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花发育是植物生长发育阶段的重要组成部分，过程虽然复杂，但十分有序。花发育的整个过程不仅受到光照、温度和湿度等外源因素的影响, 而且内源基因的相互作用也是决定开花调节机制的关键性因子[1-2]。MADS-box基因是一种植物特有的转录调控因子，在所有器官的形态发生乃至植物整个生命周期中发挥作用，例如：叶形态发生，花和果实发育以及种子发育[3]。其中，APETALA1 (AP1)类基因除了作为花分生组织特征基因[4]，还表现为花器官特征基因，通过调控花器官的分化影响花发育[5-6]。反映这一特性的是ABC模型，A类基因控制萼片和花瓣的形成，B类基因控制花瓣和雄蕊的形成，C类基因控制雄蕊和心皮的形成[7]。AP1基因作为A类基因，调控萼片和花瓣的分化，并且与C类基因相互拮抗[8-9]。由于AP1类基因在花发育调控网络中的重要作用，使得不同物种中AP1类基因的研究更具有意义与价值。目前，在拟南芥Arabidopsis thaliana[8]、金鱼草Antirrhinum majus[5]和番茄Solanum lycopersicum[10]等植物中，对AP1类基因功能进行了较深入的研究，但是在菊科Asteraceae植物中的研究还有限。菊科植物具有典型的头状花序[11]，花序外侧舌状花两侧对称，缺乏功能性雄蕊，而中央的管状花则是辐射对称的两性花，形态结构复杂。特殊的花序结构不仅提升了虫媒传粉的效率，也增强了菊科植物的观赏价值[12]。近年来，对于菊科植物，例如菊花Chrysanthemum morifolium[13]、非洲菊Gerbera hybrida[14]和向日葵Helianthus annuus[15]等的研究表明：复杂的头状花序对于研究花器官发育的遗传调控具有重要意义。因此，本研究克隆了菊科欧洲千里光Senecio vulgaris的SvAP1基因。由于菊科植物遗传转化体系较为复杂、转化周期长且转化效率低，故将SvAP1基因异源转化茄科Solanaceae龙葵Solanum nigrum中进行功能预测与分析，旨在为菊科植物AP1类基因的分子机制提供理论基础。
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将欧洲千里光和龙葵种子均在 25 ℃、光周期 16 h (白天)/8 h (黑夜)条件下播种于人工气候室。取欧洲千里光和龙葵的不同组织样品，包括新鲜的根、茎、叶和花完全展开时期的花序等，所有样品标记分装后置于液氮中速冻，保存于−80 ℃备用。
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取欧洲千里光花完全展开时期约0.1 g的花序为材料，利用Eastep® Super总RNA提取试剂盒(普洛麦格生物产品有限公司，上海)提取总RNA，并用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳和超微量紫外分光光度计(NanoDrop2000，赛默飞世尔科技公司，美国)对RNA样品的完整性和浓度进行检测。利用反转录试剂盒EasyScript®First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (全式金生物技术有限公司，北京)，参照说明书合成cDNA，产物储存于−20 ℃ 备用。
将欧洲千里光早期头状花序样品材料送至上海翰宇生物科技有限公司获得转录组数据。根据欧洲千里光转录组数据分析得到SvAP1基因序列。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI，
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) Primer-BLAST设计特异性引物，并在正向和反向引物中分别添加Xba Ⅰ和SacⅠ限制性内切酶酶切位点及保护碱基，特异性引物SvAP1-F和SvAP1-R由杭州有康生物科技有限公司合成(表1)。以欧洲千里光cDNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。PCR扩增体系为：97 ℃预变性3 min；95 ℃变性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35次循环；72 ℃总延伸10 min。PCR扩增片段经切胶回收纯化后连接至pEASY-T1 Simple载体(全式金生物技术有限公司，北京)，并转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞中(唯地生物技术有限公司，上海)，根据蓝白斑筛选以及菌落PCR验证，测序获得目的基因。表 1 基因克隆与分子鉴定所用引物序列
Table 1. Primer sequences for gene cloning and molecular identification
引物名称 正向(反向)引物序列(5′→3′) 引物名称 正向(反向)引物序列(5′→3′) SvAP1-F AATCTAGAATGGGGCGGGGAAGGGTGA NPT Ⅱ-R GTGGTCGAATGGGCAGGTAG SvAP1-R AAGAGCTCTTACTTGTTCATGAGATGAAT qSvAP1-F GTTGTGTGATGCTGACGTGG Sn18s-F CGCGCGCTACACTGATGTATTCAA qSvAP1-R GCGTGTTCCAGAGTCCAGTT Sn18s-R TACAAAGGGCAGGGACGTAGTCAA Sv18s-F ATAGCAGAACGACCTGTGAA NPT Ⅱ-F AGATGGATTGCACGCAGGTTC Sv18s-R GAAGCAAGATCCAACGCAAT 说明：下划线标记处为特异性引物限制性内切酶酶切位点 -
将目的基因在NCBI网站上进行blastx检索，下载各物种中与SvAP1同源性较高基因氨基酸FASTA格式文件；利用ClustalX(2.1)[16]及MEGA-X(10.1.8)[17]软件，采用邻接法(neighbor-joining, NJ)，校验参数Bootstrap为1 000次，进行多序列比对以及系统进化树的构建，并用GeneDoc(2.7.0)软件对多序列比对进行修饰美化。
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分别提取欧洲千里光的不同组织(根、茎、叶和花序)的RNA并反转为cDNA。以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)。根据引物设计原则设计特异引物qSvAP1-F、qSvAP1-R，内参基因引物为Sv18s-F、Sv18s-R(表1)，参照qPCR试剂盒TransStart® Tip Green qPCR SuperMix(全式金生物技术有限公司，北京)说明书，反应体系为：cDNA(稀释10倍)1 μL，2×TransStart® Tip Geen qPCR SurperMix 5 μL，上下游引物(10 μm·L−1)各0.2 μL，双蒸水3.6 μL，95 ℃预变性30 s，95℃变性5 s，60 ℃复性30 s，共进行40个循环。试验设置3个重复反应，并采用2−∆∆Ct法计算各部位SvAP1的相对表达量，通过 SPSS 19.0[18]软件进行单因素方差分析(ANOVA)，默认置信区间为95%。
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应用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ限制性内切酶酶切pBI121超表达载体与pEASY-T1Simple-SvAP1重组质粒，将酶切后的目的片段与载体片段进行酶连，将酶连产物转化至大肠埃希菌感受态DH5α中，挑选单克隆进行菌落PCR鉴定，提取质粒并进行单双酶切检验后转化到农杆菌GV3101中，PCR鉴定获得阳性菌落，然后采用农杆菌介导的叶盘法进行龙葵的遗传转化。
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利用特异性引物SvAP1-F、SvAP1-R (表1)进行PCR以及RT-PCR反应，对转基因龙葵进行进一步的鉴定及表达分析。采用十二烷基苯磺酸钠(SDS)法提取野生型及转基因龙葵基因组DNA，使用卡那霉素引物NPT Ⅱ-F、NPT Ⅱ-R及特异性引物SvAP1-F、SvAP1-R (表1)进行 PCR 检测；提取野生型及转基因龙葵幼嫩叶片的RNA，反转录后得到cDNA。以此为模板，使用内参引物Sn18s-F、Sn18s-R以及特异性引物SvAP1-F、SvAP1-R (表1)，进行半定量RT-PCR反应。反应体系为：97 ℃预变性3 min；95 ℃变性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30次循环；72 ℃总延伸10 min。
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解剖盛花期野生型及转基因龙葵花器官，以雌蕊为材料，进行纵向石蜡切片，探究其内部结构的变化。石蜡切片制作参照祁宏英等[19]的方法。主要步骤包括：①材料固定。利用真空泵将材料中的气体去除后将其放入FAA固定液(无水乙醇、冰醋酸、甲醛和双蒸水体积比为10∶1∶2∶7)固定24.0 h以上。②脱水、透明。固定材料取出后用体积分数为50%乙醇溶液冲洗，然后在一系列由低到高体积分数的乙醇溶液中逐级脱水，每级1.5 h，纯浓度1.0 h。将脱尽水的材料按照不同比例的无水乙醇和二甲苯逐级过渡到纯二甲苯溶液，使得材料中的无水乙醇被二甲苯替代达到透明的效果，每级1.0 h。③浸蜡。二甲苯后加入少量碎蜡，放入45 ℃ 恒温箱过夜，次日早上继续加入碎蜡，6.0 h后移至60 ℃ 恒温箱，换入熔融的纯蜡，之后每日早晚各换入1次纯蜡，让石蜡慢慢渗透到材料中。换2~3 d效果较好。④包埋、切片、粘片。将融化的石蜡迅速加入包埋框中，放入材料。调整轮转式切片机(RM2235，徕卡显微系统有限公司，上海)，切片厚度为8 μm，将切好的蜡带依次放入载玻片上，置于42 ℃ 恒温箱中烘片。⑤海氏铁矾-苏木精染色法染色及观察。经过脱蜡后采用海氏铁矾-苏木精染色法进行染色，并脱水、透明、树胶封片，用显微镜(EX20，舜宇仪器有限公司，宁波)观察。
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以欧洲千里光的cDNA为模板，经PCR扩增并对扩增片段进行测序，测序结果显示：SvAP1基因开放阅读框(ORF)区由705 bp组成，编码234个氨基酸，与转录组数据相一致。从NCBI-blastx筛选出拟南芥、金鱼草、马铃薯Solanum tuberosum和甘菊Chrysanthemum lavandulifolium等植物中SvAP1的同源基因序列，进行同源性分析。结果表明：欧洲千里光SvAP1与甘菊ClAP1 (ADK94172.1)和菊花CDM8 (AAO22981.1)同源性最高，分别为76.05%和75.21%。进一步分析发现：SvAP1具有典型的MIKC型MADS-box基因结构，结构域由MADS-box (M)、Intervening (I)、K-box (K)和C-terminal (C)等4个部分组成。在C末端具有真双子叶植物AP1类基因2个较短且相对保守的基序(motif)，其中之一为paleoAPETALA1 (paleoAP1)蛋白基序，另一个为FUL蛋白基序(图1A)，与ClAP1和CDM8保持一致。利用MEGA-X软件构建欧洲千里光SvAP1氨基酸序列的系统进化树(图1B)，结果显示：SvAP1与甘菊ClAP1、菊花CDM8、番茄SlFRUITFULLFUL (SlFUL) (NP_001294867.1)、马铃薯StAGL8 (XP_006345101.1)、辣椒Capsicum annuum CaAGL8 (NP_001311552.1)、绒毛烟草Nicotiana tomentosiformis NtAGL8 (XP_009625854.1)、拟南芥AP1 (CAA78909.1)和金鱼草SQUAMOSA (SQUA) (CAA45228.1)处于同一个分支中，亲缘关系接近。
图 1 欧洲千里光SvAP1氨基酸多序列比对以及系统进化树分析
Figure 1. Amino acid sequence alignment and phylogenetic tree analysis of SvAP1 in S. vulgaris
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通过qRT-PCR对欧洲千里光不同组织部位的表达水平进行分析。结果表明(图2)：SvAP1在欧洲千里光茎、叶和花序中都有表达，其中SvAP1在花序中的表达水平高于在茎和叶。因此，初步推测SvAP1在营养生长和生殖生长中可能都起到一定的调控作用。
图 2 SvAP1在欧洲千里光不同部位的相对表达
Figure 2. Relative expression of SvAP1 in different tissues of S. vulgaris
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为了研究SvAP1的功能，通过农杆菌介导的遗传转化获得的9个独立抗性植株中，选取表型变化明显的3株抗性植株，提取DNA后进行目的基因和卡那霉素抗性基因的双重扩增。结果显示：扩增的大小均与预期相符合(图3A和图3B)，表明筛选出的3株抗性植株为转基因抗性植株。以野生型植株SvAP1表达为对照，对转基因植株中SvAP1表达进行RT-PCR分析，结果显示(图4A)：相比于对照植株，3株转基因抗性植株中的SvAP1表达量都出现了不同程度的升高。其中，SvAP1-3转基因龙葵中SvAP1表达量最低，SvAP1-4转基因龙葵SvAP1表达量较高，SvAP1-9转基因龙葵SvAP1表达量最高。由此可知：SvAP1在转基因抗性植株中得到了有效表达，可进行下一步的表型分析。观察筛选到的3株表型明显的转基因抗性植株发现：与同一时期野生型龙葵相比，转基因龙葵的茎和叶无明显变化，而花器官发育异常且果实数目减少(图4B)。
图 3 野生型及转基因龙葵PCR检测
Figure 3. PCR detection of wild type S. nigrum and different transgenic lines
图 4 野生型和转基因龙葵RT-PCR及表型分析
Figure 4. RT-PCR and phenotypes analysis of wild type S. nigrumand different transgenic lines
正常的野生型龙葵花序由外到内依次为5个萼片、5个花瓣、5个雄蕊以及1个雌蕊，雌蕊被雄蕊包裹于最内轮，仅柱头部分可见(图5A)。形态学观察发现，转基因龙葵雌蕊发育异常，其中弱表型SvAP1-3转基因龙葵花序与野生型无明显差异(图5B)；中表型SvAP1-4转基因龙葵子房明显膨大，将雄蕊挤压至花瓣一侧，且雌蕊花柱基部与子房顶部连接处膨胀(图5C)；强表型SvAP1-9转基因龙葵雄蕊被膨大的子房挤压至向花瓣方向倾斜生长，雌蕊状组织增多(图5D)。
图 5 野生型及转基因龙葵花序
Figure 5. Inflorescence in wild type S. nigrum and different transgenic lines
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为了进一步探究SvAP1的异位表达对雌蕊发育的影响，对野生型及强表型SvAP1-9转基因龙葵花器官进行解剖，并对雌蕊进行显微镜观察发现：野生型龙葵雌蕊包括柱头、花柱和子房，花柱中部以下被白色绒毛，基部与卵状子房相连(图6A)；强表型SvAP1-9转基因龙葵花柱数目增多，子房膨大且有心皮组织增生冲破子房壁暴露于子房顶部，外侧有花柱包裹(图6B)。为了分析转基因龙葵雌蕊内部结构的变化，对野生型以及强表型转基因龙葵的雌蕊进行纵向石蜡切片观察，结果显示：野生型龙葵花柱基部与胎座相连，两者基本位于子房中轴线处，卵圆状胚珠经珠柄与胎座相连相对平均分布于胎座两侧(图6C)；强表型SvAP1-9转基因龙葵子房膨大，子房顶部增生的心皮组织发育较为完全。进一步分析强表型SvAP1-9转基因龙葵增生的心皮组织细胞结构：中心部分与子房胎座组织细胞结构相类似，呈不规则卵圆状紧密分布；靠近外缘部分细胞明显变小且更加紧凑呈层状排列，与子房壁细胞结构相类似(图6D)。由此推测，强表型SvAP1-9转基因龙葵增生的心皮组织形成了类似子房的结构。综上所述推测：SvAP1在龙葵中的异位表达对雌蕊发育产生影响，可能造成子房膨大且花柱与子房数目增多。
图 6 野生型和转基因龙葵雌蕊及其石蜡切片
Figure 6. Wild type S. nigrum and different transgenic lines pistil and their paraffin section
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花是植物的生殖器官，被认为是植物进化中重要的形态创新，花器官的发育对于花形态的建成具有重要作用，而且受许多调控因子的影响[20]。菊科独特的头状花序结构使其成为研究植物花器官发育的重要材料。MADS-box家族基因在调控花分生组织和花器官发育中起着重要作用，因此其在菊科植物头状花序形成中的调节作用一直是近年来的研究热点[21]。其中，AP1类基因是花发育调节机制的调控枢纽，作为花器官特征基因在菊花[13]和碎米荠Cardamine hirsute[22]等植物中被研究报道。
真双子叶植物AP1类基因分为euAP1、euFRUITFULL (euFUL)和AGAMOUS-like79 (AGL79)等3个亚支，其中euAP1分支基因具有euAP1蛋白基序，euFUL与AGL79分支基因具有paleoAP1蛋白基序[23]。本研究所获得的欧洲千里光SvAP1基因在C末端段具有paleoAP1蛋白基序，且系统进化关系分析表明：SvAP1与ClAP1、 CDM8、SlFUL、StAGL8、CaAGL8、NtAGL8、AP1和SQUA位于同一进化枝，其中与ClAP1和CDM8同源性最高。有报道指出：CDM8[13]、SlFUL[24]、CaAGL8[25]和NtAGL8[26]均属于euFUL类AP1分支，AP1[8]和SQUA[5]属于euAP1类AP1分支。综上所述可推测：SvAP1属于AP1类基因，即SQUA亚家族。LITT等[23]认为：多数具有paleoAP1蛋白基序的基因表达模式比具有euAP1蛋白基序的基因更为广泛，存在于营养组织和生殖组织，包括茎、叶、花分生组织、所有花器官和果实等。甘菊ClAP1研究较少，关于同源性较高的CDM8[13]研究表明：其在营养器官和生殖器官中都可以检测到表达，主要在茎、叶和花中表达，参与营养生长到生殖生长的调控。为了进一步研究SvAP1是否具有类似的表达模式，对欧洲千里光进行组织特异性表达分析。qRT-PCR反应显示：SvAP1基因表达模式比拟南芥AP1更为广泛，在欧洲千里光茎、叶和花中都可以检测到SvAP1表达，与CDM8相类似，可能对营养生长与生殖生长的发育都起到了调控作用。
BERBEL等[27]认为：AP1基因的“CFAA”基序并非是判断AP1类基因功能的决定性依据，不同的C端基序蛋白也可以发挥AP1基因相类似功能，“CFAA”只是增强了AP1类基因的活性，在多个物种中都有被报道，例如豌豆Pisum sativum的PEAM4[27]、大豆Glycine max的GmAP1[28]、百合Lilium longiflorum的LMADS6、LMADS7[29]和绒毛烟草的NtAGL8[26]等。因此，具有paleoAP1蛋白基序的基因也可能作为花器官特征基因影响花器官的发育。例如：LI等[30]发现：从红花玉兰Magnolia wufengensis中分离出的MawuAP1影响心皮及果实发育，主要在心皮的膨大中起作用，从而影响果实的发育；孙迎坤等[31]发现：山茶花Camellia japonica的CjAPL1转化拟南芥的阳性植株花器官发育异常，花柱和雄蕊数增加；邓柠檬等[32]发现：金钗石斛Dendrobium nobile的DnAPL1在转基因拟南芥中的表达会导致花器官数目增加，且萼片和花瓣形状发生变化。本研究发现：转基因龙葵花雌蕊发育异常，在强表型中可以观察到子房膨大且雌蕊状组织增多。因此推测，SvAP1在花器官形成中具有重要作用，且与ABC模型中A类基因超表达对于花器官发育造成的影响有所不同。在ABC模型中，A类基因的超表达会抑制C类基因的表达，从而对雄蕊与雌蕊的发育产生影响：雄蕊向花瓣同源异形转化且雌蕊转变为萼片状或叶片状器官。在本研究中，SvAP1在龙葵中的超表达同样影响了雌蕊的发育，但呈现出相对不同的表型，且雄蕊的发育无明显变化，这可能与欧洲千里光花器官调控机制与花序结构的复杂性有关。雌蕊的异常发育导致果实发育受到影响，在转基因龙葵中果实数目与同一时期野生型龙葵相比明显变少。
开花植物花调控网络十分庞大，不同基因之间存在较为复杂的相互作用关系。研究表明：在拟南芥中AP1
与SEPALLATA3 (SEP3)[32]、AGAMOUS (AG)[21]、FRUITFULL (FUL)[33]和UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO)[34]等多种花器官发育相关基因存在相互作用，其中部分基因与心皮发育的调控有关。有研究报道：AP1类基因的异位表达可能对内源基因的表达产生了抑制或者促进作用，例如：毛白杨Populus tomentosa的AtAP1M3[35]和山茶花的CjAPL1[31]等。因此推测，SvAP1雌蕊发育异常也可能与基因之间的相互作用有关。为了进一步验证SvAP1的异位表达是否对于其他内源基因的表达产生了影响，从而共同导致雌蕊的变化，还需要进行转基因龙葵相关内源基因的表达分析。 本研究通过异源转化龙葵，初步预测了菊科欧洲千里光AP1类基因SvAP1作为花器官特征基因对花器官发育的影响。欧洲千里光组织特异性表达分析显示：SvAP1可能参与了营养生长与生殖生长的调控，其在龙葵中的异位表达却对龙葵的营养生长并没有起到明显的作用，推测这可能与物种之间的差异性有关，因此，为了深入探究SvAP1基因在欧洲千里光中的作用机制，需要后续研究进一步验证。
Cloning and functional analysis of SvAPETALA1 in Senecio vulgaris
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摘要:
目的 花器官发育是影响花观赏价值的重要因素，AP1类基因调控植物花器官的形成。研究菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris的SvAP1基因在花器官形成中的重要作用，旨在探究菊科复杂花序结构产生的调控机制。 方法 以欧洲千里光为材料克隆获得了SvAP1基因，通过多序列比对、构建系统进化树、实时荧光定量PCR (qRT-PCR)反应、构建超表达载体、组织学染色观察等方法与技术，对SvAP1基因进行功能预测与分析。 结果 SvAP1基因开放阅读框长度为705 bp，编码234个氨基酸。多序列比对与系统进化分析显示：SvAP1基因属于MADS-box基因AP1类亚家族，C末端具有paleoAP1保守基序(motif)。欧洲千里光组织特异性表达分析表明：SvAP1基因在营养器官和花序中都有表达。转基因龙葵Solanum nigrum的形态学观察和石蜡切片技术分析显示：与野生型龙葵相比，转基因龙葵雌蕊发育异常，表现为子房膨大且雌蕊状组织增多。 结论 欧洲千里光SvAP1基因在龙葵中的超表达影响雌蕊发育，与ABC模型中A类基因超表达对植物花器官发育造成的影响存在差异，即转基因龙葵雄蕊无明显变化且雌蕊未转变为萼片状或叶片状器官。这可能与欧洲千里光花器官调节机制和花序结构的复杂性有关。由此可知，欧洲千里光SvAP1基因可能作为花器官特征基因在花器官形成中具有重要作用。图6表1参35 -
关键词:
- 欧洲千里光 /
- 转基因龙葵 /
- SvAPETALA1 /
- 花器官发育
Abstract:Objective Floral organ development is an important factor affecting the ornamental value of flowers, and APETALA1 (AP1) genes regulate the formation of floral organs. This study aims to explore the important role of SvAP1 gene of Senecio vulgaris (Asteraceae) in floral organ formation, so as to reveal the regulatory mechanism of the complex inflorescence structure in Asteraceae. Method SvAP1 gene was cloned from S. vulgaris. The function of SvAP1 gene was predicted and analyzed by multiple sequence alignment, phylogenetic tree construction, qRT-PCR, overexpression vector construction, and histological staining observation. Result The open reading frame (ORF) of SvAP1 gene was 705 bp in length, and encoded 234 amino acids. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis showed that SvAP1 gene belonged to AP1 subfamily of MADS-box gene, and the C-terminus had a conserved motif of paleoAP1. Tissue specific expression analysis of S. vulgaris showed that SvAP1 gene was expressed in both vegetative organs and inflorescences. Morphological observation and paraffin section analysis of transgenic Solanum nigrum showed that compared with wild S. nigrum, the pistil development of transgenic S. nigrum was abnormal, which was characterized by enlarged ovary and increased pistil-like tissue. Conclusion The overexpression of SvAP1 gene in S. nigrum affects the pistil development, which is different from the effect of over expression of class A gene in ABC model on floral organ development, that is, the stamens of transgenic S. nigrum have no obvious changes and the pistils aren’t transformed into sepal or leaf-like organs, which may be related to the complexity of the floral organ regulation mechanism and the inflorescence structure of S. vulgaris. In conclusion, SvAP1 gene may play an important role in floral organ formation as a characteristic gene of floral organ. [Ch, 6 fig. 1 tab. 35 ref.] -
Key words:
- Senecio vulgaris /
- transgenic Solanum nigrum /
- SvAPETALA1 /
- floral organ development
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密码子是识别和传递生物体遗传信息、联系蛋白质与DNA之间的重要桥梁，在生物体遗传和变异中起着至关重要的作用[1]。编码同一氨基酸的不同密码子被称为同义密码子。由于基因突变和自然选择的影响，某些同义密码子在蛋白质翻译过程中往往被高频使用，被称为密码子的使用偏好性[2−3]。物种的生物学功能与密码子偏好性密切相关，密码子偏好性不仅可以影响生物编码基因的蛋白质合成速率和翻译速率[4]，还会影响蛋白质结构、折叠程度和mRNA的合成[5]。研究表明：同一物种或亲缘关系相近的物种，具有相似的密码子偏好使用模式[6]，通过分析物种的密码子偏好性可以衡量物种之间的基因表达量，进而探究物种之间亲属关系[7]。通过密码子偏好性的研究，能够更好地阐明物种进化过程中基因的表达规律[8]，为利用基因工程技术改良物种目标基因提供参考依据[9]。
梁山慈竹Dendrocalamus farinosus属竹亚科Bambusoideae牡竹属Dendrocalamus，又名大叶竹和瓦灰竹，是中国西南地区重要的经济竹种[10]，生长速度快，适应性强，竹笋效益高，属于优良的笋竹两用竹种，与硬头黄竹Bambusa rigida都属于竹编和制浆造纸的优质原料[11]。针对梁山慈竹叶绿体基因组密码子使用偏好性的研究鲜见报道。为了更好地挖掘和利用梁山慈竹的潜在经济价值，本研究以梁山慈竹叶绿体基因组序列为研究对象，分析其密码子偏好性使用模式，探究并总结其相关表达基因的密码子偏好性，以期分析影响梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的主要因素，并筛选出最优密码子，为后续梁山慈竹叶绿体基因工程改造等研究提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 叶绿体基因组序列的获取
根据GenBank登录号MZ681865.156在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中搜索并下载梁山慈竹叶绿体基因组序列，共有85条编码序列(CDS)。序列重复或小于300 bp会对密码子偏好性指标的测定产生影响[12]。对基因序列进行筛选，剔除序列长度小于300 bp且重复的序列，获取起始密码子为ATG，终止密码子为TAG、TGA和TAA的序列，最终获得51条CDS序列作为后续分析的样本序列。
1.2 密码子组成分析
运用CodonW1.4.2 (
http://sourceforge.net/projects/codonw )和EMBOSS (http://imed.med.ucm.es/EMBOSS/ )计算有效密码子数(ENC)、适应指数(CAI)、密码子偏性指数(CBI)、最优密码子频率(FOP)以及密码子第3位核苷酸A、T、C、G的含量(分别记为A3、T3、C3、G3)。利用ENC判断密码子偏好性程度，ENC＞35说明密码子偏好性比较弱；反之，说明偏好性强[13]。通过CUSP软件分析并获得密码子鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的比率(GC比率)及GC平均比率(GCall)，使用SPSS 25.0软件对梁山慈竹密码子各位置的GC比率与ENC进行相关分析。1.3 相对同义密码子使用度分析
运用CodonW 1.4.2对同义密码子相对使用度(RSCU)进行分析，即该密码子的实际使用频率与其理论使用频率的比值[14]。当RSCU大于1时，同义密码子中偏好使用该密码子，被称为高频密码子；当RSCU等于1时，密码子无偏好性；当RSCU小于1时，密码子使用偏好性较弱[15]。
1.4 中性绘图分析
中性绘图分析是对影响密码子使用偏好性的关键因素进行分析，X轴为GC3，Y轴为GC1和GC2的平均值，绘制二维散点图对GC3和GC12 (各基因 GC1和GC2的平均值)的相关性进行分析(GC1、GC2、GC3分别代表第1、2、3位密码子的GC比例)。若回归系数接近1，代表GC3和GC12显著相关，碱基组成没有差异，说明突变是决定密码子偏好性的主要因素；若回归系数接近0，则代表自然选择是主要因素。
1.5 ENC-plot绘图分析
ENC-plot绘图分析表现密码子的使用偏好性受到突变和自然选择的影响程度。使用Python 3.7进行ENC-plot绘图分析，构建散点图，横纵坐标分别为GC3、ENC，并绘制ENC的标准曲线。基因位点靠近或在标准曲线上，表明突变是决定密码子偏好性的主要因素，若基因位点和标准曲线距离很大，则说明偏好性主要由自然选择决定。
1.6 PR2-plot偏倚分析
PR2-plot分析表明基因中密码子的第3位碱基的构成情况。计算密码子碱基中第3位上4种碱基A、T、C、G比例，G3/(G3+C3)为X轴，A3/(A3+T3)为Y轴，绘制PR2-plot散点图，中心点为碱基比例A=T、C=G时的值，代表处于此区域的密码子并无使用偏好性[16]。
1.7 最优密码子分析
将51条基因升序排列后的ENC前后两端10％的基因建立高、低表达基因库。通过CodonW软件计算2个表达库中密码子的RSCU和ΔRSCU，同时满足高频密码子(RSCU＞1)和高表达密码子(ΔRSCU≥0.08)的为最优密码子[17]。
1.8 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析
在Codon Usage Database (
http://www.kazusa.or.jp/codon/ )下载异源表达宿主和植物代表类群，包括巨龙竹D. farinosus、粉麻竹D. sinicus、小叶龙竹D. pulverulentus、硬头黄竹、大肠埃希菌Escherichia coli、烟草Nicotiana tabacum、拟南芥Arabidopsis thaliana和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae等物种基因组密码子的使用频率，与梁山慈竹基因组密码子使用频率比值进行比较分析，当梁山慈竹密码子使用频率比其他生物的比值≥2.0或≤0.5时，说明该物种与梁山慈竹的同义密码子的使用偏好性差异较大，当比值不在上述范围内时，表明这2个物种对该密码子的偏好性较接近。1.9 对应分析
将叶绿体基因如表1所示进行功能分类，使用CodinW软件，选择对应分析计算样本中各个基因的RSCU，将分析结果分布在59维向量空间中，分析指标间的对应性。
表 1 梁山慈竹叶绿体基因结构分析Table 1 Structural analysis of the choroplast genome of D. farinosus基因分类 基因分组 基因名称 光合系统基因 光系统Ⅰ基因 psaA、psaB、psbA、psbC、psbD、psbB 光系统Ⅱ基因 petA、petB、petD 细胞色素b/f复合体基因 atpA、atpB、atpE、atpF、atpI 三磷酸腺苷合成酶基因 ndhA、ndhB、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、ndhH、ndhI、ndhJ、ndhK 遗传系统基因 烟酰胺腺票吟二核甘酸氧化还原酶基因 rbcL 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因 rpoA、rpoB、rpoC1、rpoC2 RNA聚合酶亚基基因 rps2、rps3、rps4、rps7、rps8、rps11、rps12、rps14、rps18 核糖体蛋白小亚基基因 rpl2、rpl14、rpl16、rpl20、rpl22 其他基因 成熟酶K基因 matK 膜蛋白基因 cemA 细胞色素合成基因 ccsA 酪蛋白分解蛋白酶基因 clpP 未知功能基因 假定叶绿体阅读框 ycf2、ycf3、infA 2. 结果与分析
2.1 密码子的碱基组成分析
分析梁山慈竹叶绿体基因组CDS序列的碱基组成：梁山慈竹的4种碱基所对应的同义密码子的第3位碱基比例 (T3s、A3s、C3s、G3s)分别为45.28%、42.07%、18.13%、17.96%，T3s和A3s远高于G3s和C3s，表明梁山慈竹叶绿体基因组密码子的第3位碱基以A/U结尾为主。梁山慈竹的ENC为50.40，CAI为16.6%，第3位同义密码子的GC比率 (GC3S)为28.1%，表明其叶绿体基因组密码子偏好性较弱。
梁山慈竹叶绿体基因组密码子的GC平均比率为39.48%，且GC1 (47.69%)＞GC2 (39.70%)＞GC3 (31.05%)。ENC为 39.04~61.00，均值为49.51，GC比率在基因密码子上并没有均匀分布(表2)。ENC和密码子3个位置GC比率的相关分析(表3)结果发现：ENC与GC3比率显著相关，与GC1、GC2不显著相关，说明密码子使用偏好性形成过程中GC3的影响作用大于GC1、GC2。
表 2 梁山慈竹叶绿体基因组各基因密码子相关参数统计Table 2 Statistics of codon related parameters of various genes in the chloroplast genome of D. farinosus基因 GC比率/% ENC CAI FOP 基因 GC比率/% ENC CAI FOP GC GC1 GC2 GC3 GC GC1 GC2 GC3 rps12 41.87 52.00 47.20 26.40 44.85 0.140 0.341 rps18 33.53 34.50 39.77 26.32 39.04 0.147 0.333 psbA 42.56 49.72 42.94 35.03 41.33 0.313 0.532 rpl20 36.11 38.33 40.83 29.17 50.97 0.112 0.298 matK 34.44 40.82 32.42 30.08 49.49 0.166 0.329 clpP 43.01 52.53 38.25 38.25 52.37 0.175 0.337 psbD 44.44 53.39 43.50 36.44 48.99 0.242 0.456 psbB 44.01 54.42 45.97 31.63 50.73 0.190 0.380 psbC 44.66 53.59 44.73 35.63 48.91 0.183 0.386 petB 41.06 48.93 41.20 33.05 47.31 0.191 0.333 rpoB 39.19 49.81 38.01 29.74 49.69 0.153 0.353 petD 40.37 50.93 39.13 31.06 49.46 0.161 0.305 rpoC1 39.87 49.93 38.07 31.63 52.77 0.156 0.347 rpoA 37.06 46.18 35.59 29.41 49.94 0.151 0.311 rpoC2 38.95 49.01 36.64 31.18 52.29 0.154 0.333 rps11 43.52 50.69 56.25 23.61 44.33 0.174 0.396 rps2 38.40 40.51 40.93 33.76 52.55 0.168 0.338 infA 40.35 43.86 35.96 41.23 61.00 0.181 0.409 atpI 38.84 47.58 36.29 32.66 50.55 0.163 0.353 rps8 36.50 41.61 41.61 26.28 46.62 0.122 0.374 atpF 38.27 47.62 35.45 31.75 53.17 0.147 0.353 rpl14 38.71 54.84 37.10 24.19 51.90 0.181 0.392 atpA 42.06 56.01 39.96 30.12 49.96 0.182 0.385 rpl16 44.76 52.14 53.57 28.57 39.41 0.115 0.354 rps14 39.42 39.42 46.15 32.69 41.73 0.135 0.384 rps3 33.47 43.75 31.67 25.00 48.03 0.193 0.402 psaB 41.81 48.71 43.13 33.61 49.34 0.172 0.350 rpl22 37.56 41.33 36.67 34.67 47.48 0.188 0.415 psaA 43.68 51.80 43.28 35.95 52.07 0.198 0.373 rpl2 44.56 51.77 48.58 33.33 53.33 0.143 0.361 ycf3 39.69 47.40 38.15 33.53 55.45 0.156 0.343 ndhB 38.16 42.07 39.33 33.07 46.71 0.156 0.348 rps4 37.13 47.52 37.13 26.73 49.59 0.169 0.386 rps7 39.49 49.68 45.22 23.57 48.31 0.164 0.373 ndhJ 39.38 49.38 36.88 31.88 51.48 0.176 0.356 ndhF 34.19 37.84 38.92 25.81 46.19 0.144 0.321 ndhK 38.60 41.70 43.72 30.36 51.91 0.159 0.329 ccsA 33.64 33.74 41.10 26.07 45.60 0.152 0.307 ndhC 39.67 50.41 36.36 32.33 48.75 0.177 0.345 ndhD 36.19 40.72 36.93 30.94 48.98 0.133 0.314 atpE 42.51 52.17 39.13 36.23 59.51 0.167 0.405 ndhE 33.33 41.18 32.35 26.47 59.06 0.144 0.316 atpB 42.62 53.91 41.68 32.26 47.43 0.192 0.381 ndhG 34.46 44.07 32.77 26.55 45.77 0.125 0.250 rbcL 44.14 57.11 43.93 31.38 50.19 0.271 0.454 ndhI 34.99 37.57 38.67 28.73 52.09 0.171 0.345 ycf4 41.22 48.39 39.78 35.48 47.14 0.162 0.385 ndhA 33.98 42.42 36.36 23.14 44.35 0.140 0.321 cemA 33.62 41.99 27.71 31.17 55.91 0.176 0.342 ndhH 37.82 50.76 34.77 27.92 49.95 0.155 0.322 petA 40.29 53.58 35.2 32.09 51.12 0.155 0.331 表 3 梁山慈竹叶绿体基因组中各基因参数的相关性分析Table 3 Correlation analysis of various gene parameters in the chloroplast genome of D. farinosus参数 GC1 GC2 GC3 ENC CAI CBI FOP GC3s GC GC1 1 GC2 0.300* 1 GC3 0.265 −0.009 1 ENC 0.142 −0.425** 0.389** 1 CAI 0.409** 0.076 0.370** 0.012 1 CBI 0.438** 0.272 0.322* −0.092 0.774** 1 FOP 0.402** 0.312* 0.341* −0.064 0.797** 0.965** 1 GC3s 0.271 −0.029 0.946** 0.445** 0.330* 0.330* 0.370** 1 GC 0.814** 0.673** 0.525** 0.010 0.407** 0.512** 0.518** 0.499** 1 说明： *表示显著相关 (P＜0.05)；**表示极显著相关 (P＜0.01)。 2.2 相对同义密码子使用度分析
梁山慈竹叶绿体基因组中共包含18110个密码子(表4)，总计编码20个氨基酸，密码子数为12~705个，其中密码子UGA共有12个，密码子含量最多的是编码谷氨酸的GAA，共有705个。梁山慈竹叶绿体基因组蛋白编码序列RSCU分析表明：氨基酸含量较高的有亮氨酸(Leu)和精氨酸(Arg)，均为6个密码子编码，编码精氨酸的是UUA、UUG、CUU、CUC、CUA和CUG；编码亮氨酸的有AGA、AGG、CGU、CGC、CGA和CGG；除此之外，蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)均只有1个密码子编码，分别是AUG和UGG，其余氨基酸密码子编码个数分别为2~4个。
表 4 梁山慈竹叶绿体基因组蛋白编码序列RSCU分析Table 4 RSCU of protein coding region in the chloroplast of D. farinosus氨基酸 密码子 数量 RSCU 氨基酸 密码子 数量 RSCU 氨基酸 密码子 数量 RSCU 氨基酸 密码子 数量 RSCU Phe UUU* 644 1.29 Tyr UAU* 532 1.59 Ser UCU* 343 1.58 Cys UGU* 151 1.53 Phe UUC 351 0.71 Tyr UAC 137 0.41 Ser UCC* 260 1.19 Cys UGC 47 0.47 Leu UUA* 634 1.94 TER UAA* 28 1.56 Ser UCA* 222 1.02 Arg AGA* 322 1.75 Leu UUG* 362 1.11 TER UAG 14 0.78 Ser UCG 119 0.55 Arg AGG 119 0.64 Leu CUU* 420 1.29 TER UGA 12 0.67 Ser AGU* 273 1.25 Arg CGU* 261 1.41 Leu CUC 138 0.42 Trp UGG* 328 1.00 Ser AGC 89 0.41 Arg CGC 95 0.51 Leu CUA 295 0.90 Gln CAA* 477 1.53 Thr ACU* 403 1.68 Arg CGA* 234 1.27 Leu CUG 107 0.33 Gln CAG 148 0.47 Thr ACC 181 0.75 Arg CGG 76 0.41 Ile AUU* 740 1.48 Glu GAA* 705 1.46 Thr ACA* 259 1.08 Gly GGU* 421 1.24 Ile AUC 295 0.59 Glu GAG 263 0.54 Thr ACG 116 0.48 Gly GGC 145 0.43 Ile AUA 461 0.92 Lys AAA* 647 1.44 Ala GCU* 493 1.73 Gly GGA* 538 1.58 Met AUG* 416 1.00 Lys AAG 253 0.56 Ala GCC 172 0.60 Gly GGG 259 0.76 Val GUU* 382 1.47 Asp GAU* 522 1.54 Ala GCA* 343 1.20 Pro CCU* 286 1.48 Val GUC 126 0.49 Asp GAC 155 0.46 Ala GCG 135 0.47 Pro CCC* 196 1.01 Val GUA* 390 1.50 His CAU* 311 1.47 Asn AAU* 528 1.48 Pro CCA* 209 1.08 Val GUG 139 0.54 His CAC 112 0.53 Asn AAC 187 0.52 Pro CCG 84 0.43 说明：*表示RSCU大于1的高频密码子。 梁山慈竹叶绿体基因组RSCU大于1的密码子数目为34个(分别为UUU、UUA、UUG、CUU、AUU、AUG、GUU、GUA、UCU、UCC、UCA、AGU、ACU、ACA、GCU、GCA、AAU、UAU、UAA、UGG、CAA、GAA、AAA、GAU、CAU、UGU、AGA、CGU、CGA、GGU、GGA、CCU、CCC和CCA)，即筛选出了34个高频密码子，其中以A、U、C、G结尾的密码子分别有13、16、2和1个，这说明密码子偏好以A和U结尾，RSCU较高的3个密码子分别为UUU (1.94)、CUA (1.73)和UCU (1.75)。
2.3 中性绘图分析
中性绘图分析量化自然选择和突变压力之间的关系，阐明3个密码子位置之间的联系。结果表明：横坐标GC3的数值为23.14%~41.23%，纵坐标GC12的数值为39.04%~61.00% (图1)。梁山慈竹的Pearson相关系数为0.17，呈正相关关系，数据拟合后的回归系数为0.1868，决定系数(R2)较小，为0.0282，GC12和GC3的相关性不显著，说明其叶绿体基因组密码子偏好性受自然选择影响较大。
2.4 ENC-plot绘图分析
图2显示：ENC分布并不紧密，少量分布在标准曲线附近，还有个别分布在标准曲线上侧，位点的ENC均大于35，与预期ENC值有差距。说明梁山慈竹密码子偏好性较弱且自然选择和突变都对其偏好性有影响。由于落在标准曲线下方的基因点数量比较多，所以梁山慈竹基因组密码子使用偏好性主要受自然选择的影响。
2.5 PR2-plot绘图分析
图3显示：基因位点在平面图4个区域内分布并不均匀，在A3/(A3+T3)＜0.5和G3/(G3+C3)＞0.5区域范围内分布最多。表明第3位碱基使用频率为：T＞A、G＞C，梁山慈竹叶绿体基因组密码子的第3位碱基在选择上具有偏好性，同时说明其密码子使用偏好性主要受自然选择的影响。
2.6 最优密码子的确定
对梁山慈竹的ENC进行升序排列，前10%为高表达基因，即rps18、rpl16、psbA、rps14、rps11，后10%为低表达基因，即 ycf3、cemA、ndhE、atpE、infA。梁山慈竹的RSCU和ΔRSCU表明(表5)：梁山慈竹叶绿体基因组有32个高频密码子，筛选出GCA、GCU等25个高表达密码子，最终确定18个密码子作为梁山慈竹叶绿体基因组的最优密码子，分别为UAA、GCA、GCU、UUC、GGU、AAA、CUU、UUA、CCA、CCU、CAA、AGA、CGU、AGU、UCC、ACU、GUA、GUU。其中16个以A/U结尾，2个以C结尾。
表 5 梁山慈竹叶绿体基因组各氨基酸的RSCU分析及最优密码子分析Table 5 RSCU analysis and optimal codon analysis of amino acids in chloroplast genome of D. farinosus氨基酸 密码子 基因组
RSCU高表达
RSCU低表达
RSCUΔRSCU 氨基酸 密码子 基因组
RSCU高表达
RSCU低表达
RSCUΔRSCU Ter UAA*** 1.560 0 1.800 0 1.200 0 0.600 0 Met AUG 1.000 0 1.000 0 1.000 0 0 UAG 0.780 0 0.600 0 1.200 0 −0.600 0 Asn AAC* 0.520 0 0.893 6 0.625 0 0.268 6 UGA 0.670 0 0.600 0 0.600 0 0 AAU 1.480 0 1.106 4 1.375 0 −0.268 6 Ala GCA** 1.200 0 1.200 0 0.734 7 0.465 3 Pro CCA** 1.080 0 0.800 0 0.500 0 0.300 0 GCC 0.600 0 0.457 1 0.653 1 −0.196 0 CCC 1.010 0 0.800 0 1.166 7 −0.366 7 GCG 0.470 0 0.228 6 0.734 7 −0.506 1 CCG 0.430 0 0.444 4 1.000 0 −0.555 6 GCU* 1.730 0 2.114 3 1.877 6 0.236 7 CCU*** 1.480 0 1.955 6 1.333 3 0.622 3 Cys UGC** 0.470 0 0.400 0 0 0.400 0 Gln CAA* 1.530 0 1.500 0 1.368 4 0.131 6 UGU 1.530 0 1.600 0 2.000 0 −0.400 0 CAG 0.470 0 0.500 0 0.631 6 −0.131 6 Asp GAC* 0.460 0 0.500 0 0.411 8 0.088 2 Arg AGA* 1.750 0 1.723 4 1.534 9 0.188 5 GAU 1.540 0 1.500 0 1.588 2 -0.088 2 AGG 0.640 0 0.319 1 0.837 2 −0.518 1 Glu GAA 1.460 0 1.189 2 1.578 9 −0.389 7 CGA 1.270 0 1.276 6 1.395 3 −0.118 7 GAG** 0.540 0 0.810 8 0.421 1 0.389 7 CGC 0.510 0 0.319 1 0.837 2 −0.518 1 Phe UUC** 1.290 0 1.041 7 0.650 0 0.391 7 CGG 0.410 0 0.319 1 0.279 1 0.040 0 UUU 0.710 0 0.958 3 1.350 0 −0.391 7 CGU*** 1.410 0 2.042 6 1.116 3 0.926 3 Gly GGA 1.580 0 1.253 7 1.818 2 −0.564 5 Ser AGC 0.410 0 0.384 6 0.470 6 −0.086 0 GGC 0.430 0 0.417 9 0.484 8 −0.066 9 AGU** 1.250 0 1.846 2 1.411 8 0.434 4 GGG 0.760 0 0.119 4 0.363 6 −0.244 2 UCA 1.020 0 0.615 4 1.058 8 −0.443 4 GGU*** 1.240 0 2.209 0 1.333 3 0.875 7 UCC*** 1.190 0 1.769 2 0.941 2 0.828 0 His CAC** 0.530 0 0.941 2 0.571 4 0.369 8 UCG 0.550 0 0.153 8 0.705 9 −0.552 1 CAU 1.470 0 1.058 8 1.428 6 −0.369 8 UCU 1.580 0 1.230 8 1.411 8 −0.181 0 Ile AUA 0.920 0 0.850 7 0.949 4 −0.098 7 Thr ACA 1.080 0 1.181 8 1.176 5 0.005 3 AUC* 0.590 0 0.626 9 0.531 6 0.095 3 ACC 0.500 0 0.818 2 1.058 8 −0.240 6 AUU 1.480 0 1.522 4 1.519 0 0.003 4 ACG 0.480 0 0.363 6 0.588 2 −0.224 6 Lys AAA** 1.440 0 1.471 7 1.155 6 0.316 1 ACU** 1.680 0 1.636 4 1.176 5 0.459 9 AAG 0.560 0 0.528 3 0.844 4 −0.316 1 Val GUA*** 1.500 0 1.767 4 1.257 1 0.510 3 Leu CUA 0.900 0 0.833 3 1.295 5 −0.462 2 GUC 0.490 0 0 1.028 6 −1.028 6 CUC 0.420 0 0 0.545 5 −0.545 5 GUG 0.540 0 0.372 1 0.342 9 0.029 2 CUG 0.330 0 0.250 0 0.477 3 −0.227 3 GUU** 1.470 0 1.860 5 1.371 4 0.489 1 CUU* 1.290 0 1.333 3 1.227 3 0.106 0 Trp UGG 1.000 0 1.000 0 1.000 0 0 UUA*** 1.940 0 2.166 7 1.022 7 1.144 0 Tyr UAC** 0.410 0 0.521 7 0.166 7 0.355 0 UUG 1.110 0 1.416 7 1.431 8 −0.015 1 UAU 1.590 0 1.478 3 1.833 3 −0.355 0 说明: 高频密码子(RSCU＞1.00)带下划线；*. ΔRSCU≥0.08；**. ΔRSCU≥0.3；***. ΔRSCU≥0.5; 加粗的密码子表示最优密码子。 2.7 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析
将梁山慈竹基因组密码子使用频率与巨龙竹、粉麻竹、小叶龙竹、硬头黄竹、大肠埃希菌、烟草、拟南芥和酿酒酵母等物种的基因组密码子使用频率进行比较(图4)。结果显示：梁山慈竹与巨龙竹、粉麻竹、小叶龙竹和硬头黄竹的密码子使用频率为0.5~2.0，说明它们的密码子使用偏好性相似，推测具有亲缘关系的禾本科Gramineae牡竹属植物叶绿体基因组密码子偏好性相似；在大肠埃希菌、烟草、拟南芥和酿酒酵母的密码子使用比值中筛选≥2.0或≤0.5的密码子，分别有28和15、15、14个，表明梁山慈竹与这些物种在同义密码子的偏好性上有一定差异。
图 4 梁山慈竹与其他物种密码子偏好性比较Figure 4 Comparison of codon preference between D. farinosus and other species2.8 对应分析
将梁山慈竹的51个叶绿体基因的基因功能分为光合系统基因、遗传系统基因、其他基因和未知功能基因四大类，在计算RSCU的基础上将各个基因分布到59维的向量空间。对应分析结果(图5)显示：前4个向量轴分别存在18.3%、16.8%、15.6%和15.4%的差异，前4向量轴累计差异为66.1%，4个轴对密码子均有不同程度的影响；第1轴的值大于其他轴，说明第1轴对梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的影响较大。对第1轴与CAI、CBI、FOP、ENC和GC3s等指数进行进一步的相关分析发现：梁山慈竹基因在第1轴上的坐标值与CAI (r=−0.001 7，P＜0.01)、CBI (r=0.099 0，P＜0.01)、FOP (r=0.083 0，P＜0.01)、ENC (r=0.112 0，P＜0.01)、GC3s (r=−0.145 0，P＜0.01)间具有极显著的相关关系，其中CAI和GC3s第1轴具有负相关关系，表明基因组密码子的偏好性不止受单一因素的影响，自然选择、基因突变均有可能影响梁山慈竹基因组密码子使用偏好性[18]。
3. 讨论
本研究对梁山慈竹叶绿体基因组密码子进行使用偏好性分析，筛选出51条CDS序列，分析表明：GC1＞GC2＞GC3，密码子在3个位置上的分布并不均匀，密码子偏好使用以A或U结尾的碱基，且梁山慈竹叶绿体基因组的ENC均值为49.51，表明其叶绿体基因组密码子使用偏好性较弱。这与乳油木Vitellaria paradoxa[19]和二乔玉兰Magnolia soulangeana[20]等植物叶绿体基因组密码子偏好性相似。
对梁山慈竹叶绿体基因组密码子进行中性绘图、ENC-plot分析、PR2-plot分析和对应分析。在中性绘图分析中，回归系数为0.412 8，说明密码子偏好性更多受到自然选择的影响；在ENC-plot分析中，多数基因离标准曲线距离较远，实际ENC和预期ENC有差距，表明该部分基因的密码子偏好性主要受自然选择的影响；在PR2-plot绘图分析中，大部分基因位于平面图的右下方，即T＞A、G＞C，表明其密码子的使用更多受自然选择的影响。综上所述，影响梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的主要原因是自然选择。该研究结果与巨桉Eucalyptus grandi[21]、灰毛浆果楝Cipadessa cinerascens、酸枣Ziziphus jujuba var. spinosa[22]和云南油杉Keteleeria evelyniana[23]等叶绿体基因组密码子偏好性研究结果基本一致；但在对4种蔷薇科 Rosaceae果树[24]和银白杨Populus alba[25]的研究中发现：突变是影响密码子偏好性的主要因素。这说明密码子的使用偏好性受自然选择或基因突变因素影响。基于RSCU的对应分析表明：梁山慈竹的密码子使用变异原因除了突变和自然选择之外，还有其他的因素，这其中光合系统基因和遗传系统基因分布相对集中，各类基因密码子使用偏好性较为接近。该结论与木薯Manihot esculenta[26]和高山松Pinus densata[27]的研究结果一致。密码子使用频率比较结果显示：梁山慈竹与禾本科牡竹属的植物密码子偏好性相似，在基因选择外源系统表达时，可以选择密码子偏好性差异相对较小的酿酒酵母，在选择大肠埃希菌、烟草和拟南芥作为外源表达宿主时，需要根据密码子使用偏好性进行碱基优化，从而使基因在宿主体内更好地表达。
最优密码子分析表明：梁山慈竹叶绿体基因组有GCU、GAU以及GGU等18个最优密码子，最优密码子大部分以A或U结尾。该结果与抽筒竹Gelidocalamus tessellatus[28]和毛竹Phyllostachys edulis[29]叶绿体基因组最优密码子分析结果一致，这可能与亲缘关系相近，但不同物种之间叶绿体基因组进化过程中的相对保守性有关系[21]。通过筛选获取梁山慈竹偏好使用密码子，可进一步对目标基因进行密码子优化，提高梁山慈竹的竹笋产量和造纸纤维含量，以及利用新一代精准基因编辑工具CRISPR/Cas9优化梁山慈竹密码子，从而改造梁山慈竹基因组编辑的Cas9基因，提高该基因在梁山慈竹中的表达水平[30]。
4. 结论
本研究通过分析梁山慈竹叶绿体基因组的CDS序列，对梁山慈竹的叶绿体基因组进行生物信息学分析，筛选出梁山慈竹叶绿体基因组有GCU、GAU以及GGU等18个最优密码子。研究结果表明：影响梁山慈竹密码子偏好性的主要因素是自然选择。研究结果为后续在分子层面上利用基因工程开发梁山慈竹优良资源提供参考。
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图 1 欧洲千里光SvAP1氨基酸多序列比对以及系统进化树分析
Figure 1 Amino acid sequence alignment and phylogenetic tree analysis of SvAP1 in S. vulgaris
图 2 SvAP1在欧洲千里光不同部位的相对表达
Figure 2 Relative expression of SvAP1 in different tissues of S. vulgaris
图 3 野生型及转基因龙葵PCR检测
Figure 3 PCR detection of wild type S. nigrum and different transgenic lines
图 4 野生型和转基因龙葵RT-PCR及表型分析
Figure 4 RT-PCR and phenotypes analysis of wild type S. nigrumand different transgenic lines
图 5 野生型及转基因龙葵花序
Figure 5 Inflorescence in wild type S. nigrum and different transgenic lines
图 6 野生型和转基因龙葵雌蕊及其石蜡切片
Figure 6 Wild type S. nigrum and different transgenic lines pistil and their paraffin section
表 1 基因克隆与分子鉴定所用引物序列
Table 1. Primer sequences for gene cloning and molecular identification
引物名称 正向(反向)引物序列(5′→3′) 引物名称 正向(反向)引物序列(5′→3′) SvAP1-F AATCTAGAATGGGGCGGGGAAGGGTGA NPT Ⅱ-R GTGGTCGAATGGGCAGGTAG SvAP1-R AAGAGCTCTTACTTGTTCATGAGATGAAT qSvAP1-F GTTGTGTGATGCTGACGTGG Sn18s-F CGCGCGCTACACTGATGTATTCAA qSvAP1-R GCGTGTTCCAGAGTCCAGTT Sn18s-R TACAAAGGGCAGGGACGTAGTCAA Sv18s-F ATAGCAGAACGACCTGTGAA NPT Ⅱ-F AGATGGATTGCACGCAGGTTC Sv18s-R GAAGCAAGATCCAACGCAAT 说明：下划线标记处为特异性引物限制性内切酶酶切位点 
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