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氧气约占大气成分的21%，是大多数多细胞生物维持生命的必需元素，包括真菌、动物和植物。生物不仅需要氧气作为末端电子受体，以确保通过氧化磷酸化产生能量，而且在大多数代谢反应中，氧气也充当主要底物[1]。当植物生长对氧气的需求超过环境氧气的供应时，植物细胞中氧气浓度便会降低，造成缺氧。在生产中，缺氧一般是由土壤板结、淹水等因素造成的，表现为植物根系和其他器官中的氧浓度降低[2-3]。缺氧会对植物生长造成胁迫，改变植物的代谢水平，降低作物的产量[4]。缺氧会影响植物的生物量积累、激素含量、各类酶活性、细胞结构及过氧化物的产生。如ANNALISA等[5]研究发现：在缺氧条件下，拟南芥Arabidopsis thaliana细胞中活性氧(ROS)含量急剧增加，其体内过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性降低。缺氧同时也会造成乙烯在植物根系的积累，如鹰嘴豆Cicer arietinum、蚕豆Vicia faba、水稻Oryza sativa等植物淹水后根系乙烯显著积累[6-7]，参与乙烯合成的2个基因ACS1和ACO5相对表达显著增加[8]。在水稻中，脱落酸(ABA)含量会因淹水降低[9]，而赤霉素(GA)含量显著升高[10]，说明氧气在植物的各个生理过程中都起到重要作用。在长期进化过程中，植物体也有一定的适应手段来应对缺氧的胁迫。植物在缺氧条件下，会降低自身新陈代谢的水平，如淀粉、蛋白质和脂质等代谢[3,11]。水稻[12]、玉米Zea mays [13-14]和小麦Triticum aestivum [15]等能通过在根系形成通气组织从而适应缺氧环境，特别是水稻还可以在茎秆内形成通气组织[16], 从而在淹水条件下正常生长。水稻的通气组织是由乙烯诱导，通过细胞程序性死亡和皮层细胞溶解所形成的[17]。在淹水条件下，大气中的氧气是植物体内氧气的重要来源，如芦苇Phragmites australis [18]和水稻[19]，能通过通气组织将氧气输送至地下部分，从而使得它们在长期淹水的土壤中依然能正常生长。雷竹Phyllostachys violascens属禾本科Gramineae中小型散生竹类，是一种重要的笋用竹种，喜湿润，怕积水[20]。自20世纪90年代以来，覆盖增温技术在生产中得到大面积推广应用，使雷竹笋在经济价值较高的时候大量上市，显著提高了农户的经济收入，然而长期林地覆盖经营却会引起雷竹林退化[21-22]。覆盖物的阻断加上土壤中微生物大量消耗有机物质，使得雷竹林地土壤中的氧气含量降低。有学者研究表明：竹鞭上浮可能是对覆盖技术引起的土壤缺氧的适应性反应[23]。那么氧气的缺乏会对雷竹生长造成什么的影响？雷竹为适应缺氧会做出如何的响应？对于其他禾本科植物，如水稻等，其生长与氧气之间的联系研究多且较深入[24-26]，但竹子生长与氧气的关系研究鲜有报道。本研究以雷竹水培苗为材料，比较分析叶面积、生物量、光合色素质量分数和抗氧化酶活性等生长及生理指标以及根系结构变化，研究缺氧对雷竹生长的影响，初步探究雷竹对缺氧的适应性机制，为雷竹在生产实践中可能退化的原因提供理论参考。
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2018年6月从大田中挖取雷竹小苗，带回温室进行水培驯化，待其适应水培条件后，剪取基部萌蘖生长的雷竹苗进行培养扩繁。2019年6月筛选其中长势均一的无性系雷竹水培苗作为试验材料[苗质量(1.446±0.186) g·株−1]。
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试验于 2019 年 7−9 月，在浙江农林大学智能温室进行。以黑色圆桶(直径179 mm，高178 mm，容量为3 L)为培养容器，1/2木村B营养液(pH 5.6)为培养液，培养雷竹苗。每个容器分别装有营养液2.5 L，每盆培养6株雷竹水培苗，共3个重复。隔5 d更换1次营养液，培养时间为2个月。同时设置土培苗作为对照。于试验开展前通过流量计调节通气泵气体流速，控制营养液中溶解氧质量浓度，得出流速为0、6、27、55、400 mL·min−1，分别对应的溶解氧质量浓度约为0、2、4、6、8 mg·L−1，因此设置0、2、4、6、8 mg·L−1等5个处理组(图1)。为保证处理前营养液中溶解氧的一致性，用氮气充入营养液将其中的氧气去除，持续15 min使处理前营养液中溶解氧质量浓度为0 mg·L−1。
图 1 处理期间各组溶解氧质量浓度变化
Figure 1. Changes in dissolved oxygen concentration of each group during treatment
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试验期间，于每日中午12:00，采用光纤式氧气测量仪(Firesting O2, Pyro Science, 德国)测定。
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生物量增加值：实验前用吸水纸吸干根系表面的水分后，称取雷竹水培苗植株的鲜质量(精确至0.001 g)，试验结束后再用吸水纸吸干根系表面的水分，称量植株鲜质量，求前后差值，重复3次。叶面积：利用统一的A4打印纸按竹叶轮廓描下成熟竹叶形状，带回实验室按轮廓剪下分别称量，记为A；另外，剪取面积为100 cm2大小的正方形A4纸张，称取其质量，记为B，每盆描9片竹叶，重复3次，叶面积(S，cm2)计算公式为：S= 100×A/B。
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取成熟的雷竹水培苗叶片，去叶脉并剪碎，称取0.3 g，加入2 mL预冷的50 mmol·L−1的磷酸缓冲液(pH 7.8)，迅速冰浴研磨成浆，并用磷酸缓冲液冲洗研钵，定容至8 mL，离心 20 min(4 ℃，8 000 r·min−1)，取上清液于0~4 ℃下保存备用，供抗氧化酶活性测定。超氧化物歧化酶(SOD)采用南京建成生物工程研究所研制的SOD酶活(植物)试剂盒进行测定。过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法测定[27]。过氧化物酶(POD)采用愈创木酚法测定[28]。抗坏血酸过氧化物酶(APX)参照 YOSHIYUKI 等[29]的方法进行测定。以上酶活性测定均重复3次。叶绿素质量分数测定：成熟叶片用去离子水洗净并用吸水纸擦干，去除叶脉并剪碎，称取0.1 g，置于10 mL离心管内，采用体积分数95%乙醇浸提法测定[30]，重复3次。根系活力测定：取根尖样品洗净，用吸水纸吸附表面水分后称取 0.5 g，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定[31]，重复3次。
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取长度约10 cm的根系，将根系分为4段(距离根尖0.5~1.5、2.5~3.5、4.5~5.5、6.5~7.5 cm)，迅速平整埋入未凝固的体积分数4%琼脂糖溶液，冷却凝固后取出置于全自动振动切片机上切取根系横截面，厚度为100 µm，利用光学显微镜观察拍摄，最终通过ZEN软件分析图像计算通气组织于根系横截面的占比。重复3次。
以上所有指标均于处理2个月后统一测定。
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试验中所测定的原始数据采用Excel整理后经SPSS 21.0软件进行方差分析，利用Origin 2018软件进行作图。文中小写字母表示在P＜0.05水平上差异显著。
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随着营养液中溶解氧质量浓度的升高，雷竹水培苗的生物量和叶面积也逐渐增加(图2)。同时 6和 8 mg·L−1处理组中的植株生物量积累显著低于对照(即土培雷竹苗) (图2A)。在0 mg·L−1处理组中，雷竹水培苗生物量积累分别仅为对照和8 mg·L−1处理下的3.9%和5.7%(图2A)。6和8 mg·L−1处理组中的植株叶面积无显著差异。0 mg·L−1处理组中的雷竹水培苗叶面积仅为对照和8 mg·L−1处理下的47.2%、48.2%(图2B)。说明溶解氧的缺乏会影响雷竹的生长，并且从生物量的积累上最直接反映出来。
图 2 不同溶解氧质量浓度对雷竹水培苗生物量积累和叶面积的影响
Figure 2. Effects of different dissolved oxygen concentration on biomass accumulation and leaf area of hydroponic Ph. violascens seedlings
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光合作用是植物有机物合成的重要途径，光合作用的强弱可以部分从叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素等光合色素质量分数反映出来。由图3可知：雷竹水培苗叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素质量分数均随溶解氧质量浓度的升高而增加，6、8 mg·L−1处理和对照之间叶片3种色素质量分数均无显著差异，类胡萝卜素与叶绿素b在4和6 mg·L−1处理之间也无显著差异(图3B和图3C)。0和2 mg·L−1处理组中的雷竹水培苗叶片各光合色素质量分数均显著低于其余处理组(P＜0.05)(图3B和图3C)。
图 3 不同溶解氧质量浓度对雷竹水培苗根系活力和光合色素的影响
Figure 3. Effects of different dissolved oxygen concentration on the root activity and the content of photosynthetic pigments of hydroponic Ph. violascens seedlings
根系是植物吸收水分和矿质元素的主要器官。根系活力是判定植物对水分及矿质元素吸收能力的指标，可以说明植物与外界物质交换及生长等的活跃程度。雷竹水培苗根系活力随溶解氧质量浓度的升高而逐渐提高(图3D)，其中土培状态下的雷竹苗根系活力最高，约为 0 mg·L−1处理组的 5.4 倍。8 mg·L−1处理组中水培苗根系活力显著高于其他处理组(P＜0.05)，且 6 mg·L−1处理组和4 mg·L−1处理组之间也存在显著差异(P＜0.05)。当溶解氧质量浓度小于2 mg·L−1时，雷竹水培苗根系活力较低。
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超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等抗氧化酶具有将体内产生的过氧化物转换为毒害较低或无害的物质的功效，它们可以作为植物受到某种胁迫后的生理响应指标。在处理2个月后，SOD、CAT、POD和APX活性变化趋势均保持一致(图4)，即随着溶解氧质量浓度的升高，雷竹水培苗叶片内4种抗氧化酶也逐渐升高。溶解氧质量浓度为8 mg·L−1时，叶片SOD、CAT、POD和APX活性均达到了峰值，分别为0 mg·L−1处理组的5.90、5.12、3.80和4.03倍(图4)。除8 mg·L−1处理组和对照组的CAT活性没有显著差异以外(图4B)，8 mg·L−1处理组其余 3 种酶活显著高于(P＜0.05)对照组(图4A、图4C、图4D)。当溶解氧质量浓度高于6 mg·L−1时，水培苗叶片中4种抗氧化酶活性均显著高于(P＜0.05)溶解氧质量浓度较低的处理组中的酶活性。
图 4 不同溶解氧质量浓度对雷竹水培苗叶片SOD、CAT、POD、APX活性的影响
Figure 4. Effects of different dissolved oxygen concentration on SOD, CAT, POD, APX activity in the leaves of hydroponic Ph. violascens seedlings
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经过2个月的不同溶解氧质量浓度处理，水培苗根系距根尖10 mm以后的部位均不同程度地形成了通气组织。离根尖的距离越远，通气组织形成就越多。在距根尖70 mm处根系横截面通气组织占总面积的比例随氧气质量浓度的增加而降低，最高达到了7.1%；距根尖50 mm处也呈现相似的趋势，但2 mg·L−1处理通气组织占比要高于0 mg·L−1处理；在距根尖30 mm处却呈现了随溶解氧质量浓度升高而先升高后下降的趋势，且在4 mg·L−1处理中达到了峰值，8 mg·L−1处理组中雷竹水培苗根系在距根尖30 mm处便已没有通气组织的形成。虽然0 mg·L−1处理略低于2 mg·L−1处理，但两者之间并无显著差异；所有处理在距根尖10 mm处均无通气组织的形成，且对照处理中雷竹水培苗根系所有位置均无通气组织形成(图5A)。
图 5 不同溶解氧质量浓度对雷竹水培苗根系距根尖10、30、50、70 mm处通气组织面积占比和形成数量的影响
Figure 5. Effects of different dissolved oxygen concentrations on the percentage and the number of aerenchyma of root cross-sectional area at 10，30，50，70 mm from the tips of roots of hydroponic Ph. violascens seedlings
通气组织数量与面积占比变化趋势不同，其在所有位置均呈现随着氧气质量浓度的升高而先升高后下降的趋势。在50和70 mm处通气组织数量随氧气质量浓度升高而增加，但在溶解氧质量浓度达到8 mg·L−1时雷竹水培苗根系中形成的通气组织数量却显著低于6 mg·L−1处理组(P＜0.05)，50和70 mm处，8 mg·L−1处理中根系分别仅形成10和21个；30 mm处通气组织数量随溶解氧浓度升高先增加后下降，在4 mg·L−1处理组中达到峰值(17个)，后在8 mg·L−1处理中降为0(图5B)。
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在植物进行正常生理代谢和生长发育的过程中，氧气是必不可少的重要因素。在氧化磷酸化过程中氧是呼吸链电子传递的最终受体，它驱动能量物质的合成以供植物生长发育所需[31]。当外界氧气供应不足时，植物的生理生态会受到直接影响。国内外有许多学者已经对氧气与各类作物生长的关系进行了较深入的研究，如在水稻和玉米中，均发现缺氧对植株生长造成了不同程度的负面影响[32-34]。在缺氧处理后，番茄Solanum lycopersicum植株的株高、根系长度、根系数量、生物量积累及光合色素含量均低于正常生长的番茄幼苗，而增氧处理则会促进植株的生长，甚至高于正常培养的番茄植株[33,35]。在对小麦[36]和水稻[19]的研究中有相似的结果。低氧使得植物生物量积累降低, 高氧提高生物量积累。本研究发现：随着营养液中溶解氧质量浓度的升高，雷竹水培苗生物量积累、叶面积和根系活力均升高。在溶解氧质量浓度较低时，雷竹水培苗中的这几项指标均在较低的水平。植物为适应低氧或缺氧环境，存在着几种不同的适应机制，其中包括降低生长速率[12]。雷竹水培苗在缺氧状况下光合色素质量分数显著减少，光合能力的降低，最终导致生物量积累的减少，可见缺氧抑制了雷竹的生长。此外，在0 mg·L−1溶解氧处理中雷竹水培苗各项指标都降至较低的水平，可见尽管在此实验中所采用的雷竹水培苗经过水培驯化，竹鞭退化，根系大量生长于茎秆基部，具备了一定的耐淹水能力，但缺氧对水培苗依旧造成了不利的影响。水培试验持续时间为2个月，若处理时间继续延长，则缺氧处理组中的水培苗亦可能存在死亡的威胁。
在 8 mg·L−1处理组中的雷竹水培苗生物量积累和根系活力均显著低于正常土培的雷竹苗。而水稻等作物中，在对照组的基础上再增加氧气浓度却能促进水稻植株的生长。此类情况在雷竹中并未发现，这可能是由于水稻本就属于耐水淹物种，其正常生长的环境本就处于低氧甚至缺氧的状态。有学者研究表明：缺氧环境中, 水稻的根系以无氧呼吸为主, 其产生的能量仅为氧气供应充足时的3%~5%[36-38]，所以提高水稻根际的氧浓度可以大大促进水稻的生长。而雷竹正常生长时，土壤中的氧气可达10%~15%[39]。大气中空气的密度为1.293 g·L−1，可换算得雷竹正常生长于土壤时(包括覆盖及无覆盖)，氧气质量浓度为129.3~193.95 mg·L−1，处于不缺氧的状态，其对氧气的需求远远大于水稻等植物。8 mg·L−1的溶解氧质量浓度可能仍然不是雷竹水培苗生长的最适溶解氧质量浓度。但即便在水中溶解氧质量浓度可以达到土壤中的氧气质量浓度水平，雷竹水培苗的生长亦可能弱于正常生长于土壤中的雷竹苗，因为气体的扩散速度取决于周围的介质。大气中的扩散速度是水中扩散速度的1万倍[40]，也因此在水下的气体交换阻力是大气中的1万倍。在水培条件下，即使营养液中的溶解氧质量浓度达到与土壤中相等的水平，但由于水分的存在，氧气扩散速度大大降低，其进入根系的速率也随之降低，导致雷竹水培苗根系对氧气的吸收利用率下降，无法达到与在未淹水土壤中相等的水平。
在植物体中SOD、CAT、POD和APX负责清除ROS[5,41-42]。叶绿体是植物细胞中主要的ROS产生区域，而叶绿体缺少CAT，但存在几种APX同工酶。在叶绿体中，对过氧化氢的清除作用显然以APX最为关键，因为卡尔文循环中某些酶对过氧化氢是高度敏感的，微摩尔浓度的过氧化氢便会强烈抑制它们活性，而这些酶负责了二氧化碳的固定，这也说明了APX在控制过氧化氢水平中的关键作用[43]。有研究也发现，缺氧及低氧会抑制植物体内二氧化碳的固定[32]。在本研究中虽然未检测处理后短时间内的抗氧化酶活性变化，但在8 mg·L−1处理组中CAT、SOD、POD和APX的活性均较高，间接说明在淹水雷竹水培苗体内产生了过量的ROS。低溶解氧处理组中的雷竹水培苗叶片中的ROS出现堆积的情况，影响了雷竹水培苗的生长发育。有研究表明：ROS的积累会导致植株叶绿体的减少，出现叶片褪绿的情况，直接抑制了其光合能力[44]。亦有学者研究表明：ROS会抑制植物根系的生长[45]。可见，ROS的积累也是抑制雷竹水培苗生长的关键因子。
ROS在植物体中的作用是双面的。在水稻和芦苇等耐水淹植物中，即使根际氧浓度处于较低的水平，它们依旧能够正常生长，这主要是由于这些植物具有较强的通气能力。EVANS[17]明确定义了通气组织的概念，它是一种通过促进根与外界环境之间的气体扩散，提高植物的耐淹水能力的植物组织。有学者在水稻和玉米的根系中发现溶生型通气组织的形成，而这都是细胞程序性死亡的结果[17,46]。有研究表明：ROS诱导通气组织的形成[14,47]。可见ROS可能也参与调节雷竹水培苗中的通气组织的形成过程。本研究结果显示：雷竹不定根中通气组织最高仅占根系横截面的7.10 %，然而在水稻根系距离根尖50 mm处可达到30%~40%[48]，玉米中可达到15%~20%[49]。研究表明：不定根中氧气的运输可以大大提高陆生植物在淹水下的存活率[50]，而雷竹水培苗根系中的通气组织面积与水稻及其他植物之间的差距可能便是雷竹并不能如水稻等植物一样高度耐低氧的一部分原因。
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水培条件下，溶解氧质量浓度越高，雷竹水培苗长势越好。在本研究中8 mg·L−1溶解氧处理组中的雷竹水培苗生长最佳，但雷竹水培苗对氧气的需求仍大于8 mg·L−1。缺氧抑制了雷竹水培苗的生长。缺氧诱导了雷竹水培苗根中溶生型通气组织的形成，溶生型通气组织的面积仍然达不到水稻等耐水淹物种的水平。这是雷竹不具备高耐缺氧能力的部分原因。
Effects of different dissolved oxygen concentration on growth, physiology and biochemistry of hydroponic Phyllostachys violascens seedlings
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摘要:
目的 了解溶解氧质量浓度对雷竹Phyllostachys violascens水培苗生长、生理指标及根系结构的影响，初步探究雷竹水培苗对缺氧的适应性机制。 方法 以雷竹水培苗为材料，设置0、2、4、6、8 mg·L−1不同溶解氧质量浓度进行处理，分析不同溶解氧质量浓度对雷竹水培苗生物量积累、叶面积、根系活力、抗氧化酶活性、光合色素质量分数及根系结构的影响。 结果 雷竹水培苗生物量积累、叶面积、根系活力、叶片抗氧化酶活性和光合色素质量分数均随溶解氧质量浓度的升高而显著升高(P＜0.05)。8 mg·L−1处理组中雷竹水培苗叶片超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性达到峰值，分别为746.13×16.67 nkat·g−1、63.13×16.67 nkat·g−1·min−1、59 395.45×16.67 nkat·g−1·min−1和407.46 ×16.67 nkat·g−1·min−1。水培条件下，雷竹水培苗根系中形成溶生型通气组织，其面积占根系横截面面积的百分比随溶解氧质量浓度降低而显著升高(最高达到7.1%)，通气组织个数变化趋势则相反(P＜0.05)。 结论 水培条件下，溶解氧质量浓度越高，雷竹水培苗长势越好，且雷竹水培苗生长对氧气的需求大于8 mg·L−1。水培条件下，缺氧会诱导雷竹根中形成溶生型通气组织，但不足以使其具有高度耐水淹的能力。图5参50 Abstract:Objective This study aims to investigate the effects of dissolved oxygen concentration on growth, physiological indexes and root structure of hydroponic Phyllostachys violascens seedlings, and to explore the adaptive mechanism of hydroponic P. violascens seedlings to hypoxia. Method The hydroponic P. violascens seedlings were used as materials, and the effects of different dissolved oxygen concentrations (0, 2, 4, 6, 8 mg·L−1) on biomass accumulation, leaf area, root activity, antioxidant enzyme activity, photosynthetic pigment content and root structure were analyzed. Result The biomass accumulation, leaf area, root activity, leaf antioxidant enzyme activity and photosynthetic pigment content of hydroponic seedlings significantly increased with the increase of dissolved oxygen concentration(P＜0.05). The activities of SOD, CAT, POD and APX of hydroponic seedling leaves treated with 8 mg·L−1 dissolved oxygen reached the peak, which were 746.13×16.67 nkat·g−1, 63.13×16.67 nkat·g−1·min−1, 59 395.45×16.67 nkat·g−1·min−1 and 407.46×16.67 nkat·g−1·min−1 respectively. Under hydroponic conditions, lysigenous aerenchyma was formed in the roots of hydroponic seedlings, and its percentage of root cross-sectional area significantly increased with the decrease of dissolved oxygen concentration (up to 7.1%), while the number of lysigenous aerenchyma changed in the opposite direction (P＜0.05). Conclusion Under hydroponic conditions, the higher the dissolved oxygen concentration is, the better the growth of hydroponic seedlings can be. The oxygen requirement for the growth of hydroponic seedlings is greater than 8 mg·L−1 . Hypoxia can induce the formation of lysigenous aerenchyma in the root of hydroponic seedlings, but it is not enough to make it highly resistant to flooding.[Ch, 5 fig. 50 ref.] -
Key words:
- silviculture /
- Phyllostachys violascens /
- hydroponic /
- dissolved oxygen /
- hypoxia /
- growth /
- aerenchyma
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甘油脂的从头生物合成途径(de novo glycerolipid biosynthesis)是细胞中最基本的代谢过程。3-磷酸甘油酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)催化甘油脂从头合成的初始步骤，生成的溶血磷脂酸(LPA)在LPA酰基转移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase, LPAAT)的作用下转化为磷脂酸(PA)[1−6]。PA是调节真核生物中多种细胞过程的重要信号分子，也是极性甘油磷脂与中性三酰甘油(TAG)的生物合成前体。在磷酸酶的催化下PA转化为二酰甘油，后者可经脂酰辅酶A-依赖型二酰甘油酰基转移酶(acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferease, DGAT)和(或)磷脂-依赖型二酰甘油酰基转移酶(phospholipid-dependent diacylglycerol acyltransferase, PDAT)作用生成TAG[7−10]。TAG合成能力是油料作物的关键性状，同时与人类肥胖症等疾病密切相关。因而，运用遗传或化学遗传方法操控TAG生物合成，提高油料作物含油量，降低与肥胖症相关联的人类疾病，具有重要实践意义[11−16]。
脂酰基转移酶在TAG生物合成过程中发挥重要作用，但目前对于这类酶的结构与功能的内在关系知之甚少，参与第1步酰化反应的GPAT亦不例外，仅有少量关于其结构与功能关系的报道[17−18]。已知GPAT、LPAAT、磷酸二羟丙酮酰基转移酶(dihydroxyacetone-phosphate acyltransferase, DHAPAT)等脂酰基转移酶均含4个高度保守的结构域，结构域Ⅰ的组氨酸(H)、天冬氨酸(D)，结构域Ⅲ的甘氨酸(G)和结构域Ⅳ的脯氨酸(P)是GPAT催化所必需的；而结构域Ⅱ的精氨酸(R)与结构域Ⅲ的谷氨酸(E)在结合底物3-磷酸甘油中起作用[18−20]。迄今为止，对于保守结构域外的其他氨基酸残基在酰基转移酶活性调控中的作用，及与保守结构域中的氨基酸残基存在的潜在互作关系的了解非常有限。
GPAT9位于植物细胞的内质网，参与膜脂和TAG的生物合成，其功能缺失会导致种子发育异常、油脂合成减弱[20−22]。本实验室前期的酵母遗传互补研究也显示：油菜Brassica napus BnGPAT9的异源表达能够恢复酵母条件致死型双敲除突变体(ZAFU1)因GPAT酶活性缺失引起的生长缺陷。然而，拟南芥Arabidopsis thaliana AtGPAT9却不具备这种互补能力[23−25]，尽管AtGPAT9与BnGPAT9的进化关系密切[26−27]，两者氨基酸序列的一致性高达 94.1%，且两者在4个酰基转移酶保守结构域的氨基酸残基完全一致。因此，可以假设保守结构域之外的某些氨基酸残基对GPAT9的活性起着重要的调节作用。本研究充分利用AtGPAT9和BnGPAT9在酵母异源系统中表现出的不同性质，并结合定点突变与酵母遗传互补技术，剖析单个和多个氨基酸残基改变对GPAT9酶活性的影响，鉴定新的关键活性位点，以深化对脂酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为酰基转移酶的分子改造与结构优化、真核生物中TAG合成途径的改良以及全新TAG从头合成途径的构建提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 序列分析
通过Vector NTI 11.5.4软件对AtGPAT9 (Genebank 登录号: ACT32031.1)和BnGPAT9 (Genebank 登录号: ANV28166.1)的氨基酸序列进行比对。使用TMHMM 2.0和Protter进行跨膜结构域和蛋白质拓扑异构模型预测[28-29]。由I-TASSER预测三维结构[30]。
1.2 基因定点突变
将AtGPAT9和BnGPAT9编码序列分别通过BamH I/XhoⅠ和BamH I/EcoR I双酶切位点克隆至pMD19-T载体，得到新的质粒pMD19-T-AtGPAT9和pMD19-T-BnGPAT9；以之为模板，对AtGPAT9和BnGPAT9进行定点突变。具体方法如下：利用包含突变位点的引物(表1)，PCR扩增整个质粒；质粒DNA经Dpn I消化与纯化后，转入大肠埃希菌Escherichia coli并进行测序分析；序列正确的质粒经BamH I和Xho Ⅰ双酶切后，连接到经相同酶切处理的pYES2-yADH1-Kan V2酵母表达载体，并对产生的重组质粒再次进行DNA测序分析，以确保突变位点的正确性。需要说明的是，选择pMD19-T质粒作为定点突变过程中的中间质粒，而非直接在pYES2-yADH1-Kan V2质粒上进行GPAT9基因的定点突变，是因为后者DNA长度(6 998 bp)是前者(2 660 bp)的2.6倍，采取这样的策略可以降低因PCR扩增时间延长导致潜在的错误碱基出现频率。
表 1 拟南芥AtGPAT9和油菜BnGPAT9定点突变所用的引物序列Table 1 Sequences of the primers used for site-directed mutagenesis of A. thaliana AtGPAT9 and B. napus BnGPAT9突变位点 引物序列 (5′→3′) 突变位点 引物序列 (5′→3′) BnGPAT9(R40S) AGCCTCGTGGCAAGCTCAGCCTGCGTGATTTGCTAGACAT AtGPAT9(N119H) TTTCATTGTTTATCCCTGTACACGCGTTGCTGAAAGGTCAAG BnGPAT9(W85Y) TCTACTTGTTTCCTTTATACTGCTGTGGTGTTGTTGTTAG AtGPAT9(D230N) TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAGCTGAC BnGPAT9(C87F) TTGTTTCCTTTATGGTGCTTTGGTGTTGTTGTTAGATACT AtGPAT9(A235T) TAAGGGACCATGTCCAAGGAACTGACAGTAATCCTCTTCTC BnGPAT9(I102F) TTCTCTTTCCCTTGAGGTGCTTCACTTTAGCTTTTGGATG AtGPAT9(S237N) ACCATGTCCAAGGAGCTGACAATAATCCTCTTCTCATATTTCC BnGPAT9(F109I) CATCACTTTAGCTTTTGGATGGATTATTTTCCTTTCAACG AtGPAT9(D230N/A235T) TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAACTGAC BnGPAT9(T114L) TGGTTTATTTTCCTTTCATTGTTTATCCCTGTACACTCTC AtGPAT9(A235T/ S237N) TAAGGGACCATGTCCAAGGAACTGACAATAATCCTCTTCTCATATTTC BnGPAT9(H119N) TTCAACGTTTATCCCTGTAAATTCTCTCCTGAAAGGTCAG AtGPAT9(D230N/A235T/
S237N)TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAACTGAC BnGPAT9(N230D) GTAGCAAGAAAGTTAAGGGACCATGTTCAAGGAACTGACA AtGPAT9(G332A) CATAAGGCCCGGTGAAACAGCAATTGAATTTGCAGAGAGGG BnGPAT9(T235A) TAAGGAACCATGTTCAAGGAGCTGACAATAACCCTCTTCT AtGPAT9(L335H) GGTCAGAGACATGATATCTCATCGGGCGGGTCTCAAAAAGG BnGPAT9(N237S) CATGTTCAAGGAACTGACAGTAACCCTCTTCTTATATTTC AtGPAT9(P355S) TGAAGTATTCGAGACCAAGCTCCAAGCATAGTGAACGCAAG BnGPAT9(A322G) AAGGCCTGGTGAAACAGGAATTGAGTTTGCAGAGAGGGTC AtGPAT9(T10A) GTACGGCAGGGAGGCTCGTGGCTTCAAAATCCGAGCTTGAC AtGPAT9(S40R) ATGAACCTCGCGGCAAGCTCCGCCTGCGTGATTTGCTAGA AtGPAT9(S11A) CGGCAGGGAGGCTCGTGACTGCAAAATCCGAGCTTGACCTC AtGPAT9(Y85W) ATTTACTTATTCCCACTATGGTGCTTTGGGGTTGTTGTTAG AtGPAT9(S13A) GGAGGCTCGTGACTTCAAAAGCCGAGCTTGACCTCGATCAC AtGPAT9(F87C) CTTATTCCCACTATACTGCTGTGGGGTTGTTGTTAGATACT AtGPAT9(S28A) AACATCGAAGATTACCTTCCTGCTGGTTCTTCCATCAATGAAC AtGPAT9(F102I) TCCTCTTTCCCTTGAGGTGCATCACTTTAGCTTTTGGGTGG AtGPAT9(S30A) GAAGATTACCTTCCTTCTGGTGCTTCCATCAATGAACCTCGCG AtGPAT9(I109F) TCACTTTAGCTTTTGGGTGGTTTATTTTCCTTTCATTGTTT AtGPAT9(S31A) GATTACCTTCCTTCTGGTTCTGCCATCAATGAACCTCGCGGCA AtGPAT9(L114T) GGGTGGATTATTTTCCTTTCAACGTTTATCCCTGTAAATGCG 1.3 酵母遗传转化
条件致死型酵母双突变体ZAFU1[BY4742, gat1Δgat2Δ+(pGAL1::AtGPAT1 Leu2)] [25, 31]，可在半乳糖的培养基上生长，但在葡萄糖培养基上丧失了生长能力。基于菌株ZAFU1建立的酵母遗传互补法对GPAT的鉴定具有很强的专一性[25, 31]，本研究运用它鉴定不同氨基酸残基突变对GPAT9活性的影响。
使用基于醋酸锂的标准方法将重组酵母表达质粒导入菌株ZAFU1感受态细胞[25, 31]，复苏4 h，分别涂布转化液于以葡萄糖(Glu)或半乳糖(Gal)为碳源，不含尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸的培养基(SC-Ura-His-Leu)上， 30 ℃下培养3~5 d。为了准确地比较不同氨基酸残基突变对酶活性的影响，挑取在半乳糖培养基上生长的不同单菌落酵母进行浓度梯度稀释培养实验：从半乳糖培养基上随机挑选生长良好的单菌落至SC-Ura-His-Leu+Gal液体培养基，30 ℃振荡培养1~2 d至光密度[D(600)]为2.000 0~3.000 0，稀释菌液浓度至D(600)为1.000 0、0.200 0、0.040 0、0.008 0和0.001 6，取5 µL接种于SC-Ura-His-Leu+Glu和SC-Ura-His-Leu+Gal固体培养基上，30 ℃培养3~5 d。
1.4 酵母生长曲线测定及油脂分析
30 ℃下，将表达不同GPAT9突变基因的ZAFU1细胞在SC-Ura-His-Leu+Gal液体培养基中培养至D(600)为3.000 0~4.000 0，稀释接种于SC-Ura-His-Leu+Glu液体培养基至D(600)为0.100 0，振荡培养并定时记录D(600)。
将平台生长期收获的细胞在真空冷冻干燥机中干燥，提取酵母总脂质[32]，点样于硅胶板，通过薄层色谱法分离总脂质。喷洒质量浓度为0.05%樱草黄显色剂，在紫外灯下观察板上的脂质，从硅胶中提取TAG，并通过气相色谱法定量分析TAG含量[32]。
2. 结果与分析
2.1 AtGPAT9和BnGPAT9的结构差异
早期研究发现：在酵母中异源表达时，拟南芥AtGPAT9与油菜BnGPAT9表现出不同的活性[23-24]。为了找出潜在的关键活性调控位点，对AtGPAT9与BnGPAT9进行了序列比对。AtGPAT9和BnGPAT9均由376个氨基酸组成，两者序列一致性高达94.1%，4个保守的酰基转移酶结构域和C端内质网定位必需的疏水五肽结构域(−ILARL−)的氨基酸残基完全一致[18, 20]，且在N端都含多个潜在的磷酸化位点，主要由丝氨酸和苏氨酸组成(图1)。它们之间共有22个不同的氨基酸残基，其中11个具有相似的性质。基于TMHMM和Protter的跨膜结构域预测显示：跨膜区结构具有较高相似性，但3个跨膜区域中有7个不同的氨基酸残基(图1)。另外，基于I-TASSER的三维结构预测发现：AtGPAT9和BnGPAT9在40、109、114、119、230、235、237和322位氨基酸残基的不同，可能会引起两者三维空间结构的差异，因此它们成为本研究重点剖析的位点(图2)。
图 1 拟南芥AtGPAT9和油菜BnGPAT9氨基酸序列比对Figure 1 Alignment of the amino acid sequences of A. thaliana AtGPAT9 and B. napus BnGPAT9
图 2 AtGPAT9和BnGPAT9三维结构预测Figure 2 Prediction of three-dimensional structures of AtGPAT9 and BnGPAT92.2 AtGPAT9和BnGPAT9的定点突变
为了明确哪些氨基酸位点对GPAT酶活性起着重要调控作用，据上述AtGPAT9和BnGPAT9中存在的氨基酸残基差异，运用定点突变技术对两者相应位置的氨基酸位点进行相互替代，即将AtGPAT9中的单个或多个氨基酸残基同时替换成与BnGPAT9中相应位置完全相同的氨基酸残基，反之亦然。本研究共构建了58种不同的GPAT9突变基因(表2)。
表 2 AtGPAT9和BnGPAT9中单和多位点氨基酸残基的定点突变Table 2 Site-directed mutagenesis of amino acid residues at single and multiple sites in AtGPAT9 and BnGPAT9单个氨基酸残基突变 AtGPAT9氨基酸残基突变组合 BnGPAT9 AtGPAT9 BnR40S** AtT10A AtF102I/S237N AtY85W/D230N BnW85Y AtS11A AtI109F/S237N AtY85W/A235T BnC87F** AtS13A AtD230N/A235T AtY85W/S237N** BnI102F** AtS28A AtD230N/S237N AtY85W/D230N/A235T BnF109I** AtS30A AtA235T/S237N AtY85W/D230N/S237N BnT114L*** AtS31A AtD230N/A235T/S237N AtY85W/A235T/S237N BnH119N AtS40R AtS237N/G322A AtY85W/D230N/A235T/S237N BnN230D*** AtY85W AtY85W/N119H*** AtS40R/Y85W/S237N** BnT235A** AtF87C AtY85W/L114T/N119H* AtN119H/D230N BnN237S* AtF102I AtY85W/N119H/S237N*** AtN119H/A235T BnA322G* AtI109F AtY85W/L114T/N119H/S237N*** AtN119H/S237N*** AtL114T AtY85W/N119H/D230N** AtN119H/D230N/A235T AtN119H* AtY85W/N119H/A235T** AtN119H/D230N/S237N** AtD230N AtN119H/A235T/S237N*** AtA235T AtN119H/D230N/A235T/S237N AtS237N AtG322A AtL335H AtP355S 说明：每种突变以物种的首字母缩写和突变前后的氨基酸残基缩写表示，如AtS40R/S237N代表AtGPAT9的40位由丝氨酸(S)变为精氨酸(R)，237位由丝氨酸(S)变为天冬酰胺(N)。*代表基因的异源表达能够恢复酵母双突变体ZAFU1的生长缺陷；*数目代表恢复能力的大小，数目越多，能力越强。 2.3 单个氨基酸残基突变对GPAT9活性的影响
将不同GPAT9突变基因克隆至带有葡萄糖诱导启动子(ADH1)的质粒中，并以空载体与含野生型AtGPAT9的质粒为阴性对照，以含野生型BnGPAT9的质粒为阳性对照，将这些重组质粒导入到ZAFU1菌株中，测定不同GPAT9突变基因恢复ZAFU1在葡萄糖培养基上的生长缺陷能力。根据转化酵母细胞的生长速率，可以比较直观地评估不同突变位点对GPAT9酶活性的影响。结果显示：当ZAFU1突变体在葡萄糖培养基上培养时，W85Y或H119N的单位点替换导致BnGPAT9丧失对突变体生长缺陷的恢复能力(图3A)，说明W85和H119是BnGPAT9正常功能所必需的。另外，与野生型BnGPAT9相比，含N237S或A322G突变位点的BnGPAT9对ZAFU1菌株生长的促进作用下降(图3A)，表明这2个位点亦参与BnGPAT9活性的调节。相反，其他5个单位点替换(R40S、C87F、I102F、F109I、T235A)对BnGPAT9的活性不产生明显影响(图3A)。特别是N230D和T114L单位点替换增强了BnGPAT9活性，这种上调作用对于BnT114L而言尤为突出。如图4所示：与野生型BnGPAT9相比，含T114L突变位点的BnGPAT9在酵母突变体中的表达能促使细胞生长速率大幅度提高，表现为经2 d培养，表达BnGPAT9 (T114L)的菌落在葡萄糖培养基上生长的数量为野生型BnGPAT9的4倍，且每个单菌落表面积更大。
图 3 不同单位点突变对AtGPAT9和BnGPAT9酶活性的影响Figure 3 Effects of different single mutations on AtGPAT9 and BnGPAT9 activities
图 4 亮氨酸替换114位的苏氨酸(T114L)对BnGPAT9活性的影响Figure 4 Effects of the substitution of threonine for leucine at residue 114 (T114L) on BnGPAT9 activity类似地，对19个不同的AtGPAT9突变基因进行了酵母遗传互补鉴定，其中的6个编码蛋白分别在N端的潜在磷酸化位点发生T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和S31A 替换，另外13个分别发生了S40R、Y85W、F87C、F102I、I109F、L114T、N119H、D230N、A235T、S237N、G322A、L335H和P355S替换。结果显示：N端6个潜在磷酸化位点分别替换成中性氨基酸残基并不能改善AtGPAT9活性(图3B)。除了N119H，其他的单位点突变亦对AtGPAT9在酵母异源系统中的活性不产生可见影响(表2)。在酵母菌浓度梯度稀释培养实验中，N119H替换能使AtGPAT9恢复ZAFU1突变体在葡萄糖上的生长缺陷，但这种作用相对较弱(表2，图5D)。
图 5 多位点突变对AtGPAT9酶活性的影响Figure 5 Effects of mutations at multiple sites on AtGPAT9 activity2.4 多个氨基酸残基突变对GPAT9活性的交互影响
基于相邻与非相邻氨基酸残基之间均可能对酶活性产生某种特定的互作效应的假设，根据AtGPAT9和BnGPAT9之间存在的氨基酸差异，进一步构建了28个含有2~4个氨基酸残基替换的AtGPAT9突变酶。与W85、H119和N237位点对BnGPAT9活性产生重要调节作用一致，同步替换AtGPAT9上2或3个相应位点的氨基酸残基(Y85W、N119H、S237N)均能大幅提高AtGPAT9酶活性，表现为携带Y85W/N119H、Y85W/S237N、N119H/S237N、Y85W/N119H/S237N突变的AtGPAT9均能互补菌株ZAFU1的生长缺陷(图5A)；不过，单位点突变对AtGPAT9活性的影响十分有限(表2)。进一步调查发现：携带Y85W/N119H或Y85W/N119H/S237N突变组合的AtGPAT9比野生型BnGPAT9更能促进菌株ZAFU1的生长，且与携带T114L突变的BnGPAT9具有相近的作用效果(图3A，图5A)。
为了更好地剖析114位氨基酸性质对GAPT9活性的调节作用以及与其他氨基酸相互作用产生的效应，将双位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/N119H)和三位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的114位亮氨酸(L114)替换为BnGPAT9相应位置存在的苏氨酸(T)。结果显示：生成的三位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/L114T/N119H)的活性明显弱于AtGPAT9 (Y85W/N119H)，但四位点突变酶AtGPAT9(Y85W/L114T/N119H/S237N)仍与AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的活性相当(图5B)。对这种现象的可能解释是，当2个潜在磷酸化位点即T114和S237同时出现于AtGPAT9 (Y85W/L114T/N119H) (其中含S237)或BnGPAT9 (N237S)(其中含T114)时，GPAT9的磷酸化程度可能加剧，从而抑制酶的活性。因此，推测植物GPAT9活性可能受磷酸化和非磷酸化机制调节，野生型GPAT9中存在的2个潜在磷酸化位点T114和S237可能对酰基转移酶活性产生负面效应。
进一步研究发现：230位氨基酸残基能与85、119位氨基酸残基产生互作效应而影响GPAT活性。虽然D230N本身或与A235T、S237N组合突变未能对AtGPAT9酶活性产生明显影响(表2)，但当与N119H、Y85W/N119H或Y85W/S237N结合时， D230N突变能对AtGPAT9活性产生抑制作用。这是因为，与表达含N119H、Y85W/N119H或Y85W/S237N突变位点的酶的菌株相比，表达AtGPAT9 (N119H/D230N)、AtGPAT9 (Y85W/N119H/D230N)或AtGPAT9 (Y85W/D230N/S237N)的菌株ZAFU1在葡萄糖培养基上呈现生长速率明显减弱或不能生长的现象，暗示着D230N的替换不利于AtGPAT9活性(表2，图5B~D)。这一推测得到下述结果的支持，即N230D替换能提高BnGPAT9活性(图3A)。但是AtGPAT9(N119H/D230N/S237N)与AtGPAT9 (N119H/S237N)的活性相当，这说明D230N的负效应依赖于其他氨基酸的互作关系(表2，图5D)。
另外，N119H/D230N/S237N和N119H/A235T/S237N三突变组合均能提高AtGPAT9活性，使之具有拯救ZAFU1生长缺陷的能力，但在前者和后者中分别添加A235T和D230N得到的N119H/D230N/A235T/S237N四突变组合，能使相应蛋白丧失GPAT活性，如野生型AtGPAT9一样，无法恢复ZAFU1的生长缺陷(表2，图5D)。此外，无论是S237N和G322A单或双替换，均不能增强AtGPAT9在酵母中表达时的活性(表2)，这与N237S或A322G的替换导致BnGPAT9活性下降现象不一致。由此可见，尽管在237位保留非磷酸化氨基酸(天冬酰胺，N)对BnGPAT9活性有利，但其效应取决于其他位置的氨基酸性质。
综上所述，GPAT9的酶活性受85、114、119、230、237和322位氨基酸残基性质的影响，它们之间存在互作效应；当这些位置的氨基酸残基分别为色氨酸(W)、亮氨酸(L)、组氨酸(H)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)和丙氨酸(A)时，酰基转移酶的活性较高。上述多位点突变增强AtGPT9酶活性的事实说明：运用分子设计能有效地改造和优化酰基转移酶的结构，并使之产生新的特性，这对将来人为操控甘油脂的从头合成十分有益。
2.5 异源表达突变酶对酵母油脂合成的影响
为进一步探究氨基酸位点突变对GPAT9功能的影响，选取了3个活性程度不同的AtGPAT9突变酶，分别含N119H、Y85W/N119H 和Y85W/N119H/S237N突变，使其进行异源表达，测定其表达对酵母细胞中TAG合成的影响；阳性对照为野生型BnGPAT9。当相应酵母细胞的生长进入平台生长期时，提取总脂质，经薄层层析分离后，采用气相色谱法测定TAG含量。
需要指出的是，因不同突变酶活性的差异，相应酵母菌到达平台生长期所需的培养时间不一，且平台生长期时的细胞密度也不完全相同。譬如，表达BnGPAT9、AtGPAT9 (Y85W/N119H)和AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的酵母细胞在平台生长期时的细胞密度，以D(600)表示，分别为3.72、4.40、5.32 (图6)。总体而言，酶活性愈大，细胞生长越快、密度越高。
图 6 含不同突变位点的AtGPAT9表达对不同生长期酵母菌株ZAFU1的细胞密度影响Figure 6 Effects of expression of AtGPAT9 bearing different mutation sites on cell density of the yeast strain ZAFU1 in different periods of growth脂质分析显示：AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的表达使突变体酵母ZAFU1细胞中的TAG含量达0.51%，而BnGPAT9和AtGPAT9 (Y85W/N119H)的表达则分别产生0.35%和0.39%的含油量，前者比后两者分别增加了45.7%和 30.8% (图7)。与AtGPAT9 (N119H)具有相对较低的活性一致，表达此酶的酵母细胞，其TAG含量仅为0.22%，显著低于表达BnGPAT9的酵母细胞(0.35%)。以上结果表明：酵母细胞中TAG的合成能力受GPAT活性的调节，而GPAT活性大小与特定位置的氨基酸性质密切相关，因此通过分子设计优化GPAT9的氨基酸组成将有助于修饰细胞中TAG的合成能力。
图 7 含不同突变位点的AtGPAT9表达对平台生长期酵母菌株ZAFU1的TAG含量影响Figure 7 Effects of expression of AtGPAT9 bearing different mutation sites on TAG content of the yeast strain ZAFU1 at the stationary phase3. 讨论
提高油料作物油脂的合成对于保障食用油的供需平衡至关重要；相反，人类细胞中油脂合成能力的增强并非对健康有利，因为这会诱发肥胖症和心血管疾病等。目前人们试图运用遗传或化学遗传方法操控TAG的生物合成[11-16]，但仍存在诸多因素影响，如人们对TAG合成途径中酶的结构与功能的内在关系知之甚少，这阻碍了酶结构的优化，并限制了基于翻译后修饰机制调控酶活性的技术开发。本研究充分利用GPAT专一的酵母遗传互补法[25, 31]，鉴定控制植物GPAT9酶活性的关键氨基酸位点以及不同位点之间存在的互作效应，以深化对酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为将来运用合成生物学等手段有效操控真核生物中TAG的合成提供基础。
植物GPAT9与哺乳动物GPAT3结构相似，两者均参与极性膜脂和中性三酰甘油的生物合成[20-22]。尽管AtGPAT9和BnGPAT9序列相似性大于90%，它们在酵母异源表达时呈现的活性却相去甚远[23-24]，这一特性有助于有效寻找调控酶活性的候选位点。在此基础上，本研究首次明确了酰基转移酶保守结构域外的6个氨基酸位点对植物GPAT酶活性的重要调节作用。
3.1 W85和H119对GPAT9膜结合性质的影响
AtGPAT9的N端和C端均暴露于细胞质，意味着该蛋白应有偶数个跨膜结构域[20]，然而这与生物信息学预测结果不一致，即AtGPAT9含3个潜在的跨膜结构域。对于这一现象的可能解释是，位于N端的几个脯氨酸残基可能会形成一个铰链状结构，使得疏水结构域Ⅰ不能跨膜，而是附着在内质网的表面[20]。基于85和119位氨基酸残基分别位于预测的第Ⅰ和Ⅱ个疏水结构域这一特点推测，将85位的疏水色氨酸替换成亲水的酪氨酸(Y)或将119位带正电荷的组氨酸替换成中性的天冬酰胺，可能会改变GPAT9在膜中的组装方式[33]，这可能是构成AtGPAT9的酶活性低于BnGPAT9的原因之一。
3.2 磷酸化机制调节对GPAT9活性的影响
本研究结果表明：尽管AtGPAT9的N端的6个磷酸化位点单独突变(T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和 S31A)不能增强AtGPAT9在酵母异源表达时的活性，但T114L替换能增强BnGPAT9酶活性，而N237S替换则降低其活性。当114和237位氨基酸残基为非磷酸化氨基酸，即亮氨酸和天冬酰胺，而不是潜在的磷酸化位点苏氨酸(T)和丝氨酸(S)时，AtGPAT9和BnGPAT9突变酶保持较高活性。因此，推测GPAT9的活性受磷酸化机制调节，在114和237位点的磷酸化程度升高不利于维持酰基转移酶的活性。这种假设可以在某种程度上得到过去研究的支持。蛋白质磷酸化与非磷酸化修饰是酶活性的一种重要调节方式，已有研究报道哺乳动物线粒体GPAT (mtGPAT1)通过其C端S632和S639残基的磷酸化修饰调节其活性，酵母GPAT (Gat1p和Gat2p)的C端氨基酸残基发生磷酸化后也能使酶活性下调[34-35]。
3.3 多个氨基酸位点的互作效应对酰基转移酶活性的影响
当多个氨基酸残基同时突变时，它们之间的物理相互作用会导致蛋白质分子内的上位效应[36]。某些氨基酸残基突变组合可以产生协同作用，即产生正向上位效应，如Y85W、N119H和S237N任意突变组合均能增强AtGPAT9活性。相反，其他突变组合可能形成拮抗作用，导致负向上位效应，下调酶活性或彻底损伤蛋白质功能，正如AtGPAT9 (N119H/D230N/A235T/S237N)突变酶中4个氨基酸残基相互间的某种拮抗作用导致该突变酶在酵母ZAFU1中无法发挥功能。230、235和237位氨基酸残基位置相近，且位于酰基转移酶保守结构域Ⅱ中的精氨酸(R215)和Ⅲ中的谷氨酸(E245)之间；鉴于R215和E245这2个氨基酸残基对GPAT的底物结合至关重要[18]，推测230、235和237位氨基酸残基与其他位点之间存在的复杂互作效应对酶活性的影响可能与其干扰3-磷酸甘油底物结合区域的三维结构有关[37]。
尽管N237S或A322G单位点突变均能降低BnGPAT9的活性，但无论是S237N和G322A单或双替换均不能增强AtGPAT9的活性，这从一个侧面说明237和322位氨基酸的作用均极大地受到其他氨基酸的理化性质影响。但需要指出的是，两者的作用方式可能不一。如前所述，237位氨基酸的磷酸化状态可能对酶活性产生某种调节作用，而322位的丙氨酸被甘氨酸取代可能会影响蛋白构象的稳定性，这是因为甘氨酸侧链小，仅有1个氢原子，这不利于α-螺旋结构的稳定。与此一致，三维空间结构预测显示：BnGPAT9中的A322与AtGPAT9中的G322相比，前者在空间上更靠近114、119、230、235、237位氨基酸残基(它们可能与酶活性中心形成有关)，这可能对GPAT9活性产生正面效应。鉴于237与322位氨基酸的重要作用，将来有必要进一步探究在这2个氨基酸位点的何种替换有利于增强酰基转移酶的活性。
4. 结论
本研究首次报道了6个位于酰基转移酶保守区域外的GPAT9酶活性调控位点及其复杂的互作效应，从而深化了对酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为酰基转移酶的分子改造与结构优化提供了理论基础。另外，构建的GPAT9变异基因可用于探索植物中TAG的生物合成机制，特别是磷酸化-非磷酸化调控机制对GPAT酶活性的调节作用。
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图 1 处理期间各组溶解氧质量浓度变化
Figure 1 Changes in dissolved oxygen concentration of each group during treatment
图 2 不同溶解氧质量浓度对雷竹水培苗生物量积累和叶面积的影响
A. 生物量积累；B. 叶面积
Figure 2 Effects of different dissolved oxygen concentration on biomass accumulation and leaf area of hydroponic Ph. violascens seedlings
图 3 不同溶解氧质量浓度对雷竹水培苗根系活力和光合色素的影响
A. 叶绿素a；B. 叶绿素b；C. 类胡萝卜素；D. 根系活力
Figure 3 Effects of different dissolved oxygen concentration on the root activity and the content of photosynthetic pigments of hydroponic Ph. violascens seedlings
图 4 不同溶解氧质量浓度对雷竹水培苗叶片SOD、CAT、POD、APX活性的影响
Figure 4 Effects of different dissolved oxygen concentration on SOD, CAT, POD, APX activity in the leaves of hydroponic Ph. violascens seedlings
图 5 不同溶解氧质量浓度对雷竹水培苗根系距根尖10、30、50、70 mm处通气组织面积占比和形成数量的影响
对照雷竹根系及各处理中雷竹水培苗根系距根尖10 mm处无通气组织形成，故图中不显示数据
Figure 5 Effects of different dissolved oxygen concentrations on the percentage and the number of aerenchyma of root cross-sectional area at 10，30，50，70 mm from the tips of roots of hydroponic Ph. violascens seedlings
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200286
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