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城市绿地是生态城市建设的基础和重要组成部分[1]。植物病害特别是土传病害已经对绿地生态系统健康造成了严重威胁[2-3]，由真菌引起的植物病害占全部植物病害的2/3以上[4]，其中土传植物病原真菌是造成植物病害的主要类群[5]。研究表明：立枯丝核菌Rhizoctonia solani和齐整小核菌Sclerotium rolfsii是上海绿地土壤中最常见的土传植物病原真菌[6]。立枯丝核菌属于无孢科Agonomycetaceae丝核菌属Rhizoctonia[7]，在自然界中广泛存在，是引起植物根腐和茎腐症状的重要病原菌，被认为是最具破坏力的土传植物病原菌之一[8]。海桐Pittosporum tobira、八角金盘Fatsia japonica、高羊茅Festuca arundinacea和女贞Ligustrum lucidum等360个属的园林绿化植物均能被立枯丝核菌感染[9]。齐整小核菌属于无孢科小核菌属Sclerotium[6]，是一种世界性传播的土传病原真菌，可以引起植物白绢病，致使植物腐烂死亡[10]。木棉属Bombax和紫檀属Pterocarpus植物以及樟树Cinnamomum camphora和夹竹桃Nerium oleander等园林绿化植物常被齐整小核菌侵染[11]。
土传病原真菌的传统检测方法主要是根据病原菌形态特征、选择性平板计数等方法进行[12-13]，但耗时费力、效率较低，时效性较差，已不能满足实际工作需求。随着分子生物学技术的发展，实时荧光定量PCR (qPCR)因具有特异性强、灵敏度高等特点，已经越来越多地被应用于土传病原真菌的检测。目前，已经有应用该技术对农田土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌进行定性、定量检测的报道[14-16]。但是，尚缺乏应用qPCR技术对城市绿地土壤进行立枯丝核菌和齐整小核菌定量检测的研究。与农田土壤存在明显差异，城市绿地土壤异质性高，普遍面临着重金属和有机污染物等的威胁[1, 17]，因此，针对城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌，探索建立具有较强特异性、较高灵敏性和较好重复性的分子生物学检测方法，对于及时了解上海城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的分布，保障植物和城市绿地生态系统健康具有重要意义。
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立枯丝核菌和齐整小核菌标准菌株购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China, ACCC)，编号分别为ACCC37615和ACCC37946。菌株的培养参照《丝状真菌分子细胞生物学与实验技术》[18]。
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2018年7月，采用多点混合采样法，在上海市随机采集绿地0~20 cm表层土壤样品。采样点信息见表1。每个采样点设置5个子样点，每个土壤样品由5个子样点样品混合而成。土壤样品充分混合后，去除石块、草根等杂物，−20 ℃保存，用于后续试验[17]。
表 1 绿地土壤样品信息
Table 1. Information of green space soil samples
样品编号 绿地类型 采样位置 行政区 绿地名称 纬度(N) 经度(E) 1 道路绿地 金山区 朱平公路中央绿化带内 30°49′ 121°08′ 2 公园绿地 闵行区 闵行文化公园 31°10′ 121°21′ 3 公园绿地 金山区 亭林公园 30°20′ 121°18′ 4 道路绿地 金山区 亭卫公路 30°20′ 121°20′ 5 公园绿地 奉贤区 奉浦四季生态园 30°56′ 121°27′ 6 公园绿地 崇明区 崇明新城公园 31°37′ 121°25′ 7 公园绿地 黄浦区 复兴公园 31°13′ 121°27′ 8 道路绿地 徐汇区 虹梅路 31°08′ 121°24′ 9 道路绿地 普陀区 真北路 31°16′ 121°23′ 10 道路绿地 浦东新区 杨高中路 31°13′ 121°32′ 11 道路绿地 浦东新区 杨高北路 31°15′ 121°35′ 12 道路绿地 浦东新区 济阳路上浦路 31°08′ 121°29′ 13 道路绿地 浦东新区 杨高南路 31°11′ 121°31′ 14 道路绿地 青浦区 外青松公路 31°12′ 121°07′ 15 道路绿地 浦东新区 唐镇路 31°12′ 121°38′ 16 公园绿地 宝山区 炮台湾湿地公园 31°23′ 121°30′ 17 公园绿地 宝山区 淞南公园 31°20′ 121°28′ 18 道路绿地 闵行区 华宁路剑川路 31°01′ 121°23′ 19 道路绿地 杨浦区 殷行路 31°19′ 121°31′ 20 公园绿地 浦东新区 名人苑公园北门东侧 31°14′ 121°33′ 21 公园绿地 嘉定区 汇龙潭公园 31°22′ 121°14′ -
采用AntGene DNA提取试剂盒 (武汉安特捷生物技术有限公司)提取立枯丝核菌和齐整小核菌标准菌株DNA。采用土壤基因组DNA提取试剂盒(FastDNA spin kit for soil, MP Biomedicals, 美国)提取绿地土壤样品DNA。使用NanoDrop 2000微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific, 美国)测定DNA的吸光度比值D(260)/D(280)及D(260)/D(230)，确定DNA质量及浓度，之后于−80 ℃超低温冰箱保存。
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通过文献检索，根据已有报道选择了ST-RS1/ ITS4、ITS1/GMRS-3等引物进行扩增立枯丝核菌的特异性引物的筛选，选择SCR-F/SCR-R、SRITSF/SRITSR等引物进行扩增齐整小核菌的特异性引物的筛选(表2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ )中Primer-BLAST功能将4对引物分别与Non-Redundant Protein Sequence (NR)数据库进行序列比对，在线筛选和验证引物的特异性。表 2 用于立枯丝核菌和齐整小核菌qPCR的引物信息
Table 2. qPCR primer sets of R. solani and S. rolfsii
病原菌 引物名称 引物序列 (5ʹ→3ʹ) 产物大小/bp 退火温度/℃ 参考文献 立枯丝核菌 ST-RS1 AGTGTTATGCTTGGTTCCACT 187 60 [19] ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 564 65 [20] GMRS-3 AGTGGAACCAAGCATAACACT 齐整小核菌 SCR-F CGTAGGTGAACCTGCGGA 540 54 [21] SCR-R CATACAAGCTAGAATCCC SRITSF TACACCTGTGAACCAACTG 465 52 [22] SRITSR CATACAAGCTAGAATCCC -
以2种病原菌标准菌株DNA为模板，分别使用筛选的特异性引物对其进行PCR扩增。PCR产物经质量分数为2%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带，使用通用型DNA纯化试剂盒[天根生化科技(北京) 有限公司，中国北京]对目的条带进行纯化回收。按照pGM-T Fast连接试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，中国北京]说明书将回收所得片段连接到pGEM-T Easy载体上(Promega, 美国)，转化至JM109感受态细胞中(Promega, 美国)，经蓝白斑筛选阳性克隆子，并进行菌落PCR验证后，按照质粒抽提试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，中国北京]说明书进行质粒抽提，提取所得重组质粒送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。使用NanoDrop 2000 微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific, 美国)测定质粒标准品浓度，计算质粒拷贝数[23]。
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qPCR反应体系包含有10 μL GoTaq q-PCR Master Mix (Promega，美国)，DNA模板用量分别设置为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L−1)分别设置为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 μL，加无菌重蒸水补足至20 μL。阴性对照使用无菌重蒸水代替DNA模板。使用Roche Light Cycle 480Ⅱ型qPCR仪(罗氏医学仪器公司，瑞士)。qPCR反应程序：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性 15 s，退火温度下退火40 s [退火温度在文献中引物Tm值(表2)上下浮动3 ℃范围内设置7个温度梯度]，72 ℃延伸40 s，45个循环。循环结束后进入熔解曲线程序：65 ℃升温至95 ℃，隔1 ℃采集荧光信号。
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将立枯丝核菌和齐整小核菌质粒标准品分别进行10倍梯度稀释，质粒标准品浓度范围为108~101 (×106拷贝·L−1)，分别得到8个稀释浓度的质粒标准品模板，使用1.6.1中优化后的qPCR反应条件进行扩增，绘制标准曲线。
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以质粒标准品和绿地土壤样品DNA为模板进行qPCR扩增，通过熔解曲线判断qPCR扩增产物是否单一。qPCR扩增产物利用质量分数为2%琼脂糖凝胶电泳(110 V, 40 min)检测，通过紫外凝胶成像系统对电泳条带进行观察和分析。将质粒标准品和土壤样品扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行克隆测序，并利用NCBI数据库对质粒标准品和土壤样品PCR扩增产物测序结果进行序列比对。
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分别将2种病原真菌的质粒标准品进行10倍梯度稀释，从108 ×106拷贝·L−1稀释至101×106拷贝·L−1，取稀释好的质粒标准品作为模板，按照1.6中优化后的qPCR条件进行扩增，根据试验结果确定方法的最低检测限，验证此方法的灵敏性。
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随机选择5个不同类型绿地土壤样品DNA作为模板，按照1.6中优化后的方法进行立枯丝核菌和齐整小核菌qPCR扩增，每个反应重复2次。随后根据每个样品组内重复间拷贝数的变异系数，验证方法的重复性和稳定性。
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采用1.6中优化后的qPCR方法对21份上海绿地土壤样品进行立枯丝核菌和齐整小核菌定量检测，每个反应设置3个平行试验，计算土壤样品中病原菌ITS基因的拷贝数，y=c×n×v/s。其中：y为基因拷贝数(拷贝·g−1)，c为浓度(×106拷贝·L−1)，n为模板稀释倍数，v为DNA洗脱体积(μL)，s为土壤干质量(g)。
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运用Excel 2016软件对数据进行分析处理。
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使用NCBI中Primer-BLAST功能将表2的4对引物分别与NR数据库进行序列比对。结果显示：引物ST-RS1/ITS4和ITS1/GMRS-3均可有效匹配目的序列900余条，错配率分别为7.7%和6.3%，在理论上均可实现对立枯丝核菌种水平特异性扩增(表3)。与引物ITS1/GMRS-3相比，引物ST-RS1/ITS4扩增目的片段长度小于200 bp，更适用于在qPCR方法中的应用，因此，本研究仅保留引物ST-RS1/ITS4用于后续立枯丝核菌定量检测方法的建立。引物SRITSF/SRITSR可有效匹配目的序列429条，错配率为8.1%，理论上可以实现对齐整小核菌种水平特异性扩增，而引物SCR-F/SCR-R仅匹配30条目的序列，覆盖率相对低于引物SRITSF/SRITSR，且该引物错配率较高，因此，本研究仅保留引物SRITSF/SRITSR用于后续齐整小核菌定量检测方法的建立(表3)。
表 3 qPCR引物在线比对结果
Table 3. On-line blast results of qPCR primers
引物名称 目的序列
长度/bp匹配目的
序列数/条匹配非目的
序列数/条错配
率/%ST-RS1/ITS4 187 908 76 7.7 ITS1/GMRS-3 564 936 63 6.3 SRITSF/SRITSR 465 429 38 8.1 SCR-F/SCR-R 540 30 4 13.3 -
以2种病原菌质粒标准品为模板进行qPCR反应条件的优化。结果表明：引物ST-RS1/ITS4最佳退火温度为60 ℃，引物SRITSF/SRITSR最佳退火温度为52 ℃。在上述退火温度下，2种病原菌qPCR扩增效率最高。因此，最终确定立枯丝核菌qPCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，45个循环。齐整小核菌qPCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，45个循环。
2种病原菌qPCR反应体系中最适引物用量均为0.3 μL (10 μmol·L−1)，DNA模板用量均为2 μL (10 mg·L−1)，在该反应条件下荧光信号最强。因此，最终确定2种病原菌qPCR反应体系(20 μL)为：模板2 μL(10 mg·L−1)，上下游引物(10 μmol·L−1)各0.3 μL，GoTaq®q-PCR Master Mix (Promega，美国)10 μL，无菌重蒸水7.4 μL。
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以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板，使用2.2.1优化后的qPCR反应条件进行扩增，绘制标准曲线。立枯丝核菌标准曲线线性关系表达式为y=−3.319x+33.98 (y为Ct值，x为模板量)，决定系数(R2)为0.999 5，扩增效率为100.1%。齐整小核菌标准曲线线性关系表达式为y=−3.552x+33.65 (y为Ct值，x为模板量)，决定系数(R2)为0.997 9，扩增效率为91.2%。结果表明：2种病原菌qPCR 的Ct值与质粒标准品浓度的对数均具有良好的线性关系，扩增效率符合qPCR定量检测方法的要求，表明本研究建立的2种病原菌定量检测方法具有较高的准确度和有效性，可作为立枯丝核菌和齐整小核菌快速定量检测的方法。对立枯丝核菌的线性检测范围为2.42×101~2.42×108 (×106拷贝·L−1)，对齐整小核菌的线性检测范围为2.20×101~2.20×108 (×106拷贝·L−1)。
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以质粒标准品和绿地土壤样品DNA为模板进行qPCR扩增。结果显示：熔解曲线均为单一熔解峰，无杂峰，表明qPCR扩增产物单一且未产生引物二聚体。qPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果显示：引物ST-RS1/ITS4扩增得到约200 bp的片段，引物SRITSF/SRITSR扩增得到约450 bp的片段，均与目的片段大小一致(图1)。利用NCBI数据库对PCR扩增产物克隆测序的结果进行序列比对，结果见表4。采用引物ST-RS1/ITS4从质粒标准品及土壤样品扩增到的产物分别与立枯丝核菌R. solani BTRFB1(登录号: MZ158299)和R. solani AG-F(登录号：JQ343829)序列相似度最高，相似度为99.4%。采用引物SRITSF/SRITSR从质粒标准品及土壤样品扩增到的产物分别与齐整小核菌S. rolfsii NTNM(登录号: MT126473)和S. rolfsii SR1(登录号: MG847186)序列相似度最高，分别为99.5%和98.8%。扩增产物测序结果说明：利用引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR扩增到的DNA序列均与目的片段序列一致，具有较强的特异性。
图 1 立枯丝核菌和齐整小核菌 DNA的PCR扩增
Figure 1. PCR amplification of R. solani and S. rolfsii DNA
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以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板，使用2.2.1优化后的qPCR反应条件进行扩增，进行qPCR灵敏性验证。结果显示：本研究建立的qPCR定量检测方法对立枯丝核菌和齐整小核菌的检测限分别可达24×106和22×106 拷贝·L−1 (图2)。
图 2 qPCR的灵敏性
Figure 2. Sensitivity test of qPCR
表 4 质粒标准品和土壤样品测序比对结果
Table 4. Sequencing alignment result of plasmid standard and soil sample
引物 样品 同源菌株 基因登录号 相似度/% ST-RS1/ITS4 质粒标准品 R. solani BTRFB1 MZ158299 99.4 土壤样品 R. solani AG-F JQ343829 99.4 SRITSF/SRITSR 质粒标准品 S. rolfsii NTNM MT126473 99.5 土壤样品 S. rolfsii SR1 MG847186 98.8 -
随机选择5个绿地土壤样品DNA作为模板，使用本研究建立的方法对样品中立枯丝核菌和齐整小核菌ITS基因拷贝数进行测定。结果表明：绿地土壤样品立枯丝核菌和齐整小核菌ITS基因拷贝数2次检测结果的变异系数范围分别为3.37%~4.61%和0.66%~8.61%(表5)，变异系数均低于10%，表明本研究建立的立枯丝核菌和齐整小核菌定量检测方法具有较好的重复性和稳定性。
表 5 qPCR的重复性
Table 5. Repeatability of qPCR
病原菌 样品编号 第1次试验 第2次试验 变异系数/% Ct 拷贝数/(×106拷贝·L−1) Ct 拷贝数/(×106拷贝·L−1) 立枯丝核菌 4 31.74 3.09×101 31.60 3.25×101 3.57 5 30.54 6.45×101 30.56 6.15×101 3.37 6 29.49 1.23×102 29.51 1.17×102 3.54 10 30.98 4.91×101 31.03 4.60×101 4.61 12 29.71 1.07×102 29.74 1.01×102 4.08 齐整小核菌 3 33.76 2.16×102 33.53 2.44×102 8.61 6 35.15 1.02×102 35.09 1.05×102 2.05 14 35.04 1.08×102 35.05 1.07×102 0.66 16 36.55 4.77×101 36.63 4.57×101 3.03 18 35.72 7.46×101 35.67 7.66×101 1.87 -
将本研究建立的立枯丝核菌和齐整小核菌定量检测方法应用于上海绿地土壤样品的检测。检测结果表明：立枯丝核菌的检出率为100%， ITS基因拷贝数最高为2.61×106 拷贝·g−1；齐整小核菌的检出率为19%，检出样品的ITS基因拷贝数最高为2.94×105 拷贝·g−1。说明立枯丝核菌在上海绿地表层土壤中广泛存在。
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引物的特异性是对土传病原真菌进行qPCR检测的关键[24]。真菌ITS序列目前已被广泛用于真菌的亲缘关系分析，为病原菌的分子检测提供了较为理想的分子标记[25]。本研究通过检索文献[19, 22]及数据库，筛选得到了基于真菌ITS区域设计的立枯丝核菌和齐整小核菌种水平特异性引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR。NCBI NR数据库在线比对结果显示：ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR目的片段错配率分别为7.7%和8.1%，理论上可实现对立枯丝核菌和齐整小核菌种水平特异性扩增；同时，qPCR熔解曲线均为单一熔解峰，扩增产物片段大小与序列均与目的片段一致。上述结果均表明：本研究建立的立枯丝核菌和齐整小核菌荧光定量检测方法具有较强的特异性。此外，qPCR检测方法的灵敏性是评价其是否可行的另一个关键因素，一般是指可以准确测量的样品最小拷贝数[26]。前人的研究表明：对农田土壤立枯丝核菌和大豆茎褐腐病菌Phialophora gregata等土传病原菌qPCR检测的灵敏性可以达26.7~100.0 (×106拷贝·L−1)[13, 27-28]。本研究针对立枯丝核菌和齐整小核菌检测限分别可达24×106和22×106拷贝·L−1，具有较高的灵敏性。因此，本研究所建立的qPCR检测方法可以用于城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的定量检测。
立枯丝核菌和齐整小核菌是寄主范围广、危害性强的土传病原真菌，可侵染一些重要经济植物，例如水稻Oryza sativa、花生Arachis hypogaea、樟树和海桐等，造成植物根腐病和白绢病等病害的发生[7, 10]。鉴于这2种病原菌分布的广泛性，因此有必要了解其在城市绿地土壤中的分布情况，从而有效预防园林植物立枯病、根腐病和白绢病等病害的发生。本研究中上海绿地表层土壤立枯丝核菌的检出率达100%，表明立枯丝核菌在上海绿地土壤中广泛存在。齐整小核菌检出率较低，为19%。齐整小核菌检出率低，可能有两方面的原因。一方面，随着对城市绿地养护技术和措施的不断提高和加强，齐整小核菌在土壤中的存在范围可能缩小了；另一方面，也可能是由于采样点的局限性，还不足以反映上海绿地土壤中齐整小核菌整体的存在情况，后期需要通过扩大绿地土壤样品采集范围，更为全面地检测齐整小核菌在上海绿地土壤中的分布情况。同时应该看到，应用qPCR方法检测土壤中病原菌的数量时，并不能有效区分活体和死体病原菌的DNA，检测结果可能会过高估计土壤中病原菌基因的丰度[29]。因此，如何准确、快速测定城市绿地土壤中活体立枯丝核菌和齐整小核菌基因的丰度，尚需进一步研究。
综上所述，本研究通过立枯丝核菌和齐整小核菌qPCR引物的筛选和特异性验证、qPCR反应条件的建立及灵敏性和重复性评价，建立了针对立枯丝核菌和齐整小核菌的快速、特异且灵敏性较高的qPCR检测方法，可用于城市绿地土壤中这2种病原菌的定量检测。
Quantitative real-time PCR for rapid detection of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in urban green space
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摘要:
目的 土传病原真菌立枯丝核菌Rhizoctonia solani和齐整小核菌Sclerotium rolfsii严重威胁园林绿化植物正常生长。建立针对这2种土壤病原真菌的快速定量检测方法。 方法 通过筛选2种病原菌特异性引物，优化反应条件。 结果 初步建立了2种病原菌的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR可以分别用于立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR检测，其灵敏度分别达24×106和22×106拷贝·L−1，2次重复反应的变异系数分别为3.37%~4.61%和0.66%~8.61%。对上海绿地土壤样品的检测结果表明：立枯丝核菌和齐整小核菌的检出率分别为100%和19%。 结论 建立的qPCR检测方法具有较强特异性、较高灵敏度和较强重复性，可以用于上海城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的快速、有效定量检测。图2表5参29 Abstract:Objective This study aims to establish a rapid quantitative detection method for Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii, 2 soil-borne pathogenic fungi that seriously threaten the normal growth of landscape plants in Shanghai. Method The reaction conditions were optimized by screening 2 pathogen specific primers. Result A quantitative real-time PCR (qPCR) method was established for the detection of the two pathogens. The primers ST-RS1/ITS4 and SRITSF/SRITSR could be used for qPCR detection of R. solani and S. rolfsii, with sensitivity of 24×106 and 22×106 copies·L−1, respectively. The coefficients of variation of the 2 repeated reactions were 3.37%−4.61% and 0.66%−8.61%, respectively. The detection results of soil samples in Shanghai green space showed that the detection rates of R. solani and S. rolfsii were 100% and 19%, respectively. Conclusion The established qPCR method has high specificity, sensitivity and repeatability, and can be used for rapid and effective quantitative detection of R. solani and S. rolfsii in Shanghai urban green soil. [Ch, 2 fig. 5 tab. 29 ref.] -
Key words:
- urban green space soil /
- Rhizoctonia solani /
- Sclerotium rolfsii /
- qPCR
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间伐是优化林分密度，调整林分空间分布格局的重要经营措施[1-2]，能通过增加林冠开度、降低冠层叶面积指数、增加冠层枝叶反射的散射光和透过林层的直射光来提高林下植被的光合作用速率，促进林下植物有机质的积累[3-4]。林下灌木在稳定森林群落结构和维持物种多样性以及种子萌发和幼苗更新等方面发挥重要作用[5-6]，在一定程度上影响着林下更新幼苗定居及早期生长状况[7]。植物功能性状是植物在漫长进化过程中为适应或降低环境干扰、充分利用环境资源所形成的生物特征，能揭示植物适应环境的能力和策略[8-9]。环境引起的植物功能性状的变化主要表现在器官(根、茎、叶等)的结构性状和化学性状的权衡关系[10]，其中，叶片作为光能捕获及有机质转化器，与植物的资源获取和生物量密切相关[11]；茎是植物地上部分的支撑组织，具有储存和运输养分功能[12]；根系的生长和发达程度决定了土壤资源的获取和利用状况[13]。三者功能性状均对植物生长状况具有一定指示作用。目前，关于环境变化对植物功能性状影响的研究主要集中于叶片[14]，对整个植株各器官功能性状的研究未见报道。间伐对林冠结构的调整使林下光照增加，植物结构性状和化学性状的调节会影响植物光合作用[15]，进而促进植物有机质的积累。研究间伐对林下灌木功能性状的影响，为有效改善林分结构，促进栓皮栎Quercus variabilis人工林更新提供理论和技术支撑。荆条Vitex negundo var. heterophylla作为研究区灌层的建群种，具有较强的耐旱性，是干旱半干旱地区生态恢复的重要指示性物种[16-17]。栓皮栎人工林自然整枝能力较弱，林相差，林下更新萌蘖多，实生苗少且未得到有效保护，急需开展以人工促进天然更新为主要措施的森林抚育。有研究表明：弱度间伐最有利于栎类幼苗更新[18]，林下灌木层盖度对4~10年生幼苗数量具有决定性作用[19]。荆条的“肥岛”效应为林下幼苗生长提供相对充足的生长资源[20]。因此，有必要研究弱度间伐对林下荆条功能性状的影响，以较准确地反映间伐后荆条应对环境资源变化的生存策略，为干旱半干旱地区栓皮栎人工林可持续经营管理提供科学依据。
1. 研究区概况
研究区位于河南省国有登封林场清凉寺林区(34°26′~34°33′N，112°44′~113°05′E)，海拔为518~755 m，坡度为5°~30°。该地区属暖温带大陆性季风气候，年平均气温14.2 ℃，年平均降水量614.0 mm，降水主要集中在夏季，占全年总降水量的33.8%左右。土壤贫瘠，以褐土和棕壤为主，表现为富钾、少氮、极缺磷。乔木以栓皮栎、侧柏Platycladus orientalis、刺槐Robinia pseudoacacia、槲栎Q. aliena、黄栌Cotinus coggygria为主，灌木以荆条Vitex negundo var. heterophylla、扁担杆Grewia biloba、酸枣Ziziphus jujuba为主。
2. 研究方法
2.1 样地布设与调查
2016年在登封国有林场选取2个林分立地条件、坡度、坡向、坡位相同，林龄、林分密度、林木生长状况基本一致的林班，样地栓皮栎间伐及未间伐林分年龄均为40 a，郁闭度约0.90，坡度分别为9°和7°，坡向均为南坡，平均胸径分别为10.01和10.10 cm，平均树高分别为7.98和8.06 m，林分密度分别为2 200和2 211株·hm−2。分别设置1个100 m×100 m(1 hm2)间伐样地和未间伐样地。间伐方式以修枝、非全面割灌、伐除病腐木及没有培育前途的林木为主的生产性间伐，基本不降低林分蓄积量(间伐株数强度31.55%，蓄积强度为3.26%)。2019年调查间伐样地林分密度为1 532株·hm−2，林木平均胸径12.80 cm，平均树高11.45 m，未间伐样地林分密度2 110株·hm−2，林木平均胸径10.64 cm，平均树高9.05 m。间伐3 a后，间伐后林木生长加快，平均胸径及树高均有所提高，一方面是因为大径级林木被保留下来，另一方面是保留木生长空间及资源充足，加速林木生长。2019年6月在间伐样地和未间伐样地分别均匀设置6个20 m×20 m的方形森林动态监测样方，调查每个样方内荆条平均高度及冠幅，选取具有平均高度和平均叶量的荆条3株，共36株。采集东西南北4个方向完全展开、没有病虫害的叶片。用BY-N4型植物营养测定仪测定叶片叶绿素和氮质量分数，用Yaxin-1241叶面积仪测定荆条叶面积、叶长、叶宽等指标，采用全根挖掘法采集植株根系，带回实验室于2019年6−7月进行地上功能性状和根系结构功能指标测定。样地设置及样地基本情况见闫东锋等[1]。
2.2 数据处理及分析方法
2.2.1 指标测定
选取荆条根、茎、叶共32个植物功能指标，调查及测定的植物功能性状指标见表1。表1中，叶长宽比=叶长/叶宽，比叶面积=叶面积/叶片质量，叶干物质质量分数=叶干质量/叶鲜质量，茎干物质质量分数=茎干质量/茎鲜质量，根干物质质量分数=根干质量/根鲜质量，比根长=总根长/根干质量，基径采用Haglof游标卡尺测定。植株各器官全磷质量分数通过钼锑抗比色法测定，全钾采用火焰光度计测定，有机碳通过烘箱加热法测定。
表 1 所选植物功能性状Table 1 Functional traits of selected plants植物功能性状 单位符号 植物功能性状 单位符号 植物功能性状 单位符号 植物功能性状 单位符号 高度 m 基径 cm 根干物质质量分数 茎全氮 g·kg−1 叶周长 cm 茎生物量 g 根生物量比 茎全钾 mg·kg−1 叶面积 cm2 茎干物质质量分数 根冠比 茎全磷 g·kg−1 比叶面积 cm2·g−1 主根长 cm 比根长 cm·g−1 茎有机碳 g·kg−1 叶绿素 总根长 cm 叶全氮 g·kg−1 根全氮 g·kg−1 叶生物量 g 根表面积 cm2 叶全钾 mg·kg−1 根全钾 mg·kg−1 叶干物质质量分数 根体积 cm3 叶全磷 g·kg−1 根全磷 g·kg−1 叶长宽比 根生物量 g 叶有机碳 g·kg−1 根有机碳 g·kg−1 采用GLA 2.0软件获取林下光照条件(林下直射光和林下散射光)。用CI-110冠层分析仪测定荆条冠层的光合有效辐射强度、太阳辐射时间等指标。采用五点取样法对样地0~10和10~20 cm的土壤取样，并充分混匀带回实验室测定土壤营养元素质量分数，其中土壤全氮采用凯氏定氮法测定，全磷、全钾、有机碳的测定与荆条养分测定方法相同。采用环刀法测定土壤容重，并计算土壤毛管孔隙度、非毛管孔隙度等物理性质。
2.2.2 数据处理
对各器官功能性状的差异进行显著性检验(t检验)，在检验之前对数据的正态性进行检验；计算荆条地上功能性状与林下光环境和根系与土壤理化性质的Pearson相关系数；以荆条各器官功能性状指标为因变量，以与其相关关系显著的环境因子作为自变量进行线性逐步回归分析。
3. 结果与分析
3.1 间伐对荆条各器官功能性状的影响
3.1.1 间伐对荆条地上部分功能性状的影响
从表2可见：间伐样地荆条平均高为0.97 m，高于未间伐样地(0.92 m)，2个样地荆条高为0.86~1.06 m，但无显著差异(P＞0.05)。间伐样地荆条叶周长、叶面积、比叶面积和叶生物量(48.91 cm，17.27 cm2，31.97 cm2·g−1，90.53 g)均显著高于未间伐样地(33.16 cm，10.18 cm2，24.07 cm2·g−1，67.55 g，P＜0.05)，叶干物质质量分数(0.35)低于未间伐样地(0.44)，但差异不显著(P＞0.05)。基径(1.39 cm)高于未间伐样地(1.18 cm)，但分布均为0.60~1.69 cm。
表 2 间伐对荆条地上部分功能性状的影响Table 2 Effect of thinning on the functional traits of aboveground part of on V. negundo var. heterophylla项目 措施 高度/m 叶周长/cm 叶面积/cm2 比叶面积/(cm2·g−1) 叶绿素 叶生物量/g 平均值±标准差 间伐 0.97±0.03 A 48.91±1.04 A 17.27±0.49 A 31.97±0.63 A 43.55±2.50 A 90.53±9.68 A 未间伐 0.92±0.03 A 33.16±1.77 B 10.18±1.71 B 24.07±1.85 B 34.15±3.60 A 67.55±4.52 B 数值范围 间伐 0.91~1.06 46.37~52.49 15.90~18.55 30.37~33.12 37.75~52.75 66.02~112.78 未间伐 0.86~0.98 28.31~37.33 5.53~15.67 18.15~28.46 20.50~40.05 53.01~76.94 项目 措施 叶干物质质量分数 叶长宽比 基径/cm 茎生物量/g 茎干物质质量分数 平均值±标准差 间伐 0.35±0.02 A 1.60±0.06 A 1.39±0.20 A 32.91±6.82 A 0.55±0.02 A 未间伐 0.44±0.05 A 2.43±0.88 A 1.18±0.15 A 25.02±6.13 A 0.52±0.03 A 数值范围 间伐 0.30~0.38 1.45~1.76 0.60~1.69 16.64~43.28 0.47~0.59 未间伐 0.35~0.47 1.20~5.91 0.80~1.69 12.13~47.25 0.41~0.58 说明：同列不同字母表示功能性状间存在显著差异(P＜0.05)，相同字母表示无显著差异(P＞0.05) 3.1.2 间伐对荆条根功能性状的影响
由表3可知：间伐后荆条主根长和根表面积(9.02 cm，701.032 cm2)大于未间伐样地(8.8 cm，516.52 cm2)，但差异不显著(P＞0.05)；总根长、根生物量、比根长和根体积(207.3 cm，43.78 g，6.79 cm·g−1，31.79 cm3)均显著高于未间伐样地(133.96 cm，34.58 g，3.97 cm·g−1，18.50 cm3，P＜0.05)。荆条根干物质质量分数和根生物量比小于未间伐样地，间伐样地和未间伐样地荆条根冠比差异不大。
表 3 间伐对荆条地下部分功能性状的影响Table 3 Effect of thinning on the functional traits of underground part of V. negundo var. heterophylla项目 措施 主根长/cm 根总长/cm 根表面积/cm2 根体积/cm3 根生物量/g 平均值±标准差 间伐 9.02±0.91 A 207.30±24.40 A 701.03±180.68 A 31.79±3.28 A 43.78±7.36 A 未间伐 8.80±0.61 A 133.96±12.61 B 516.52±251.68 A 18.50±4.45 B 34.58±3.32 B 数值范围 间伐 6.6~12.10 131.42~285.56 508.90~1060.67 21.99~42.34 14.88~56.32 未间伐 7.5~10.60 108.45~169.85 275.21~865.78 9.0~33.65 27.22~42.49 项目 措施 根干物质质量分数 根生物量比 根冠比 比根长/(cm·g−1) 平均值±标准差 间伐 0.62±0.01 B 0.40±0.08 B 1.16±0.42 A 6.79±0.31 A 未间伐 0.68±0.05 A 0.52±0.05 A 1.16±0.31 A 3.97±0.41 B 数值范围 间伐 0.52~0.75 0.21~0.53 0.27~2.15 2.64~19.19 未间伐 0.56~0.82 0.39~0.69 0.44~2.28 2.69~5.22 说明：同列不同字母表示功能性状间存在显著差异(P＜0.05)，相同字母表示无显著差异(P＞0.05) 3.1.3 间伐对荆条各器官营养分配特征的影响
对栓皮栎人工林间伐和未间伐林下荆条各器官养分分配比较分析(图1)发现：荆条营养物质植株各器官中的分配规律一致：氮元素主要分配给叶，其次为根；磷元素质量分数较低且主要分布在植株根中；钾元素分配规律从大到小依次为叶、茎、根；有机碳质量分数从大到小依次为茎、根、叶。
图 1 间伐对荆条各器官养分分配影响Figure 1 Effect of thinning on nutrient distribution of various organs of V. negundo var. heterophylla间伐与未间伐样地荆条同一器官化学性状分配规律表现为：间伐样地荆条叶片氮质量分数以及根和茎的有机碳质量分数(3.72、775.33、461.30 g·kg−1)，显著高于未间伐样地(3.06、540.16、402.49 g·kg−1，P＜0.05)。这说明间伐不改变矿质养分在荆条各器官的分配规律，但在一定程度上促进叶和茎功能性状的优化。间伐样地荆条叶全钾质量分数(9.08 mg·kg−1)显著低于未间伐样地(11.63 mg·kg−1，P＜0.05)，茎全钾质量分数(5.69 mg·kg−1)低于未间伐样地(4.43 mg·kg−1)，但差异不显著(P＞0.05)。这与未间伐样地土壤钾质量分数较高有关。
3.2 荆条地上部分功能性状与光环境的关系
由表4可知：荆条叶面积与林下散射辐射通量、总辐射通量和太阳辐射时间呈极显著正相关关系(P＜0.01)，比叶面积与林下直射辐射通量和散射辐射通量呈极显著正相关(P＜0.01)，与太阳辐射时间呈显著正相关(P＜0.05)。叶全氮质量分数和有机碳质量分数与光合有效辐射强度和总辐射通量呈显著正相关(P＜0.05)，与太阳辐射时间呈极显著正相关(P＜0.01)。茎干物质质量分数与光合有效辐射呈显著正相关(P＜0.05)，茎全钾与林下直射辐射通量和散射辐射通量呈显著正相关(P＜0.05)，与太阳辐射时间呈极显著正相关(P＜0.01)。茎有机碳质量分数与林下直射辐射通量和总辐射通量呈显著正相关(P＜0.05)。
表 4 荆条地上部分功能性状与林下光环境的相关性分析Table 4 Correlation analysis of aboveground part functional traits of V. negundo var. heterophylla and understory light environment地上部分功能性状 光合有效辐射强度 直射辐射通量 散射辐射通量 总辐射通量 太阳辐射时间 叶面积 0.534 0.442 0.823** 0.837** 0.882** 叶绿素 0.263 0.578 0.484 0.274 0.528 叶干物质质量分数 0.861 0.215 0.521 0.215 0.779 比叶面积 0.547 0.797** 0.837** 0.768** 0.661* 叶全氮 0.706* 0.304 0.492 0.902* 0.946* 叶全磷 0.180 0.071 0.186 0.552 0.620 叶全钾 0.664* 0.831** 0.311 0.752* 0.520 叶有机碳 0.663* 0.821** 0.752* 0.761* 0.940** 茎干物质质量分数 0.841** 0.018 0.488 0.831** 0.783** 茎生物量比 −0.400 0.171 −0.316 0.067 −0.141 茎全氮 0.415 0.296 0.447 0.111 0.569 茎全磷 0.209 0.160 0.244 0.031 0.435 茎全钾 0.640* 0.710* 0.769** 0.786** 0.649* 茎有机碳 0.313 0.862** 0.686 0.801** 0.669 说明：*表示显著相关(P＜0.05)；**表示极显著相关(P＜0.01) 3.3 根功能性状与土壤因子的关系
表5表明：栓皮栎人工林林下荆条总根长与土壤容重和毛管孔隙度、总孔隙度呈显著负相关(P＜0.01)，与土壤非毛管孔隙度、土壤有机碳呈极显著正相关(P＜0.01)，根表面积与土壤容重呈显著负相关(P＜0.05)，与土壤非毛管孔隙度、有机质和全氮呈极显著正相关(P＜0.05)，根体积与土壤容重呈极显著负相关(P＜0.01)，与非毛管孔隙度和土壤有机质呈极显著正相关(P＜0.01)。根全氮与土壤非毛管孔隙度呈显著正相关(P＜0.05)，根有机碳与土壤容重呈极显著负相关(P＜0.01)，与土壤非毛管孔隙度和土壤有机碳呈极显著正相关(P＜0.01)。这说明间伐改善了土壤团粒结构，使土壤容重降低，有利于增大土壤非毛管孔隙度，促进荆条根系对土壤养分和水分的吸收，从而促进植物的生长以及土壤有机碳的积累。
表 5 荆条根功能性状与土壤因子的相关性分析Table 5 Correlation analysis of the functional characters of V. negundo var. heterophylla root and soil factors根功能性状 土壤容重 非毛管孔隙度 毛管孔隙度 总孔隙度 土壤有机碳 土壤全氮 土壤全磷 土壤全钾 主根长 −0.547 0.612 −0.541 −0.454 0.619 0.756* 0.432 0.357 总根长 −0.807** 0.829** −0.848** −0.791** 0.873** 0.451 −0.109 −0.155 根表面积 −0.739* 0.740* −0.672 −0.577 0.734* 0.690* 0.290 0.431 根体积 −0.914** 0.953** −0.876 −0.759 0.915** 0.604 0.175 0.139 根生物量 −0.479 0.460 0.212 0.228 0.233 0.009 −0.407 −0.120 根干物质质量分数 −0.629 0.650* −0.077 −0.016 0.378 0.634* 0.238 0.479 根生物量比 0.174 −0.158 −0.597 −0.578 −0.474 −0.031 −0.104 0.423 根冠比 −0.142 0.166 −0.663* −0.620 −0.016 0.217 0.260 0.481 比根长 −0.588 0.551 −0.834** −0.838** 0.752* 0.485 0.108 −0.074 根全氮 −0.634 0.647* −0.578 −0.540 0.586 0.505 −0.060 0.153 根全磷 −0.858** 0.717* −0.934** −0.871** 0.818** 0.265 −0.220 −0.221 根全钾 −0.813** 0.775** 0.212 0.228 0.750* 0.439 −0.234 −0.223 根有机碳 −0.916** 0.913** −0.077 −0.016 0.979** 0.433 −0.058 −0.197 说明：*表示显著相关(P＜0.05)；**表示极显著相关(P＜0.01) 3.4 荆条主要功能性状与环境因子逐步回归分析
为进一步探究栓皮栎人工林间伐背景下，林下荆条地上部分功能性状与林下光环境和荆条根与土壤理化特性指标值的关系，以荆条功能性状为因变量(y)，以与各功能性状密切相关的5个光环境因子和5个土壤理化因子为自变量进行线性逐步回归分析，结果见表6。
表 6 荆条各器官功能性状与环境因子的逐步回归分析模型Table 6 Stepwise regression analysis of V. negundo var. heterophylla functional traits and environmental factors each organ功能性状 回归方程 P R2 叶面积 y=−6.89+1.282x4+0.056x5 0.026 0.896 比叶面积 y=−7.385−0.13x1+10.229x3 0.014 0.910 叶全氮 y=1.143+0.013x4+0.089x5 0.048 0.911 叶有机碳 y=77.476+77.11x1−0.794x3 0.160 0.987 茎干物质质量分数 y=0.415+0.001x1 0.002 0.706 茎有机碳 y=74.329+121.525x2 0.038 0.620 总根长 y=−118.671−2.234 x7+3.555 x8+4.312 x9 0.001 0.783 根干物质 y=−230.074+10x7−0.013x9 0.017 0.753 根体积 y=−9.176−15.724 x6+3.499 x7+0.199 x9 0.001 0.923 比根长 y=−17.111−4.765 x7+1.124x8+0.840 x9 0.003 0.930 根有机碳 y=−338.69+4.253x9−26.676x10 0.001 0.978 说明：x1为光合有效辐射；x2为林下直射辐射通量；x3为林下散射辐射通量；x4为林下总辐射通量；x5为太阳辐射时间；x6为土壤容 重；x7为土壤非毛管孔隙度；x8为毛管总孔隙度；x9为土壤有机质；x10为土壤全氮。 由地上部分功能性状指标与光环境的线性逐步回归分析结果可以看出：荆条叶面积和叶全氮均与林下总辐射通量和太阳直射时间存在较好的线性回归关系，R2分别达0.896和0.911，P均小于0.05。比叶面积和叶有机碳质量分数与光合有效辐射和林下散射辐射线性回归拟合效果较好，R2分别达0.910和0.987，P分别小于0.01和0.05。茎干物质质量分数与光合有效辐射有较强的线性回归关系(P＜0.01，R2=0.896)，而茎有机碳质量分数与林下直射辐射通量存在较好的线性回归关系(P＜0.05，R2=0.620)。
根功能性状与其相关性较强的土壤理化特性线性逐步回归分析结果表明：根总长与土壤非毛管孔隙度、总孔隙度和土壤有机碳，根体积和比根长与土壤容重土壤非毛管孔隙度和毛管孔隙度，根有机碳与土壤有机碳和土壤全磷的线性回归拟合效果较好，R2分别达0.783、0.923、0.930、0.978，P均小于0.01。根干物质质量分数与土壤非毛管孔隙度和土壤有机碳，根体积与土壤容重存在较好的线性回归关系(R2=0.753，P＜0.05)。其中，对土壤理化特征反应敏感的指标为根有机碳质量分数、比根长、根体积，R2分别为0.978、0.930、0.923，对根系影响最大的土壤理化指标是土壤有机质。
4. 结论与讨论
4.1 间伐背景下荆条生长与天然更新的关系
生产性抚育间伐往往是采用清理病腐木、修枝、割灌等为主的低强度间伐为特征的作业方法，而本研究对象采用的是割除对影响抚育作业的少量灌木为主的非全面割灌作业方式。相对于酸枣Ziziphus jujuba等其他灌木，荆条对于开展作业活动影响不大，因此作业时大部分被保留下来。间伐能够改善林内环境，提高栎林林下幼苗天然更新密度[18]，促进栎类树种幼苗的定居和生长，而荆条作为栓皮栎人工林林下的主要建群灌木种类，对于林下更新幼苗具有一定的保护和“肥岛”效应[20]，可以为林下更新幼苗的早期定居和生长提供遮光环境，这不仅对于需要遮光的栓皮栎更新幼苗的生长发育具有一定的保护作用，且由于荆条灌丛“肥岛”现象对土壤持水保肥发挥着重要作用，可为幼苗生长提供相对充足的水肥资源，因此，林下荆条数量及生长状况直接或间接地影响着林下更新幼苗的存活与发育，而林下更新幼苗的生长状况决定着林分更新潜力和抗干扰能力。因此，间伐作为改善林分结构的主要措施，研究生产性间伐对林下主要灌木种类(如荆条)的影响，对于预测林下天然更新动态，制定科学合理的人工促进天然更新措施(如选择性割除或保留林下灌木)，实现森林可持续经营具有一定的参考意义。
4.2 间伐对栓皮栎人工林灌层荆条各器官功能性状的影响
间伐后林内环境发生变化，植物叶片是对光环境变化最敏感的器官，而茎功能性状与植物固碳能力、养分水分传输和防御能力密切相关，对植物生长发育状况具有指示作用[10-11]。根系是与土壤密切接触的器官，其功能性状均能对环境变化做出响应。本研究发现：间伐样地荆条叶面积、比叶面积、叶全氮、茎全氮和茎有机碳显著高于未间伐样地。主要原因可能是，相对于未间伐样地，间伐样地林冠开度的增大使林内光照、温度、水分及土壤理化性质发生异质性[21]，荆条能够获取更充足的资源，使地上部分功能性状均处于较高水平。这说明间伐后林下光环境充足，荆条采用资源获取性生长策略，通过优化自身的结构性状和化学性状，截获更多光能，促进荆条叶片光合作用和有机质的积累。未间伐样地荆条具有较低的比叶面积和较高的叶干物质，说明荆条采取保守型生存策略，通过提高养分利用率，来适应遮光较强的未间伐样地，这与路兴慧等[22]的研究结果一致，即较小的比叶面积和较高的叶干物质有利于林下苗木适应低光环境相一致。总根长、根体积、根生物量和根有机碳均显著高于未间伐样地，原因可能是间伐样地冠层开度的增大在一定程度上增加林内土壤温度，减少降水截留，增加土壤湿度，有利于土壤微生物的生存与繁殖，加速林下腐殖质的分解，有利于林下土壤矿质养分的增加，为荆条根系提供充足的养分，促进根系长度的增加和生物量的积累。但根干物质低于未间伐样地，差异不显著。这可能由于相对于间伐样地，未间伐样地根系的水分比例相对较低，保持较高的根干物质，有利于荆条根系的水分保持。
4.3 荆条地上部分功能性状与林下光环境特征的关系
森林冠层是森林内部与外界环境相互作用最直接、最活跃的交界面[23]。林冠结构的垂直分量会影响穿过林冠的透光率[24]，林冠开度的扩大能促进林下总辐射通量、林下直射光和散射光的增加[3]。间伐引起的林下光环境的优化将直接或间接的影响着植物地上部分功能性状。本研究发现：荆条比叶面积与光合有效辐射强度和散射辐射通量呈极显著的线性正相关，与CORNELISSEN等[25]认为：叶面积越大越有利于植物增强捕获资源能力的研究结果一致。HOGAN等[26]研究间伐对热带幼树功能性状的影响结果：林冠开度增大有利于比叶面积较大的先锋树种定居和生长也佐证这一结论。叶全氮与林下总辐射通量呈极显著的线性正相关关系。这说明间伐后，冠层结构的优化促进林下光环境改善，有利于荆条叶进行光合作用，而氮是光合蛋白质的重要组成成分，与植物的光合作用密切相关。这与高林浩等[27]的研究结果比叶面积与叶全氮含量呈显著正相关相互验证。茎有机碳均与直射辐射通量呈显著正相关。虽然茎光合作用较弱，但在直射辐射通量增加时，叶片光合作用合成更多有机碳，在运输过程中储存在茎中。
4.4 荆条根功能性状与土壤理化性质的关系
根系作为土壤和植物地上部分的枢纽，既可吸收土壤水分和矿质营养反馈植物生长，又能周转、分解土壤养分和改善土壤理化特性[28]。荆条具有浅根特性。研究区荆条根系在0~20 cm土层中所占比例最大，且由于荆条具有“肥岛”效应，其土壤养分表现为表层养分最丰富[20]，因此，本研究分析荆条根系与0~20 cm土壤理化特性的关系。发达的根系能降低土壤容重，增加非毛管孔隙度，促进土壤有机质积累[29]。本研究发现：间伐样地荆条根系生物量显著高于未间伐样地，且总根长与土壤容重呈极显著负相关，与非毛管孔隙度和土壤矿质养分呈极显著正相关，这说明间伐有利于改善土壤孔隙结构，使土壤水分易于根系吸收。这与李建聪[30]研究的土壤非毛管孔隙度与根系的分布具有一致性的结果类似。荆条比根长与土壤有机碳极显著线性正相关，根有机碳与土壤有机质极显著线性正相关。这说明灌木倾向于通过比根长提高水分和养分的获取能力[13]。JACKSON等[31]认为：根系分布异质性的主要原因是土壤养分及空间异质性，根系对土壤空间异质性的基本响应是调整生物量，这说明间伐样地荆条根系趋向于资源获取效率提升。但是，由于森林经营的长周期性，随着时间的推移，冠层开度下降，林下光环境减弱，林内环境与未间伐样地的差异性缩小，因此想要探究间伐对林下荆条的长期影响，需进行进一步周期性系统研究。
4.5 结论
栓皮栎人工林间伐后，荆条拥有较高叶周长、叶面积、比叶面积、叶全氮、茎有机碳、总根长、根体积、根生物量、根有机碳功能性状组合，其资源获取性生存策略突出。地上部分对光环境最敏感的功能性状有叶面积、比叶面积、叶氮质量分数和茎总有机碳质量分数。其中，林下散射辐射通量、总辐射通量和太阳直射时间是荆条地上部分功能性状最主要的影响因子。荆条根功能性状中总根长、比根长是对土壤理化特性最敏感的性状指标，而影响荆条根功能性状的关键因子是土壤有机质。
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表 1 绿地土壤样品信息
Table 1. Information of green space soil samples
样品编号 绿地类型 采样位置 行政区 绿地名称 纬度(N) 经度(E) 1 道路绿地 金山区 朱平公路中央绿化带内 30°49′ 121°08′ 2 公园绿地 闵行区 闵行文化公园 31°10′ 121°21′ 3 公园绿地 金山区 亭林公园 30°20′ 121°18′ 4 道路绿地 金山区 亭卫公路 30°20′ 121°20′ 5 公园绿地 奉贤区 奉浦四季生态园 30°56′ 121°27′ 6 公园绿地 崇明区 崇明新城公园 31°37′ 121°25′ 7 公园绿地 黄浦区 复兴公园 31°13′ 121°27′ 8 道路绿地 徐汇区 虹梅路 31°08′ 121°24′ 9 道路绿地 普陀区 真北路 31°16′ 121°23′ 10 道路绿地 浦东新区 杨高中路 31°13′ 121°32′ 11 道路绿地 浦东新区 杨高北路 31°15′ 121°35′ 12 道路绿地 浦东新区 济阳路上浦路 31°08′ 121°29′ 13 道路绿地 浦东新区 杨高南路 31°11′ 121°31′ 14 道路绿地 青浦区 外青松公路 31°12′ 121°07′ 15 道路绿地 浦东新区 唐镇路 31°12′ 121°38′ 16 公园绿地 宝山区 炮台湾湿地公园 31°23′ 121°30′ 17 公园绿地 宝山区 淞南公园 31°20′ 121°28′ 18 道路绿地 闵行区 华宁路剑川路 31°01′ 121°23′ 19 道路绿地 杨浦区 殷行路 31°19′ 121°31′ 20 公园绿地 浦东新区 名人苑公园北门东侧 31°14′ 121°33′ 21 公园绿地 嘉定区 汇龙潭公园 31°22′ 121°14′ 
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表 2 用于立枯丝核菌和齐整小核菌qPCR的引物信息
Table 2. qPCR primer sets of R. solani and S. rolfsii
病原菌 引物名称 引物序列 (5ʹ→3ʹ) 产物大小/bp 退火温度/℃ 参考文献 立枯丝核菌 ST-RS1 AGTGTTATGCTTGGTTCCACT 187 60 [19] ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 564 65 [20] GMRS-3 AGTGGAACCAAGCATAACACT 齐整小核菌 SCR-F CGTAGGTGAACCTGCGGA 540 54 [21] SCR-R CATACAAGCTAGAATCCC SRITSF TACACCTGTGAACCAACTG 465 52 [22] SRITSR CATACAAGCTAGAATCCC
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表 3 qPCR引物在线比对结果
Table 3. On-line blast results of qPCR primers
引物名称 目的序列
长度/bp匹配目的
序列数/条匹配非目的
序列数/条错配
率/%ST-RS1/ITS4 187 908 76 7.7 ITS1/GMRS-3 564 936 63 6.3 SRITSF/SRITSR 465 429 38 8.1 SCR-F/SCR-R 540 30 4 13.3
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表 4 质粒标准品和土壤样品测序比对结果
Table 4. Sequencing alignment result of plasmid standard and soil sample
引物 样品 同源菌株 基因登录号 相似度/% ST-RS1/ITS4 质粒标准品 R. solani BTRFB1 MZ158299 99.4 土壤样品 R. solani AG-F JQ343829 99.4 SRITSF/SRITSR 质粒标准品 S. rolfsii NTNM MT126473 99.5 土壤样品 S. rolfsii SR1 MG847186 98.8
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表 5 qPCR的重复性
Table 5. Repeatability of qPCR
病原菌 样品编号 第1次试验 第2次试验 变异系数/% Ct 拷贝数/(×106拷贝·L−1) Ct 拷贝数/(×106拷贝·L−1) 立枯丝核菌 4 31.74 3.09×101 31.60 3.25×101 3.57 5 30.54 6.45×101 30.56 6.15×101 3.37 6 29.49 1.23×102 29.51 1.17×102 3.54 10 30.98 4.91×101 31.03 4.60×101 4.61 12 29.71 1.07×102 29.74 1.01×102 4.08 齐整小核菌 3 33.76 2.16×102 33.53 2.44×102 8.61 6 35.15 1.02×102 35.09 1.05×102 2.05 14 35.04 1.08×102 35.05 1.07×102 0.66 16 36.55 4.77×101 36.63 4.57×101 3.03 18 35.72 7.46×101 35.67 7.66×101 1.87
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