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城市绿地是生态城市建设的基础和重要组成部分[1]。植物病害特别是土传病害已经对绿地生态系统健康造成了严重威胁[2-3]，由真菌引起的植物病害占全部植物病害的2/3以上[4]，其中土传植物病原真菌是造成植物病害的主要类群[5]。研究表明：立枯丝核菌Rhizoctonia solani和齐整小核菌Sclerotium rolfsii是上海绿地土壤中最常见的土传植物病原真菌[6]。立枯丝核菌属于无孢科Agonomycetaceae丝核菌属Rhizoctonia[7]，在自然界中广泛存在，是引起植物根腐和茎腐症状的重要病原菌，被认为是最具破坏力的土传植物病原菌之一[8]。海桐Pittosporum tobira、八角金盘Fatsia japonica、高羊茅Festuca arundinacea和女贞Ligustrum lucidum等360个属的园林绿化植物均能被立枯丝核菌感染[9]。齐整小核菌属于无孢科小核菌属Sclerotium[6]，是一种世界性传播的土传病原真菌，可以引起植物白绢病，致使植物腐烂死亡[10]。木棉属Bombax和紫檀属Pterocarpus植物以及樟树Cinnamomum camphora和夹竹桃Nerium oleander等园林绿化植物常被齐整小核菌侵染[11]。
土传病原真菌的传统检测方法主要是根据病原菌形态特征、选择性平板计数等方法进行[12-13]，但耗时费力、效率较低，时效性较差，已不能满足实际工作需求。随着分子生物学技术的发展，实时荧光定量PCR (qPCR)因具有特异性强、灵敏度高等特点，已经越来越多地被应用于土传病原真菌的检测。目前，已经有应用该技术对农田土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌进行定性、定量检测的报道[14-16]。但是，尚缺乏应用qPCR技术对城市绿地土壤进行立枯丝核菌和齐整小核菌定量检测的研究。与农田土壤存在明显差异，城市绿地土壤异质性高，普遍面临着重金属和有机污染物等的威胁[1, 17]，因此，针对城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌，探索建立具有较强特异性、较高灵敏性和较好重复性的分子生物学检测方法，对于及时了解上海城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的分布，保障植物和城市绿地生态系统健康具有重要意义。
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立枯丝核菌和齐整小核菌标准菌株购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China, ACCC)，编号分别为ACCC37615和ACCC37946。菌株的培养参照《丝状真菌分子细胞生物学与实验技术》[18]。
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2018年7月，采用多点混合采样法，在上海市随机采集绿地0~20 cm表层土壤样品。采样点信息见表1。每个采样点设置5个子样点，每个土壤样品由5个子样点样品混合而成。土壤样品充分混合后，去除石块、草根等杂物，−20 ℃保存，用于后续试验[17]。
表 1 绿地土壤样品信息
Table 1. Information of green space soil samples
样品编号 绿地类型 采样位置 行政区 绿地名称 纬度(N) 经度(E) 1 道路绿地 金山区 朱平公路中央绿化带内 30°49′ 121°08′ 2 公园绿地 闵行区 闵行文化公园 31°10′ 121°21′ 3 公园绿地 金山区 亭林公园 30°20′ 121°18′ 4 道路绿地 金山区 亭卫公路 30°20′ 121°20′ 5 公园绿地 奉贤区 奉浦四季生态园 30°56′ 121°27′ 6 公园绿地 崇明区 崇明新城公园 31°37′ 121°25′ 7 公园绿地 黄浦区 复兴公园 31°13′ 121°27′ 8 道路绿地 徐汇区 虹梅路 31°08′ 121°24′ 9 道路绿地 普陀区 真北路 31°16′ 121°23′ 10 道路绿地 浦东新区 杨高中路 31°13′ 121°32′ 11 道路绿地 浦东新区 杨高北路 31°15′ 121°35′ 12 道路绿地 浦东新区 济阳路上浦路 31°08′ 121°29′ 13 道路绿地 浦东新区 杨高南路 31°11′ 121°31′ 14 道路绿地 青浦区 外青松公路 31°12′ 121°07′ 15 道路绿地 浦东新区 唐镇路 31°12′ 121°38′ 16 公园绿地 宝山区 炮台湾湿地公园 31°23′ 121°30′ 17 公园绿地 宝山区 淞南公园 31°20′ 121°28′ 18 道路绿地 闵行区 华宁路剑川路 31°01′ 121°23′ 19 道路绿地 杨浦区 殷行路 31°19′ 121°31′ 20 公园绿地 浦东新区 名人苑公园北门东侧 31°14′ 121°33′ 21 公园绿地 嘉定区 汇龙潭公园 31°22′ 121°14′ -
采用AntGene DNA提取试剂盒 (武汉安特捷生物技术有限公司)提取立枯丝核菌和齐整小核菌标准菌株DNA。采用土壤基因组DNA提取试剂盒(FastDNA spin kit for soil, MP Biomedicals, 美国)提取绿地土壤样品DNA。使用NanoDrop 2000微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific, 美国)测定DNA的吸光度比值D(260)/D(280)及D(260)/D(230)，确定DNA质量及浓度，之后于−80 ℃超低温冰箱保存。
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通过文献检索，根据已有报道选择了ST-RS1/ ITS4、ITS1/GMRS-3等引物进行扩增立枯丝核菌的特异性引物的筛选，选择SCR-F/SCR-R、SRITSF/SRITSR等引物进行扩增齐整小核菌的特异性引物的筛选(表2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ )中Primer-BLAST功能将4对引物分别与Non-Redundant Protein Sequence (NR)数据库进行序列比对，在线筛选和验证引物的特异性。表 2 用于立枯丝核菌和齐整小核菌qPCR的引物信息
Table 2. qPCR primer sets of R. solani and S. rolfsii
病原菌 引物名称 引物序列 (5ʹ→3ʹ) 产物大小/bp 退火温度/℃ 参考文献 立枯丝核菌 ST-RS1 AGTGTTATGCTTGGTTCCACT 187 60 [19] ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 564 65 [20] GMRS-3 AGTGGAACCAAGCATAACACT 齐整小核菌 SCR-F CGTAGGTGAACCTGCGGA 540 54 [21] SCR-R CATACAAGCTAGAATCCC SRITSF TACACCTGTGAACCAACTG 465 52 [22] SRITSR CATACAAGCTAGAATCCC -
以2种病原菌标准菌株DNA为模板，分别使用筛选的特异性引物对其进行PCR扩增。PCR产物经质量分数为2%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带，使用通用型DNA纯化试剂盒[天根生化科技(北京) 有限公司，中国北京]对目的条带进行纯化回收。按照pGM-T Fast连接试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，中国北京]说明书将回收所得片段连接到pGEM-T Easy载体上(Promega, 美国)，转化至JM109感受态细胞中(Promega, 美国)，经蓝白斑筛选阳性克隆子，并进行菌落PCR验证后，按照质粒抽提试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，中国北京]说明书进行质粒抽提，提取所得重组质粒送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。使用NanoDrop 2000 微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific, 美国)测定质粒标准品浓度，计算质粒拷贝数[23]。
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qPCR反应体系包含有10 μL GoTaq q-PCR Master Mix (Promega，美国)，DNA模板用量分别设置为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L−1)分别设置为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 μL，加无菌重蒸水补足至20 μL。阴性对照使用无菌重蒸水代替DNA模板。使用Roche Light Cycle 480Ⅱ型qPCR仪(罗氏医学仪器公司，瑞士)。qPCR反应程序：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性 15 s，退火温度下退火40 s [退火温度在文献中引物Tm值(表2)上下浮动3 ℃范围内设置7个温度梯度]，72 ℃延伸40 s，45个循环。循环结束后进入熔解曲线程序：65 ℃升温至95 ℃，隔1 ℃采集荧光信号。
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将立枯丝核菌和齐整小核菌质粒标准品分别进行10倍梯度稀释，质粒标准品浓度范围为108~101 (×106拷贝·L−1)，分别得到8个稀释浓度的质粒标准品模板，使用1.6.1中优化后的qPCR反应条件进行扩增，绘制标准曲线。
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以质粒标准品和绿地土壤样品DNA为模板进行qPCR扩增，通过熔解曲线判断qPCR扩增产物是否单一。qPCR扩增产物利用质量分数为2%琼脂糖凝胶电泳(110 V, 40 min)检测，通过紫外凝胶成像系统对电泳条带进行观察和分析。将质粒标准品和土壤样品扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行克隆测序，并利用NCBI数据库对质粒标准品和土壤样品PCR扩增产物测序结果进行序列比对。
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分别将2种病原真菌的质粒标准品进行10倍梯度稀释，从108 ×106拷贝·L−1稀释至101×106拷贝·L−1，取稀释好的质粒标准品作为模板，按照1.6中优化后的qPCR条件进行扩增，根据试验结果确定方法的最低检测限，验证此方法的灵敏性。
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随机选择5个不同类型绿地土壤样品DNA作为模板，按照1.6中优化后的方法进行立枯丝核菌和齐整小核菌qPCR扩增，每个反应重复2次。随后根据每个样品组内重复间拷贝数的变异系数，验证方法的重复性和稳定性。
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采用1.6中优化后的qPCR方法对21份上海绿地土壤样品进行立枯丝核菌和齐整小核菌定量检测，每个反应设置3个平行试验，计算土壤样品中病原菌ITS基因的拷贝数，y=c×n×v/s。其中：y为基因拷贝数(拷贝·g−1)，c为浓度(×106拷贝·L−1)，n为模板稀释倍数，v为DNA洗脱体积(μL)，s为土壤干质量(g)。
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运用Excel 2016软件对数据进行分析处理。
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使用NCBI中Primer-BLAST功能将表2的4对引物分别与NR数据库进行序列比对。结果显示：引物ST-RS1/ITS4和ITS1/GMRS-3均可有效匹配目的序列900余条，错配率分别为7.7%和6.3%，在理论上均可实现对立枯丝核菌种水平特异性扩增(表3)。与引物ITS1/GMRS-3相比，引物ST-RS1/ITS4扩增目的片段长度小于200 bp，更适用于在qPCR方法中的应用，因此，本研究仅保留引物ST-RS1/ITS4用于后续立枯丝核菌定量检测方法的建立。引物SRITSF/SRITSR可有效匹配目的序列429条，错配率为8.1%，理论上可以实现对齐整小核菌种水平特异性扩增，而引物SCR-F/SCR-R仅匹配30条目的序列，覆盖率相对低于引物SRITSF/SRITSR，且该引物错配率较高，因此，本研究仅保留引物SRITSF/SRITSR用于后续齐整小核菌定量检测方法的建立(表3)。
表 3 qPCR引物在线比对结果
Table 3. On-line blast results of qPCR primers
引物名称 目的序列
长度/bp匹配目的
序列数/条匹配非目的
序列数/条错配
率/%ST-RS1/ITS4 187 908 76 7.7 ITS1/GMRS-3 564 936 63 6.3 SRITSF/SRITSR 465 429 38 8.1 SCR-F/SCR-R 540 30 4 13.3 -
以2种病原菌质粒标准品为模板进行qPCR反应条件的优化。结果表明：引物ST-RS1/ITS4最佳退火温度为60 ℃，引物SRITSF/SRITSR最佳退火温度为52 ℃。在上述退火温度下，2种病原菌qPCR扩增效率最高。因此，最终确定立枯丝核菌qPCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，45个循环。齐整小核菌qPCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，45个循环。
2种病原菌qPCR反应体系中最适引物用量均为0.3 μL (10 μmol·L−1)，DNA模板用量均为2 μL (10 mg·L−1)，在该反应条件下荧光信号最强。因此，最终确定2种病原菌qPCR反应体系(20 μL)为：模板2 μL(10 mg·L−1)，上下游引物(10 μmol·L−1)各0.3 μL，GoTaq®q-PCR Master Mix (Promega，美国)10 μL，无菌重蒸水7.4 μL。
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以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板，使用2.2.1优化后的qPCR反应条件进行扩增，绘制标准曲线。立枯丝核菌标准曲线线性关系表达式为y=−3.319x+33.98 (y为Ct值，x为模板量)，决定系数(R2)为0.999 5，扩增效率为100.1%。齐整小核菌标准曲线线性关系表达式为y=−3.552x+33.65 (y为Ct值，x为模板量)，决定系数(R2)为0.997 9，扩增效率为91.2%。结果表明：2种病原菌qPCR 的Ct值与质粒标准品浓度的对数均具有良好的线性关系，扩增效率符合qPCR定量检测方法的要求，表明本研究建立的2种病原菌定量检测方法具有较高的准确度和有效性，可作为立枯丝核菌和齐整小核菌快速定量检测的方法。对立枯丝核菌的线性检测范围为2.42×101~2.42×108 (×106拷贝·L−1)，对齐整小核菌的线性检测范围为2.20×101~2.20×108 (×106拷贝·L−1)。
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以质粒标准品和绿地土壤样品DNA为模板进行qPCR扩增。结果显示：熔解曲线均为单一熔解峰，无杂峰，表明qPCR扩增产物单一且未产生引物二聚体。qPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果显示：引物ST-RS1/ITS4扩增得到约200 bp的片段，引物SRITSF/SRITSR扩增得到约450 bp的片段，均与目的片段大小一致(图1)。利用NCBI数据库对PCR扩增产物克隆测序的结果进行序列比对，结果见表4。采用引物ST-RS1/ITS4从质粒标准品及土壤样品扩增到的产物分别与立枯丝核菌R. solani BTRFB1(登录号: MZ158299)和R. solani AG-F(登录号：JQ343829)序列相似度最高，相似度为99.4%。采用引物SRITSF/SRITSR从质粒标准品及土壤样品扩增到的产物分别与齐整小核菌S. rolfsii NTNM(登录号: MT126473)和S. rolfsii SR1(登录号: MG847186)序列相似度最高，分别为99.5%和98.8%。扩增产物测序结果说明：利用引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR扩增到的DNA序列均与目的片段序列一致，具有较强的特异性。
图 1 立枯丝核菌和齐整小核菌 DNA的PCR扩增
Figure 1. PCR amplification of R. solani and S. rolfsii DNA
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以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板，使用2.2.1优化后的qPCR反应条件进行扩增，进行qPCR灵敏性验证。结果显示：本研究建立的qPCR定量检测方法对立枯丝核菌和齐整小核菌的检测限分别可达24×106和22×106 拷贝·L−1 (图2)。
图 2 qPCR的灵敏性
Figure 2. Sensitivity test of qPCR
表 4 质粒标准品和土壤样品测序比对结果
Table 4. Sequencing alignment result of plasmid standard and soil sample
引物 样品 同源菌株 基因登录号 相似度/% ST-RS1/ITS4 质粒标准品 R. solani BTRFB1 MZ158299 99.4 土壤样品 R. solani AG-F JQ343829 99.4 SRITSF/SRITSR 质粒标准品 S. rolfsii NTNM MT126473 99.5 土壤样品 S. rolfsii SR1 MG847186 98.8 -
随机选择5个绿地土壤样品DNA作为模板，使用本研究建立的方法对样品中立枯丝核菌和齐整小核菌ITS基因拷贝数进行测定。结果表明：绿地土壤样品立枯丝核菌和齐整小核菌ITS基因拷贝数2次检测结果的变异系数范围分别为3.37%~4.61%和0.66%~8.61%(表5)，变异系数均低于10%，表明本研究建立的立枯丝核菌和齐整小核菌定量检测方法具有较好的重复性和稳定性。
表 5 qPCR的重复性
Table 5. Repeatability of qPCR
病原菌 样品编号 第1次试验 第2次试验 变异系数/% Ct 拷贝数/(×106拷贝·L−1) Ct 拷贝数/(×106拷贝·L−1) 立枯丝核菌 4 31.74 3.09×101 31.60 3.25×101 3.57 5 30.54 6.45×101 30.56 6.15×101 3.37 6 29.49 1.23×102 29.51 1.17×102 3.54 10 30.98 4.91×101 31.03 4.60×101 4.61 12 29.71 1.07×102 29.74 1.01×102 4.08 齐整小核菌 3 33.76 2.16×102 33.53 2.44×102 8.61 6 35.15 1.02×102 35.09 1.05×102 2.05 14 35.04 1.08×102 35.05 1.07×102 0.66 16 36.55 4.77×101 36.63 4.57×101 3.03 18 35.72 7.46×101 35.67 7.66×101 1.87 -
将本研究建立的立枯丝核菌和齐整小核菌定量检测方法应用于上海绿地土壤样品的检测。检测结果表明：立枯丝核菌的检出率为100%， ITS基因拷贝数最高为2.61×106 拷贝·g−1；齐整小核菌的检出率为19%，检出样品的ITS基因拷贝数最高为2.94×105 拷贝·g−1。说明立枯丝核菌在上海绿地表层土壤中广泛存在。
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引物的特异性是对土传病原真菌进行qPCR检测的关键[24]。真菌ITS序列目前已被广泛用于真菌的亲缘关系分析，为病原菌的分子检测提供了较为理想的分子标记[25]。本研究通过检索文献[19, 22]及数据库，筛选得到了基于真菌ITS区域设计的立枯丝核菌和齐整小核菌种水平特异性引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR。NCBI NR数据库在线比对结果显示：ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR目的片段错配率分别为7.7%和8.1%，理论上可实现对立枯丝核菌和齐整小核菌种水平特异性扩增；同时，qPCR熔解曲线均为单一熔解峰，扩增产物片段大小与序列均与目的片段一致。上述结果均表明：本研究建立的立枯丝核菌和齐整小核菌荧光定量检测方法具有较强的特异性。此外，qPCR检测方法的灵敏性是评价其是否可行的另一个关键因素，一般是指可以准确测量的样品最小拷贝数[26]。前人的研究表明：对农田土壤立枯丝核菌和大豆茎褐腐病菌Phialophora gregata等土传病原菌qPCR检测的灵敏性可以达26.7~100.0 (×106拷贝·L−1)[13, 27-28]。本研究针对立枯丝核菌和齐整小核菌检测限分别可达24×106和22×106拷贝·L−1，具有较高的灵敏性。因此，本研究所建立的qPCR检测方法可以用于城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的定量检测。
立枯丝核菌和齐整小核菌是寄主范围广、危害性强的土传病原真菌，可侵染一些重要经济植物，例如水稻Oryza sativa、花生Arachis hypogaea、樟树和海桐等，造成植物根腐病和白绢病等病害的发生[7, 10]。鉴于这2种病原菌分布的广泛性，因此有必要了解其在城市绿地土壤中的分布情况，从而有效预防园林植物立枯病、根腐病和白绢病等病害的发生。本研究中上海绿地表层土壤立枯丝核菌的检出率达100%，表明立枯丝核菌在上海绿地土壤中广泛存在。齐整小核菌检出率较低，为19%。齐整小核菌检出率低，可能有两方面的原因。一方面，随着对城市绿地养护技术和措施的不断提高和加强，齐整小核菌在土壤中的存在范围可能缩小了；另一方面，也可能是由于采样点的局限性，还不足以反映上海绿地土壤中齐整小核菌整体的存在情况，后期需要通过扩大绿地土壤样品采集范围，更为全面地检测齐整小核菌在上海绿地土壤中的分布情况。同时应该看到，应用qPCR方法检测土壤中病原菌的数量时，并不能有效区分活体和死体病原菌的DNA，检测结果可能会过高估计土壤中病原菌基因的丰度[29]。因此，如何准确、快速测定城市绿地土壤中活体立枯丝核菌和齐整小核菌基因的丰度，尚需进一步研究。
综上所述，本研究通过立枯丝核菌和齐整小核菌qPCR引物的筛选和特异性验证、qPCR反应条件的建立及灵敏性和重复性评价，建立了针对立枯丝核菌和齐整小核菌的快速、特异且灵敏性较高的qPCR检测方法，可用于城市绿地土壤中这2种病原菌的定量检测。
Quantitative real-time PCR for rapid detection of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in urban green space
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摘要:
目的 土传病原真菌立枯丝核菌Rhizoctonia solani和齐整小核菌Sclerotium rolfsii严重威胁园林绿化植物正常生长。建立针对这2种土壤病原真菌的快速定量检测方法。 方法 通过筛选2种病原菌特异性引物，优化反应条件。 结果 初步建立了2种病原菌的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR可以分别用于立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR检测，其灵敏度分别达24×106和22×106拷贝·L−1，2次重复反应的变异系数分别为3.37%~4.61%和0.66%~8.61%。对上海绿地土壤样品的检测结果表明：立枯丝核菌和齐整小核菌的检出率分别为100%和19%。 结论 建立的qPCR检测方法具有较强特异性、较高灵敏度和较强重复性，可以用于上海城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的快速、有效定量检测。图2表5参29 Abstract:Objective This study aims to establish a rapid quantitative detection method for Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii, 2 soil-borne pathogenic fungi that seriously threaten the normal growth of landscape plants in Shanghai. Method The reaction conditions were optimized by screening 2 pathogen specific primers. Result A quantitative real-time PCR (qPCR) method was established for the detection of the two pathogens. The primers ST-RS1/ITS4 and SRITSF/SRITSR could be used for qPCR detection of R. solani and S. rolfsii, with sensitivity of 24×106 and 22×106 copies·L−1, respectively. The coefficients of variation of the 2 repeated reactions were 3.37%−4.61% and 0.66%−8.61%, respectively. The detection results of soil samples in Shanghai green space showed that the detection rates of R. solani and S. rolfsii were 100% and 19%, respectively. Conclusion The established qPCR method has high specificity, sensitivity and repeatability, and can be used for rapid and effective quantitative detection of R. solani and S. rolfsii in Shanghai urban green soil. [Ch, 2 fig. 5 tab. 29 ref.] -
Key words:
- urban green space soil /
- Rhizoctonia solani /
- Sclerotium rolfsii /
- qPCR
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据世界旅游组织(UNWTO)统计，受新型冠状病毒引发的肺炎疫情(新冠疫情)影响，2020年国际游客数量比2019年下降73％，约10亿人次，国际旅游收入损失1.3万亿美元。疫情改变了旅游行为方式[1]，使游客旅游目的地偏好发生明显变化[2]。疫情暴发后游客更倾向于自然风光类、休闲度假类与历史文化类的旅游产品[3]，放松、观光、文化是游客出游的主要动机[4]。在实施最严格保护的前提下，探究自然保护地旅游资源的可持续利用，是现阶段自然保护地体系所面临的现实问题[5]。生态旅游是中国自然保护区可持续发展的战略选择[6]，但国内自然保护区生态旅游发展处于初级阶段[7]。如何加强自然保护区生态旅游资源的保护与开发利用，避免由资源消耗型向环境破坏型和景观浪费型转变[8]，需要加强生态旅游资源与其他类型旅游资源和产业的融合[9]，构建高品质、多样化的旅游产品体系。现阶段中国自然保护地生态旅游产品以观光旅游、休闲度假为主，科普、科考、探险、观鸟等专项生态旅游产品[10]颇受欢迎，生态旅游客源市场日益向专业化、多样化、个性化发展。加强对生态旅游消费行为特征的研究[11]，把握当前及今后旅游消费者的偏好和选择意愿，可促进生态旅游产品供给与需求的有效匹配[12]。
旅游偏好是人们对旅游产品的认知和价值评价的结果，与旅游决策、旅游行为关系密切[13]。了解显示性偏好(revealed preference，RP)与陈述性偏好(stated preference，SP)是定量研究旅游偏好的前提和基础，显示性偏好关注消费者选择了哪些产品或服务，而陈述性偏好关注消费者将要选择哪些产品或服务[14]，国外研究者多关注2种偏好数据的检验和比较 [15-16]，国内有部分学者应用陈述性偏好法研究了旅游者的需求偏好[17-18]，但在旅游偏好与旅游需求、旅游感知、旅游动机与行为等相互关系上报道较少[19]。新冠疫情暴发后，学者开始关注自然保护地(区)生态旅游消费行为特征和生态旅游产品偏好，探讨生态旅游产品陈述性偏好与显示性偏好的关联性。本研究以浙江省天目山国家级自然保护区为例，对比了疫情暴发前后自然保护区游客生态旅游特征，分析疫情后生态旅游产品偏好特征，为提升自然保护区提供生态旅游产品与服务水平，满足游客对生态旅游高质量休闲体验的需求等，提供现实依据。
1. 研究区概况
1.1 天目山自然保护区概况
浙江天目山国家级自然保护区位于浙江省杭州市临安区天目山镇，总面积4 284 hm²。区内植被景观独特，动植物种类丰富，分布多种珍稀、濒危、特有、孑遗物种，主要森林植被以“高、大、古、稀、多”称绝，素有“大树王国”“物种基因库”之称。天目山自然保护区1986年被批准为“国家级森林和野生动物类型自然保护区”，1996年成为联合国教科文组织“人与生物圈”保护区网络成员，现为中国生物多样性保护示范基地、国家级自然保护区示范单位、全国科普教育基地、全国青少年科技教育基地、国家AAAA级景区。
1.2 天目山自然保护区生态旅游发展现状
2004年12月，天目山自然保护区与浙江大华建设集团有限公司正式签订旅游资源依法保护、开发和特许经营协议，天目山生态旅游转变为以企业法人为经营主体、保护区管理局为管理主体的新体制[20]。2005—2007年景区游客数量迅速上升，年均增长率达36.97%；2008—2020年景区游客数量总体呈现缓慢下降趋势，年均增长率为−5.23%；2020年，新冠肺炎疫情暴发，年接待量仅为7.19万人次，为历史最低。天目大峡谷景区2014年被天目山景区收购，2019年游客接待量达到最高，为15.86万人次，2020年锐减到6.55万人次。
自然保护区生态旅游收入主要由景区门票、餐饮住宿、自然教育和旅游车队经营收入等组成。总体来看，门票收入、旅游车队经营收入与游客接待人数变化趋势基本一致。自2016年开始，自然学校、幻住山房茶室、大树堂餐厅、知了酒店等相继营业，虽在总体旅游收入中占比不大，但表现出良好的成长性。2020年因疫情影响除大树堂餐厅收入略有增长，其他均不同程度下降。
2. 数据收集与处理
2.1 数据收集
参考相关研究成果[21-22]，结合对自然保护、生态旅游领域专家的咨询，设计调查问卷。问卷第一部分，调查游客对自然保护区生态旅游产品的陈述性偏好、出游目的、频次、时段等生态旅游需求特征；第二部分调查游客信息渠道、出游方式、逗留时间、旅游消费、食宿设施选择、问题认知等生态旅游行为特征，及对自然保护区生态旅游产品的显示性偏好；第三部分调查游客居住地、性别、年龄、受教育程度、职业、月收入等游客个人信息。2019年10月2—6日发放问卷300份，收回300份，有效问卷234份，有效率为78.00%。2020年10月2—6日发放问卷300份，收回300份，有效问卷251份，有效率为83.67%。生态旅游产品陈述性偏好、显示性偏好均采用Likert 5级测量，1级最低，5级最高。
2.2 数据处理
应用SPSS 23.0软件统计疫情暴发前后天目山保护区游客人口学特征；两独立样本的秩和检验(Mann-Whitney U检验)[23]分析疫情暴发前后游客生态旅游需求、行为特征；单因素方差法分析疫情暴发后游客生态旅游产品的陈述性偏好、显示性偏好特征。
分析疫情暴发后生态旅游产品陈述性偏好对显示性偏好的影响效应。先按保护区生态旅游产品亚类陈述性偏好水平的均值进行降维和分级，即均值1.00~1.49时为1，1.50~2.49为2，2.50~3.49为3，3.50~4.49为4，4.50~5.00为5；比较各陈述性偏好等级对应的显示性偏好水平，采用K-S方法检验其分布，若满足正态分布，则使用独立样本T检验，反之使用Mann-Whitney U检验[23]。
3. 结果与分析
3.1 游客人口学特征
由表1可知：相比2019年，疫情暴发后的2020年，自然保护区游客以男性为主；职业以企业人员为主，军人增幅最大，学生、离退休人员减少明显；20岁以下游客增加较明显，20~29岁游客减少较明显；大专或大学本科学历游客占比最高，略有下降；各收入段游客变化不明显。
表 1 疫情暴发前后游客人口学特征Table 1 Demographic characteristics of visitors before and after COVID-19特征 分项 占比/% 特征 分项 占比/% 2019年10月 2020年10月 2019年10月 2020年10月 性别 男 41.9 57.4 年龄/岁 ＜20 4.3 14.7 女 58.1 42.6 20~29 38.5 28.7 30~39 26.9 31.9 职业 公务员 6.8 6.8 40~49 15.4 16.3 私营企业主 6.8 12.0 50~59 11.1 6.0 企业人员 33.8 28.3 ≥60 3.8 2.4 文教/专业技术人员 8.1 14.3 自由职业 15.0 2.4 受教育程度 高中及以下 20.9 18.7 服务/销售人员 5.6 6.0 大专或本科 73.1 65.7 军人 0.4 24.7 研究生及以上 6.0 15.5 学生 10.7 1.2 工人 1.3 0.4 月收入/元 ≤5 000 40.2 33.1 农民 1.7 2.4 5 001~10 000 33.3 30.3 离退休人员 3.0 14.3 10 001~15 000 15.0 17.1 其他 6.8 0 15 001~24 999 4.3 9.6 ≥25 000 7.3 8.0 3.2 游客生态旅游需求特征
由表2可知：疫情暴发前后游客去往自然保护区旅游频次、旅游时段差异极显著(P＜0.01)，而旅游目的差异不显著。疫情暴发后游客自然保护区旅游的时间以小长假、黄金周最多，依次为周末、工作日，其中周末出游略有减少；多数游客旅游目的为自然山水观光，疫情后以增进身体健康为目的明显增加，陪伴家人、朋友出游的比例增加较明显。
表 2 疫情暴发前后游客生态旅游需求特征Table 2 Ecotourism demand characteristics of visitors before and after COVID-19特征 分项 占比/% P 特征 分项 占比/% P 2019年10月 2020年10月 2019年10月 2020年10月 旅游频次/
(次·a−1)1 18.8 16.3 0.01** 旅游目
的(多选)自然山水风光 67.9 76.1 0.20 2 53.0 38.2 观赏动植物 20.5 25.9 3 17.1 29.1 缓解紧张情绪 37.6 33.5 ≥4 11.1 16.4 学习生态知识 12.4 9.6 增进身体健康 7.7 41.8 旅游时段 周末 33.8 29.1 0.00** 了解历史文化 34.2 18.3 小长假、黄金周 54.2 55.7 户外运动探险 19.2 14.7 工作日 6.0 9.2 陪伴家人、朋友 34.2 51.0 暑假 6.0 6.0 其他 0 6.4 说明：**表示差异极显著(P＜0.01) 3.3 游客生态旅游行为特征
由表3可知：疫情对游客了解自然保护区的信息渠道、交通方式、旅游花费影响极显著(P＜0.01)，而组织方式、旅游时长、选择食宿设施类型、存在问题等其他生态旅游行为特征均无显著影响。疫情暴发后，游客获取信息渠道以亲朋介绍、“旧地重游”较多，家庭自驾游数量明显增加；出游以一日游为主，二日游游客明显减少；相比2019年，2020年人均消费500~999元的游客减少较明显，人均消费2 000元以上的游客明显增加。参与性、娱乐性不强，接待设施不完善，交通不便被认为是生态旅游发展存在的主要问题。
表 3 疫情暴发前后游客生态旅游行为特征Table 3 Ecotourism behavior characteristics of visitors before and after COVID-19特征 分项 占比/% P 特征 分项 占比/% P 2019年10月 2020年10月 2019年10月 2020年10月 了解渠道
(多选)微信微博 38.5 37.1 0.01** 食宿
类型农家乐 34.2 22.3 0.71 旅行社 24.8 13.5 民宿 41.0 29.1 亲朋介绍 43.6 53.0 酒店 17.5 15.9 曾经参与 9.8 23.5 其他 7.3 5.6 杂志报纸 9.8 9.2 其他 7.7 10.4 旅游花
费/元≤500 34.6 41.9 0.00** 500~999 33.3 7.2 组织方式 跟团 16.2 2.0 0.35 1 000~1 499 17.5 17.9 独自 23.1 17.1 1 500~1 999 5.6 6.4 家庭游 37.2 76.5 ≥2 000 9.0 26.6 单位组织 23.5 4.4 存在
问题
(多选)交通不便 38.5 23.5 0.10 交通方式 公共交通 7.7 8.0 0.00** 接待设施不完善 20.9 28.3 自驾 58.1 86.1 服务质量差 2.1 3.2 旅游大巴 34.2 6.0 参与性、娱乐性不强 34.6 31.9 有害生物威胁 2.6 3.2 旅游时长/d 1 41.9 49.4 0.33 当地人不友好 1.3 0.8 2 41.0 28.7 其他 17.1 9.1 3 12.8 18.7 ≥4 4.3 3.2 说明：**表示差异极显著( P＜0.01) 3.4 游客生态旅游产品偏好特征
3.4.1 疫情暴发后生态旅游产品陈述性偏好的人口学特征差异
游客人口学特征对部分生态旅游产品的陈述性偏好存在显著性差异。由表4可知：天气与气候景观(观星象、观冰雪、观日出、观雾凇、雨凇)、森林度假产品(小木屋、树屋)、自然教育产品(自然课堂、自然艺术创作)和生态康养产品(森林浴、森林瑜伽、森林冥想)等产品，不同性别游客的陈述性偏好差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；观鸟、观星象、树屋等产品，不同年龄段游客陈述性偏好差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；观冰雪、民宿、森林瑜伽等产品，不同受教育程度的游客陈述性偏好差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；观星象、树屋、丛林穿越、溯溪攀岩等产品，不同职业的游客陈述性偏好差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；观日出、观云雾、观星象、观冰雪、树屋、自然艺术创作等产品，不同收入的游客陈述性偏好差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)。
表 4 疫情后游客生态旅游产品陈述性偏好的人口学特征差异Table 4 Differences in demographic characteristics of visitors’ stated preferences for ecotourism products after COVID-19产品主类 产品亚类 产品名称 性别 年龄 受教育程度 职业 月收入 偏好均值 生态观光 地文景观 观奇峰异石 0.09 0.58 0.99 0.58 0.87 3.10 水域景观 观瀑布溪流 0.45 0.13 0.15 0.11 0.35 3.88 生物景观 观鸟 0.67 0.05* 0.37 0.58 0.38 3.23 观蝶 0.92 0.34 0.28 0.43 0.13 2.92 观珍稀植物 0.43 0.95 0.98 0.80 0.41 3.61 观森林景观 0.96 0.70 0.20 0.74 0.52 3.88 天象与气候景观 观日出 0.01** 0.09 0.09 0.06 0.00** 4.05 观云雾 0.11 0.18 0.07 0.19 0.00** 4.20 观星象 0.04* 0.00** 0.93 0.00** 0.00** 3.81 观冰雪 0.03* 0.31 0.01* 0.33 0.01* 3.94 观雾凇、雨凇 0.00** 0.15 0.07 0.51 0.43 3.85 生态度假 森林度假 小木屋 0.00** 0.13 0.27 0.30 0.23 3.45 帐篷露营 0.36 0.09 0.91 0.05 0.28 3.15 汽车露营 0.26 0.29 0.88 0.23 0.24 2.99 树屋 0.00** 0.00** 0.16 0.01** 0.00** 3.40 度假酒店 0.62 0.24 0.32 0.28 0.61 3.82 乡村度假 民宿 0.22 0.55 0.01** 0.25 0.23 3.80 农家乐 0.47 0.33 0.77 0.09 0.90 3.10 专项生态 自然教育 自然课堂 0.01* 0.40 0.34 0.02* 0.65 3.22 自然艺术创作 0.00** 0.39 0.52 0.12 0.03* 3.19 生态康养 森林浴 0.02* 0.30 0.47 0.09 0.28 3.46 森林瑜伽 0.00** 0.44 0.04* 0.35 0.31 3.01 森林冥想 0.05* 0.19 0.29 0.35 0.11 3.28 户外运动 丛林穿越 0.17 0.64 0.55 0.04* 0.39 3.59 溯溪攀岩 0.90 0.14 0.86 0.05* 0.47 3.43 户外拓展 0.75 0.13 0.96 0.29 0.45 3.45 说明：*表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01) 3.4.2 疫情暴发后生态旅游产品显示性偏好的人口学特征差异
由表5可见：游客人口学特征对天目山自然保护区部分生态旅游产品的显示性偏好存在显著性差异。对倒挂莲花峰、五世同堂古银杏Ginkgo bibloba、大树王柳杉Gryptomeria japonica、白鹇Lophura nycthemera及其栖息地等景点，不同年龄段游客显示性偏好有显著差异(P＜0.05)；对半月池景点，不同受教育程度的游客显示性偏好有极显著差异(P＜0.01)；对眠牛石景点，不同职业的游客显示性偏好有显著性差异(P＜0.05)。
表 5 疫情后生态旅游产品显示性偏好的人口学特征差异Table 5 Differences in demographic characteristics of visitors’ revealed preferences of ecotourism products after COVID-19产品主类 产品亚类 生态旅游产品 性别 年龄 受教育程度 职业 月收入 偏好均值 生态观光 地文景观 天目大峡谷 0.81 0.40 0.19 0.47 0.55 4.37 冰川大峡谷 0.92 0.92 0.05 0.52 0.59 4.52 倒挂莲花峰 0.30 0.05* 0.08 0.15 0.90 3.88 四面峰 0.11 0.25 0.60 0.73 0.78 3.93 眠牛石 0.70 0.28 0.33 0.03* 0.71 3.88 红蛇洞 0.74 0.08 0.18 0.08 0.57 3.94 水域景观 双清潭 0.92 0.41 0.32 0.08 0.82 3.88 半月池 0.34 0.12 0.00** 0.10 0.06 3.66 伏虎瀑 0.90 0.48 0.11 0.09 0.76 4.11 生物景观 原始森林 0.70 0.49 0.88 0.44 0.84 4.33 柳杉群 0.49 0.69 0.49 0.17 0.29 4.24 五世同堂古银杏 0.07 0.03* 0.27 0.66 0.35 4.26 大树王柳杉 0.46 0.01* 0.29 0.97 0.43 4.45 冲天树金钱松 0.23 0.31 0.91 0.73 0.59 4.21 天目铁木 0.29 0.38 0.84 0.99 0.52 4.33 黑麂及其栖息地 0.06 0.18 0.66 0.40 0.24 4.45 白鹇及其栖息地 0.05 0.03* 0.77 0.80 0.75 4.48 专项生态 自然教育 自然博物馆 0.74 0.31 0.74 0.95 0.73 4.51 大地之野自然学校 0.30 0.21 0.42 0.90 0.84 4.31 说明：*表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01)。金钱松 Pseudolarix amabilis，天目铁木 Ostrya rehderiana，黑麂 Muntiacus crinifrons 3.4.3 疫情暴发后生态旅游产品陈述性偏好对显示性偏好的影响效应
由表6可见：总体上，随着游客对保护区生态旅游产品的陈述性偏好等级增加，其对天目山保护区生态旅游产品的显示性偏好水平也相应提高，说明陈述性偏好水平对显示性偏好水平有显著影响。多重比较分析表明：将游客对自然保护区生态旅游产品的陈述性偏好等级分为5级时，天目山保护区地文景观、水域景观、生物景观和自然教育产品的显示性偏好，根据显著性水平只有相应的3、3、4和4级，说明游客对生态旅游产品的陈述性偏好与显示性偏好存在不一致现象，且前两者的陈述性偏好对显示性偏好的影响效应比后两者小。
表 6 疫情后生态旅游产品陈述性偏好对显示性偏好的影响效应Table 6 Effects of revealed preferences on stated preferences of ecotourism products after COVID-19陈述性偏
好等级显示性偏好水平 地文景观 水域景观 生物景观 自然教育产品 1 2.58±0.92 c 1.72±1.16 c 2.50±1.52 cd 1.91±1.30 d 2 3.26±0.82 b 3.28±1.14 ab 3.32±0.91 d 3.04±1.00 c 3 3.45±0.78 b 3.16±0.89 b 3.83±0.74 c 3.44±1.06 c 4 3.83±0.69 a 3.46±0.94 a 4.11±0.73 b 3.88±0.88 b 5 3.59±1.09 ab 3.53±1.10 a 4.51±0.58 a 4.46±0.90 a 说明：同列不同小写字母表示不同等级间差异显著(P＜0.05) 4. 结论与建议
4.1 结论
2015年开始天目山自然保护区调整经营思路，走内涵发展道路，开发生态旅游、自然教育、文化创意等新型业态。2018年起以接待散客为主，积极开辟新兴市场。2016—2019年接待游客数量下降明显，但同期自然保护区生态旅游收入呈上升趋势，说明其他生态旅游业态的发展弥补了生态观光旅游下降带来的损失。
疫情暴发后，保护区游客从以女性为主转变为以男性为主，20岁以下游客明显增加、20~29岁游客减少较明显，以大专或大学本科学历的游客占比最高；游客多为通过亲朋介绍、“旧地重游”者，家庭自驾游数量增加，团队游明显减少，倾向于一日游或多日游，人均消费较高的游客比例增加较明显。选择小长假、黄金周出游的人数最多，主要以自然山水观光和增进身体健康为目的，多数为陪伴家人、朋友出游。
疫情暴发后，游客性别、年龄、受教育程度、职业、收入等人口学特征对部分生态旅游产品陈述性偏好有显著影响；年龄、受教育程度、职业对部分产品显示性偏好水平有显著影响。游客对保护区生态旅游产品的显示性偏好水平随着陈述性偏好等级增加而提高，陈述性偏好水平对显示性偏好水平有显著影响；天目山保护区游客对生态旅游产品的陈述性偏好与显示性偏好存在不一致现象，生物景观和自然教育产品的陈述性偏好对显示性偏好的影响效应，比地文景观和水域景观更明显。
4.2 建议
后疫情时代，旅游业要积极应对挑战，增强创新发展动力，发挥产业融合的叠加效应、追求在线融合的乘数效应，共建共生推动旅游业高质量发展[24]。因此，从以下几个方面提出天目山自然保护区生态旅游产品的开发建议：一是利用游客家庭自驾、社交休闲、山水观光、生态康养、自然教育等生态旅游产品陈述性偏好水平高的特点，开展观鸟、森林康养等特色项目，融合创新产品引导全新需求，提供多元化、高品质的生态旅游产品供给，增强游客的显示性偏好水平，提升其满意度与推荐、重游意愿。二是自然保护区应充分认识新趋势、融合新技术，依托5G、VR、AR等技术推出智慧化生态旅游产品服务，引导自然保护区从需求侧进行产品创新。比如将自然保护区大尺度山体植被垂直景观带、偶见性强的珍稀动植物等，通过“云旅游”多维度、多视角传递给潜在旅游者，增强其陈述性偏好，推动其向现实旅游者转化。三是自然保护区积极利用大数据分析手段，发挥“两微一短”(微信、微博、短视频)用户受众面广、黏性强特点，针对周边客源市场选择合适的媒体平台，加强游客生态旅游产品体验后的分享，刺激潜在需求，提升潜在消费者生态旅游产品的陈述性偏好水平。
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表 1 绿地土壤样品信息
Table 1. Information of green space soil samples
样品编号 绿地类型 采样位置 行政区 绿地名称 纬度(N) 经度(E) 1 道路绿地 金山区 朱平公路中央绿化带内 30°49′ 121°08′ 2 公园绿地 闵行区 闵行文化公园 31°10′ 121°21′ 3 公园绿地 金山区 亭林公园 30°20′ 121°18′ 4 道路绿地 金山区 亭卫公路 30°20′ 121°20′ 5 公园绿地 奉贤区 奉浦四季生态园 30°56′ 121°27′ 6 公园绿地 崇明区 崇明新城公园 31°37′ 121°25′ 7 公园绿地 黄浦区 复兴公园 31°13′ 121°27′ 8 道路绿地 徐汇区 虹梅路 31°08′ 121°24′ 9 道路绿地 普陀区 真北路 31°16′ 121°23′ 10 道路绿地 浦东新区 杨高中路 31°13′ 121°32′ 11 道路绿地 浦东新区 杨高北路 31°15′ 121°35′ 12 道路绿地 浦东新区 济阳路上浦路 31°08′ 121°29′ 13 道路绿地 浦东新区 杨高南路 31°11′ 121°31′ 14 道路绿地 青浦区 外青松公路 31°12′ 121°07′ 15 道路绿地 浦东新区 唐镇路 31°12′ 121°38′ 16 公园绿地 宝山区 炮台湾湿地公园 31°23′ 121°30′ 17 公园绿地 宝山区 淞南公园 31°20′ 121°28′ 18 道路绿地 闵行区 华宁路剑川路 31°01′ 121°23′ 19 道路绿地 杨浦区 殷行路 31°19′ 121°31′ 20 公园绿地 浦东新区 名人苑公园北门东侧 31°14′ 121°33′ 21 公园绿地 嘉定区 汇龙潭公园 31°22′ 121°14′ 
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表 2 用于立枯丝核菌和齐整小核菌qPCR的引物信息
Table 2. qPCR primer sets of R. solani and S. rolfsii
病原菌 引物名称 引物序列 (5ʹ→3ʹ) 产物大小/bp 退火温度/℃ 参考文献 立枯丝核菌 ST-RS1 AGTGTTATGCTTGGTTCCACT 187 60 [19] ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 564 65 [20] GMRS-3 AGTGGAACCAAGCATAACACT 齐整小核菌 SCR-F CGTAGGTGAACCTGCGGA 540 54 [21] SCR-R CATACAAGCTAGAATCCC SRITSF TACACCTGTGAACCAACTG 465 52 [22] SRITSR CATACAAGCTAGAATCCC
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表 3 qPCR引物在线比对结果
Table 3. On-line blast results of qPCR primers
引物名称 目的序列
长度/bp匹配目的
序列数/条匹配非目的
序列数/条错配
率/%ST-RS1/ITS4 187 908 76 7.7 ITS1/GMRS-3 564 936 63 6.3 SRITSF/SRITSR 465 429 38 8.1 SCR-F/SCR-R 540 30 4 13.3
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表 4 质粒标准品和土壤样品测序比对结果
Table 4. Sequencing alignment result of plasmid standard and soil sample
引物 样品 同源菌株 基因登录号 相似度/% ST-RS1/ITS4 质粒标准品 R. solani BTRFB1 MZ158299 99.4 土壤样品 R. solani AG-F JQ343829 99.4 SRITSF/SRITSR 质粒标准品 S. rolfsii NTNM MT126473 99.5 土壤样品 S. rolfsii SR1 MG847186 98.8
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表 5 qPCR的重复性
Table 5. Repeatability of qPCR
病原菌 样品编号 第1次试验 第2次试验 变异系数/% Ct 拷贝数/(×106拷贝·L−1) Ct 拷贝数/(×106拷贝·L−1) 立枯丝核菌 4 31.74 3.09×101 31.60 3.25×101 3.57 5 30.54 6.45×101 30.56 6.15×101 3.37 6 29.49 1.23×102 29.51 1.17×102 3.54 10 30.98 4.91×101 31.03 4.60×101 4.61 12 29.71 1.07×102 29.74 1.01×102 4.08 齐整小核菌 3 33.76 2.16×102 33.53 2.44×102 8.61 6 35.15 1.02×102 35.09 1.05×102 2.05 14 35.04 1.08×102 35.05 1.07×102 0.66 16 36.55 4.77×101 36.63 4.57×101 3.03 18 35.72 7.46×101 35.67 7.66×101 1.87
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