取30粒果实，测定前将果实置于室温(25±1)℃平衡2 h。测定参数设置如下：探头类型为P/5圆柱形探头，测试速度为1.0 mm·s⁻¹，压缩比为50%，触发力为5 g。具体指标定义及计算公式参考文献[24]。

每种枸杞品种随机挑选30粒种子，使用显微镜连接imageView软件测量种子长度(mm)和宽度(mm)。种子千粒重测定方法为：随机选取1 000粒种子，使用电子天平(精度为0.001 g)称量，重复3次取平均值。单果种子数通过解剖30个果实，统计每个果实中的种子数量，计算平均值。

数据处理与统计分析借助Excel 2021完成，并结合SPSS 27.0进行差异显著性检验(ANOVA)、Pearson相关性分析、主成分分析(PCA)。使用R语言进行系统聚类分析^[25]。

由表2可知：14个品种宁夏枸杞各表型性状之间均存在差异。红果枸杞中，‘宁杞8号’‘Ningqi 8’的果长、单果质量均最大。由图1发现：‘宁杞8号’果实较其他品种更大。而在黄果枸杞中，‘宁农杞20号’‘Ningnongqi 20’的各性状明显优于其他3种黄果。14个品种宁夏枸杞根据果形指数又可分为圆形与椭圆形，果形指数大于1.5的为椭圆形，小于1.5的为圆形。‘宁杞1号’‘Ningqi 1’、‘宁杞2号’‘Ningqi 2’、‘宁杞3号’‘Ningqi 3’、‘宁杞4号’‘Ningqi 4’、‘宁杞5号’‘Ningqi 5’、‘宁杞6号’‘Ningqi 6’、‘宁杞8号’‘宁杞9号’‘Ningqi 9’、‘宁农杞19号’‘Ningnongqi 19’、‘宁农杞20号’为椭圆形，‘宁杞7号’‘Ningqi 7’、‘宁杞10号’‘Ningqi 10’、‘宁农杞4号’‘Ningnongqi 4’、‘宁农杞5号’‘Ningnongqi 5’为圆形。14个品种宁夏枸杞中椭圆形的比例明显高于圆形，说明大部分枸杞在自然生长的状况下趋近于椭圆形。观察不同品种枸杞的色度值发现：黄果枸杞亮度值(L*=43.45~46.70)高于红果枸杞(L*=34.64~39.97)，其中‘宁农杞20号’呈橙黄色(a*=18.4)，‘宁农杞19号’为亮黄色(a*=7.36)。

Figure 1.  Pictures of fruits of 14 cultivars of L. barbarum

由表3可见：各种枸杞间的质构性状存在差异，黄果品种‘宁农杞4号’硬度最高(30.07 N)，但其弹性(0.71)显著低于红果品种(0.79~0.89)(P＜0.05)。

从表4可见：14个品种宁夏枸杞的种子中，黄果枸杞的种子更大且千粒重明显高于红果枸杞。而在红果枸杞中，‘宁杞3号’的种子千粒重明显高于其他品种。‘宁杞8号’‘宁杞9号’的种子最大。且黄果枸杞的种子数量明显少于红果枸杞，它们单果产出的种子更少。而在红果枸杞中，‘宁杞1号’与‘宁杞2号’的种子数量较少，种子产量与4种黄果枸杞相当。

对14个品种宁夏枸杞种实的16项表型性状进行相关性分析(图2)发现：果长与果宽、单果质量、果形指数、果柄长、硬度、弹性、种形指数之间呈显著正相关(P＜0.05)；果宽与单果质量、果柄长、硬度之间呈显著正相关(P＜0.05)；单果质量与果形指数、果柄长、硬度、弹性、种形指数之间呈显著正相关(P＜0.05)；果形指数与硬度、弹性、种形指数之间呈显著正相关(P＜0.05)；果柄长与果长、果宽、单果质量之间呈显著正相关(P＜0.05)；硬度与果长、果宽、单果质量之间呈显著正相关(P＜0.05)；黏聚性与胶着性、咀嚼性、种子长、种子宽之间呈显著正相关(P＜0.05)；胶着性与咀嚼性、种子长、种子宽之间呈显著正相关(P＜0.05)。

Figure 2.  Correlation analysis of fruiting traits of different cultivars of L. barbarum

从表5可见：14个品种宁夏枸杞16项种实表型性状的平均变异系数为19.16%，变异幅度为0.17%~59.08%。果实16项性状平均变异系数为19.69%，大于种子性状的17.17%。果实色度变异幅度为1.35%~59.08%，变异丰富。平均变异系数较大的性状为黏聚性、胶着性和咀嚼性，均值都大于40%，平均变异系数最小的是种子千粒重，均值仅为0.17%。同一性状在不同品种枸杞之间的变异系数也不同，弹性在‘宁农杞4号’的变异系数达28.09%，在其他品种均为个位数。而变化范围较大的有黏聚性、胶着性、咀嚼性、种形指数。其他性状的变化范围较小，均未超过20%；同一品种枸杞各性状的变异程度也存在较大差距，且各品种中变异系数最小的均为种子千粒重。而观察不同品种枸杞之间的变异系数发现：‘宁杞4号’‘宁杞5号’‘宁杞9号’‘宁杞10号’‘宁农杞4号’‘宁农杞20号’的变异系数平均值都超过了20%，说明这6种枸杞变异丰富，多样化程度较高。

在果实表型特征维度考察中，发现色度与品质关联较弱，因此未将其纳入聚类分析体系。对14个品种分别从果实表型(除色度外)、果实质构特征及种子表型特征3个维度进行系统分析，并基于所有性状指标开展综合评价(图3)。基于果实性状聚类分析结果(图3A)显示：‘宁农杞4号’与‘宁农杞5号’聚为第Ⅰ类群，两者果实显著小于其他品种。‘宁杞3号’因果柄特征突出单独成类(Ⅱ类群)，其余11个品种构成Ⅲ类群。基于果实质构性状聚类分析结果(图3B)显示：‘宁农杞4号’因独特机械特性独立成类(Ⅰ类群)，其硬度最高，但弹性最低，黏着性与胶着性高于其他品种，建议采用低温干燥工艺保留色泽。‘宁杞5号’ ‘宁杞7号’等5个低黏着性品种聚为Ⅱ类群。余下8个高咀嚼性品种构成Ⅲ类群。基于种子性状聚类分析结果(图3C)显示：‘宁农杞4号’ ‘宁农杞5号’ ‘宁农杞19号’因近圆形种子形成Ⅰ类群；‘宁杞1号’等8个小粒品种为Ⅱ类群；‘宁农杞20号’‘宁杞3号’等大粒品种构成Ⅲ类群。整合三维度性状的综合聚类分析结果(图3D)显示：‘宁农杞4号’独立为Ⅰ类群；‘宁农杞5号’与‘宁农杞19号’聚为Ⅱ类群；其余11个品种构成Ⅲ类群。

Figure 3.  Cluster analysis of different cultivars of L. barbarum

鉴于果实色度不作为品质评价指标，本研究以枸杞种实为研究对象，系统性聚焦除色度外的15个关键性状，开展主成分分析。以特征值1.0为标准提取了4个主成分，其方差累计贡献率达74.478%，保留了原始性状中的大部分遗传信息，分析结果见表6。主成分1的方差贡献率和特征值均为最大，其中黏聚性、胶着性、咀嚼性、种子长、种子宽的正向载荷度达0.6以上，果长、果宽、单果质量、果形指数均为负向指标，说明主成分1主要反映果实与种子大小。主成分2载荷较大的有果长、果宽、单果质量，为正向指标，说明主成分2主要反映果实的大小。主成分3载荷较大的正向指标为种子千粒重，负向指标较大的有胶着性和咀嚼性。主成分4载荷较大的是果形指数，为正向指标。

设提取的4个主成分依次为F₁、F₂、F₃、F₄，可列出4个主成分得分函数表达式，分别为：

F₁=−0.231X₁−0.073X₂−0.132X₃−0.216X₄+0.164X₅+0.161X₆+0.142X₇−0.321X₈+0.400X₉+0.401X₁₀+0.326X₁₁+ 0.284X₁₂+0.371X₁₃−0.189X₁₄+0.144X₁₅；

F₂=0.414X₁+0.395X₂+0.458X₃+0.229X₄+0.231X₅+0.155X₆+0.325X₇−0.022X₈+0.073X₉+0.124X₁₀+0.173X₁₁+ 0.141X₁₂−0.108X₁₃+0.282X₁₄+0.256X₁₅；

F₃=−0.134X₁−0.201X₂+0.116X₃−0.269X₄+0.272X₅+0.301X₆−0.341X₇+0.186X₈−0.207X₉−0.285X₁₀−0.295X₁₁+ 0.283X₁₂+0.231X₁₃−0.116X₁₄+0.427X₁₅；

F₄=0.311X₁−0.347X₂−0.090X₃+0.552X₄−0.054X₅+0.378X₆+0.071X₇−0.266X₈−0.141X₉−0.083X₁₀−0.200X₁₁− 0.011X₁₂+0.228X₁₃−0.345X₁₄+0.102X₁₅。

其中，15个指标中，X₁为果长，X₂为果宽，X₃为单果质量，X₄为果形指数，X₅为果柄长，X₆为果柄粗，X₇为硬度，X₈为弹性，X₉为黏聚性，X₁₀为胶着性，X₁₁为咀嚼性，X₁₂为种子长，X₁₃为种子宽，X₁₄为种形指数，X₁₅为种子千粒重。

设综合得分为F，以主成分的方差贡献率为权重，构建综合评价公式：F=31.327%F₁+21.419%F₂+13.770%F₃+7.961%F₄。

表7显示：14个品种宁夏枸杞中，‘宁农杞4号’‘宁杞3号’‘宁农杞20号’的综合得分排名前3位，其共同特征为高硬度、适中果形指数及优异色泽，适合开发高品质干果与即食产品。综合得分在8分以上的品种中，‘宁杞3号’‘宁农杞20号’‘宁杞9号’均来自种子聚类中的第3类群。

枸杞是传统的药食同源植物，具有重要的经济价值。研究发现：长期食用枸杞果实有助于促进肠道免疫^[26]。枸杞中的枸杞多糖具有改善肝损伤^[27]、降血糖抗肾炎的作用^[28]。随着枸杞中的功效被不断发掘，人们对枸杞的品质、产量有了更高的要求，急需创制高产、抗逆和优质等综合性状优异的枸杞新种质资源。本研究发现：在14个品种宁夏枸杞中，大部分枸杞的果实在自然生长中趋近于椭圆形，而黄果枸杞的果实亮度明显高于红果枸杞。在黄果枸杞中，‘宁农杞20号’的a*较高，偏橙黄色，‘宁农杞19号’为亮黄色(a*=7.36)，可作为天然色素提取原料。本研究对枸杞果实的质构性状研究发现：高硬度品种(‘宁杞3号’‘宁杞8号’‘宁农杞20号’)更耐机械挤压，适合干制加工；低硬度品种(‘宁农杞5号’‘宁农杞19号’)果肉柔软，适合鲜食或制浆。对不同品种枸杞种子的性状与单果种子数量进行分析发现：黄果枸杞的种子明显比红果枸杞大，而单果产出的种子数量相较于红果枸杞更少。4种黄果枸杞的种形也略有差异，‘宁农杞4号’‘宁农杞5号’‘宁农杞19号’的种形相较于其他枸杞更加圆润，而‘宁农杞20号’的种形与红果枸杞较为相似。对14个品种枸杞的种实性状进行相关性分析发现：枸杞果柄长与果柄粗和种子大小呈正相关趋势，果柄越长、越粗，种子越大；果实硬度和果柄长与果实大小、果实质量呈正相关，果实越硬、果柄越长，其长势越好。而枸杞种实性状之间联系紧密，其中一个性状指标的变化可能会引起其他性状指标的变化^[29]。

种实性状丰富的变异有助于优良种质的筛选^[30]。一般认为，变异系数大于10%，表明样本群体的性状差异较大，就越能适应更广泛的环境条件^[31]。14个品种宁夏枸杞的种实性状平均变异系数达19.16%，说明其具有较高的环境适应性。其中，果实性状的变异系数为19.69%，高于种子性状17.17%，证明与种子表型变异相比，果实性状变异更加丰富，这与李永梅等^[32]对旱区野生铁线莲Clematis florida种实表型分析的研究结果一致。而不同品种枸杞种子的长、宽以及种形指数变异系数较高，说明种子外在形状稳定性较低。而在植物的遗传变异过程中，表型性状可直观地体现植物遗传多样性，而表型性状变异也是物种遗传变异的表现形式^[33−34]。通过研究植物表型多样性能够认识植物群体的遗传变异规律及对环境的响应与适应机制^[35]。本研究发现：11个种实表型性状平均变异系数为0.17%~59.08%，变异幅度大、变异丰富。

分维度进行聚类揭示了特异性状组合。果实质构指标显示：‘宁农杞4号’的高硬度可能适合机械化采收，而低弹性提示加工时需调整工艺参数。多维表型分析能有效反映种质间亲缘关系，而分维度聚类可为定向育种提供性状选择依据^[36]。不同品种枸杞相互之间可能具有独立的遗传背景，涵盖比较丰富的遗传变异，可为后期品种选育提供更为丰富的遗传材料^[37]。‘宁农杞20号’在4种聚类方式下均与黄果枸杞聚为1类，这可能与其遗传背景相关，因它是由红果枸杞变异而来，从而也解释了‘宁农杞20号’种实性状为何与红果枸杞相似。‘宁农杞4号’在4种聚类方式下均为第Ⅰ类，值得注意的是‘宁农杞4号’在果实表型聚类中与‘宁农杞5号’同组，但在种子聚类中‘宁农杞5号’与其分离，表明其果实形态与种子特征可能受不同的遗传机制调控^[38]，同时，‘宁农杞4号’在所有分维度聚类中均独立成类，且在综合聚类中与红果枸杞完全分离，暗示其具有独特的遗传背景。同时，其在综合聚类与果实表型聚类时单独聚为1类，说明其种实性状较为独特。主成分分析可以反映各指标对主成分载荷作用的能力与方向^[39]。结合主成分综合得分发现：‘宁农杞4号’排名第1位，后期可重点培育这一品种并加以利用。种实性状是决定产量的重要因素，种子千粒重更大的群体更容易产出综合得分较高的优良个体，利用种子质量较高的类群筛选优良品种更为高效^[40]。‘宁杞3号’‘宁农杞20号’‘宁杞9号’的综合排名分别为第2、3、4位，种子性状较优，在今后的研究中可着重关注这3个品种枸杞，开展种子品质相关研究。

本研究发现：枸杞种实表型变异性强，多样性丰富。而果实的变异系数相较于种子更高，变异更加丰富，稳定性较种子更差。枸杞果柄的长势影响着果实与种子的长势，果柄越长，果实越大，果柄越长、越粗，种子越大。同时，黄果枸杞单果产出的种子数明显少于红果枸杞，且种子相较于红果枸杞更圆(‘宁农杞20号’除外)，因其由红果变异而来，导致表型性状更接近红果枸杞。在14个品种枸杞中，‘宁农杞4号’的综合排名最好，后续应着重研究。