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绿竹Bambusa oldhami是禾本科Gramineae竹亚科Bambusoideae绿竹属Bambusa的优质笋用竹植物，分布于华南丛生竹林亚区和华中亚热带混生竹林亚区南部，5−10月为产笋期[1-3]。绿竹笋形似马蹄，俗称“马蹄笋”，笋肉细嫩，味道鲜美，深受人们喜爱。由于出笋时期温度较高，加之出笋集中，绿竹笋采后容易发生变质、腐败、木质化，储藏难度较大，限制了产品的流通和销售[4-5]。草酸广泛存在于动植物和真菌体内，具有很强的抗氧化性[6]。适当浓度的草酸溶液可以作为抗氧化剂应用于果蔬的保鲜、储藏与运输等。有研究发现：草酸处理能够有效延缓鲜切香蕉Musa nana[7]、荔枝Litchi chinensis[8]、去皮荸荠Heleocharis dulcis[9]的变质腐败，延长保鲜期。关于外源草酸处理对于采后去壳绿竹笋的抗氧化和木质化的影响尚未被报道。因此，本研究以绿竹笋为对象，研究外源草酸对去壳绿竹笋抗氧化酶和木质化的影响，为竹笋的采后储藏保鲜提供依据。
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供试材料绿竹笋于2017年7月下旬采自浙江省瑞安市，瑞安市地理坐标27°40′~28°00′N，120°10′~120°15′E，全年无严寒酷暑，冬短夏长，四季分明，雨水充沛。全年平均气温17.9 ℃，年平均降水量1 110~2 200 mm，历史年平均降水量1 527.2 mm。挑选外观完好且直径和长度相近的绿竹笋，放置于泡沫箱中6 h内运至实验室。绿竹笋样品切除基部2~3 cm不可食用部分，小心剥除笋壳，用自来水清洗干净沥干，处理组浸入5 mmol·L−1草酸溶液中10 min(该草酸浓度和处理时间为前期预实验获得的最佳处理参数)，对照组浸入自来水保持同等时间，取出沥干后于阴凉通风处晾干，然后放于塑料筐中，套0.5 mm厚度的聚乙烯袋，不封口，置于(6±1) ℃的恒温恒湿箱(Sanyo，MIR-554)中储藏。处理当天取样为T0，随后每天随机取样，取样时间为Tn，n=1、2、3、4、5、6 d，取笋体基部切口位置往上2~4 cm的一段笋肉用于指标测定。每个处理每次取5根笋样，重复3次。
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过氧化氢(H2O2)质量摩尔浓度采用苏州科铭生物技术有限公司过氧化氢试剂盒测定。超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、过氧化物酶(POD)活性参照曹建康等[10]的方法。木质素质量分数参照鞠志国等[11]的方法。4-香豆酸-辅酶A连接酶(4-CL)活性参照毕咏梅等[12]的方法并加以修改。羟基肉桂醇脱氢酶(CAD)活性参照CAI等[13]的方法并加以修改。基因表达量采用大连TaKaRa公司SYBR Premix Ex TapTM(TliRNaseH Plus)Kit测定。
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用Excel进行数据统计分析及图表制作；用SPSS 22进行0.05水平差异显著性分析。
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由图1A可知：草酸处理组与对照组的绿竹笋H2O2质量摩尔浓度在冷藏期间的变化趋势基本一致，总体上呈先上升后下降的趋势，草酸处理组的H2O2质量摩尔浓度在冷藏2~6 d时显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组分别降低了9.2%、8.5%、14.3%、10.2%和12.2%。由图1B和C可知：草酸处理组与对照组的绿竹笋SOD和CAT活性在冷藏期间的变化趋势基本一致，总体上呈先上升后下降的趋势；草酸处理组的SOD活性在冷藏2~6 d时显著高于对照组的SOD活性(P＜0.05)，比对照组分别提高了23.4%、41.5%、18.1%、14.6%和16.4%；草酸处理组的CAT活性在冷藏2~6 d时显著高于对照组(P＜0.05)，比对照组分别提高了20.2%、7.1%、78.4%、29.7%和25.6%。由此表明：外源草酸处理可以提高绿竹笋体内抗氧化酶SOD、CAT的活性，并延缓H2O2的积累。
图 1 低温下草酸对绿竹笋H2O2质量摩尔浓度、SOD和CAT活性的影响
Figure 1. Effects of oxalic acid treatment on H2O2 content, SOD and CAT activities of bamboo shoots at low temperature
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如图2可知：草酸处理组与对照组的绿竹笋木质素质量分数和硬度在冷藏期间的变化趋势基本一致，总体上呈上升趋势。由图2A可知：草酸处理组的木质素质量分数在冷藏的2、3和5 d时显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组分别降低了25.3%、17.3%、12.7%。由图2B可知：草酸处理组的硬度在冷藏的3~5 d时显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组分别降低了30.5%、33.8%、16.5%。由此说明：外源草酸处理可以延缓绿竹笋木质素的积累和硬度的上升。
图 2 低温下草酸对绿竹笋木质素质量分数和硬度的影响
Figure 2. Effects of oxalic acid treatment on lignin content and firmness of bamboo shoots at low temperature
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如图3可知：草酸处理组与对照组的绿竹笋PAL、4-CL、CAD、POD活性在冷藏期间的变化趋势基本一致。如图3A可知：PAL活性总体上呈上升的趋势，草酸处理组的PAL活性在冷藏2~5 d时显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组分别降低了23.3%、25.8%、16.0%、18.2%。如图3B可知：4-CL活性总体上呈先上升后下降的趋势，草酸处理组的4-CL活性在冷藏3 d时显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组降低了26.3%。如图3C可知：CAD活性总体上呈先上升后下降的趋势，草酸处理组的CAD活性在冷藏3~5 d时显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组分别降低了17.7%、17.0%、19.7%。如图3D可知：POD活性总体上呈先上升后下降的趋势，草酸处理组的POD活性在冷藏2~3 d时显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组分别降低了19.9%、21.1%。由此表明：外源草酸处理可以抑制绿竹笋木质素合成关键酶PAL、4-CL、CAD、POD活性的上升。
图 3 低温下草酸对绿竹笋PAL、4-CL、CAD和POD活性的影响
Figure 3. Effects of oxalic acid treatment on PAL, 4-CL, CAD and POD activities of bamboo shoots at low temperature
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如图4可知：草酸处理组与对照组的绿竹笋PAL、4-CL、CAD、POD基因相对表达量在冷藏期间的变化趋势基本一致。由图4A可知：PAL基因相对表达量总体上呈先下降后上升再下降的趋势，草酸处理组的PAL基因相对表达量在冷藏3~5 d时显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组分别降低了37.4%、28.1%、45.4%。由图4B可知：4-CL基因相对表达量总体上呈上升的趋势，草酸处理组的4-CL基因相对表达量在冷藏3~5 d时显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组分别降低了45.0%、17.5%、28.1%。由图4C可知：CAD基因相对表达量总体上呈先上升后下降的趋势，草酸处理组的CAD基因相对表达量在冷藏2~3 d时显著低于对照组(P＜0.05)，比对照组分别降低了34.7%、48.2%。由图4D可知：POD基因相对表达量总体上呈下降的趋势，草酸处理组的POD基因相对表达量略低于对照组，差异不显著(P＞0.05)。由此说明：外源草酸处理可以抑制PAL、4-CL、CAD和POD基因的表达。
图 4 低温下草酸对绿竹笋PAL、4-CL、CAD和POD基因相对表达量的影响
Figure 4. Effects of oxalic acid treatment on PAL, 4-CL, CAD and POD relative expression of bamboo shoots at low temperature
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本研究表明：外源草酸处理可以提高绿竹笋体内抗氧化酶SOD、CAT的活性并延缓H2O2质量摩尔浓度的积累；可以延缓木质素的积累和硬度的上升；既可以抑制绿竹笋木质素合成关键酶PAL、4-CL、CAD、POD活性的上升，又可以抑制PAL、
4-CL、CAD和POD基因的表达；可以减缓绿竹笋的木质化进程，延缓绿竹笋品质的下降，延长绿竹笋的保鲜期。 植物在受到外界逆境胁迫时会产生活性氧(ROS)，导致细胞膜脂过氧化，破坏生物膜的结构和功能，严重则会致使细胞程序性死亡。为了抵御ROS的伤害，植物体会激活体内抗氧化防御系统，提高抗氧化酶的活性，以消除ROS[14−17]。本研究结果显示：在低温储藏下，草酸处理组的去壳绿竹笋笋肉组织中的H2O2质量摩尔浓度显著低于对照组(P＜0.05)，较低的H2O2质量摩尔浓度有助于减轻ROS对笋肉细胞的毒害。草酸处理组的去壳绿竹笋笋肉组织中的SOD和CAT活性显著高于对照组(P＜0.05)。梁春强等[18]研究认为：适合浓度的草酸处理不但可以显著提高氧化酶SOD和CAT的活性，还可以有效降低O2－的生成速率和H2O2的含量。
木质素为植物次生代谢的产物，属酚类化合物，是构成细胞壁次生结构的主要成分。竹笋在采后非常容易老化变质，失去食用价值，其中一个重要的因素就是木质化。木质化主要表现为笋体组织硬度上升，木质素质量分数增加，笋体发生褐变等[19−21]。除了竹笋，茭白Zizania latifolia、芦笋Asparagus officinalis等蔬菜在采后储藏过程中均有木质化的发生[22−25]。本研究发现：低温条件下储藏，草酸处理不但可以抑制绿竹笋硬度的上升，还能够减缓木质素的生物合成，抑制采后去壳竹笋的木质化，维持较好的口感品质，延长竹笋可食用期限。与王琪等[26]研究的采用外源草酸抑制带壳雷竹Phyllostachys praecox笋
木质素的合成累积以及硬度的上升的结论相似。 PAL、4-CL、CAD和POD等4种酶与木质素的合成有密切的关系，其活性的升高都能促进木质素的合成，提高组织的木质化程度。本研究结果表明：低温条件下，经草酸处理的绿竹笋的PAL、4-CL、CAD和POD的活性均低于对照组，草酸处理在总体上明显抑制了去壳绿竹笋的木质素生物合成关键酶的活性。这与沈玫等[27]研究的利用外源草酸抑制带壳绿竹笋PAL和POD活性的结论类似。
果蔬的木质化进程受编码木质素代谢的关键酶基因的表达调控。LU等[28]研究发现：PpCAD1和PpCAD2这2个基因主要调控梨Pyrus pyrifolia的木质素代谢生物合成。不同种类的果蔬，调控木质素合成关键酶的基因也不同，SHAN等[29]研究表明，调控枇杷Eriobotrya japonica的木质素代谢基因主要是EjCAD1、EjPOD、EjPAL2这3个基因。此外，大多数研究人员认为是PAL、4-CL、CAD和POD的活性与其对应基因的表达在协同调控木质素的合成[30−31]。本研究结果表明：草酸处理在冷藏的中后期能够显著抑制去壳绿竹笋的木质素合成关键酶PAL、CAD和4-CL的基因表达水平，可以抑制POD的基因表达水平。结合硬度、木质素质量分数以及对应酶的活性的变化趋势分析可见，PAL、4-CL、CAD基因表达与硬度、木质素质量分数以及酶活性的变化趋势相一致，POD基因表达与硬度、木质素质量分数以及酶活性的变化趋势相反，说明绿竹笋木质素合成关键酶的基因表达和活性变化同步调控木质素的生物合成。LU等[28]研究发现：利用氯化钙可以抑制梨果肉中PpCAD1和PpCAD2基因表达，从而调控木质素的生物合成途径，最终达到抑制梨的硬化的效果，这与本研究结果类似。另外，SEWALT等[32]研究发现，烟草Nicotiana tabacum的PAL基因在受到抑制之后，不但木质素质量分数明显下降，PAL的活性也明显降低。本研究中草酸处理既抑制了木质素代谢关键酶活性，又抑制了对应基因表达水平，从2个方面抑制了去壳绿竹笋笋肉硬度的上升和木质素的累积，延缓了冷藏过程中竹笋食用品质的下降。
Effects of exogenous oxalic acid on antioxidant enzymes and lignification of Bambusa oldhami shoots
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摘要:
目的 研究外源草酸处理对低温下去壳绿竹笋Bambusa oldhami的保鲜效果及其机制。 方法 用5 mmol·L−1草酸浸泡去壳绿竹笋10 min，置于(6±1) ℃下，定期测定去壳绿竹笋的过氧化氢(H2O2)质量摩尔浓度、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性、硬度、木质素质量分数和木质素代谢关键酶(PAL、4-CL、CAD、POD)的活性及其基因表达水平。 结果 5 mmol·L−1草酸溶液浸泡去壳绿竹笋10 min，能够提高去壳绿竹笋组织内SOD和CAT的活性并延缓H2O2的累积，抑制去壳绿竹笋木质素代谢关键酶(PAL、4-CL、CAD、POD)的基因表达水平和活性的上升，并显著降低木质素质量分数和硬度的上升。 结论 外源草酸处理通过抑制木质素代谢和提高抗氧化酶系统阻止去壳绿竹笋采后木质化进程，从而延缓了其冷藏期内品质的下降。图4参32 Abstract:Objective The purpose is to explore the preservation effect and mechanism of exogenous oxalic acid treatment on bamboo(Bambusa oldhami) shoots at low temperature. Method The peeled bamboo shoots were soaked in 5 mmol·L−1 oxalic acid solution for 10 minutes and stored at (6±1) ℃. The effects of oxalic acid treatment on H2O2 content, SOD activity, CAT activity, hardness, lignin content, key enzymes of lignin metabolism (PAL, 4-CL, CAD, POD) activities as well as their gene expression levels were measured regularly. Result Soaking the bamboo shoots in 5 mmol·L−1 oxalic acid solution for 10 minutes increased the activities of SOD and CAT, delayed the accumulation of H2O2, inhibited the increase of key enzymes of lignin metabolism (PAL, 4-CL, CAD, POD) activities and their gene expression level, and significantly reduced the accumulation of lignin and hardness increase in bamboo shoots without sheaths. Conclusion Exogenous oxalic acid treatment can retard the lignification process in bamboo shoots without sheaths by inhibiting lignin metabolism and improving antioxidant enzyme system. Thus, the quality decline during the cold storage could be postponed. [Ch, 4 fig. 32 ref.] -
Key words:
- botany /
- Bambusa oldhami shoots /
- exogenous oxalic acid /
- lignin metabolism /
- antioxidant system
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桂花Osmanthus fragrans为木犀科Oleaceae木犀属Osmanthus，是中国十大传统名花之一，也是园林造景常用植物。根据开花时间不同，桂花可以分为秋桂和四季桂；根据花色差异，秋桂又可以分为丹桂、金桂和银桂。已有研究分析了桂花不同花色品种呈色物质成分，证实类胡萝卜素的种类及其质量分数是决定桂花花色的最主要因素[1−2]。目前，桂花类胡萝卜素的定性定量及其代谢途径中相关催化酶基因已被陆续分离得到[3−5]。桂花不同花色品种花瓣所含的类胡萝卜素中，β-胡萝卜素相对含量最高[1]。桂花番茄红素β-环化酶OfLCYB具备使番茄红素两端环化转化为β-胡萝卜素的能力，且OfLCYB对番茄红素的底物亲和性强于其他番茄红素环化酶，是桂花类胡萝卜素代谢途径中的关键催化酶[6−7]。沈子又等[8]分离得到了OfLCYB基因启动子，发现其启动子序列均包含有TATA-box、CAAT-box响应元件及水杨酸、赤霉素、脱落酸等激素响应元件等，但目前有关桂花OfLCYB基因上游转录因子的筛选及鉴定鲜见报道。
已有研究认为：ERF[9]、MYB[10]、NAC[11]等转录因子参与调控植物类胡萝卜素代谢。AP2/ERF转录因子家族具有众多的家族成员。根据AP2/ERF结构域的数目和序列特征，AP2/ERF家族转录因子分为AP2、ERF、CBF/DREB、RAV和Soloist这5个亚组，其中ERF类转录因子仅含有1个AP2/ERF结构域。ERF转录因子通过结合下游靶基因的GCC (GCCGCC)或DRE (CCGAC)序列[12]调节基因的表达，参与调节植物生长发育、生物或非生物胁迫应答、调控果实成熟等。此外，在拟南芥Arabidopsis thaliana[9]、番茄Solanum lycopersicum[13]和苹果Malus domestica[14]中还发现B2亚组的ERF转录因子具有调控植物类胡萝卜素合成的功能。拟南芥B2亚组ERF转录因子包括At3g16770.1(AtERF72/AtRAP2.3)、At1g72360.2 (AtERF73)、At1g53910.1 (AtERF74/AtRAP2.2)等5个成员。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。在黄龙胆Gentiana lutea[16]中，GlLCYB、GlLCYE、GlZEP、GlPDS、GlZDS、GlBCH基因的启动子上均存在ATCTA作用元件，说明ATCTA元件广泛存在于类胡萝卜素合成基因启动子上，表明B2亚组的ERF转录因子可能对一系列类胡萝卜素代谢基因具有调控作用。
本研究以桂花丹桂品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhong Gui’为材料，首先对OfLCYB基因启动子的ATCTA顺式作用元件进行分析，再对桂花B2亚组的ERF转录因子基因进行序列分析和表达分析，利用酵母单杂交技术筛选和鉴定与OfLCYB互作的关键B2亚组的OfERF转录因子，不仅可以扩展桂花花色研究领域，同时为揭示桂花类胡萝卜素代谢的调控网络提供理论依据，为桂花品种培育和种质创新提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料
选择浙江农林大学桂花资源圃生长状况良好的地栽桂花品种‘堰虹桂’为材料，分别采集‘堰虹桂’的新鲜嫩叶以及顶壳期(S1)、铃梗期(S2)、初花期(S3)、盛开期(S4)的花瓣样品[17]，每个样品3次生物学重复，取样时间均为10:00。上述叶片与花瓣样品快速采集后放入液氮冷冻，随后保存于−80 ℃超低温冰箱，供后续使用。
1.2 方法
1.2.1 OfLCYB启动子序列分析、克隆及OfLCYB基因表达分析
根据诺禾致源的Ultraclean plant DNA purification Kit试剂盒操作说明提取‘堰虹桂’的嫩叶鲜样DNA。借助PlantCARE数据库(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )分析启动子顺式作用元件。根据OfLCYB的启动子序列信息[8]设计引物，以‘堰虹桂’嫩叶DNA为模板扩增得到其启动子。以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以OfLCYB基因序列设计表达引物，以桂花OfACT基因[18]为内参基因，按照TB Green® Premix Ex TM TapⅡ说明进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析。引物序列见表1。利用参照基因的2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。表 1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences引物名称 引物序列(5′→3′) LCYB-PRO-GW-F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGCTTCTTGTTGTTGTACG LCYB-PRO-GW-R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCAATTTTGGCATGTTCTTAG OfLCYB-qF GAAAGGAGACGCCAAAGGGAG OfLCYB-qR GGAAGAAATAGCCGAGATGATAAGA 说明：小写字母表示部分attB序列。 1.2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
使用天根公司RNA perp Pure Plant Kit试剂盒，根据产品说明提取‘堰虹桂’不同时期的花瓣RNA。随后用紫外分光光度计和质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量。按照PrimeScriptTM RT Master Mix说明书将检验合格的盛花期RNA进行反转录。
应用Prot-Param在线软件 (
http://web.expasy.org/protparam/ ) 预测所编码蛋白的分子量、理论等电点、不稳定系数等；采用MEGAX软件中的邻位相邻法(NJ)进行同源聚类，建立系统发育树，并采用Bootstrap法(重复1 000次) 评估检测系统进化树。运用DNAMAN 7.0对4个OfERF基因推测所得的序列进行多序列比对分析。1.2.3 B2亚组OfERFs表达分析
以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以筛选得到的桂花B2亚组OfERFs序列设计引物，以桂花OfACT为内参基因。分析方法参照1.2.1。引物序列见表2。
表 2 OfERFs基因RT-qPCR引物序列Table 2 RT-qPCR primer sequences of OfERFs引物名称 引物序列(5′→3′) 引物名称 引物序列(5′→3′) OfERF73a-qF CTGAAGAGAAACCGCCAACAA OfERF72a-qR GGGTAGTAAACTTCTTGTTGCTGCGTA OfERF73a-qR TTAACGCCATCAGAAGACACAAGT OfERF72b-qF CAAATATCCTATGTTCAGAGG OfERF73b-qF AATTGGGATGCCGCCTCA OfERF72b-qR ATAGCATACCATAACATACCA OfERF73b-qR TTAAATCCCACCAAACATAGCACT OfACT-qF CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT OfERF72a-qF CCAACCCCACCGGCTC OfACT-qR ACCCCATCACCAGAATCAAGAA 1.2.4 OfERFs与OfLCYB启动子酵母互作验证
通过Gateway方法构建pAbAi-OfLCYB-pro载体，之后利用限制性内切酶BstB I线性化质粒pAbAi-OfLCYB-pro、阳性对照p53-AbAi以及阴性对照pAbAi载体。按照Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 User Manual产品说明制备酵母感受态，并将线性化的质粒转入感受态细胞中，涂布于尿嘧啶缺陷培养基(SD/-Ura)酵母板筛选培养基上，28 ℃倒置培养2~3 d。挑取单菌落扩大培养，提取酵母DNA。以粗提酵母DNA为模板，进行PCR检验。用质量分数为0.9% 的无菌氯化钠溶液稀释菌液，D(600)=0.002时，均匀涂布于金担子素A (AbA)不同浓度的SD/-Ura固体培养基上，倒置于28 ℃培养箱内培养2~3 d，以检测AbAr基因本底表达水平。将pGADT7-OfERF72a、pGADT7-OfERF72b、pGADT7-OfERF73a、pGADT7-OfERF73b和pGADT7-53、pGADT7分别转入诱饵菌株pAbAi-OfLCYB-pro和阳性对照p53-AbAi、阴性对照pAbAi的酵母感受态细胞，悬浮液均匀涂布于SD/-Leu缺陷培养基上，倒置于30 ℃培养箱内培养3~5 d，再将长出的单菌落分别在亮氨酸缺陷培养基(SD/-Leu)与含300 μg·L−1的亮氨酸缺陷培养基[SD/-Leu/AbA(300 μg·L−1)]点斑检测其互作情况。
2. 结果与分析
2.1 OfLCYB启动子序列分析及表达分析
由图1可见：桂花OfLCYB基因启动子序列含有2个ATCTA顺式作用元件。
图 1 OfLCYB启动子的ATCTA顺式作用元件分析Figure 1 Analysis of ATCTA cis-acting elements of the OfLCYB promoter通过荧光定量检测‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfLCYB的表达水平(图2)，发现OfLCYB的表达量从顶壳期到盛开期逐渐升高，在盛开期表达量最高。
图 2 OfLCYB在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 2 Expression of OfLCYB at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
通过对桂花转录组数据库分析，筛选获得4个B2亚组ERF有关的Unigene序列。利用MEGAX软件对4个桂花OfERFs氨基酸全长和拟南芥ERF家族的122个成员的氨基酸序列构建系统进化树，结果显示：4个桂花OfERFs与5个拟南芥ERF序列聚集在B2亚组(图3)。其中CL2088.Contig2和CL2088.Contig3聚为一小支，与拟南芥At3g16770.1 (AtERF72)的关系最为接近，将CL2088.Contig2和CL2088.Contig3分别命名为OfERF72a和OfERF72b。此外，CL550.Contig3、Unigene4342与拟南芥At1g72360.2 (AtERF73)关系较近，将CL550.Contig3和Unigene4342分别命名为OfERF73a和OfERF73b。
图 3 桂花B2亚组OfERFs系统发育分析Figure 3 Phylogenetic analysis of OfERFs in subgroup B2 of O. fragrans多序列比对分析发现(图4) ：4个OfERF基因均包含1个AP2保守结构域。4个OfERFs蛋白序列的基本理化性质(表3)分析发现：OfERF72a基因的氨基酸数量为232个，分子量为26 144 Da；OfERF72b基因的氨基酸数量为228个，分子量为25 841 Da；OfERF73a基因的氨基酸数量为386个，分子量为43 632 Da；OfERF73b基因的氨基酸数量为375个，分子量为41 607 Da。4个OfERF的理论等电点为4.63~5.33，均属于偏酸性蛋白质；总平均亲水指数均为负值，都属于亲水性蛋白。OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a不稳定系数分别为43.67、54.42、43.21，判断为不稳定的蛋白质；OfERF73b不稳定系数为38.40，判断为稳定的蛋白质。
图 4 B2亚组OfERFs氨基酸序列比对分析Figure 4 Amino acid multiple sequence alignment analysis of OfERFs of subgroup B2表 3 B2亚组OfERFs基本理化性质分析Table 3 Analysis of basic physicochemical properties OfERFs of subgroup B2基因名称 氨基酸数量/个 分子量/Da 理论等电点 不稳定系数 总平均亲水指数 OfERF72a 232 26 144 5.33 43.67 −0.744 OfERF72b 228 25 841 5.30 54.42 −0.796 OfERF73a 386 43 632 4.63 43.21 −0.739 OfERF73b 375 41 607 5.01 38.40 −0.710 2.3 B2亚组OfERFs表达分析
利用RT-qPCR技术分析‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b相对表达量(图5)发现：从顶壳期到盛开期，OfERF72a、OfERF72b的相对表达量基本呈现逐渐下降的趋势，OfERF73a的相对表达量在顶壳期、铃梗期与盛花期之间差异较小，在初花期相对表达量略有下降。OfERF73b的相对表达量在顶壳期、铃梗期较高，随后在初花期相对表达量显著下降(P＜0.05)。
图 5 B2亚组OfERF在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 5 Expression of OfERF genes of subgroup B2 at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’为了验证OfERFs与OfLCYB之间的关系，用y表示OfERFs的相对表达量取以10为底的对数，用x表示OfLCYB相对表达量取以10为底的对数进行相关性分析(图6)。其中，OfERF72a直线回归方程为y= − 0.987 6x − 0.010 0，决定系数(R2)为0.933 6，P=0.033 8；OfERF72b直线回归方程为y= − 1.208 0x − 0.077 9，R2=0.941 6，P=0.029 6。OfLCYB的表达水平与OfERF72a、OfERF72b呈显著负相关。
图 6 OfERFs与OfLCYB相对表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis of relative expression levels of OfERFs with OfLCYB2.4 酵母单杂交分析B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子互作
为了探究B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子之间是否存在物理互作，同时将阴性对照pAbAi+pGADT7、阳性对照p53-AbAi+pGADT7-Rec-p53以及实验组pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF分别接种于SD/-Leu与SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)的酵母培养基上，于30 ℃倒置培养3~5 d。结果发现(图7)：在SD/-Leu培养基上，酵母均能正常生长，而在SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)培养基上，只有阳性对照与pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF72b正常生长，其余酵母菌均不能生长，表明OfERF72b可以与OfLCYB启动子物理结合。
图 7 OfERF蛋白与OfLCYB启动子互作验证Figure 7 Verification of physical interaction between OfERF proteins and OfLCYB promoter3. 讨论
本研究得到4个桂花‘堰虹桂’B2亚组的OfERFs基因，编码区长度为687~1 161 bp，编码228~386个氨基酸残基。拟南芥B2亚组ERF At1g53910.1、At1g72360.2、At2g47520.1、At3g14230.1以及At3g16770.1分别编码358、262、171、397和248个氨基酸残基[15]。牡丹Paeonia suffruticosa ERF家族中B2亚组基因PsERF1编码区长度为1 158 bp，编码385个氨基酸残基[19]。在番木瓜Carica papaya中，属于B2亚组的基因CpERF4、CpERF6、CpERF9则分别编码431、253、234个氨基酸残基[20]。而在番茄ERF中，其B2亚组的SlERF6、SlERF.E.1、SlERF90、SlERF91、SlERF.A.3分别编码255、260、386、1 454和372个氨基酸残基[21]。由此可以发现：同一物种B2亚组ERF基因编码不同长度的氨基酸序列，推测其不同成员的功能存在差异。
对4个桂花OfERFs基因的氨基酸序列进行系统进化分析，发现OfERFs与拟南芥B2亚组ERF聚集在一起，说明它们的同源性较高。其中2个基因与At3g16770.1 (AtERF72/AtRAP2.3)聚为一支，2个基因与At1g72360.2 (AtERF73/AtRAP2.2)聚为另一小支。据此将4个OfERFs基因分别命名OfERF72a与OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b。桂花OfERF72与OfERF73均存在2个拷贝，说明桂花OfERF基因家族成员在进化和扩张过程中与基因重复事件有着紧密联系。在拟南芥中，AtERF72能够与缺铁反应基因IRT1、HA2和CLH1的启动子区域结合，负调控拟南芥的缺铁响应。与野生型植株相比，AtERF72突变体中铁和镁质量分数显著增加[22]。AtRAP2.3的同源基因SlERF6被证实是番茄中类胡萝卜素合成的负调控因子[13]。此外，在苹果中也有研究证明：AtRAP2.3的同源基因AP2D15可以负调控苹果PSY1和PSY2基因启动子序列中的ATCTA顺式作用元件[14]。拟南芥AtRAP2.2可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上调控基因的表达，过表达AtRAP2.2后导致植物体内类胡萝卜素降低[15]。
桂花花瓣中主要类胡萝卜素为β-胡萝卜素，其生物合成由OfLCYB直接催化生成，是桂花花瓣中类胡萝卜素代谢的重要催化酶[23]。OfLCYB基因启动子中存在2个ATCTA顺式作用元件，推测其响应B2亚组ERF转录因子的调控。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。进一步研究发现：OfERF72a和OfERF72b的表达趋势与OfLCYB基因呈显著负相关。酵母单杂交结果表明：OfERF72b与OfLCYB启动子存在物理结合，表明B2亚组的OfERF72b可能通过结合OfLCYB基因启动子ATCTA顺式作用元件调控其表达。ATCTA元件也存在于桂花OfPSY[24]和OfCCD1[25]等其他类胡萝卜素代谢基因的启动子上，其是否响应B2亚组的ERF转录因子的调控需要进一步研究。
4. 结论
本研究基于桂花‘堰虹桂’转录组数据筛选了4个OfERF基因，OfERF72a与OfERF72b基因表达量均随着开花进程逐渐下降，与OfLCYB基因的表达量显著负相关。OfLCYB基因启动子含有2个ATCTA顺式作用元件，OfERF72b与OfLCYB启动子之间存在互作，表明OfERF72b可能参与调控OfLCYB的表达。
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图 1 低温下草酸对绿竹笋H2O2质量摩尔浓度、SOD和CAT活性的影响
Figure 1 Effects of oxalic acid treatment on H2O2 content, SOD and CAT activities of bamboo shoots at low temperature
图 2 低温下草酸对绿竹笋木质素质量分数和硬度的影响
Figure 2 Effects of oxalic acid treatment on lignin content and firmness of bamboo shoots at low temperature
图 3 低温下草酸对绿竹笋PAL、4-CL、CAD和POD活性的影响
Figure 3 Effects of oxalic acid treatment on PAL, 4-CL, CAD and POD activities of bamboo shoots at low temperature
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20190337
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