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竹林金针虫是取食竹笋的叩甲幼虫的总称，虫害发生时竹笋产量显著减少，严重时竹种无法成竹，制约了竹林的自然更新[1-2]。筛胸梳爪叩甲Melanotus cribricollis隶属于鞘翅目Coleoptera叩甲科 Elateridae梳爪叩甲属Melanotus，其幼虫为中国南方早园竹Phyllostachys propinqua竹林的优势种。化学药剂防治竹林金针虫易造成环境污染、抗药性和食品安全等问题，阻碍以“生态、健康、有机”为标签的林产品产业发展，因此近年来逐渐采用生物技术防治该虫害。绿僵菌Metarhizium sp.是常见的昆虫致病真菌[3-4]，对鞘翅目和鳞翅目Lepidoptera等害虫均有一定防效[5-6]。研究竹林金针虫抗绿僵菌相关基因的表达有利于深入了解害虫免疫抗性机制和虫菌互作机制，也有利于生防菌菌株改造等研究，提高其对农林害虫防治的效果。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)是研究基因表达分析的关键技术，省时、高效、应用广泛；为保证目的基因定量表达结果的准确性，需引入表达稳定的内参基因作为参照[7]。内参基因又称看家基因，理想的内参基因其表达水平应在各条件下保持稳定，而实际上不同条件下许多内参基因的表达并不稳定[8-9]。因此，即使是同一物种，不同试验条件下的内参基因也不能一概而用，qRT-PCR试验之前应对所选内参基因的表达稳定性进行评估。常用的qRT-PCR内参基因包括ACT (肌动蛋白)、TUB (微管蛋白)、GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、UBC (泛素结合酶)、18S rRNA (核糖体蛋白S18)、28S rRNA (核糖体蛋白S28)、EF1 (延伸因子1)、SYN1 (突触融合蛋白1)、SYN6 (突触融合蛋白6)、RPS3 (核糖体蛋白S3)、PRS20 (泛素-核糖体蛋白S20)、PRS27a (泛素-核糖体蛋白S27a)、RPL10 (核糖体蛋白L10)、RPL13α (核糖体蛋白S13α)、AK (精氨酸激酶)和V-ATPase (液泡型ATP合酶)等。符伟等[10]分析了小菜蛾Plutella xylostella候选内参基因在Bt毒素诱导时的表达稳定性，最终筛选出由PRS13、RPL32和 EF1α组成的最佳内参基因组合。冯波等[11] 筛选出最适合校正松墨天牛Monochamus alternatus化学感受组织基因表达的GAPDH和TUB内参基因组合。刘金泊[12]评价了赤拟谷盗Tribolium castaneum的候选内参基因在磷化氢诱导条件下的表达稳定性，筛选出RPS18和 RPL13α最佳内参基因组合。杨苓等[13]筛选出了适合桃蛀螟Conogethes punctiferalis不同发育时期和不同组织的基因表达研究的2组最佳内参组合(RP49和GAPDH，RPL13和RP49)。陶蓉等[14]则分别筛选出了美国白蛾Hyphantria cunea不同发育阶段、不同温度和不同组织的3组最佳内参基因(RPL12和EF1β，EF1α和GAPDH，ACT和RPS16)。目前，关于筛胸梳爪叩甲幼虫内参基因的筛选评估尚未见报道。本研究对平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense侵染不同时期的筛胸梳爪叩甲幼虫qRT-PCR内参基因进行了筛选和评估，以期选出最佳的内参基因，为今后开展竹林金针虫等昆虫的基因表达研究提供参考。
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供试筛胸梳爪叩甲幼虫于2020年3月下旬至4月中旬采自浙江省湖州市德清县的早园竹林地，带回室内置于塑料养虫箱中，箱内装满约3/4的土壤(湿度为10% ± 1%)，定期喂以鲜笋。供试平沙绿僵菌WP08菌株由中国林业科学研究院亚热带林业研究所森林保护团队提供，该菌株最初从僵死的筛胸梳爪叩甲幼虫虫体上分离获得[15]。WP08菌株接种于PDA培养基，产孢3周左右收集分生孢子。供试土壤采自德清早园竹园区，40 目的网筛过筛，高温灭菌(121 ℃、1 h)，烘干备用。
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取一定量的平沙绿僵菌WP08分生孢子与供试土壤，混匀后调节土壤水分为(10 ± 1)%，土壤孢子密度为1.1×107个·g−1。挑选活力强且个体大小一致的幼虫置于处理样品中，培养至7、12和17 d时取样，以未经绿僵菌侵染处理的幼虫作为对照组(0 d)，随机取样5头·份−1。试验在人工气候培养箱中进行，温度设定为(25 ± 1) ℃，空气相对湿度为(80 ± 10)%，黑暗条件，设置3个生物学重复。所有样品用无菌水清洗数遍，用体积分数75%的乙醇表面消毒后，再用无菌水清洗1遍；无菌滤纸吸干虫体体表水分，液氮速冻，存放于−80 ℃备用。
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利用景新微量动物组织总RNA提取试剂盒(SIMGEN，杭州)提取不同样品的RNA，具体操作参照试剂盒说明书。利用质量浓度1.0%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计(美国Thermo Scientific)检测所提取总RNA的质量和质量浓度。利用无菌双蒸水(ddH2O)将所有样品RNA稀释到125 mg·L−1备用。按照PrimeScriptTM Reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒(Takara)说明书合成样品cDNA，每个样品取7.0 μL RNA。
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参考昆虫常用内参基因，根据筛胸梳爪叩甲幼虫的转录组测序注释结果[16]，筛选不同内参基因(β-actin、α-tubulin、GAPDH、AK、SYN6、RPS3、RPL13α、RPL10、RPS27a、RPL32、RPS20和EF-1α)的同源序列，同时筛选昆虫免疫应答相关基因的6个同源序列[PGRP、Prx、SDR(1)、SDR(2)、SDR(3)和SDR(4)]，并利用在线网站http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/针对基因开放阅读框(ORF)区设计qRT-PCR扩增引物。所有引物均由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
以cDNA(0 d)为模板进行普通PCR扩增，并根据电泳结果筛选出扩增条带单一的特异性引物对。PCR扩增反应体系为：2×TSINGKE Master Mix 10.0 μL，上下游引物(10 μmol·L−1)各1.5 μL，模板cDNA 3.0 μL，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火55 ℃，72 ℃延伸2 min，共35个循环；最后于72 ℃补平7 min，终止温度为4 ℃。PCR扩增反应在LifeECO基因扩增仪(杭州博日)上进行。取PCR扩增产物3.0 μL，点样于质量浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上，TS-GelRed核酸染料染色，1×TAE缓冲液中电泳30~40 min(120 V)，利用Bio-Rad凝胶成像分析仪(美国伯乐)摄取扩增图谱。
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标准曲线构建。将反转录获得的cDNA(0 d)稀释2倍后，再依次稀释5个梯度，各梯度依次稀释5倍。以梯度稀释的cDNA为模板进行qRT-PCR，反应在Line Gene 9600 Plus实时荧光定量PCR仪(杭州博日)上进行，使用Gene-9660 software采集数据。PCR扩增反应体系为：2×SYBR Green Mix 5.0 μL，上下游引物(5 μmol·L−1)各0.2 μL，模板cDNA 1.0 μL，ddH2O补足至10.0 μL。qRT-PCR扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，共40个循环，60 ℃采集荧光信号。扩增结束后做熔解曲线分析以检测扩增产物的特异性。熔解曲线程序：95 ℃，15 s；65 ℃，1 min；95 ℃，20 s，隔20 s步进0.2 ℃；30 ℃，1 min。各样品进行3次技术重复，取循环阈值(cycle threshold，Ct)的平均值。判断每对引物是否具有特异性以及是否有引物二聚体，熔解曲线为单峰时用于后续分析。
扩增效率分析。利用SPSS 19.0软件分析cDNA模板质量浓度(对数值)和Ct值的线性关系，获得相关系数(R2)和斜率(S)，利用公式E=(10−1/S−1)×100%计算引物的扩增效率[17]。
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以0(ck)、7、12和17 d取样的cDNA为模板，利用1.4节筛选出的引物对进行qRT-PCR，具体程序同1.4节所述。利用Excel 2003，GeNorm[18]、Normfinder[19]和Bestkeeper[20]软件根据Ct平均值分析候选内参基因的表达稳定性。GeNorm根据表达稳定度(M值)大小对候选内参基因进行排序，M值越小表示基因表达越稳定；根据标准化因子的配对差异分析(Vn/n+1)判定最佳的内参基因数组，Vn/n+1＜0.15代表该条件下内参基因最佳数目为n个。Bestkeeper软件通过标准差(SD)和概率值(P)直接分析Ct值，SD＞1或者P＞0.05时，判定该基因不适合作为内参基因。具体操作方法参考文献[21]。
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选择免疫应答相关基因的6个同源序列作为目的基因，分析1.6节选出的内参基因在不同处理间(0、7、12和17 d)的相对表达量变化，以验证其表达稳定性。目的基因相对表达量的计算采用
${2^{{\rm{ - }}\Delta \Delta {C_{\rm{t}}}}} $ 法。其中：ΔΔCt=ΔCt-实验−ΔCt-对照，△Ct=Ct-目的基因−Ct-内参基因。采用统计学单因素方差分析及最小显著性差异法(LSD)多重比较分析差异显著性。 -
由图1可见：所有样品D(260)/D(280)均为1.8~2.1，凝胶电泳结果可见2条清晰条带(28S和18S rRNA)，说明总RNA较为完整，未出现明显降解。
图 1 总RNA电泳图
Figure 1. Electrophoretogram of total RNA
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根据筛胸梳爪叩甲幼虫的转录组测序数据，筛选出24条候选内参基因和6条目的基因的同源序列，根据普通PCR扩增结果选出条带单一的22对特异性引物，再根据qRT-PCR的引物熔解曲线、R2和扩增效率进一步筛选出6对内参基因(β-actin、GAPDH、α-tubulin、RPL13α、RPS27a和RPS3)和6对目的基因的引物。12对引物的熔解曲线均为单峰，R2为0.989~0.998，扩增效率为88.69%~112.48%，表明引物具有特异性，cDNA的质量浓度和Ct值存在明确的线性关系，引物扩增效率符合荧光定量要求(表1)。
表 1 qRT-PCR引物信息
Table 1. Informations of qRT-PCR primers
基因 引物序列 产物长度/bp 扩增效率/% R2 β-actin F：GGATACCTCTTTTGCTCTGGG，R：ATCAGGGTGTCATGGTTGG 75 112.48 0.993 GAPDH F：CTACTCATGGTCGTTACAAGGG，R：TTCTACAACGTATTCAGCTCCAG 140 101.79 0.993 α-tubulin F：GAAGCTCGTGAAGATTTGGC，R：ACCTTCGCCTTCTCCTTCTC 137 100.63 0.996 RPL13α F：CTGAGGAAGAGCGTAAGGTG，R：TCAGCACGAGCCTTTCTTAAG 145 106.97 0.990 RPS27a F：CTTGTCCTGAATCTTTGCCTTG，R：GTTCTTTTGGTAGCGTGTCATG 146 96.20 0.998 RPS3 F：CAATAGCGCACAAACCACG，R：TGTATTGGGTGAAAAGGGAAGG 128 111.93 0.992 PGRP F：TGTCGTACTTCTGGCTATCATTG，R：TGTGATGGAGGGTTTACTTGC 123 88.69 0.989 Prx F：CTATCCCTTAGACTTCACCTTCG，R：ATTTCTCCCAAACCTCCCTG 171 106.67 0.996 SDR(1) F：CGGCATTGACGGAAACTTTAC，R：GGTTTCCACAGACTTTTGCG 126 109.16 0.995 SDR(2) F：AGGTGCTAGTTCGGGAATTG，R：CGTGTAATTTGCCAGGTTTTCC 140 99.49 0.997 SDR(3) F：GGATTACGAGCATAAGTCCTGG，R：CGGCGATGTCTTCAGATTTTAAC 126 106.58 0.996 SDR(4) F：TTAGGGTTTCAGTCAAGGCAG，R：GAAGCCGTCCAAGATATGAAAG 148 93.34 0.994 -
不同平沙绿僵菌侵染处理时长(0、7、12和17 d)下，筛胸梳爪叩甲幼虫6个候选内参基因的Ct值为11.110~15.463(图2)，表明本试验条件下所选内参基因表达水平较高。但不同基因的Ct值存在差异，其中β-actin最低，平均Ct值为11.622；α-tubulin最高，平均Ct值为14.712；GAPDH的Ct值跨度最小(13.273~13.873)；RPS3跨度最大(13.720~14.970)。
图 2 筛胸梳爪叩甲幼虫候选内参基因的Ct值分析
Figure 2. Ct value analysis of candidate reference genes of Melanotus cribricollis larvae
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GeNorm软件计算基因的表达稳定度(M值)，M＞1.5的内参基因不可用，M越小，内参基因的表达越稳定。该软件分析结果显示：6个候选内参基因的M值均＜1.5，PRS27a和RPS3的表达最稳定，其后依次是α-tubulin、RPL13α和β-actin，GAPDH的表达最不稳定。NormFinder通过比较样本的组内变异和组间变异来评估基因的稳定值。该软件分析结果显示：RPL13α的表达最稳定，其后依次是α-tubulin、RPS3、RPS27a和β-actin，GAPDH的表达最不稳定。BestKeeper是以标准差和P来判断内参基因是否可用。该软件分析结果显示：所有候选内参基因的标准差均＜1，但β-actin和GAPDH P＞0.05，不适合作为本试验条件下的内参，其余4个内参基因可用。综合3个软件的评价结果发现：RPS3、PRS27a、RPL13α和α-tubulin这4个内参的表达稳定性排名稍有差异，RPS3的表达最稳定，PRS27a和RPL13α次之，随后是α-tubulin(表2)。GeNorm软件通过判断配对变异值(＜0.15)来确定内参基因最佳数目。由表3可知：V2/3=0.084＜0.15，表明该条件下最佳内参基因的数目n=2(表3)。
表 2 利用BestKeeper软件评价候选内参基因的表达稳定性
Table 2. Stability of candidate reference genes based on BestKeeper analysis
基因 GeNorm NormFinder BestKeeper 稳定值 排名 稳定值 排名 标准差 P 排名 β-actin 0.391 4 0.244 5 0.27 0.313 6 GAPDH 0.426 5 0.293 6 0.16 0.261 5 α-tubulin 0.242 2 0.177 2 0.24 0.042 4 RPL13α 0.319 3 0.164 1 0.32 0.024 3 RPS27a 0.197 1 0.206 4 0.35 0.012 2 RPS3 0.197 1 0.202 3 0.39 0.002 1 表 3 内参基因的最佳数量评估
Table 3. Determination of the optimal number of reference genes for normalization
Vn/n+1 配对变异值 Vn/n+1 配对变异值 V2/3 0.084 V4/5 0.092 V3/4 0.092 V5/6 0.074 说明：n表示内参基因数目 -
综合3款软件的内参基因表达稳定性排名和最佳组合数目分析结果，本研究选择PRS27a和RPS3为内参基因。由图3可知：以PRS27a和RPS3为内参基因时，6个目的基因在平沙绿僵菌不同处理时间(0、7、12和17 d)的筛胸梳爪叩甲幼虫中的表达变化趋势相同；其中，PGRP基因相对表达量在7 d时都较对照(0 d)显著提高(P＜0.05)，随后下降，12 和17 d时无显著差异；Prx基因相对表达量整体呈上升趋势，在12 和17 d时均显著高于对照(P＜0.05)；SDR(1)相对表达量则呈下降趋势；SDR(2)在17 d 时相对表达量显著升高(P＜0.05)；SDR(3)和SDR(4)相对表达量均先升高后下降，并在12 d时表达量最高，较其他处理时间存在显著性差异(P＜0.05)。
图 3 以PRS27a和RPS3为内参时6个目的基因不同处理时间下的相对表达量
Figure 3. Expression analysis of six target genes under different processing times calibrated by PRS27a and RPS3 as reference genes
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实时荧光定量PCR具有快速、准确和灵敏的特性，在基因表达分析研究中应用广泛，然而表达稳定的内参基因选择是获得目的基因准确表达结果的前提条件。同一内参基因在不同物种、组织、发育阶段和处理条件下的表达稳定性也存在差异[8-9]。目前尚未见有关筛胸梳爪叩甲幼虫内参基因的研究报道。本研究首次对该虫在平沙绿僵菌侵染条件下的候选内参基因进行了筛选评估。GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选内参基因的分析结果表明：PRS27a和RPS3的表达稳定。本研究以PGRP、Prx、SDR(1)、SDR(2)、SDR(3)和 SDR(4)为目的基因对PRS27a和RPS3内参基因进行了验证，结果显示：分别以这2个基因为内参时，6个目的基因的表达趋势一致，证明了这2个基因作为内参的可靠性。PGRP隶属于模式识别受体蛋白(pattern recognition receptor proteins，PRRs)家族，可与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的肽聚糖结合，激活Toll和Imd信号转导通路，诱导免疫防御相关的水解级联反应，发生吞噬作用[22-23]。以PRS27a和RPS3为内参时，目的基因PGRP在筛胸梳爪叩甲幼虫体内被平沙绿僵菌诱导表达，7 d时较对照组显著升高，该现象与赤拟谷盗和油菜花露尾甲Meligethes aeneus PGRP基因被寄生物或病原菌诱导后表达上调相似[24-25]。Prx基因编码过氧化物还原酶(peroxiredoxin)，是抗氧化家族中的一员，能够通过消除细胞内的活性氧(ROS)以维持氧化还原平衡[26]。以PRS27a和RPS3为内参时，目的基因Prx整体表达呈上升趋势，推测其可能在病程后期发挥作用。SDR蛋白(short-chain dehydrogenases/reductases，短链脱氢还原酶)是一个超级家族，由多种酶编码基因家族组成，在多种生物合成途径、细胞信号通路和病理途径中都扮演重要角色[27]。本研究发现：筛胸梳爪叩甲幼虫4个SDR基因[SDR(1)、SDR(2)、SDR(3)和 SDR(4)]对绿僵菌侵染的响应机制不同，可能是因为参与过程不同。由上可见，以PRS27a和RPS3为内参时，筛胸梳爪叩甲幼虫PGRP、Prx和SDR这3类基因的表达模式符合赤拟谷盗和油菜花露尾甲等昆虫对病原菌的响应机制，进一步证实了该内参组合适用于绿僵菌侵染条件下的目的基因表达水平研究。
本研究首次报道了在平沙绿僵菌侵染条件下筛胸梳爪叩甲幼虫可用的内参基因(PRS27a和RPS3)，为后续研究绿僵菌和竹林金针虫互作相关基因的表达奠定基础，也对其他昆虫基因表达以及虫菌互作相关研究提供参考。
Screening and application of reference genes for qRT-PCR in bamboo wireworm
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摘要:
目的 筛选平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense侵染条件下筛胸梳爪叩甲Melanotus cribricollis幼虫稳定表达的内参基因，为该竹林金针虫相关基因的表达研究奠定基础。 方法 基于筛胸梳爪叩甲幼虫的转录组数据，利用实时荧光定量PCR扩增特异性引物，分析相关性和扩增效率；利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评估筛选出6个候选内参基因(β-actin、GAPDH、α-tubulin、RPL13α、RPS3、RPS27a)，并验证其表达稳定性。 结果 GeNorm分析结果显示：PRS27a和RPS3的表达最稳定，随后依次是α-tubulin、RPL13α、β-actin和GAPDH；最适合的内参基因数目为2。NormFinder分析结果显示：RPL13α的表达最稳定，随后依次是α-tubulin、RPS3、RPS27a、β-actin和GAPDH。BestKeeper分析结果显示：β-actin和GAPDH的P＞0.5，不适合作为本试验条件下的内参基因。不同软件分析得出的候选内参排序存在一定差异。综合分析和表达稳定性验证表明PRS27a或RPS3是最佳内参基因，6个目的基因的表达水平变化趋势均基本一致。 结论 PRS27a和RPS3是研究平沙绿僵菌侵染的竹林金针虫相关基因表达的最佳内参基因。图3表3参27 Abstract:Objective The objective of this study was to screen the stable expression of internal reference genes of Melanotus cribricollis larvae infected by Metarhizium pingshaense, so as to lay a foundation for the research on related gene expression in this bamboo wireworm. Method Based on the transcriptome data of M. cribricollis larvae, the correlation (R2) and amplification efficiency were analyzed by qRT-PCR with specific primers. The 6 candidate reference genes including β-actin, GAPDH, α-tubulin, RPL13α, RPS3 and RPS27a were evaluated by GeNorm, NormFinder and BestKeeper softwares. The stabilities of selected candidate reference genes including PRS27a and RPS3 were further validated by analyzing the expression of 6 target genes. Result GeNorm analysis showed that the expression of PRS27a and RPS3 were the most stable, followed by α-tubulin, RPL13α, β-actin and GAPDH. The most suitable number of internal reference genes was 2. NormFinder analysis showed that the expression of RPL13α was the most stable, followed by α-tubulin, RPS3, RPS27a, β-actin, and GAPDH. BestKeeper analysis showed that the P values of β-actin and GAPDH were ＞0.5, which were not suitable for reference genes under the condition of this experiment. There were some differences in the ranking of candidate internal parameters obtained by different software analysis. Comprehensive analysis and expression stability verification showed that PRS27a or RPS3 were the best internal reference genes, and the expression levels of 6 target genes were basically the same. Conclusion PRS27a and RPS3 were the most appropriate reference genes for qRT-PCR analysis in bamboo wireworm infected by M. pingshaense. [Ch, 3 fig. 3 tab. 27 ref.] -
抚育间伐是常用的森林管理措施[1]，因伐除林冠相对密集的部分树木，增加了太阳辐射，改变了森林小气候和土壤微生境，必然影响森林生态系统的养分和生物地球化学循环过程，以及该循环过程的核心环节——土壤微生物活动和酶活性。目前，土壤胞外酶研究更多关注于碳、氮和磷循环相关的降解酶，如碳酶[β-葡糖苷酶(BG)、纤维二糖水解酶(CBH)、β-木糖苷酶(BX)]，氮酶[β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)]和磷酶[酸性或碱性磷酸酶(AcP)]，其活性可作为微生物资源分配的代理指标[2]。在养分循环期间酶活性的相对丰度变化可反映微生物群落的代谢水平。SINSABAUGH等[3]最先通过整合分析发现：在全球尺度上碳、氮和磷循环相关酶计量比接近1∶1∶1，表明土壤酶化学计量比呈稳态性。但也有研究发现：土壤酶化学计量比呈非稳态性[4−6]，说明微生物可能受到能量或关键营养物质(即碳、氮和磷)的限制[7]。
间伐措施对土壤胞外酶活性和酶化学计量的影响仍不确定。如土壤酶活性在森林间伐后会增加[8]、减少[9]或保持不变[10]。大多数研究主要围绕不同间伐强度对酶活性的影响[11]。间伐措施的影响效果还会随森林恢复过程而发生改变。如QIU等[12]对塞罕坝林场内华北落叶松Larix principis-rupprechtii人工林进行间伐恢复9 a后的结果显示：间伐措施显著增加了土壤BG、NAG+LAP和AcP活性。而LULL等[13]对地中海栎Quercus ilex林间伐后5个月至7 a内，氮和磷循环酶的活性并未发生显著改变。间伐处理和林下移除可在短时间内减少微生物对土壤资源的竞争，进而改变酶的活性[14]。但随树木生长速度和土壤养分含量的变化，微生物资源利用策略也发生改变，可能造成微生物受到不同养分的限制[15]。
目前，关于间伐处理对土壤胞外酶活性的研究大多侧重于间伐强度和人工林生态系统的研究，而对天然林生态系统间伐后不同恢复阶段土壤酶活性的研究较少。鉴于此，本研究采用空间代替时间的方法，探讨北亚热带秦岭松栎混交林在抚育间伐后不同恢复时间内林地表层土壤酶活性、酶化学计量比的变化规律，为制定森林可持续经营方案及合理的生态恢复措施提供理论依据。
1. 研究地区与研究方法
1.1 研究区概况
研究区位于陕西省安康市宁东林业局新矿林场(33°20′~33°26′N，108°32′~108°34′E)，地处秦岭山脉，海拔为1 400.0~1 800.0 m。该区属于北亚热带与温带过渡区，年均气温为8.5 ℃，年平均降水量为908.0 mm，土壤为山地棕壤。研究区域为20世纪70年代末采伐后天然更新形成的次生针阔混交林[16]，采取的是低强度间伐和林冠下补植等保护经营作业法。林内主要以油松Pinus tabuliformis、锐齿槲栎Quercus aliena var. acutiserrata、华山松Pinus armandii为主要建群种，伴生有漆树Toxicodendron vernicifluum、小叶女贞Ligustrum quihoui、青榨槭Acer davidii等树种。林下植被以卫矛Euonymus alatus、木姜子Litsea pungens、披针叶薹草Carex lanceolata、龙牙草Agrimonia pilosa、茜草Rubia cordifolia为主。
2021年10月，根据研究区内实际间伐处理、林木生长和分布状况，选择立地条件基本一致的林分，设置3种间伐处理，即未间伐(ck)、间伐恢复5 a (5 a，2018年间伐)和间伐恢复13 a (13 a，2010年间伐)。每个间伐处理设置4块面积为20 m×30 m的样地，共计12块样地。为防止样地之间相互干扰，样方之间的间隔不小于100 m。进行间伐处理后林下物种数量增加，更新了枫杨Pterocarya stenoptera、栗Castanea mollissima、桤木Alnus cremastogyne、灯台树Cornus controversa和胡桃楸Juglans mandshurica等树种。其中各样地内物种丰富度和Shannon-Wiener指数参照刘思泽等[17]的方法计算。样地调查基本概况见表1。
表 1 试验样地基本概况Table 1 Basic survey of test plots间伐后恢
复时间/a海拔/
m株数密度/
(株·hm−2)胸径/
cm郁闭度 物种
丰富度Shannon-Wiener
指数凋落物量/
(t·hm−2·a−1)林内主要树种 ck 1 585.00±61.85 1 420±88 14.60±0.49 0.7 25 2.48 7.01±0.37 油松、锐齿槲栎、华山松、毛樱桃、垂柳、
木姜子、三桠乌药5 1 457.32±13.14 1 208±355 13.80±0.84 0.5 32 2.78 5.69±0.26 锐齿槲栎、栗、油松、白桦、垂柳、
榆树、桤木13 1 757.57±20.17 1 254±207 13.80±1.19 0.6 29 2.68 6.55±0.29 毛樱桃、油松、锐齿槲栎、漆树、水蜡树、
木姜子、灯台树说明：毛樱桃Prunus tomentosa，垂柳Salix babylonica，三桠乌药Lindera obtusiloba，白桦Betula platyphylla，榆树Ulmus pumila，水蜡树Ligustrum obtusifolium。 1.2 采样设计
2023年7月，根据S型取样方法，在ck、5 a、13 a间伐样地内，用直径为3.6 cm的土钻采集0~10 cm的表层土样，为避免样品受到污染，将土壤混合储存于灭菌自封袋中，再用便携冷藏箱带回实验室。在室内充分混匀后过2 mm筛。一份新鲜土样于4 ℃冰箱保存，用于有效氮、土壤酶活性和土壤微生物生物量的测定；另一份土壤样品自然风干，用于其他土壤理化性质的测定。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 土壤理化性质测定
土壤含水率采用105 ℃烘干法；土壤pH采用电位法(土水体积质量比为1.0∶2.5)；土壤总氮采用元素分析仪测定；土壤有机碳采用重铬酸钾氧化-外加热法；土壤有效氮指铵态氮和硝态氮的总和，分别采用2 mol·L−1氯化钾浸提-靛酚蓝比色法、氯化钾提取-双波长紫外分光光度法测定；土壤总磷采用硫酸-高氯酸-钼锑抗比色法[18]。微生物生物量碳、氮采用氯仿熏蒸法，使用岛津总有机碳分析仪测定。
1.3.2 土壤胞外酶活性及酶计量的测定与计算
参照SAIYA-CORK等[19]的方法，测定与碳、氮、磷循环密切相关的酶活性，各种土壤酶的名称、简称及底物见表2。其中，水解酶(BG、BX、CBH、NAG、LAP、AcP)活性采用微孔板荧光法，用多功能酶标仪在365 nm波长处激发，450 nm波长处荧光测定；氧化酶(POX、PER)活性采用DOPA-紫外分光光度法，用多功能酶标仪在450 nm波长处测定。
表 2 土壤胞外酶的简称及所用底物Table 2 Soil enzyme along with their enzyme abbreviation and substrate of soil enzyme酶名称 简称 底物 β-葡糖苷酶β-glucosidase BG 4-MUB-β-D-glucoside β-木糖苷酶β-xalosidase BX 4-MUB-β-D-xylopyranoside 纤维二糖水解酶Cellobiohydrolase CBH 4-MUB-β-D-cellobioside β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶β-N-acetylglucosaminidase NAG 4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminde 亮氨酸氨基肽酶Leucine aminopeptidase LAP L-leucine-7-amido-4 methylcounarin 酸性磷酸酶Acid phosphatase AcP 4-MUB-phosphatase 酚氧化物酶Phenol oxidase POX L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) 过氧化物酶Peroxidase PER L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) and H2O2 说明：MUB为甲基伞形酮酰Methylumbelliferyl。 通过计算碳、氮和磷酶活性的比值研究土壤胞外酶化学计量[20]，同时，采用酶计量的载体分析，即用矢量长度(VL)及矢量角(VA)分析间伐处理对微生物能量和营养的相对限制状况[21]，计算公式如下。
$$ {E}_\text{C/N}\text{}\text=\text{}\text{ln}{H}_{\mathrm{B}\mathrm{G}}\text{/ln}\text{(}{H}_{\text{NAG}}\text+{H}_{\text{LAP}}\text{)}\text{;}\text{}\text{}\text{} $$ (1) $$ {E}_\text{C/P}\text{}\text=\text{}\text{ln}{H}_{\text{BG}}\text{/ln}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}};\text{}\text{}\text{}\text{}\text{}$$ (2) $$ {E}_\text{N/P}\text{= ln}\text{(}{H}_{\text{NAG}}\text+{H}_{\text{LAP}}\text{)}\text{/ln}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}}; $$ (3) $$ {V}_{\text{L}}\text=\text{SQRT}\text{[}\text{(}{E}_\text{C/N}\text{)}^2\text+\text{(}{E}_\text{C/P}\text{)}^2\text{]}\text{;} $$ (4) $$ {V}_{\text{A}}\text=\text{Degrees}\text{[}\text{ATAN2}\text{(}{E}_\text{C/P}\text{,}\text{}{E}_\text{C/N}\text{)}\text{]}\text{。}$$ (5) 式(1)~(5)中：$ {E}_\text{C/N} $、$ {E}_\text{C/P} $、$ {E}_\text{N/P} $分别为土壤碳获取酶/氮获取酶比值、土壤碳获取酶/磷获取酶比值、土壤氮获取酶/磷获取酶比值；$ {H}_{\mathrm{B}\mathrm{G}}\mathrm{、}{H}_{\text{NAG}}\mathrm{、}{H}_{\text{LAP}}\mathrm{、}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}} $分别为BG、NAG、LAP、AcP的酶活性；SQRT为平方根函数，Degrees为角度转换函数，ATAN2为反正切函数。VL越大，表明碳限制越严重。VA以45°为分界线，＞45°为磷限制，＜45°为氮限制。偏离程度越大，限制程度越强。
1.4 数据分析
使用SPSS 25.0对不同间伐恢复时间下的土壤理化性质、胞外酶活性、酶化学计量比、酶矢量长度和角度的差异进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和最小显著性差异法(LSD)(P＜0.05)；利用Sperman检验分析与土壤酶活性和酶矢量变化显著相关的土壤因子，利用Origin 2021绘图。以酶活性及其矢量作为物种因子，土壤理化性质作为环境因子，利用Canoco 5.0进行冗余分析。通过方差膨胀因子(VIF)判断解释变量之间的线性关系，剔除共线性较强(VIF＞5)的变量，对剩余的pH、有效氮、有机碳和全磷共4个变量进行研究。
2. 结果与分析
2.1 间伐恢复对土壤理化性质的影响
从表3可见：间伐恢复对土壤pH、有效氮、全磷、碳氮比、氮磷比、有机碳、微生物量碳、微生物量氮和微生物量碳氮比均有显著影响(P＜0.05)。恢复5 a的土壤pH显著高于ck (P＜0.05)。恢复13 a的土壤全磷、微生物量碳和微生物量氮均显著高于ck (P＜0.05)，分别是ck的1.28、1.19和1.15倍。土壤有效氮、碳氮比和氮磷比均显著低于ck (P＜0.05)。恢复5 a的土壤有机碳显著降低了25.93% (P＜0.05)，但恢复13 a的土壤有机碳质量分数逐渐恢复至未间伐前水平。间伐恢复对土壤含水率和全氮无显著影响。
表 3 不同间伐恢复时间下土壤理化特性状况Table 3 Soil physical and chemical properties under different thinning treatments间伐后恢复时间/a pH 含水率/% 有效氮/(mg·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 碳氮比 ck 5.48±0.10 b 37.28±4.01 a 21.34±1.96 a 4.58±0.86 a 0.60±0.08 b 10.02±1.16 a 5 5.98±0.13 a 35.10±6.81 a 17.19±0.48 ab 3.28±0.68 a 0.52±0.10 b 9.34±1.41 ab 13 5.76±0.17 ab 40.37±1.67 a 16.56±0.58 b 3.93±0.44 a 0.77±0.07 a 8.55±1.32 b 间伐后恢复时间/a 氮磷比 有机碳/(g·kg−1) 微生物量碳/(g·kg−1) 微生物量氮/(g·kg−1) 微生物量碳氮比 ck 7.49±0.71 a 35.94±3.84 a 1.14±0.04 b 0.20±0.01 b 5.97±0.37 ab 5 6.45±0.95 ab 26.62±2.79 b 1.14±0.09 b 0.22±0.01 ab 5.09±0.13 b 13 5.04±0.34 b 33.33±2.27 ab 1.36±0.02 a 0.23±0.01 a 6.11±0.33 a 说明：数据均为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著 (P＜0.05)。 2.2 间伐恢复对土壤酶活性及胞外酶计量比的影响
从图1可见：间伐恢复对不同土壤酶活性的影响并不一致。恢复13 a时土壤BX、AcP和NAG+LAP活性显著下降(P＜0.05)，较ck分别降低了25.39%、22.92%和46.25%，同时土壤BG活性还显著提高(P＜0.05)，是ck的1.34倍(P＜0.05)。土壤氧化酶(POX、PER)和CBH活性变化趋势与前4种酶不同，在恢复5 a时活性最低，在恢复13 a时活性最高。
通过矢量分析发现：VA＞45°，且EN/P＜1、EC/N＞1 (图2A)，表明研究区土壤微生物生长代谢主要受碳和磷共同限制。森林土壤EC/P和EN/P显著偏离1，且随间伐后时间的持续而逐渐恢复或显著增大(P＜0.05，图2B)。VA和VL在3个间伐恢复间均有明显差异(图2C~D)。与ck相比，间伐恢复5 a的VA显著降低了4.42%，13 a的VL是ck的1.13倍(P＜0.05)。表明间伐措施在恢复初期能够缓解土壤微生物受磷限制的状况，而后随恢复时间的持续，微生物受碳限制程度显著增加(P＜0.05)。
图 2 间伐恢复对土壤酶化学计量及酶矢量的影响Figure 2 Effects of thinning treatment on soil enzyme stoichiometry and enzyme vector2.3 土壤酶整体变化和土壤理化性质的相关性分析及冗余分析
相关性分析(表4)表明：水解酶活性与有效氮、有机碳和微生物量碳氮比均呈正相关关系。其中土壤碳获取酶(BG、CBH)与土壤全磷、有机碳、微生物量碳呈显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关，BX活性与土壤有效氮、微生物量碳氮比呈显著正相关(P＜0.05)。土壤氮获取酶(NAG+LAP)和磷获取酶(AcP)均与土壤有效氮呈极显著正相关(P＜0.01)。酚氧化物酶(PER)除与pH呈显著负相关外(P＜0.05)，还与有机碳、微生物量碳氮比呈极显著正相关(P＜0.01)。VA仅与pH呈极显著负相关(P＜0.01)。VL与全磷和微生物量碳呈显著正相关外(P＜0.05)，还与氮磷比呈极显著负相关(P＜0.01)。
表 4 土壤酶变化与土壤理化性质的相关性分析Table 4 Correlation analysis between soil enzyme changes and soil physical and chemical properties指标 pH IN TP SOC MBC MBC/MBN N/P POX −0.54 −0.29 −0.04 −0.07 0.26 0.30 −0.04 PER −0.65* 0.19 0.32 0.45* 0.22 0.52** 0.21 BG 0.28 0.35 0.73** 0.55** 0.63** 0.38 −0.25 BX −0.53 0.54** −0.01 0.27 0.10 0.45* 0.56 CBH −0.01 0.24 0.46* 0.43* 0.53** 0.65** 0.17 AcP −0.72* 0.57** −0.38 0.06 −0.13 0.22 0.85** NAG+LAP 0.17 0.66** −0.08 0.14 −0.01 0.00 0.60 VA −0.95** 0.01 −0.30 −0.06 −0.04 0.35 0.43 VL 0.45 −0.28 0.70** 0.31 0.48* 0.15 −0.63* 说明：IN为土壤有效氮，TP为土壤全磷，SOC为土壤有机碳，MBC为微生物量碳，MBN为微生物量氮，N/P为氮磷比。POX为酚氧化物酶，PER为过氧化物酶，BG为β-葡糖苷酶，BX为β-木糖苷酶，CBH为纤维二糖水解酶，AcP为酸性磷酸酶，NAG+LAP为氮获取酶(β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶总和)，VA为酶矢量角度，VL为酶矢量长度。*表示显著相关(P＜0.05)，**表示极显著相关(P＜0.01)。 冗余分析(图3)表明：剔除存在共线性关系的变量后，pH、有效氮、有机碳和全磷共解释了酶活性和酶矢量变异的73.71%。其中pH和有机碳是对土壤酶整体变化解释度最高的因子，分别解释了变量的48.80%和13.10%，且pH与酶指标变化显著相关(P＜0.05)。
图 3 土壤酶活性与理化性质关系的冗余分析Figure 3 Redundancy analysis of soil enzyme activity and physical and chemical properties3. 讨论
3.1 间伐恢复年限对土壤理化性质及微生物生物量的影响
间伐改变了秦岭松栎混交林表层土壤pH和养分质量分数，但在不同恢复阶段规律不一致。在本研究中，间伐导致pH提高，尤其是间伐恢复5 a后，这与许多学者的研究结果一致。如对云杉Picea crassifolia[22]林和火炬松Pinus taeda[23]林研究表明：间伐减少了针叶凋落物作为有机酸主要输入组分的产生，从而显著提高土壤表层pH。本研究中针叶树种的胸高断面积占比在间伐后有所降低，这在一定程度上能缓解土壤酸化。同时，间伐后土壤含水率、全氮、全磷和有机碳质量分数均呈先减少后逐步恢复的趋势。这可能是因为间伐短期内树冠层郁闭度减小，导致土壤蒸发增强的同时，也促进林下植被的快速生长，加快了土壤水分的消耗[24]。凋落物作为土壤最主要的有机碳源，通过微生物转化为腐殖质的同时也改变了土壤pH，影响凋落物的分解，改变土壤养分水平[25]。相较于ck，间伐恢复5、13 a后，凋落物量分别恢复至81.16%和93.41%，间伐恢复13 a的土壤全氮、全磷和有机碳质量分数有所提高，表明随时间的持续，林分结构及相关生态过程在一定程度上得到恢复。此外，本研究中微生物量碳、氮和土壤有效氮在间伐恢复13 a后的变化趋势不一致，可能因为间伐后林地内出现了栗、桤木和水蜡树等阳性植物，以及毛樱桃、白桦和漆树等阔叶树种，林地内相对多度增加，根系密度和根系分泌物增多，有利于土壤微生物生物量的积累[26]。而林下喜光物种的快速生长[27]，对土壤游离态氮的需求增大，导致土壤有效氮质量分数有所降低。这与周璇等[28]对8年生柳杉Cryptomeria japonica人工林进行间伐后的研究结果一致。
3.2 间伐恢复年限对土壤酶活性的影响
在本研究中，间伐恢复年限导致土壤BX、AcP和NAG+LAP活性显著降低，但对其他土壤酶活性影响趋势不同，如POX、PER、BG和CBH通常在间伐恢复5 a时活性最低，在13 a时恢复到间伐前水平或高于未间伐处理(如BG)。这与其他研究结果相似，但并不完全一致[29−30]。这种结果可能是由于不同的林分环境以及微生物利用资源多寡的差异，导致土壤酶活性对同一干扰方式的不同改变[31]。随着间伐恢复时间的持续，易分解有机物质减少而难降解的碳相对较多[32]，POX、PER和BG、CBH作为土壤中主要的木质素降解酶和纤维素降解酶，其活性得到显著提高，以增强微生物利用顽固性有机碳的能力。这与MEISAM等[33]的研究结果一致。而以分解几丁质和蛋白质、半纤维素等易分解物质为主的NAG+LAP、BX活性的显著降低也映证了SINSABAUGH等[34]的资源分配理论。
土壤胞外酶与土壤养分输入和微生物量等密切相关[35]。通过相关分析发现：BG和CBH活性与微生物量碳、全磷显著正相关，表明土壤微生物数量的变化与碳循环土壤酶活性的变化关系最为密切，而全磷则是磷素限制环境中影响微生物生长的主要因素[7, 16]。有效氮质量分数的减少虽然在一定程度上能促使氮获取酶的产生，但同样也会降低土壤微生物的活性和限制酶促反应底物供应，从而减少部分酶的释放[36]，这与孙鹏跃等[37]的研究结果一致。冗余分析发现：土壤pH也是影响土壤酶活性的主要因素，并与部分酶变化表现出负相关关系，这与多数研究结果是一致的[3]。有研究表明：大多数土壤酶在特定的pH范围(最适值在4.0~5.5)内表现出最大的活性和稳定性，当pH超过这个范围时，酶活性会降低[38]。
3.3 间伐恢复年限对酶化学计量比和微生物养分限制的影响
本研究中所有处理的土壤酶矢量角度均＞45°，符合亚热带地区森林土壤微生物更受磷素限制的理论[39]。同时参与土壤碳、氮和磷循环相关酶计量比偏离了表层土壤中接近1∶1∶1的平均水平[3]，也在一定程度上反映了秦岭区域松栎混交林间伐恢复过程中微生物受碳和磷的共同限制，这与薛悦等[40]对安康市火池塘林区撂荒地恢复过程的研究结果相一致。与未间伐样地相比，间伐后恢复5 a时显著降低的酶矢量角度表征了微生物受到的磷限制减弱，随时间进程减弱效应逐渐消失，林内物种丰富度的提高和凋落物量的增加，促使土壤微生物分泌更多碳获取酶(如BG)来降解有机质，释放磷以供给微生物活动，以缓解磷限制，这些过程都会导致微生物碳限制的进一步增加。相关性分析结果中，酶矢量长度与微生物量碳呈显著正相关，证实了微生物需要更多的碳源来满足代谢活动所耗的能量，这与CUI等[41]的研究结果相似。
4. 结论
间伐改变了松栎混交林区域内的年凋落物总量及针叶与阔叶的凋落量比例，同时改变了林内物种丰富度和林分郁闭度，从而影响了土壤基本理化性质。抚育间伐在一定程度上能够缓解土壤微生物受磷限制的状况，但随恢复时间持续，林内凋落物量逐渐增加使土壤微生物受碳限制更为严重。
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图 2 筛胸梳爪叩甲幼虫候选内参基因的Ct值分析
Figure 2 Ct value analysis of candidate reference genes of Melanotus cribricollis larvae
图 3 以PRS27a和RPS3为内参时6个目的基因不同处理时间下的相对表达量
对照组的相对表达量设定为1 。不同小写字母表示以RPL27a为内参时差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示以PRS3为内参时差异显著(P＜0.05)
Figure 3 Expression analysis of six target genes under different processing times calibrated by PRS27a and RPS3 as reference genes
表 1 qRT-PCR引物信息
Table 1. Informations of qRT-PCR primers
基因 引物序列 产物长度/bp 扩增效率/% R2 β-actin F：GGATACCTCTTTTGCTCTGGG，R：ATCAGGGTGTCATGGTTGG 75 112.48 0.993 GAPDH F：CTACTCATGGTCGTTACAAGGG，R：TTCTACAACGTATTCAGCTCCAG 140 101.79 0.993 α-tubulin F：GAAGCTCGTGAAGATTTGGC，R：ACCTTCGCCTTCTCCTTCTC 137 100.63 0.996 RPL13α F：CTGAGGAAGAGCGTAAGGTG，R：TCAGCACGAGCCTTTCTTAAG 145 106.97 0.990 RPS27a F：CTTGTCCTGAATCTTTGCCTTG，R：GTTCTTTTGGTAGCGTGTCATG 146 96.20 0.998 RPS3 F：CAATAGCGCACAAACCACG，R：TGTATTGGGTGAAAAGGGAAGG 128 111.93 0.992 PGRP F：TGTCGTACTTCTGGCTATCATTG，R：TGTGATGGAGGGTTTACTTGC 123 88.69 0.989 Prx F：CTATCCCTTAGACTTCACCTTCG，R：ATTTCTCCCAAACCTCCCTG 171 106.67 0.996 SDR(1) F：CGGCATTGACGGAAACTTTAC，R：GGTTTCCACAGACTTTTGCG 126 109.16 0.995 SDR(2) F：AGGTGCTAGTTCGGGAATTG，R：CGTGTAATTTGCCAGGTTTTCC 140 99.49 0.997 SDR(3) F：GGATTACGAGCATAAGTCCTGG，R：CGGCGATGTCTTCAGATTTTAAC 126 106.58 0.996 SDR(4) F：TTAGGGTTTCAGTCAAGGCAG，R：GAAGCCGTCCAAGATATGAAAG 148 93.34 0.994 
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表 2 利用BestKeeper软件评价候选内参基因的表达稳定性
Table 2. Stability of candidate reference genes based on BestKeeper analysis
基因 GeNorm NormFinder BestKeeper 稳定值 排名 稳定值 排名 标准差 P 排名 β-actin 0.391 4 0.244 5 0.27 0.313 6 GAPDH 0.426 5 0.293 6 0.16 0.261 5 α-tubulin 0.242 2 0.177 2 0.24 0.042 4 RPL13α 0.319 3 0.164 1 0.32 0.024 3 RPS27a 0.197 1 0.206 4 0.35 0.012 2 RPS3 0.197 1 0.202 3 0.39 0.002 1
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表 3 内参基因的最佳数量评估
Table 3. Determination of the optimal number of reference genes for normalization
Vn/n+1 配对变异值 Vn/n+1 配对变异值 V2/3 0.084 V4/5 0.092 V3/4 0.092 V5/6 0.074 说明：n表示内参基因数目
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