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城市绿地中立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR快速检测方法

雒淑红 骆玉珍 赵莺莺 张维维 刘文 何山文 安磊 王永杰 韩继刚

雒淑红, 骆玉珍, 赵莺莺, 张维维, 刘文, 何山文, 安磊, 王永杰, 韩继刚. 城市绿地中立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR快速检测方法[J]. 浙江农林大学学报. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210801
引用本文: 雒淑红, 骆玉珍, 赵莺莺, 张维维, 刘文, 何山文, 安磊, 王永杰, 韩继刚. 城市绿地中立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR快速检测方法[J]. 浙江农林大学学报. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210801
LUO Shuhong, LUO Yuzhen, ZHAO Yingying, ZHANG Weiwei, LIU Wen, HE Shanwen, AN Lei, WANG Yongjie, HAN Jigang. Quantitative real-time PCR for rapid detection of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in urban green space[J]. Journal of Zhejiang A&F University. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210801
Citation: LUO Shuhong, LUO Yuzhen, ZHAO Yingying, ZHANG Weiwei, LIU Wen, HE Shanwen, AN Lei, WANG Yongjie, HAN Jigang. Quantitative real-time PCR for rapid detection of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in urban green space[J]. Journal of Zhejiang A&F University. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210801

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城市绿地中立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR快速检测方法

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210801
基金项目: 上海市绿化和市容管理局科技攻关项目(G200201);上海市科学技术委员会科研计划项目(19dz1203300)
详细信息
    作者简介: 雒淑红(ORCID: 0000-0001-8129-1927),从事生物化学与分子生物学研究。E-mail: 2495240181@qq.com
    通信作者: 韩继刚(ORCID: 0000-0001-9717-4725),教授,博士,从事城市绿地土壤质量监测和土壤功能微生物研究。E-mail: jghan9@gmail.com
  • 中图分类号: Q949.32

Quantitative real-time PCR for rapid detection of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in urban green space

  • 摘要:   目的  土传病原真菌立枯丝核菌Rhizoctonia solani和齐整小核菌Sclerotium rolfsii严重威胁园林绿化植物正常生长。建立针对这2种土壤病原真菌的快速定量检测方法。  方法  通过筛选2种病原菌特异性引物,优化反应条件。  结果  初步建立了2种病原菌的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR可以分别用于立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR检测,其灵敏度分别达24×106和22×106拷贝·L−1,2次重复反应的变异系数分别为3.37%~4.61%和0.66%~8.61%。对上海绿地土壤样品的检测结果表明:立枯丝核菌和齐整小核菌的检出率分别为100%和19%。  结论  建立的qPCR检测方法具有较强特异性、较高灵敏度和较强重复性,可以用于上海城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的快速、有效定量检测。图2表5参29
  • 图  1  立枯丝核菌和齐整小核菌 DNA的PCR扩增

    Figure  1  PCR amplification of R. solani and S. rolfsii DNA

    图  2  qPCR的灵敏性

    Figure  2  Sensitivity test of qPCR

    表  1  绿地土壤样品信息

    Table  1.   Information of green space soil samples

    样品编号绿地类型采样位置
    行政区 绿地名称纬度(N)经度(E)
    1 道路绿地 金山区  朱平公路中央绿化带内 30°49′ 121°08′
    2 公园绿地 闵行区  闵行文化公园 31°10′ 121°21′
    3 公园绿地 金山区  亭林公园 30°20′ 121°18′
    4 道路绿地 金山区  亭卫公路 30°20′ 121°20′
    5 公园绿地 奉贤区  奉浦四季生态园 30°56′ 121°27′
    6 公园绿地 崇明区  崇明新城公园 31°37′ 121°25′
    7 公园绿地 黄浦区  复兴公园 31°13′ 121°27′
    8 道路绿地 徐汇区  虹梅路 31°08′ 121°24′
    9 道路绿地 普陀区  真北路 31°16′ 121°23′
    10 道路绿地 浦东新区 杨高中路 31°13′ 121°32′
    11 道路绿地 浦东新区 杨高北路 31°15′ 121°35′
    12 道路绿地 浦东新区 济阳路上浦路 31°08′ 121°29′
    13 道路绿地 浦东新区 杨高南路 31°11′ 121°31′
    14 道路绿地 青浦区  外青松公路 31°12′ 121°07′
    15 道路绿地 浦东新区 唐镇路 31°12′ 121°38′
    16 公园绿地 宝山区  炮台湾湿地公园 31°23′ 121°30′
    17 公园绿地 宝山区  淞南公园 31°20′ 121°28′
    18 道路绿地 闵行区  华宁路剑川路 31°01′ 121°23′
    19 道路绿地 杨浦区  殷行路 31°19′ 121°31′
    20 公园绿地 浦东新区 名人苑公园北门东侧 31°14′ 121°33′
    21 公园绿地 嘉定区  汇龙潭公园 31°22′ 121°14′
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    表  2  用于立枯丝核菌和齐整小核菌qPCR的引物信息

    Table  2.   qPCR primer sets of R. solani and S. rolfsii

    病原菌引物名称引物序列 (5ʹ→3ʹ)产物大小/bp退火温度/℃参考文献
    立枯丝核菌 ST-RS1 AGTGTTATGCTTGGTTCCACT 187 60 [19]
    ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
    ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 564 65 [20]
    GMRS-3 AGTGGAACCAAGCATAACACT
    齐整小核菌 SCR-F CGTAGGTGAACCTGCGGA 540 54 [21]
    SCR-R CATACAAGCTAGAATCCC
    SRITSF TACACCTGTGAACCAACTG 465 52 [22]
    SRITSR CATACAAGCTAGAATCCC
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    表  3  qPCR引物在线比对结果

    Table  3.   On-line blast results of qPCR primers

    引物名称目的序列
    长度/bp
    匹配目的
    序列数/条
    匹配非目的
    序列数/条
    错配
    率/%
    ST-RS1/ITS4 187 908 76 7.7
    ITS1/GMRS-3 564 936 63 6.3
    SRITSF/SRITSR 465 429 38 8.1
    SCR-F/SCR-R 540 30 4 13.3
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    表  4  质粒标准品和土壤样品测序比对结果

    Table  4.   Sequencing alignment result of plasmid standard and soil sample

    引物样品同源菌株基因登录号相似度/%
    ST-RS1/ITS4 质粒标准品 R. solani BTRFB1 MZ158299 99.4
    土壤样品 R. solani AG-F JQ343829 99.4
    SRITSF/SRITSR 质粒标准品 S. rolfsii NTNM MT126473 99.5
    土壤样品 S. rolfsii SR1 MG847186 98.8
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    表  5  qPCR的重复性

    Table  5.   Repeatability of qPCR

    病原菌样品编号第1次试验第2次试验变异系数/%
    Ct拷贝数/(×106拷贝·L−1)Ct拷贝数/(×106拷贝·L−1)
    立枯丝核菌431.743.09×10131.603.25×1013.57
    530.546.45×10130.566.15×1013.37
    629.491.23×10229.511.17×1023.54
    1030.984.91×10131.034.60×1014.61
    1229.711.07×10229.741.01×1024.08
    齐整小核菌333.762.16×10233.532.44×1028.61
    635.151.02×10235.091.05×1022.05
    1435.041.08×10235.051.07×1020.66
    1636.554.77×10136.634.57×1013.03
    1835.727.46×10135.677.66×1011.87
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-12-14
  • 录用日期:  2022-06-01
  • 修回日期:  2022-05-28

城市绿地中立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR快速检测方法

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210801
    基金项目:  上海市绿化和市容管理局科技攻关项目(G200201);上海市科学技术委员会科研计划项目(19dz1203300)
    作者简介:

    雒淑红(ORCID: 0000-0001-8129-1927),从事生物化学与分子生物学研究。E-mail: 2495240181@qq.com

    通信作者: 韩继刚(ORCID: 0000-0001-9717-4725),教授,博士,从事城市绿地土壤质量监测和土壤功能微生物研究。E-mail: jghan9@gmail.com
  • 中图分类号: Q949.32

摘要:   目的  土传病原真菌立枯丝核菌Rhizoctonia solani和齐整小核菌Sclerotium rolfsii严重威胁园林绿化植物正常生长。建立针对这2种土壤病原真菌的快速定量检测方法。  方法  通过筛选2种病原菌特异性引物,优化反应条件。  结果  初步建立了2种病原菌的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR可以分别用于立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR检测,其灵敏度分别达24×106和22×106拷贝·L−1,2次重复反应的变异系数分别为3.37%~4.61%和0.66%~8.61%。对上海绿地土壤样品的检测结果表明:立枯丝核菌和齐整小核菌的检出率分别为100%和19%。  结论  建立的qPCR检测方法具有较强特异性、较高灵敏度和较强重复性,可以用于上海城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的快速、有效定量检测。图2表5参29

English Abstract

雒淑红, 骆玉珍, 赵莺莺, 张维维, 刘文, 何山文, 安磊, 王永杰, 韩继刚. 城市绿地中立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR快速检测方法[J]. 浙江农林大学学报. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210801
引用本文: 雒淑红, 骆玉珍, 赵莺莺, 张维维, 刘文, 何山文, 安磊, 王永杰, 韩继刚. 城市绿地中立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR快速检测方法[J]. 浙江农林大学学报. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210801
LUO Shuhong, LUO Yuzhen, ZHAO Yingying, ZHANG Weiwei, LIU Wen, HE Shanwen, AN Lei, WANG Yongjie, HAN Jigang. Quantitative real-time PCR for rapid detection of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in urban green space[J]. Journal of Zhejiang A&F University. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210801
Citation: LUO Shuhong, LUO Yuzhen, ZHAO Yingying, ZHANG Weiwei, LIU Wen, HE Shanwen, AN Lei, WANG Yongjie, HAN Jigang. Quantitative real-time PCR for rapid detection of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in urban green space[J]. Journal of Zhejiang A&F University. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210801

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