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松材线虫Bursaphelenchus xylophilus是公认的检疫性有害生物，破坏性地危害欧亚地区的松林资源[1]。松材线虫的生活史分为2个阶段：繁殖阶段和扩散阶段[2]。在温度适宜的夏季和秋季，松材线虫进入繁殖阶段，在树体内经过卵、繁殖型幼虫(J1~J4)，再发育为成虫。在不良环境条件下，松材线虫进入扩散阶段，即滞育型周期，繁殖型J2会转型发育为扩散型J3幼虫和扩散型J4幼虫，在此过程中体内脂滴数量增加，并发生脂滴融合现象，形成超大脂滴或者块状脂肪[3]。扩散型J4幼虫口针退化不取食，依靠消耗体内超大脂滴作为能量侵染新的寄主植物。因此，脂滴对于松材线虫的生存和传播都具有重要作用。中性脂肪(甘油三酯和胆固醇)在线虫中主要以脂滴的形式存在，是松材线虫体内脂肪的主要储存形式[4-6]。松材线虫的肠道是脂类物质沉积的主要场所。由于线虫虫体是透明的，可在显微镜下清楚地看到从头部到尾部的整个肠道，是研究脂肪沉积的一种理想模型[7]。模式线虫秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans可采用染料苏丹黑B、尼罗红和油红O等方法检测脂肪储存和代谢，不同染色方法下脂肪含量的表征呈现一定程度的差异。利用脂溶性的染料苏丹黑B来着色脂滴，脂滴在肠和皮下组织中可见。荧光染料尼罗红和油红O可将脂滴染成红色[8]。目前在松材线虫中尚无相关脂滴染色研究报道，因此，本研究使用不同的染料标记松材线虫体内的脂滴分布，通过使用ImageJ软件测量线虫脂滴的平均像素强度，来表征脂肪含量，确定适合松材线虫脂滴染色的方法[9]。
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松材线虫NXY61虫株为中国林业科学院森林保护研究所从浙江省宁波市罹病马尾松Pinus massoniana中分离获得。使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养的灰葡萄孢Botrytis cinerea来培养繁殖型松材线虫[2]。混合龄期的繁殖型线虫置于PDA培养基上生长3 d，在加入灭菌双蒸水(ddH2O)的贝尔曼漏斗中将线虫从培养基上洗下来，3 000 r·min−1离心3 min，清除上清液。扩散型3龄幼虫从当年采集的疫木中分离，扩散型4龄幼虫从媒介昆虫松墨天牛Monochamus alternatus体内分离。
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将松材线虫用M9缓冲液(3.00 g KH2PO4, 6.00 g Na2HPO4, 5.00 g NaCl, 1 mL 1 mol·L−1 MgSO4，加入蒸馏水定容至1 L)洗涤离心3次(3 000 r·min−1，1 min)；将线虫置于含体积分数为1%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)的M9缓冲液中，4 ℃过夜；−80 ℃冰箱冻融3次；将M9洗涤固定的线虫经梯度体积分数乙醇(25%，50%和70%)分级脱水，每级5 min；随后，在溶于体积分数为70%乙醇的苏丹黑B溶液中进行染色[10]。显微镜观察和拍摄染色后的线虫，并对皮下和肠道内染色的脂滴像素统计。
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将线虫用体积分数为1%多聚甲醛溶液固定，使线虫细胞和亚细胞结构保持稳定状态[9]。线虫和多聚甲醛溶液混合，并于室温摇动2~3 h后，静置使线虫沉降；在−80 ℃冰箱冻融3次，固定后的线虫逐级脱水；在M9缓冲液的线虫沉淀中加入1 mL尼罗红(1 mg·L−1)，在避光的环境下混匀并染色25~30 min，染色期间轻轻翻转离心管，使得虫体均匀接触染料；用1×PBS(8.00 g NaCl，0.20 g KCl，1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，溶于800 mL蒸馏水，用HCl调节溶液pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L)清洗1次，去除线虫表面的染料，然后使线虫自然沉降。最后用显微镜观察拍照。
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用M9缓冲液将松材线虫洗至离心管中，在体积分数为1%多聚甲醛室温或4 ℃固定15~30 min；然后置于−80 ℃冰箱中冷冻15 min，在43 ℃水浴中迅速解冻；低速离心1 min，弃上清；用1×PBS冲洗3次，弃去PBS；用体积分数为1%Triton X-100、异丙醇油红O溶液浸泡30 min；用1×PBS冲洗3次。用异丙醇置于载玻片上，显微镜下观察拍照[11]。
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使用改良的后置油红O染色方案[12]。将油红O溶于异丙醇，制成质量浓度为5.00 g·L−1原液。采用混合法制备油红O工作液(60%的原液和40%的水)。油红O工作液静置后用0.22 mm自旋过滤器过滤。将线虫用体积分数为1%多聚甲醛/PBS在室温下固定摇动30 min；然后立即将样品在冰箱中冷冻干燥15 min，并在自来水中溶解，共3次；低速离心1 min，弃上清；用1×PBS洗涤样品3次，用体积分数为60%异丙醇脱水2 min；用1 mL油红O工作液摇动1 h进行染色。染色后的样品用1×PBS洗涤3次，再水合1×PBS，并安装在琼脂填充的载玻片上，显微镜观察拍照。
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用徕卡荧光正置显微镜(DM4B)使用40×物镜观察固定的尼罗红、油红O和苏丹黑B染色的线虫，用CCD相机(DFC7000T)拍摄16位图像，并用ImageJ(V2.1.4.7)进行图像处理分析。
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将固定后的虫体置于显微镜下观察，与未染色线虫相比，苏丹黑B染色线虫的肠道普遍被染成蓝色(图1)。在实验过程中，用苏丹黑B原溶液染色线虫如图1A~B，显微镜下观察到的脂滴边界不清晰，整条成虫呈现深蓝色；将苏丹黑B稀释60%，染色观察如图1C~D，幼虫和成虫脂滴边界尚清楚，但仍会影响观察松材线虫的脂滴动态变化。
图 1 苏丹黑B、尼罗河红染色线虫中相同脂滴
Figure 1. Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets
尼罗红与苏丹黑B共同标记了肠道周围的脂滴。尼罗红染色线虫在显微镜下观察到部分脂滴呈浅红色(图1E~H)。将配置的母液染料稀释500倍，染色时间30 min，显微成像效果不佳(图1E~F)，大部分虫体脂滴染色不均，其中成虫的色泽较浅。当提高工作液浓度，仅将母液稀释了100倍，为5 mg·L−1, 并将染色时间增加为1 h (图1G~J)，可以分辨分布在成虫肠道周围的圆形大脂滴，而幼虫的脂滴边界相对比较模糊，不便于测量松材线虫脂滴的大小和脂肪存储量。
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在用油红O与后置油红O染色线虫时，培养的同步发育繁殖型线虫和野外采集的扩散型线虫都呈现明显的红色脂滴(图2)。油红O染色如图2A~D，可以观察到，当虫体内出现较多脂滴时，单个脂滴未能良好分离，会影响测量松材线虫脂肪储存量化及繁殖型与扩散型松材线虫的脂滴大小的变化。用后置油红O方法染色线虫结果如图2E~J，在显微镜下观察到脂滴边界清晰，其中J2和J3幼虫大部分较小的脂滴分布在肠道和表皮，并能观察到从幼虫J4到成虫出现小脂滴聚集成大脂滴的现象。扩散型J3较大的脂肪块与扩散型J4脂质小滴之间的脂滴大小变化十分明显。
图 2 油红O、后置油红O染色线虫中相同脂滴
Figure 2. Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus
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通过光学显微镜捕获的苏丹黑B、尼罗红、油红O染色松材线虫脂滴图片，用ImageJ进行图像处理，计算线虫脂滴图片的平均像素强度。图3结果显示：苏丹黑B和后置油红O染色松材线虫脂滴的平均像素强度明显高于尼罗红和油红O染色，其中苏丹黑B染色后整条虫呈现蓝色，所以脂滴平均像素强度最高，而尼罗红的最低，因为颜色较浅。这就说明脂滴平均像素强度偏高或偏低都会影响表征脂肪。经ImageJ图像处理比较分析，后置油红O染色脂滴经计算转换与原始图像的一致，具有单个脂滴的良好分离(图4)。
图 3 使用苏丹黑B、尼罗红、油红O和后置油红O染色的松材线虫脂滴平均像素的ImageJ图像分析结果
Figure 3. ImageJ image analysis results of average pixels of B. xylophilus lipid droplets stained with Sudan black B, Nile red, oil red O, and post-fix oil red O
图 4 后置油红O染色的松材线虫脂滴的图像处理
Figure 4. Image processing of post-fix oil red O stained adipocytes in B. xylophilus
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如表1所示：综合考虑染色方法的简易性、染色时间的长短[11]、染色的观察效果，后置油红O染色方法在4种染色方法中的染色时间相对较短，脂滴呈现的效果比较清晰，能实现脂滴的单个分离，方法步骤比较简单，认为后置油红O染色方法是松材线虫脂滴的最佳染色方法。
表 1 不同染料标记和方法的比较
Table 1. Comparison of different dyestuff markers and methods
染料 储备溶液 脱水步骤 染色时间/min 输出颜色 实现单个脂滴分离 油红O 5 g·L−1异丙醇 30 红色 否 苏丹黑B 体积分数为70%乙醇 乙醇系列 360 深蓝色 否 尼罗红 丙酮 乙醇系列 30 浅红色 否 后置油红O 5 g·L−1异丙醇 体积分数为60%异丙醇 60 红色 是 -
本研究通过使用染料标记的不同测定法来探索松材线虫的最佳脂滴染色方法。在染色前，需要先对虫体进行有效固定，多聚甲醛可很好地保存生物体组织的细微结构特征。固定以后，组织中的各种物质会沉淀和凝固，产生不同的折射率，促使产生光学差异，方便染色后观察。
油红O、苏丹黑B、尼罗红染色一般都能观察到线虫体内脂肪储存，但在本研究中呈现不同显色效果。苏丹黑B作为一种经典的染料，在固定过程中经乙醇的洗涤，无法标记线虫中脂肪储存[9]。本研究也发现：苏丹黑B染色松材线虫脂滴观察效果不佳，染色时间也比较长。尼罗红是一种由尼古蓝衍生的脂类染料，在疏水环境时发荧光，既可染色脂滴，又可检查完整活体动物的脂肪含量[13-15]，经常被作为秀丽隐杆线虫的脂肪酸代谢研究的染料标记。最近研究还发现，鲜活的线虫经尼罗红染色没有显示染色模式的差异[12]。当线虫被喂食尼罗红时，染料会在与溶酶体有关的细胞器中积聚[16]，固定尼罗红比喂食尼罗红更能显示脂肪储存情况。本研究初期观察到的脂滴色泽非常浅，甚至整条线虫未被染色，呈透明状态，经过多步实验探索，线虫中脂滴有部分染色，但仍有染色不完整的脂滴。而且由于尼罗红是亲水性染料，可能会染色脂褐素，导致固定染色不能将中性脂肪存储区与脂褐素区分开，影响结果[17]。油红O是一种油溶性偶氮染料，溶于乙醇和丙酮，在脂肪内能高度溶解，从而染色，颜色比较鲜红，染色效果相对于前面2种染料要好。后置油红O染色用体积分数为1%多聚甲醛的固定液在分子杂交炉中室温条件摇动30 min，通过摇动，使线虫充分接触固定液。将样品放在−80 ℃冰箱中冻融3次，并在自来水中溶解，相比于油红O染色(在43 ℃水浴中迅速解冻)，可增加线虫的缓冲性。在后置油红O染色过程中，异丙醇脱水使线虫显微成像时观察到的组织结构更清晰，用自旋过滤器过滤油红O工作液，可以减少沉淀杂质的产生。用琼脂填充幻灯片成像，可以防止线虫干死，也可以更好地固定已染色的线虫。经过多次实验探究，油红O染色之后，观察到的大小脂滴聚集，脂滴边界未能体现，红色会成片区域出现，当测量脂滴大小变化、脂滴数量时，会加大实验数据误差；后置油红O染色方法经过改良，线虫在室温下用体积分数为1%多聚甲醛摇动，并经多次冻融以后用体积分数为60%的异丙醇脱水，染色效果比较理想，可直接观察脂滴大小变化。综上所述，后置油红O染色方法是最佳松材线虫脂滴染色方法。
Comparison of four lipid droplets staining methods in Bursaphelenchus xylophilus
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摘要:
目的 从4种脂滴染色方法中筛选最适合松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的脂滴染色方法。 方法 采用苏丹黑B染色、尼罗红染色、油红O染色和后置油红O染色等4种染色方法来固定和表征松材线虫体内脂滴的分布，对染色后的线虫进行显微观察和拍摄，并用ImageJ软件对皮下和肠道内染色的脂滴像素进行统计。 结果 4种脂滴染色方法对松材线虫的脂滴都有一定的染色效果。显微拍照后观察脂滴与ImageJ软件图像处理后像素强度比较结果显示：苏丹黑B染色脂滴像素为200.00×1017 m2，尼罗红染色脂滴像素41.64×1012 m2，油红O染色脂滴像素52.12×1017 m2，后置油红O染色脂滴像素83.85×1017 m2。苏丹黑B染色脂滴平均像素强度最高，尼罗红染色脂滴平均像素强度最低，而后置油红O法染色脂滴经计算转换产生了与原始图像一致的表征，实现单个脂滴的良好分离。 结论 综合染色方法的简易、染色时间的长短和染色后的效果，改良后的后置油红O法是最佳的松材线虫脂滴染色方法，能清晰显示脂滴大小及分布。图4表1参17 Abstract:Objective With a comparison of the four commonly used methods for staining Caenorhabditis elegans lipid droplets, this study is aimed to figure out the most suitable dyeing method for Bursaphelenchus xylophilus lipid droplets. Method Four were used to fix and characterize After the distribution of lipid droplets in B. xylophilus was defined with its features revealed employ four dyeing methods including Sudan black B staining, Nile red staining, oil red O staining, and post-fix oil red O staining, the stained nematodes were observed and photographed microscopically, and then ImageJ software was used to count the subcutaneous and intestinal lipid droplet pixels. Result 1) The four dyeing methods have a certain dyeing effect on the lipid droplets of B. xylophilus. 2) Upon the observation of the lipid droplets after microphotographing and the comparison of the pixel intensity after image processing by ImageJ software, the stained lipid droplets pixels with Sudan black B, Nile red, oil red O and post-fix oil red O are 200×1017 m2, 41.64×1012 m2, 52.12×1017 m2, and 83.85×1017 m2 respectively. 3) Lipid droplets stained by Sudan black have the highest average pixel intensity, and lipid droplets stained by Nile red have the lowest average pixel intensity, whereas the lipid droplets stained by post-fix oil red O, after calculation and conversion, produced a consistent characterization with the original image, with a favorable separation of individual lipid droplet. Conclusion In conclusion, in light of the simplicity of the dyeing method, the length of dyeing time and the effect of dyeing, the improved post-fix oil red O method is the optimal method for dyeing lipid droplets in B. xylophilus, with the size and distribution of lipid droplets clearly shown. [Ch, 4 fig. 1 tab. 17 ref.] -
Key words:
- Bursaphelenchus xylophilus /
- lipid droplets staining /
- Nile red /
- oil red O /
- Sudan black /
- post-fix oil red O
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植物的蒸腾作用是其水分利用的主要方式，拉动水分在“土壤—植物—大气”连续体体系中不断循环迁移。蒸腾耗水与植物生命表征直接联系，决定着植物的水分盈缺和灌溉与否[1]。对活立木蒸腾耗水的准确测定，可以为低耗水树种选择、合理密度配置以及城市园林绿化等工作提供理论依据和参考[2]。树木蒸腾耗水产生的水势差会拉动水分通过木质部向上运输进而形成液流，因此树干液流可作为评估树木蒸腾耗水能力的一项重要指标[3-4]。目前，有多种方法可以评估树木蒸腾耗水能力，多数是通过测定树木液流速率来估算蒸腾耗水量和耗水能力。不同树干液流测定方法测量精度不同，在选择树干液流速率测量方法时需要考虑实验研究目的、活立木树种的生理条件和实验研究所处的自然环境等因素。目前液流速率的测量主要有同位素示踪法和热技术法[5] 2类。其中同位素示踪法通过将化学同位素作为示踪剂注射到树木木质部，从而检测树木液流速率；但该方法在野外应用不便，且测定精度较低，有待改进[6]。利用热技术法测定树干液流不受外界环境和树木自身结构影响，安装布置操作相对简易，并且对树木组织结构损伤较小，具有一定的应用优势[7]，因此被广泛应用于树干液流测定、液流速率与环境因子的关系研究中[8-10]。如王檬檬等[11]应用热技术法研究了晋西黄土区苹果Malus pumila树液流速率与太阳辐射、大气水份等的关系；温淑红等[12]应用热技术法分析了宁南黄土陵区山桃Amygdalus davidiana树树干液流速率与太阳辐射、温度、风速的关系；杨洁等[13]应用热技术法研究了树干液流时滞效应，并精确估算树木的蒸腾耗水；还有学者[14-15]应用热技术法探究树干木质部径向不同深度的液流速率和不同时间尺度下的液流速率特征等。目前常用的测量树干液流的热技术法主要有热脉冲法(Heat Pluse Velocity Method，HPVM)、热平衡法、热扩散法、热场变形法以及外热比法等，前3种方法在国内应用较多，后2种方法在国外有较为详细的应用描述，但在国内的研究有限。鉴于此，本研究综述了现有的树干液流无损检测方法，阐述这些方法的基本原理、装置布置、应用领域和最新研究案例，对不同热技术方法的测量精度、适用范围、潜在优势以及今后改进方向等方面进行讨论和比较，并对不同研究目标和实验条件下适用的测定方法给出建议，展望各自在液流研究方面的应用前景。
1. 基于热技术的液流检测方法
1.1 热脉冲法
热脉冲法最早由HUBER等[16]提出，首次用热作为液体流动的示踪剂，利用热脉冲测量植物液流速率。该装置由加热元件和2个热电偶组成探针块，通过测量加热器发出热脉冲随着液流上升到达热电偶处所需的时间，计算液流速率(图1A)。由于热传导和对流会使得测量结果偏高，MARSHALL[17]利用热流方程建立了热脉冲法的模型框架，为热脉冲法的进一步发展提供了理论基础。
基于脉冲加热的方法包括补偿热脉冲法、最大温差法(T-max法)以及热比率法。其中补偿热脉冲法(Compensation Heat Pulse Method，CHPM)通过测量2个对称放置在线性加热器两侧的温度传感器达到相同温度时的时间来计算液流密度，该装置安装探针时会对周围木材组织造成损伤而导致液流速率失真，因此需要根据不同探针间距设置校正参数[18]，从而使液流速率的测量值更接近真实值。T-max法[19]的装置由加热器和1个温度探针组成，通过记录从发出热脉冲至温度探针到达最大温度时的时间，再根据MARSHALL的基础理论计算液流速率。该方法设备简单，仅需确定被测树干边材的导热系数，即可计算树干液流密度。热比率法(Heat Ratio Method，HRM)基于补偿热脉冲法提出[20]，测量范围可以达到零值甚至延伸至负值，其装置由1个加热器和2个安装在加热器上下游的温度探针组成，通过测定2个探针的增温比即可计算液流速率。
1.2 热平衡法
热平衡法(Heat Balance Method，HBM)的原理是当树干内通过一定量液流时，加热元件作为热源会向树干提供已知的热量，直至树干温度趋于稳定。若不考虑热传导以及隔热层损失热量，热源提供的热量应与被液流带走的热量相等，可根据这种热平衡关系计算液流速率。热平衡法可分为茎热平衡法和树干热平衡法[21]。
1.2.1 茎热平衡法
茎热平衡法(Stem Heat Balance，SHB)[22]以环形加热元件作为热源，提供稳定的热量，热量散失途径包括树干液流带走、热传导向树干上下方散失和对流散失。装置(图1B)设计为包裹式，利用包裹式隔热层(通常为聚苯乙烯泡沫)防止热辐射造成的热量散失(树干周围的热辐射忽略不计)。加热元件上下方安装2对热电偶，用来测定液流通过后的温差，依据热量平衡关系计算液流。SHB法适用于测定胸径较小的树干，其优点是检测时不需要标定，不需要将热电偶插入树干中，对树木无直接损伤。
1.2.2 树干热平衡法
树干热平衡法(Trunk Heat Balance，THB)[23]的原理与茎热平衡法类似，均通过热量平衡关系计算液流，不同点是THB法测量装置(图1C)由插入树干的加热片和1对热电偶组成，2个热电偶分别安装在紧挨加热片上端(温度场最大值)和加热片下端(不受温度场影响)位置，通过记录液流通过前后树干温度差来计算液流。THB法同样不需要标定，并且可测定胸径较大的树干。但THB法设备较多，安装相对复杂，易对树干造成微损伤。目前热平衡法的应用较为广泛，通常用来研究环境因子与液流速率的关系以及耗水特性。
1.3 热扩散法
热扩散法(Thermal Dissipation Method，TDM)[24]又称Granier法，是目前应用最广泛的液流测定方法。该装置(图1D)包含2个传感器探针，沿液流方向插入树干中。下游(上部)探针包括加热元件(长约20 mm)，并缠绕在装有热电偶的钢针上，热电偶尖端正对加热元件的中间；下游(上部)探针不加热，用作参考探头，以测量木质部的环境温度。工作时下游探针以恒定功率(0.2 W)连续加热，受液流的散热影响，2个探头间存在温度差异，因此可通过温差与液流速率间的关系计算液流速率。
TDM法常用来研究树干液流与环境因子的关系。万艳芳等[25]应用热扩散技术测定并分析了青海云杉Picea crassifolia树干液流密度与环境因子的关系，确定液流密度的主要环境影响因子是太阳辐射。朱敏捷等[26]利用热扩散法测定了尾叶桉Eucalyptus urophylla树干液流，研究了树干液流的方位差异以及与环境因子的关系。姚增旺等[27]应用热扩散探针测定梭梭Haloxylon ammodendron树干液流，研究了树干液流与环境因子之间的时滞效应。另外，通过测定单株树干液流还可以推算林分蒸腾量。王志超等[28] 研究了林分蒸腾耗水规律后发现：忽略夜间林分蒸腾耗水量会导致对林分蒸腾耗水量的估计不准确。
1.4 热场变形法
基于热脉冲法测量树木液流密度时，需要测量热脉冲前后温度，获得温度差，这就要求木材具有较高的热稳定性；热脉冲法两侧测量需要时间间隔，可以测得液流密度的最大值为45 cm3·cm−2·h−1，说明该方法具有一定的局限性。为解决以上问题，NADEZHDINA等[29]提出了热场变形法(Heat Field Deformation，HFD)，通过记录线性加热器周围的木质部中不同径向位置的热场变化，将热场变形与树干木质部的液流密度联系起来。热场变形法液流检测系统(图1E)包括3个探针和1个加热器，其中2个探针沿轴向对称安装在加热器的上游和下游，另1个探针沿切向平行于加热器水平安装在加热器侧边，轴向探针测量对称温差，切向探针测量不对称温差。通过测定加热器周围轴向和切向的温度差来表征由树液流动而产生的热场变化，进而确定液流密度。液流密度q (cm3·cm−2·h−1)的一般计算公式为：
$$ q=3\; 600D_{{\rm{st}}}(K＋T_{{\rm{s}}-{\rm{a}}})/T_{{\rm{as}}}Z_{{\rm{ax}}}Z_{{\rm{tg}}}L_{{\rm{sw}}}。 $$ 其中：Dst表示树干边材热扩散率(m2·s−1)；(K＋Ts-a)/Tas表示温差比率；ZaxZtg表示传感器探针间距离的校正因子；Lsw表示边材深度。K表示零液流下Ts-a的绝对值，其中Ts-a为Tsym与Tas的差。Tsym表示对称探针间的温差；Tas表示非对称探针间的温差；Zax表示轴向上游探针与加热器的距离；Ztg表示切向探针与加热器的距离。
HFD传感器也可以记录反向流量，即将Tsym改为负值。因此，计算公式转换为：
$$ q＝－3 \;600D_{{\rm{st}}}(－K+T_{{\rm{s}}-{\rm{a}}})/T_{{\rm{as}}}Z_{{\rm{ax}}}Z_{{\rm{tg}}}L_{{\rm{sw}}}。 $$ 用HFD法测量液流密度，非零液流下，利用线性外推法能准确测得零液流密度，相比其他热技术方法优势显著。同时HFD法结合了对称与非对称温差测量，利用对称温差测量低液流密度较为有效，而测得的高液流密度与实际蒸腾量线性关系不显著，因此高液流密度准确性不够[30]。而利用非对称温差测量是中高液流密度准确性较高。因此，HFD法对于低液流量和高液流量都可以准确测定。
HFD法广泛应用于液流指数(the sap flow index，SFI) 的测定。SFI是植物水分状况的敏感指标，用来决定植物是否需要灌溉。SFI值通过在加热器周围轴向等距安装差动热电偶测得，是液流速率测定的原始数据之一[31]。此外，HFD法可以直接监测木质部的水分运动[32]，通过沿着木质部半径的不同深度，用围绕普通线性加热器的传感器进行液流测定，具有快速响应和高度敏感的特性。NADEZHDINA[33]在对枫树Acer spp. 水运输路径的研究中，利用HFD法测定枫树木质部液流，证实了枫树的维管结构具有完整拓扑结构。
1.5 外热比法
外热比法(External Heat-Ratio，EHR)是在热比率法的基础上提出的，用外部加热元件代替插入式加热元件，其基本原理与激光脉冲法(laser heat-pulse gauge，LHPG)类似。不同点是后者用近红外激光源代替插入式加热元件，并通过红外摄像机从外部监控热量传播，热脉冲速度由温度数据确定，并与液流速率相关。HELFTER等[34]利用激光脉冲法对小茎木本植物的液流速率进行了测定，发现小茎木本植物韧皮部与木质部液流速率几乎一致。CLEARWATER等[35]首次提出了外热比法(图1F)，将1个微型外部加热器(电子芯片电阻)和温度传感器(精密热电偶)粘在软木块上，并压在茎干表面。释放热脉冲后，根据2个热电偶的增温比来计算液流密度。利用外热比法可以测定灌木液流速率[36]，研究植物水动力学，对直径较小的茎干具有良好的适用性。外热比法最小可测直径为5 mm，可测液流密度为0.36~50.00 cm3·cm−2·h−1，较少应用于直径较大的茎干。因此，下一步可改进EHR技术，用于测定较大茎段植物的液流密度。
2. 问题与建议
2.1 热技术方法的不足与改进
探针的使用会对树干边材造成一定的破坏，使得探针处树干边材的热均匀性改变，从而降低测量结果的准确性。GREEN等[37]用二维的“热-液流”模型确定不同伤口大小的校正因子，给出了补偿脉冲法和T-max法的校正因子表，并通过比较美洲黑杨Populus deltoides与白柳Salix alba的液流通量值与实际蒸腾速率值的关系证明了校正因子的有效性。TESTI等[38]在补偿热脉冲法的基础上提出了校准平均梯度法(calibrated average gradient，CAG)，有效测定了低速液流，使用也较为简易。
LANGENSIEPEN等[39] 发现：为更好地适应小麦Triticum aestivum茎的解剖结构和热物理特性，在应用茎热平衡法测量小麦液流速率时，通过引入降噪方程可有效提高液流计的测量精度。TRCALA等[40]利用热场变形法的温度场理论，通过改变传感器的几何形状(从垂直到水平)来改善热平衡法的传感性能，实现了零液流和反向液流的测定。这种方法也被称为线性热平衡法[41]，是从基础传导—对流传热方程解析得出的精确方程，不仅提高了液流测定的精度，而且基于热导率信息实现了水含量的估算。NAKANO等[42]发现：对金柑Fortunella crassifocia进行环剥处理后，可利用热平衡法测定其韧皮部和木质部的液流速率。
TDM法测定液流速率需要估算线性回归关系，确定零液流状态下的温差，而这个过程会产生一定误差[43]，许多情况下准确性受到质疑[44]。因此用热扩散法确定树木的蒸腾量时，有必要对测量树种液流量估计方程进行校准[45-47]。
外热比法也存在一些不足。首先，大多数加热传感器从加热芯片的中心到两侧感温元件有一定的窄间距。随着热量沿横截面向内传播和沿茎轴上下传播，热量到达木质部导管时变得非常分散，来自液流的热比率信号会减弱。其次，加热器和温度传感器被安置在1个矩形的不导电硅酮/软木块中，无法有效隔绝环境温度对检测温度的影响，增加了液流检测结果的误差。再次，矩形加热芯片横压在圆柱形树干上，载荷不均匀，加热器元件使用窄的矩形芯片电阻，比圆形芯片更容易断开。为此，王胜[48]开发了1种新设计的EHR加热传感器，增加了加热元件至温度传感器的间距，使之更适应直径较大的茎干。改良后的装置茎干直径检测范围扩大，可用于胸径较小的树木测量。
2.2 基于热技术液流速度测量的常用方法比较
目前，基于热技术的树干液流测定方法日趋完善，不同方法具有相对应的优势和劣势。由表1可知：不同热技术方法液流测定装置均包括为加热器提供能量的能量供应单元和用于收集检测数据的数据记录仪。具体来看，热脉冲法不受环境条件以及树冠结构及根系特性的影响，装置简洁，但存在一定的灵敏度和精度问题。热平衡法无需标定，测量精度有所提高，但仅适于测定高液流密度。热扩散法是目前研究蒸腾耗水特性应用最广泛的方法，测定结果较准确，仪器成本较低，安装简单，有较成熟的商业化产品，但测定结果容易被低估。热场变形法操作复杂，应用较少，但该方法能够准确测定零液流以及逆向液流，测定精度与范围也有很大的提升。外热比法与激光脉冲法均可实现精确的零破坏检测，但仅适用于胸径较小的树干，另外，激光脉冲法装置成本昂贵，未能普及。
表 1 树干液流的测定方法对比Table 1 Comparison of methods for sap flow measurement方法 装置 优点 缺点 热脉冲法 加热器，2个热电偶 不受环境条件，树冠结构及根系特性的影响，简洁准确， 经济可行[49] 存在测定精度问题[37−38] 热平衡法 探针，加热元件 无需标定，进一步提高了测量精度[22−23] 不适用于液流速率较高的 植物[50] 热扩散法 加热探针，参照探针 测定结果较准确，仪器成本较低，安装简单，有较成熟的 商品化产品[51] 液流可能被低估[43] 激光热脉冲法 近红外激光源，红外摄像机 无须将热源插入植物茎干内，避免对茎干内组织破坏而造 成误差[34] 成本较高 热场变形法 加热器，3根探针 能够准确地测定零液流量以及逆向液流[52] 测定过程较复杂[29] 外热比法 微型外部加热传感器 精确、无损地测定胸径较小的树干中的双向液流[53] 微型外部量规的配置尚存 在问题[35−36] 2.3 活立木液流测定方法选择建议
利用热技术方法测定液流速率，可以精确估算树木蒸腾耗水量[54]，但不同热技术方法的测量精度、测定范围以及适用性不尽相同，实际应用时应根据不同实验条件选择不同的热技术方法。选择热技术方法测定树干液流通常需要考虑树木胸径大小、热技术方法的误差范围、热技术方法的测定精度、热技术方法的可行性等因素。
首先，不同胸径活立木应选用不同的热技术方法，外热比法和茎热平衡法适合测定胸径较小的树木，树干热平衡法适合测定胸径较大的树木。其次，不同热技术方法可测得的液流速率范围不同，补偿热脉冲法、T-max法以及热扩散法测定低速液流的误差较大，茎热平衡法测定高液流速率时误差较大，热比率法和热场变形法测定液流范围较广。热场变形法和外热比法可以测定逆向液流，热场变形法还可以准确测定零液流。热脉冲法、热平衡法和热扩散法较成熟[55]，应用较广泛，可行性较高。另外，将不同测定范围的热技术方法组合使用，可以有效提高测定精度。不同植物的液流速率不同。向日葵Helianthus annuus和玉米Zea mays等植物的液流速率相对较低，在利用T-max方法测定时，测量值总是略高于实际值[56]；换成热比率法测定也不够精确，而采用T-max法与热比率法组合测量则较为准确。
3. 热技术方法应用展望
利用热技术方法测定液流速率约80多年的研究，方法不断得到改进与创新，在校准度、测定范围和测定精度上均有所提高，同时，实验操作不断简化，数据实现自动化采集和存储，并逐步实现连续时间以及多层空间的同步测定[57]。其中，热脉冲法、热平衡法、热扩散法经一系列的发展与完善，极大程度上减小了测量误差[58]。热扩散法还形成了成熟的商业化产品，并得到了广泛的应用。虽然利用外热比法和热场变形法测定活立木液流速率的研究有限，但外热比法实现了精确的零破坏检测，热场变形法液流速率测定范围广，并可准确的测定零液流和逆向液流。在利用外热比法测定液流速率时，需要针对不同样本以及实验条件设计不同的量规，这是外热比法的不足之处。因此，外热比法和热场变形法亟待更为深入研究。
目前，热技术方法成为液流测量的首要选择。在未来，应用热技术测定树干液流仍需关注以下热点：在完善研究活立木蒸腾耗水特点的同时，结合土壤生物因子和气象因子与树干液流的关系，进一步深入研究活立木生理作用；从微观和宏观方面监控水分运动，研究水分利用与树木生长的关系；在生产实际方面，进一步完善活立木单株和森林林区的数据监控，为实现高效的林区治理提供有力依据。
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图 1 苏丹黑B、尼罗河红染色线虫中相同脂滴
Figure 1 Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets
图 2 油红O、后置油红O染色线虫中相同脂滴
Figure 2 Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus
图 3 使用苏丹黑B、尼罗红、油红O和后置油红O染色的松材线虫脂滴平均像素的ImageJ图像分析结果
Figure 3 ImageJ image analysis results of average pixels of B. xylophilus lipid droplets stained with Sudan black B, Nile red, oil red O, and post-fix oil red O
图 4 后置油红O染色的松材线虫脂滴的图像处理
Figure 4 Image processing of post-fix oil red O stained adipocytes in B. xylophilus
表 1 不同染料标记和方法的比较
Table 1. Comparison of different dyestuff markers and methods
染料 储备溶液 脱水步骤 染色时间/min 输出颜色 实现单个脂滴分离 油红O 5 g·L−1异丙醇 30 红色 否 苏丹黑B 体积分数为70%乙醇 乙醇系列 360 深蓝色 否 尼罗红 丙酮 乙醇系列 30 浅红色 否 后置油红O 5 g·L−1异丙醇 体积分数为60%异丙醇 60 红色 是 
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200674
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