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松材线虫Bursaphelenchus xylophilus是公认的检疫性有害生物，破坏性地危害欧亚地区的松林资源[1]。松材线虫的生活史分为2个阶段：繁殖阶段和扩散阶段[2]。在温度适宜的夏季和秋季，松材线虫进入繁殖阶段，在树体内经过卵、繁殖型幼虫(J1~J4)，再发育为成虫。在不良环境条件下，松材线虫进入扩散阶段，即滞育型周期，繁殖型J2会转型发育为扩散型J3幼虫和扩散型J4幼虫，在此过程中体内脂滴数量增加，并发生脂滴融合现象，形成超大脂滴或者块状脂肪[3]。扩散型J4幼虫口针退化不取食，依靠消耗体内超大脂滴作为能量侵染新的寄主植物。因此，脂滴对于松材线虫的生存和传播都具有重要作用。中性脂肪(甘油三酯和胆固醇)在线虫中主要以脂滴的形式存在，是松材线虫体内脂肪的主要储存形式[4-6]。松材线虫的肠道是脂类物质沉积的主要场所。由于线虫虫体是透明的，可在显微镜下清楚地看到从头部到尾部的整个肠道，是研究脂肪沉积的一种理想模型[7]。模式线虫秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans可采用染料苏丹黑B、尼罗红和油红O等方法检测脂肪储存和代谢，不同染色方法下脂肪含量的表征呈现一定程度的差异。利用脂溶性的染料苏丹黑B来着色脂滴，脂滴在肠和皮下组织中可见。荧光染料尼罗红和油红O可将脂滴染成红色[8]。目前在松材线虫中尚无相关脂滴染色研究报道，因此，本研究使用不同的染料标记松材线虫体内的脂滴分布，通过使用ImageJ软件测量线虫脂滴的平均像素强度，来表征脂肪含量，确定适合松材线虫脂滴染色的方法[9]。
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松材线虫NXY61虫株为中国林业科学院森林保护研究所从浙江省宁波市罹病马尾松Pinus massoniana中分离获得。使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养的灰葡萄孢Botrytis cinerea来培养繁殖型松材线虫[2]。混合龄期的繁殖型线虫置于PDA培养基上生长3 d，在加入灭菌双蒸水(ddH2O)的贝尔曼漏斗中将线虫从培养基上洗下来，3 000 r·min−1离心3 min，清除上清液。扩散型3龄幼虫从当年采集的疫木中分离，扩散型4龄幼虫从媒介昆虫松墨天牛Monochamus alternatus体内分离。
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将松材线虫用M9缓冲液(3.00 g KH2PO4, 6.00 g Na2HPO4, 5.00 g NaCl, 1 mL 1 mol·L−1 MgSO4，加入蒸馏水定容至1 L)洗涤离心3次(3 000 r·min−1，1 min)；将线虫置于含体积分数为1%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)的M9缓冲液中，4 ℃过夜；−80 ℃冰箱冻融3次；将M9洗涤固定的线虫经梯度体积分数乙醇(25%，50%和70%)分级脱水，每级5 min；随后，在溶于体积分数为70%乙醇的苏丹黑B溶液中进行染色[10]。显微镜观察和拍摄染色后的线虫，并对皮下和肠道内染色的脂滴像素统计。
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将线虫用体积分数为1%多聚甲醛溶液固定，使线虫细胞和亚细胞结构保持稳定状态[9]。线虫和多聚甲醛溶液混合，并于室温摇动2~3 h后，静置使线虫沉降；在−80 ℃冰箱冻融3次，固定后的线虫逐级脱水；在M9缓冲液的线虫沉淀中加入1 mL尼罗红(1 mg·L−1)，在避光的环境下混匀并染色25~30 min，染色期间轻轻翻转离心管，使得虫体均匀接触染料；用1×PBS(8.00 g NaCl，0.20 g KCl，1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，溶于800 mL蒸馏水，用HCl调节溶液pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L)清洗1次，去除线虫表面的染料，然后使线虫自然沉降。最后用显微镜观察拍照。
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用M9缓冲液将松材线虫洗至离心管中，在体积分数为1%多聚甲醛室温或4 ℃固定15~30 min；然后置于−80 ℃冰箱中冷冻15 min，在43 ℃水浴中迅速解冻；低速离心1 min，弃上清；用1×PBS冲洗3次，弃去PBS；用体积分数为1%Triton X-100、异丙醇油红O溶液浸泡30 min；用1×PBS冲洗3次。用异丙醇置于载玻片上，显微镜下观察拍照[11]。
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使用改良的后置油红O染色方案[12]。将油红O溶于异丙醇，制成质量浓度为5.00 g·L−1原液。采用混合法制备油红O工作液(60%的原液和40%的水)。油红O工作液静置后用0.22 mm自旋过滤器过滤。将线虫用体积分数为1%多聚甲醛/PBS在室温下固定摇动30 min；然后立即将样品在冰箱中冷冻干燥15 min，并在自来水中溶解，共3次；低速离心1 min，弃上清；用1×PBS洗涤样品3次，用体积分数为60%异丙醇脱水2 min；用1 mL油红O工作液摇动1 h进行染色。染色后的样品用1×PBS洗涤3次，再水合1×PBS，并安装在琼脂填充的载玻片上，显微镜观察拍照。
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用徕卡荧光正置显微镜(DM4B)使用40×物镜观察固定的尼罗红、油红O和苏丹黑B染色的线虫，用CCD相机(DFC7000T)拍摄16位图像，并用ImageJ(V2.1.4.7)进行图像处理分析。
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将固定后的虫体置于显微镜下观察，与未染色线虫相比，苏丹黑B染色线虫的肠道普遍被染成蓝色(图1)。在实验过程中，用苏丹黑B原溶液染色线虫如图1A~B，显微镜下观察到的脂滴边界不清晰，整条成虫呈现深蓝色；将苏丹黑B稀释60%，染色观察如图1C~D，幼虫和成虫脂滴边界尚清楚，但仍会影响观察松材线虫的脂滴动态变化。
图 1 苏丹黑B、尼罗河红染色线虫中相同脂滴
Figure 1. Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets
尼罗红与苏丹黑B共同标记了肠道周围的脂滴。尼罗红染色线虫在显微镜下观察到部分脂滴呈浅红色(图1E~H)。将配置的母液染料稀释500倍，染色时间30 min，显微成像效果不佳(图1E~F)，大部分虫体脂滴染色不均，其中成虫的色泽较浅。当提高工作液浓度，仅将母液稀释了100倍，为5 mg·L−1, 并将染色时间增加为1 h (图1G~J)，可以分辨分布在成虫肠道周围的圆形大脂滴，而幼虫的脂滴边界相对比较模糊，不便于测量松材线虫脂滴的大小和脂肪存储量。
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在用油红O与后置油红O染色线虫时，培养的同步发育繁殖型线虫和野外采集的扩散型线虫都呈现明显的红色脂滴(图2)。油红O染色如图2A~D，可以观察到，当虫体内出现较多脂滴时，单个脂滴未能良好分离，会影响测量松材线虫脂肪储存量化及繁殖型与扩散型松材线虫的脂滴大小的变化。用后置油红O方法染色线虫结果如图2E~J，在显微镜下观察到脂滴边界清晰，其中J2和J3幼虫大部分较小的脂滴分布在肠道和表皮，并能观察到从幼虫J4到成虫出现小脂滴聚集成大脂滴的现象。扩散型J3较大的脂肪块与扩散型J4脂质小滴之间的脂滴大小变化十分明显。
图 2 油红O、后置油红O染色线虫中相同脂滴
Figure 2. Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus
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通过光学显微镜捕获的苏丹黑B、尼罗红、油红O染色松材线虫脂滴图片，用ImageJ进行图像处理，计算线虫脂滴图片的平均像素强度。图3结果显示：苏丹黑B和后置油红O染色松材线虫脂滴的平均像素强度明显高于尼罗红和油红O染色，其中苏丹黑B染色后整条虫呈现蓝色，所以脂滴平均像素强度最高，而尼罗红的最低，因为颜色较浅。这就说明脂滴平均像素强度偏高或偏低都会影响表征脂肪。经ImageJ图像处理比较分析，后置油红O染色脂滴经计算转换与原始图像的一致，具有单个脂滴的良好分离(图4)。
图 3 使用苏丹黑B、尼罗红、油红O和后置油红O染色的松材线虫脂滴平均像素的ImageJ图像分析结果
Figure 3. ImageJ image analysis results of average pixels of B. xylophilus lipid droplets stained with Sudan black B, Nile red, oil red O, and post-fix oil red O
图 4 后置油红O染色的松材线虫脂滴的图像处理
Figure 4. Image processing of post-fix oil red O stained adipocytes in B. xylophilus
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如表1所示：综合考虑染色方法的简易性、染色时间的长短[11]、染色的观察效果，后置油红O染色方法在4种染色方法中的染色时间相对较短，脂滴呈现的效果比较清晰，能实现脂滴的单个分离，方法步骤比较简单，认为后置油红O染色方法是松材线虫脂滴的最佳染色方法。
表 1 不同染料标记和方法的比较
Table 1. Comparison of different dyestuff markers and methods
染料 储备溶液 脱水步骤 染色时间/min 输出颜色 实现单个脂滴分离 油红O 5 g·L−1异丙醇 30 红色 否 苏丹黑B 体积分数为70%乙醇 乙醇系列 360 深蓝色 否 尼罗红 丙酮 乙醇系列 30 浅红色 否 后置油红O 5 g·L−1异丙醇 体积分数为60%异丙醇 60 红色 是 -
本研究通过使用染料标记的不同测定法来探索松材线虫的最佳脂滴染色方法。在染色前，需要先对虫体进行有效固定，多聚甲醛可很好地保存生物体组织的细微结构特征。固定以后，组织中的各种物质会沉淀和凝固，产生不同的折射率，促使产生光学差异，方便染色后观察。
油红O、苏丹黑B、尼罗红染色一般都能观察到线虫体内脂肪储存，但在本研究中呈现不同显色效果。苏丹黑B作为一种经典的染料，在固定过程中经乙醇的洗涤，无法标记线虫中脂肪储存[9]。本研究也发现：苏丹黑B染色松材线虫脂滴观察效果不佳，染色时间也比较长。尼罗红是一种由尼古蓝衍生的脂类染料，在疏水环境时发荧光，既可染色脂滴，又可检查完整活体动物的脂肪含量[13-15]，经常被作为秀丽隐杆线虫的脂肪酸代谢研究的染料标记。最近研究还发现，鲜活的线虫经尼罗红染色没有显示染色模式的差异[12]。当线虫被喂食尼罗红时，染料会在与溶酶体有关的细胞器中积聚[16]，固定尼罗红比喂食尼罗红更能显示脂肪储存情况。本研究初期观察到的脂滴色泽非常浅，甚至整条线虫未被染色，呈透明状态，经过多步实验探索，线虫中脂滴有部分染色，但仍有染色不完整的脂滴。而且由于尼罗红是亲水性染料，可能会染色脂褐素，导致固定染色不能将中性脂肪存储区与脂褐素区分开，影响结果[17]。油红O是一种油溶性偶氮染料，溶于乙醇和丙酮，在脂肪内能高度溶解，从而染色，颜色比较鲜红，染色效果相对于前面2种染料要好。后置油红O染色用体积分数为1%多聚甲醛的固定液在分子杂交炉中室温条件摇动30 min，通过摇动，使线虫充分接触固定液。将样品放在−80 ℃冰箱中冻融3次，并在自来水中溶解，相比于油红O染色(在43 ℃水浴中迅速解冻)，可增加线虫的缓冲性。在后置油红O染色过程中，异丙醇脱水使线虫显微成像时观察到的组织结构更清晰，用自旋过滤器过滤油红O工作液，可以减少沉淀杂质的产生。用琼脂填充幻灯片成像，可以防止线虫干死，也可以更好地固定已染色的线虫。经过多次实验探究，油红O染色之后，观察到的大小脂滴聚集，脂滴边界未能体现，红色会成片区域出现，当测量脂滴大小变化、脂滴数量时，会加大实验数据误差；后置油红O染色方法经过改良，线虫在室温下用体积分数为1%多聚甲醛摇动，并经多次冻融以后用体积分数为60%的异丙醇脱水，染色效果比较理想，可直接观察脂滴大小变化。综上所述，后置油红O染色方法是最佳松材线虫脂滴染色方法。
Comparison of four lipid droplets staining methods in Bursaphelenchus xylophilus
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摘要:
目的 从4种脂滴染色方法中筛选最适合松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的脂滴染色方法。 方法 采用苏丹黑B染色、尼罗红染色、油红O染色和后置油红O染色等4种染色方法来固定和表征松材线虫体内脂滴的分布，对染色后的线虫进行显微观察和拍摄，并用ImageJ软件对皮下和肠道内染色的脂滴像素进行统计。 结果 4种脂滴染色方法对松材线虫的脂滴都有一定的染色效果。显微拍照后观察脂滴与ImageJ软件图像处理后像素强度比较结果显示：苏丹黑B染色脂滴像素为200.00×1017 m2，尼罗红染色脂滴像素41.64×1012 m2，油红O染色脂滴像素52.12×1017 m2，后置油红O染色脂滴像素83.85×1017 m2。苏丹黑B染色脂滴平均像素强度最高，尼罗红染色脂滴平均像素强度最低，而后置油红O法染色脂滴经计算转换产生了与原始图像一致的表征，实现单个脂滴的良好分离。 结论 综合染色方法的简易、染色时间的长短和染色后的效果，改良后的后置油红O法是最佳的松材线虫脂滴染色方法，能清晰显示脂滴大小及分布。图4表1参17 Abstract:Objective With a comparison of the four commonly used methods for staining Caenorhabditis elegans lipid droplets, this study is aimed to figure out the most suitable dyeing method for Bursaphelenchus xylophilus lipid droplets. Method Four were used to fix and characterize After the distribution of lipid droplets in B. xylophilus was defined with its features revealed employ four dyeing methods including Sudan black B staining, Nile red staining, oil red O staining, and post-fix oil red O staining, the stained nematodes were observed and photographed microscopically, and then ImageJ software was used to count the subcutaneous and intestinal lipid droplet pixels. Result 1) The four dyeing methods have a certain dyeing effect on the lipid droplets of B. xylophilus. 2) Upon the observation of the lipid droplets after microphotographing and the comparison of the pixel intensity after image processing by ImageJ software, the stained lipid droplets pixels with Sudan black B, Nile red, oil red O and post-fix oil red O are 200×1017 m2, 41.64×1012 m2, 52.12×1017 m2, and 83.85×1017 m2 respectively. 3) Lipid droplets stained by Sudan black have the highest average pixel intensity, and lipid droplets stained by Nile red have the lowest average pixel intensity, whereas the lipid droplets stained by post-fix oil red O, after calculation and conversion, produced a consistent characterization with the original image, with a favorable separation of individual lipid droplet. Conclusion In conclusion, in light of the simplicity of the dyeing method, the length of dyeing time and the effect of dyeing, the improved post-fix oil red O method is the optimal method for dyeing lipid droplets in B. xylophilus, with the size and distribution of lipid droplets clearly shown. [Ch, 4 fig. 1 tab. 17 ref.] -
Key words:
- Bursaphelenchus xylophilus /
- lipid droplets staining /
- Nile red /
- oil red O /
- Sudan black /
- post-fix oil red O
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在自然界中，植物易受到各种病原物的侵害，植物与病原物协同进化，形成了一系列复杂的防御体系。组成型抗性和诱导型抗性是植物应对病原菌侵害和植食者取食的2种典型的防御机制，植物通过协调不同防御机制实现其最佳防御效果[1]。角质蜡质是植物表皮中由超长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物构成的一类次生代谢产物。角质蜡质组成的角质层是植物在长期的生态适应过程中，为抵御恶劣生态环境、生物/非生物胁迫而形成的重要保护屏障，广泛参与植物逆境抵御、病虫害防卫等诸多抗性生理过程，在抗病、抗虫、耐盐、抗旱等方面具有重要的生态学功能[2]。近年来，角质蜡质的研究受到各国研究者的持续关注，取得了诸多新进展[3-4]。本研究以植物组成型、诱导型抗性防御反应为主线，归纳总结目前有关角质蜡质代谢及其抗病作用机制的研究进展，以期为植物抗病机理的阐明及相关病害的防治提供研究思路。
1. 角质蜡质生物合成
1.1 角质层蜡质生物合成
角质层是植物地上部分一层重要的疏水性保护膜，对植物适应复杂多变的环境具有重要意义[5]。最新研究证实：植物根冠和胚胎中也存在角质层结构，其中根冠角质层在植物应对渗透胁迫和侧根形成中发挥了重要作用，而胚胎角质层则在成熟种子中起着扩散屏障以及调控种子萌发的作用[6-7]。角质层结构可分为三部分：第1部分是由嵌入细胞壁多糖的角质以及蜡质组成的角质层基层；第2部分是由角质和镶嵌在角质内部的蜡质共同组成的真角质层；第3部分是由蜡质膜/蜡质晶体沉积在植物表面形成的蜡质层[8]。
角质层由角质和蜡质组成，其中蜡质又分为表层蜡质和内部蜡质。角质层蜡质由超过20个碳原子的超长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物组成，包括醛、烷烃、支链烷烃、烯烃、伯醇、仲醇、不饱和脂肪醇、酮和蜡酯，以及萜类和甾醇类的环状化合物等[9]。利用正向和反向的遗传学手段对拟南芥Arabidopsis thaliana等模式植物开展研究，目前蜡质的生物合成途径已经基本弄清。对拟南芥中大量蜡质合成缺陷突变体ECERIFERUM(CER)的研究，已经分离鉴定出了一大批涉及蜡质生物合成的蜡质突变体基因(CER)。质体合成的C16、C18脂肪酸是蜡质合成的重要前体物，在长链脂酰辅酶A合成酶(LACS)的作用下以脂酰-COA的形式运输到内质网，通过内质网上的脂肪酸延长酶复合体以及BAHD酰基转移酶CER2及其同系物CER2-LIKE1/ CER26和CER2-LIKE2在内的一些辅助因子的协同作用进行碳链延伸[10]，生成C20以上的超长链脂酰-COA；随后通过烷烃合成途径形成醛、烷烃、次级醇和酮等蜡质组分，或通过内质网的醇合成途径形成初级醇和蜡酯等蜡质组分[11]。拟南芥烷烃合成酶CER1和WAX2/CER3基因突变体，其醛、烷烃、次级醇和酮的含量降低，这与烷烃合成通路的代谢产物一致；而CER1、WAX2/CER3和CYTB5共表达引起来自超长链脂酰-CoA的超长链烷烃的氧化还原依赖性合成，表明其可能编码烷烃合成途径中烷烃的合成[12]。作为拟南芥中编码醛脱羧酶的CER1基因家族成员之一的CER1-like1也通过与CER1相同的机制在烷烃的生物合成中起着至关重要的作用，但CER1-like1更偏向于催化短链烷烃的合成[13]。烷烃合成途径的最终反应被认为是由属于细胞色素P450家族的中链烷烃羟化酶1(MAH1/CYP96A15)催化烷烃氧化产生次级醇，并进一步催化次级醇氧化生成酮类[14]。研究表明：在醇合成途径中，编码脂酰辅酶A还原酶的CER4基因负责地上部分组织表皮细胞和根中初级醇的合成，而编码蜡酯合成酶基因的WSD1基因其拟南芥突变体表现出比野生型更低的蜡酯含量，表明WSD1可能负责蜡酯的合成[15-17]。
1.2 角质层角质生物合成
成熟角质层中还含有角质，角质是一种主要由ω端和中链羟基化的C16和C18的氧化脂肪酸以及甘油以酯键交联而成的聚合物[18]。角质单体的合成在内质网上进行，内质网对质体产生的C16和C18脂肪酸进一步修饰合成各种以单酰基甘油酯形式存在的角质单体。角质单体的合成涉及许多氧化反应，由细胞色素P450酶催化，其中末端碳链氧化反应涉及细胞色素P450末端羟化酶(CYP86A)家族成员，而中链氧化反应涉及细胞色素P450中链羟化酶(CYP77A)家族成员。拟南芥CYP86A2、CYP86A4、CYP86A7和CYP86A8突变体表现出角质层结构异常和角质组分改变，表明这几个基因与角质生物合成中ω链的羟基化密切相关[19]。ω-羟基脂肪酸则进一步经过脱氢反应生成脂肪醛，脂肪醛再经氧化反应最终生成二羧酸；虽然催化该过程的酶尚不清楚，但是由于CYP86A2和HTH(hothead)这2个基因的拟南芥突变体中缺少二羧酸，因此认为其可能涉及ω-OH脂肪酸氧化生成二羧酸的反应[20-21]。CYP77A6是目前唯一被鉴定为能够进行中链羟化的酶，CYP77A基因在花瓣中强烈表达，但在其拟南芥突变体的花瓣中却完全丢失了二羟基角质单体；其异源表达结果表明：该基因特异性催化ω-OH脂肪酸的中链羟基化，这也表明角质合成的中链羟基化反应发生在末端羟基化之后[22]。此外，CYP77A4异源表达催化环氧化羟基脂肪酸的合成，表明其可能参与环氧化脂肪酸的合成，但目前尚未完全证实。角质单体合成的最终反应由甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化完成，脂酰-COA在甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化下，酰基转移至甘油-3-磷酸生产单酰基甘油角质单体。拟南芥GPAT1-8基因被报道在细胞外脂质聚酯的合成中起着重要作用，其中GPAT4-8已经被证明有助于角质的合成，并且这几种酶相较于未被取代的脂肪酸表现出对末端羟基或羧基脂肪酸具有更强的催化效率，表明他们在氧化反应之后发挥作用[23]。
质膜ATP结合盒转运蛋白(ABCG)已经被证明可能与角质和蜡质向质外体的转运有关；而脂质转移蛋白(LTPs)被证明很可能有助于角质单体通过细胞壁向角质层的转运[24]。随着番茄Solanum lycopersicum中CD1/GDSL1这第1个角质合酶的发现，长久以来存疑的脂肪酶(GDSL)家族的酶在角质组装中的作用也得到了确证[25-27]，而拟南芥α/β水解酶蛋白基因BODYGUARD (BDG)的发现证明了植物中可能存在一些其他的角质合酶[28]。尽管目前的研究已经在角质蜡质的合成、运输、组装方面取得了一定的进展，但角质层的形成机制仍然未知。
2. 植物的抗病类型
2.1 组成型抗性
组成型抗性是植物的固有特性，是植物在遭受侵害前就己存在的抗性，包含植物固有的层和细胞壁的角质、蜡质、木质素等成分。其中，化学抗性主要包括酚类、皂苷、不饱和内酯及有机硫化合物等植保素(phytoalexins)[29]。组成型抗性是植物在长期的系统发育中产生和发展起来的[30]，由植物基因型决定，但其抗性强弱也会受到环境因素的影响。
2.2 诱导型抗性
诱导型抗性是指植物经病原物刺激后诱导产生的抗性成分或抗性反应，包括物理抗性和化学抗性2类。物理抗性包括细胞壁及角质层加固和修复、乳突的形成、木质化作用及侵填体的形成等[31]。化学抗性则包括过敏性反应的诱导、植保素的产生、水解酶的激活及病程相关蛋白的表达等。诱导型抗性类似于免疫反应，只有在遇到外界因子，如物理损伤、植食者取食和病原菌侵染时才得以表现[32]。因此，诱导型抗性具有“开-关效应”，也称作“兼性抗性”。物理抗性与化学抗性通常协同发挥作用，一些物理屏障和化学因子不仅属于组成型抗性，也会在诱导型抗性中起重要作用，典型的如角质蜡质。
诱导型抗性并非植物的原始性状，而是一种衍生性状。植物长期处于复杂的环境中，容易受到各种病原物的侵害，组成型抗性是一种被动的防御机制，并不能确保植物对病原物的完全防御。为了更好地抵御病原菌的入侵，植物进化出了一系列诱导防御反应，植物的这种抵抗外界病原物刺激所形成的防御反应又被称为植物的先天免疫。植物先天免疫由微生物、病原体和/或损伤相关的分子模式(分别为MAMP，PAMP和/或DAMP)识别相应的化学分子所触发[33]，这些化学分子在植物与微生物相互作用过程中释放，并被模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别。
植物的先天免疫包括两大类，病原物相关分子模式触发型免疫(PAMP-triggered immunity，PTI)和效应因子触发型免疫(effector-triggered immunity，ETI)[34]。植物-病原体互作中植物启动先天免疫的第1步是植物模式识别受体(PRRs)识别病原相关分子模式(PAMPs)的化学分子，引发病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)，激活植物体中促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，从而使植物产生早期应答反应[35]。然而，病原体为了抑制植物的诱导型防御反应便于自身的入侵反应，往往会产生大量抑制PTI激活的效应因子，而植物此时会启动先天免疫的第2步反应，通过特异性的抗性蛋白(R蛋白)识别效应因子，在侵染位点启动快速剧烈的防御反应，这种防御反应即为ETI[36]。ETI诱导的抗性通常表现为入侵位点的细胞凋亡，即过敏反应[37]。
MAMPs/PAMPs或DAMPs都可以诱导PTI[38]，并且相较于特异性的ETI具有更加广谱的抗性反应，如活性氧(ROS)积累，激活MAPK依赖性信号级联反应，植物抗毒素的生物合成，水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等防御相关激素以及相关抗性基因的诱导表达[33, 39]。植物的这2种免疫反应机制通过启动防御反应诱导植物产生局部和系统抗性，两者协同作用进而抵御病原菌的入侵[40]。植物在侵染位点启动超敏反应特异性抵御病原菌侵染的这种反应被称为植物的局部抗性，而与之相对的，植物活化抗性基因使植物在整株水平上产生抗性或者产生抵御病原菌再次入侵的抗性，这种非专化性的抗性则被称为系统抗性[41]。通常植物的系统抗性包括诱导系统抗性(ISR)和获得性系统抗性(SAR)，ISR主要由非致病菌诱导产生，而SAR则是由植物响应病原菌侵染产生的[42]。这2种系统抗性依赖于SA，JA和ET信号途径的协同效应。SA和JA作为植物中十分重要的2条信号途径，在抗病化学信号的转导中的作用尤为重要。现在也有越来越多的证据表明，角质和蜡质在植物的诱导防御反应中也扮演着重要的角色[43]。
3. 角质蜡质在植物-病原互作中的作用
3.1 角质蜡质的组成型抗性
角质蜡质组成的角质层作为植物地上部分共有的一层保护性屏障，在植物组成型抗性中扮演着重要角色。角质蜡质组成型抗性作用也可分为物理抗性和化学抗性2类[44]。角质层及其组分角质蜡质维持着植物正常生长必需的机械强度，与植物对真菌的物理抗性密切相关；许多真菌需要通过附着胞的物理穿刺刺破植物角质层进而侵染内部细胞[45]，因此，完整的具有一定机械强度的角质层会阻碍真菌对植物的侵染，如许多果腐病病原体只能通过角质层缺陷的方式侵染果实[46]。
植物角质蜡质组成对病原菌的物理抗性，不仅影响植物表皮机械强度，还会影响植物表面的疏水性(不渗透性)[44]。真菌孢子的萌发和细菌的繁殖需要高湿环境，疏水的角质层表面则不利于病原菌的停滞，能有效减少病原菌的侵染[47]。拟南芥和番茄角质蜡质合成缺陷的突变体具有强渗透性的角质层，表现出病原体感染的易感性。如拟南芥酰基载体蛋白4(ACP4)和GL1(GLABROUS 1)突变体的角质蜡质含量更低，增加了其表皮渗透性，叶片则表现出对2种病原体的高易感性[48-49]。研究表明：角质蜡质相关SHINE转录因子的突变导致角质层缺陷，进而导致了对灰霉病菌Botrytis cinerea易感性[50]。这些结果也进一步验证了角质蜡质代谢可通过调控角质层的渗透性进而影响植物的抗病性。
此外，角质蜡质组分也具有化学抗性功能。角质蜡质的某些组分可以抑制或者刺激孢子的萌发，如去蜡质处理的大麦Hordeum vulgare叶片有更多的附着胞生成，增加了其对锈菌的敏感性[51]；水稻Oryza sativa叶片角质组分十六烷二醇，可以诱导稻瘟菌Pyricularia oryzae的产生和附着胞的分化形成，并促进灰霉病真菌孢子的萌发和角质酶的表达[52-53]。此外，角质和蜡质的某些组分对某些病原体还具有直接的抑制作用，如C16和C18羟基脂肪酸对丁香假单胞菌Pseudomonas syringae有直接的抑制作用[54]，这些角质蜡质成分对病原菌的抑制作用构成了角质蜡质组成型抗性中的化学抗性。
综上所述，角质蜡质一方面能够通过影响角质层的物理性质(机械强度和疏水性)，实现对病原菌的物理屏蔽作用；另一方面也能通过羟基脂肪酸等抑菌成分直接调控病原菌的增殖分化来实现其化学防御功能。
3.2 角质蜡质的诱导型抗性
传统观点认为，角质层及其角质蜡质组分主要通过组成型抗性发挥其保护性屏障功能。现在更多研究证实：角质蜡质在植物的诱导防御反应中也发挥着重要作用[55]。与组成型抗性类似，角质蜡质的诱导型抗性也可分为物理抗性和化学抗性2类。在病原菌侵染植物的过程中，角质蜡质组分均会对病原菌的刺激作出响应。角质蜡质诱导型物理抗性功能的发挥，一般是响应病原菌的刺激，上调角质蜡质的合成，增强角质层的保护性屏障作用。如受到炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides感染的番茄果实，其角质蜡质的生物合成会显著上调[56]。柑橘Citrus sinensis花瓣感染炭疽病后，其表皮细胞脂质合成上调，角质蜡质相关代谢物沉积，并引起角质层结构的改变进而增强其物理抗性[57]。此外，大麦感染由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum引起的赤霉病后，抗性品种小穗会上调角质层的生物合成进而增强其对病原菌的物理抗性[58]。上述这些都表明角质蜡质在植物的诱导防御反应中发挥了重要的物理屏障作用。
角质蜡质也可作为诱导型抗性成分在病原菌侵染过程中发挥化学抗性功能。病原体侵染植物后，植物产生的降解产物和释放的内生肽可作为植物损伤相关分子模式的诱导子(DAMPs)被植物模式识别受体(PRRs)所识别，继而启动下游的免疫反应(PTI)[33]。目前的研究表明：角质层被真菌角质酶降解的产物也可作为DAMPs被损伤相关模式的受体所识别[17, 59]。由此认为角质蜡质可以通过作为诱导子激活下游的诱导防御反应进而实现其化学抗性的功能(图1)。这一观点也得到了许多外施角质单体研究结果的支持，如外施无抑菌活性的角质单体增加了大麦对白粉病菌Erysiphe graminis f.sp. hordei的抗性[60]；组织培养的马铃薯Solanum tuberosum细胞外施角质单体后乙烯的合成积累和相关防御基因的表达均上调[61]；外源施加角质单体增加了番茄病程相关基因的表达水平[62]；水稻叶片外源施加角质单体16-羟基棕榈酸，脂质转运蛋白基因OsLTP5和病程相关基因PR-10的表达也上调[63]。这些都在一定程度上表明角质蜡质可能是通过调控下游抗性基因的表达进而实现其化学抗性(图1)。
进一步的研究表明：除了作为诱导子调控下游抗性相关基因，某些角质蜡质组分也可以作为活性氧的诱导子诱导活性氧的积累。如黄瓜Cucumis sativus下胚轴外施角质蜡质组分的研究表明：某些角质蜡质成分具有良好的活性氧诱导活性[64-65]，而活性氧介导了植物包括超敏反应在内的一系列防御反应。基于这些研究，目前也有一些观点认为：角质蜡质可能通过作为活性氧的诱导子来激活下游的诱导防御反应进而实现其抗性功能[43,66]。除此之外，角质蜡质被认为可能作为信号分子影响植物的系统获得性抗性(SAR)[67]。基于上述研究，可得出角质蜡质作为诱导子激活下游的诱导防御反应时，可能主要是通过调控病原物相关分子模式触发型免疫(PTI)中的包括活性氧爆发，抗病基因表达，系统获得性抗性在内的一系列的抗性反应进而实现其抗性功能(图1)。
大量研究证实：激素信号在植物-病原体互作中发挥了重要作用[68]；激素作为重要的抗病信号可能涉及了植物角质蜡质介导的抗性反应。某些激素被证明可以调控角质蜡质的合成和相关抗性，如JA处理豌豆Vicia sativa幼苗，诱导其角质单体羟基脂肪酸的合成[69]，而羟基脂肪酸作为植物的内源信号分子发挥了重要的抗性作用，这表明JA可以调控角质的生物合成进而介导其抗病性。JA和角质蜡质同属于脂肪酸代谢通路，具有共同的合成前体，因此，也有观点认为JA不仅能够直接调控角质蜡质的生物合成介导其抗病性，还和角质蜡质存在着代谢流的重定向；基于角质蜡质生物合成缺陷突变体的研究也在一定程度上支持了这一观点。如拟南芥突变体RST1角质蜡质生物合成缺陷，JA及其相关抗病基因PDF1.2上调表达，表现出对白粉病的抗性[70]；柑橘自发突变体蜡质合成缺陷，JA和相关抗病基因PDF1.2上调表达，增加了对病原菌的抗性[71]。这些结果均表明：JA和角质蜡质之间可以通过代谢流的重定向进而调控植物的抗病性(图1)。
4. 结论与展望
角质层作为植物抵御病原菌侵染的第1道防线，在植物-病原互作中具有重要作用。角质蜡质是角质层主要成分，一方面可以作为组成型抗性成分发挥物理抗性(物理屏障)和化学抗性(抑菌)作用；另一方面，也可作为诱导型抗性成分发挥作用，诱导产生的角质蜡质组分可作为信号分子或者诱导子激活下游的抗性反应进而发挥其化学抗性功能。目前，角质蜡质介导的诱导抗性研究受到广泛关注，但其作用机理尚未完全阐明；哪些角质蜡质组分参与了植物的诱导型防御反应，其作为诱导子激活下游抗性反应的具体机制如何？激素信号介导的角质蜡质抗性机制如何？诸多问题均有待深入探讨，角质蜡质抗性机理的阐释为作物抗性育种提供了新的思路。此外，虽然已有相关研究表明角质蜡质具有抑菌活性和植物免疫反应诱导子的作用，但目前尚无角质蜡质类生物农药(植物免疫诱导剂)的报道。因此，角质蜡质作为生物农药(植物免疫诱导剂)具有广阔的开发前景，同时角质蜡质类生物农药(植物免疫诱导剂)的开发也将为病害防控提供新的思路。
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图 1 苏丹黑B、尼罗河红染色线虫中相同脂滴
Figure 1 Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets
图 2 油红O、后置油红O染色线虫中相同脂滴
Figure 2 Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus
图 3 使用苏丹黑B、尼罗红、油红O和后置油红O染色的松材线虫脂滴平均像素的ImageJ图像分析结果
Figure 3 ImageJ image analysis results of average pixels of B. xylophilus lipid droplets stained with Sudan black B, Nile red, oil red O, and post-fix oil red O
图 4 后置油红O染色的松材线虫脂滴的图像处理
Figure 4 Image processing of post-fix oil red O stained adipocytes in B. xylophilus
表 1 不同染料标记和方法的比较
Table 1. Comparison of different dyestuff markers and methods
染料 储备溶液 脱水步骤 染色时间/min 输出颜色 实现单个脂滴分离 油红O 5 g·L−1异丙醇 30 红色 否 苏丹黑B 体积分数为70%乙醇 乙醇系列 360 深蓝色 否 尼罗红 丙酮 乙醇系列 30 浅红色 否 后置油红O 5 g·L−1异丙醇 体积分数为60%异丙醇 60 红色 是 
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200674
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