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近年来，全球气候的持续变化加剧了干旱对森林的威胁[1]。以往研究表明：水力安全阈值(导水率损失50%时的水势与最小水势差)与年均降水量无关，这意味着干旱引发的森林衰退存在全球趋同现象[2]。在严重干旱后的数年内，植物普遍存在生长缓慢和恢复不完全的遗留效应，植物生长强弱根据水力安全阈值而异[2-3]，生长在湿润地区的植物受遗留效应的影响，恢复能力较弱，难以在未来更为频繁的干旱威胁下正常生长，从而导致湿润区生态系统的永久损伤，并进一步造成森林碳汇的普遍退化[4]。通过对湿润区不同水分环境植物的研究，有助于理解水分有效性对湿润区植物生存策略的影响。
水力失效是干旱期间植物生产力下降和死亡的主要原因[5]。水分供需矛盾的加剧迫使更多空气进入木质部管道，由此产生的栓塞阻碍了植物的水分运输，最终导致水力失效。植物的输水效率常通过植物茎的比导率(Ks)来衡量[6]，湿润生境下的植物倾向于最大化输水效率而非增加木质部对栓塞的抵抗力以满足生长需求[7]。栓塞抗性(植物导水率损失50%的水势，P50)常用来表征植物应对干旱的能力[6]。研究表明：植物的栓塞抗性与干旱胁迫强度呈正相关[2, 8]。当水势降至P50以下时，木质部栓塞加速，水力运输功能明显受阻。通过对水力性状的研究，有助于描述不同植物水力策略的范围，进而深入理解植物的驱动因素[9]。
裸子植物和被子植物的木质部结构差异较大[10-11]，管胞在运输和支撑方面发挥作用，导管则仅具有运输功能。依赖纤维提供木材强度[12-13]，厚度跨度比及纹孔形态作为管壁的重要特征，与栓塞抗性密切相关[14]。输水效率由管腔面积及管道密度决定。根据Hagen-Poiseuill定律[15]，木质部管腔面积分数的减少可以通过增大管道尺寸弥补。相比由管胞构成的裸子植物木质部，被子植物复杂的木质部结构可独立改变导管结构以优化运输，为机械强度或储存功能提供更大的木质部空间[16]。
环境水分有效性对植物的水力策略具有选择性，从而驱动植物群落的分布[17]。本研究通过比较7种裸子植物和7种被子植物在不同生境下的栓塞抗性、输水效率和解剖结构的性状差异，探究植物水力性状与木质部解剖结构的关系，以期为研究湿润区亚热带植物在不同水分条件下的水力适应策略提供参考。
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研究区位于浙江省杭州市临安区，该区地处中亚热带向北亚热带过渡区域，四季分明，区内年平均气温为8.8~14.8 ℃，年降水量为1 390~1 870 mm，无霜期为209~235 d，相对湿度为76%~81%。在研究区内选择自然和人工生境进行植物样本采集(表1)。自然生境位于西天目山景区，除自然降水外无额外灌溉。植被类型以常绿-落叶阔叶混交林为主，除研究树种外(表2)，其他常见树种有北美香柏Thuja occidentalis、短尾柯Lithocarpus brevicaudatus、榧树Torreya grandis和榉树Zelkova serrata等。人工生境为浙江农林大学植物园，相比自然生境土壤水分有效性高，人工灌溉充分。除研究树种外(表2)，其他常见树种有枫香Liquidambar formosana、桂花Osmanthus fragrans、冬青Ilex chinensis、垂柳Salix babylonica和竹柏Podocarpus nagi等。
表 1 自然和人工生境的基本特征
Table 1. Basic characteristics for study sites in natural and artificial habitats
生境 经纬度 海拔/m 坡向 坡度/(°) pH 生长季土壤含水量/% 自然生境 30°26′N, 119°73′E 400~450 西南 9~12 4.85±0.16 29.53±1.21 人工生境 30°15′N, 119°43′E 51~74 西南 15~20 5.23±0.12 35.98±1.22 说明：pH和生长季土壤含水量数值为平均值±标准误(n=3) 表 2 7种裸子植物和7种被子植物基本概况
Table 2. Basic overview of 7 species of gymnosperms and 7 species of angiospermae
植物 科 植物 生长习性 生活型 裸子植物 杉科 Taxodiaceae 柳杉 Cryptomeria japonica 落叶 乔木 松科 Pinaceae 金钱松 Pseudolarix amabilis 落叶 乔木 杉科 Taxodiaceae 落羽杉 Taxodium distichum 落叶 乔木 杉科 Taxodiaceae 杉木 Cunninghamia lanceolata 常绿 乔木 松科 Pinaceae 雪松 Cedrus deodara 常绿 乔木 柏科 Cupressaceae 日本扁柏 Chamaecyparis obtusa 常绿 乔木 杉科 Taxodiaceae 北美红杉 Sequoia sempervirens 常绿 乔木 被子植物 槭树科 Aceraceae 三角槭 Acer buergerianum 落叶 乔木 大戟科 Euphorbiaceae 重阳木 Bischofia polycarpa 落叶 乔木 胡桃科 Juglandacea 青钱柳 Cyclocarya paliurus 落叶 乔木 壳斗科 Fagaceae 青冈 Cyclobalanopsis glauca 常绿 乔木 木犀科 Oleaceae 女贞 Ligustrum lucidum 常绿 乔木 木兰科 Magnoliaceae 广玉兰 Magnolia grandiflora 常绿 乔木 樟科 Lauraceae 樟树 Cinnamomum bodinieri 常绿 乔木 -
2021年4—6月，在不同生境下选取生长状况良好的7种裸子植物和7种被子植物作为目标物种(表2)。选择同一生境下立地条件基本一致，且胸径、树高、树龄、冠幅等相近的同一植物15~21株。在天气晴朗的8:00—11:00采集枝条，所选枝条均位于树体南部外层和树冠中部。每株随机截取3~5个枝条，所剪枝条基部直径为6~8 mm，长为15~30 cm。剪取后迅速放入装有水的黑色收纳箱中(防止水分散失和外界空气等进入被切开的导管内)，立即带回实验室，进行水力功能性状和结构性状的测定。
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采回样品在水中暗适应30~60 min后，在水下再次剪短样品，并修平切口。裸子植物剪取枝段平均长度为134.23 mm，平均直径为4.95 mm，被子植物剪取枝段平均长度为160.04 mm，平均直径为5.47 mm。本研究采用空气注入法构建枝段脆弱性曲线，具体如下：将枝段放入压力腔，并将枝段近轴端连接到木质部导水率与栓塞测量系统XYL’EM-Plus (Bronkhorst, Montigny-les-Cormeilles, 法国)。使用测量溶液20 mmol·L−1 氯化钾+1 mmol·L−1 氯化钙[18]，在高压(120 kPa)下反复冲刷枝段10 min至最大导水率不再变化，以确保潜在栓塞被去除。在低压(6 kPa)下测量枝段的最大导水率(Kmax，kg·m·s−1·MPa−1)[19]。在确定Kmax后，对枝段施加压力2 min，用测量Kmax的方法测量相应的导水率(Kh，kg·m·s−1·MPa−1)。该过程以0.2~0.3 MPa的增量重复进行(取决于植物)，直到导水率损失(PLC)至少达到90%[20]。采用XylWin 3.2软件(Bronkhorst, Montigny-les-Cormeilles, 法国)对其导水数据进行分析。比导率(Ks，kg·s−1·m−1·MPa−1)作为输水效率指标，通过Kmax除以无髓和树皮的基部边材横截面积得到[19]。导水率损失百分比计算如下：PLC=(1−Kh/Kmax)×100%[21]。导水率损失50%时的水势(P50)作为本研究的栓塞抗性指标。
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从测定导水率的枝段上截取0.5 cm长小段样品，固定软化后，采用石蜡切片法制成永久切片，所用样品的横切面用Leica DM 3000显微镜在50和400倍镜下摄像，所有样品的纵切面在400倍镜下摄像。用Image J图像处理软件分析照片，测量管胞壁厚度(μm)及导管壁厚度(μm)，并计算管胞水力直径(μm)、导管水力直径(μm)、管胞密度(个·mm−2)、导管密度(个·mm−2)、厚度跨度比。根据文献[22]计算管胞水力直径和导管水力直径。管胞密度和导管密度分别通过横截面管胞数量和导管数量除以横截面面积得到。管胞壁和导管壁厚度跨度比具体测量方法可参考相关文献[14, 23]。
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从测定导水率的枝段上截取3根3~5 cm的小枝段，用于木质部密度(WD, g·cm−3)测量。参考文献[24]方法：用刀片除去枝段样品树皮，利用阿基米德原理确定样品的新鲜体积(V，cm3)；测得体积后，将样品置于75 ℃烘箱烘48 h，测得干质量(W，g)，则WD=W/V。
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图表制作与统计分析利用R软件(version 3.5.3)。同一植物在不同生境下各水力性状和解剖结构性状的差异，在除去异常值后，在种内进行t检验。植物枝水力性状与解剖结构性状间的关系采用Pearson相关性分析。文中所有数值为平均值±标准误。
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在植物输水效率方面，自然生境下6种被子植物的Ks显著大于人工生境(P＜0.05，图1A)，且被子植物Ks的均值显著大于人工生境(P＜0.05，图1B)。在栓塞抗性方面，自然生境下7种被子植物的P50均显著小于人工生境(P＜0.05，图1C)，且被子植物P50的均值显著小于人工生境(P＜0.05，图1D)。
图 1 自然与人工生境下7种被子植物的水力功能性状
Figure 1. Hydraulic functional characteristics of 7 species of angiosperms in natural and artificial habitats
在植物输水效率方面，自然生境下5种裸子植物的Ks显著大于人工生境(P＜0.05，图2A)，但裸子植物Ks的均值在不同生境间差异不显著(P＞0.05，图2B)。在栓塞抗性方面，自然生境下6种裸子植物的P50显著小于人工生境(P＜0.05，图2C)，且裸子植物P50的均值显著小于人工生境(P＜0.05，图2D)。
图 2 自然与人工生境下7种裸子植物的水力功能性状
Figure 2. Hydraulic functional characteristics of 7 species of gymnosperms in natural and artificial habitats
对14种被子植物和裸子植物的输水效率和栓塞抗性比较发现：自然生境植物的Ks均值显著大于人工生境(P＜0.05，图3A)，自然生境植物的P50显著小于人工生境(P＜0.05，图3B)。
图 3 不同生境下14种植物的水力功能性状
Figure 3. Hydraulic functional characteristics of 14 studied plants in different habitats
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从被子植物的解剖结构可以看出：自然生境下5种被子植物的水力直径显著大于人工生境(P＜0.05，图4A)；5种被子植物的导管壁厚度显著小于人工生境(P＜0.05，图4B)；5种被子植物的厚度跨度比显著小于人工生境(P＜0.05，图4C)；樟树、青钱柳、女贞的导管密度显著小于人工生境，其余4种被子植物则相反(P＜0.05，图4D)；不同生境下，三角槭、青钱柳、女贞的木质部密度无显著差异，重阳木、樟树、广玉兰的木质部密度显著小于人工生境，青冈的木质部密度显著大于人工生境(P＜0.05，图4E)。
图 4 自然与人工生境下7种被子植物的木质部解剖结构特征
Figure 4. Characteristics of xylem anatomical structure of 7 species of angiosperms in natural and artificial habitats
从裸子植物的解剖结构可以看出：自然生境雪松、落羽杉、北美红杉的水力直径显著小于人工生境，柳杉、杉木、金钱松的水力直径显著大于人工生境(P＜0.05，图5A)；柳杉、杉木、北美红杉的管胞壁厚度显著大于人工生境，日本扁柏、金钱松、落羽杉的管胞壁厚度显著小于人工生境(P＜0.05，图5B)；柳杉、杉木、北美红杉的厚度跨度比显著大于人工生境，日本扁柏、金钱松、落羽杉的厚度跨度比显著小于人工生境(P＜0.05，图5C)；雪松、柳杉、日本扁柏的导管密度显著大于人工生境，杉木、金钱柳、北美红杉的导管密度显著小于人工生境(P＜0.05，图5D)；雪松、金钱松的木质部密度均显著大于人工生境，杉木、日本扁柏、落羽杉的木质部密度均显著小于人工生境(P＜0.05，图5E)。
图 5 自然与人工生境下7种裸子植物的木质部解剖结构特征
Figure 5. Characteristics of xylem anatomical structure of 7 species of gymnosperms in natural and artificial habitats
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被子植物水力功能性状与木质部解剖结构性状相关性分析表明(图6A和图6B)：自然生境下，导管密度、厚度跨度比与Ks和P50均呈正相关，其中导管密度与Ks、P50相关极显著(P＜0.01)。水力直径、导管壁厚度、木质部密度与Ks和P50均呈负相关，其中水力直径与Ks、P50相关极显著(P＜0.01)；人工生境下，水力直径、导管壁厚度与Ks和P50均呈正相关关系，且相关极显著(P＜0.01)，厚度跨度比、导管密度、木质部密度与Ks及P50均呈负相关，除厚度跨度比外，其他指标间相关性均极显著(P＜0.01)。此外，被子植物的水力直径与Ks和P50在自然生境均为负相关，在人工生境则均为正相关，导管密度与Ks和P50在自然生境均为正相关，在人工生境则均为负相关。
图 6 被子植物和裸子植物水力功能性状与解剖结构性状的相关性
Figure 6. Correlation analysis between hydraulic function and anatomical structure traits of angiosperms and gymnosperms.
裸子植物水力功能性状与木质部解剖结构性状相关性分析表明(图6C和图6D)：自然生境下，水力直径与Ks呈显著正相关(P＜0.01)，与P50呈显著负相关(P＜0.01)。管胞密度与Ks呈显著负相关(P＜0.01)，与P50则呈显著正相关(P＜0.01)；人工生境下，水力直径与Ks正相关，与P50负相关，且与Ks、P50相关性均极显著(P＜0.01)，其余性状与Ks均呈负相关(P＜0.05)，与P50均正相关，其中厚度跨度比、导管密度、木质部密度与P50相关显著(P＜0.05)。此外，裸子植物水力直径、管胞密度在不同生境下均与Ks、P50保持一致相关性，其中水力直径与Ks呈显著正相关(P＜0.05)，与P50呈显著负相关(P＜0.05)。管胞密度与Ks呈极显著负相关(P＜0.01)，与P50呈极显著正相关(P＜0.01)。
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以往研究表明：相比于干燥环境，水分充足环境下的同一植物的Ks通常较高[2, 7]。本研究中，除被子植物青钱柳及裸子植物落羽杉、北美红杉外，自然生境中植物的Ks显著大于人工生境，表明自然生境的植物拥有更高的输水效率，这与上述研究结果一致。MAHERALI等[25]指出：相比于高山环境，西黄松Pinus ponderosa在沙漠环境的Ks较高；MAHERALI等[26]研究表明：落叶被子植物Ks随生境降水量的降低而增加，因此植物通过增加输水效率以适应相对干旱环境的生存策略可能较为普遍。Hagen-Poiseuill定律表明：更高的输水效率需要较大的导管直径以满足功能需求[15]，然而本研究植物较大的水力直径并未与更高的输水效率一一对应，与上述定律存在一定的偏差[27]。
植物的栓塞抗性受环境控制的假设已被证实[20, 28]。通常认为，植物的栓塞抗性随栖息地干旱程度的加剧而增加[2, 8]。本研究中除裸子植物落羽杉外，植物的栓塞抗性在自然生境显著较低，表明人工生境植物的栓塞抗性更强，这与HAJEK等[29]研究结果一致。不同生境同一植物的栓塞抗性差异显著[2]，这与先前报道植物的栓塞抗性可塑性较低不符[30-31]，生境干旱水平对植物栓塞抗性的预测亦存在偏差[32]，栓塞抗性可能与生境水分差异无关[33]。通常植物栓塞抗性的强弱与木质部机械强度息息相关，厚度跨度比可独立于导管直径而变化，因此相比于木质部密度，厚度跨度比对植物栓塞抗性的预测效果更好[14, 23]。本研究结果与上述观点一致，厚度跨度比能更好指示栓塞抗性在不同生境的强弱。
水分条件的差异促使植物采取不同的水力策略。本研究中，自然生境下的植物通过提高输水效率以满足蒸发需求的加剧[25-26]，减轻对栓塞抗性的依赖[34]。表明栓塞抗性并非唯一的抗旱手段，植物亦可通过有效的性状组合应对干旱胁迫[33, 35]，尽管这将迫使植物更接近其自身的功能极限[2]。落羽杉、北美红杉均为杉科植物，两者在应对持续水分胁迫后脱落酸(ABA)含量较低[36]。先前研究表明[37]：当植物处于轻度水分胁迫且脱落酸水平较低时，导水效率会相应提升，这可能意味着湿润区人工生境同样面临着干旱威胁。
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人工生境被子植物的水力直径、导管密度与Ks、P50间存在显著相关性，这可能是纤维对木质部机械强度的驱动所造成[38]，纤维与导管的功能差异可能导致输水效率与机械支持解隅[39]，使植物在提升输水效率的同时最大化木质部安全投资。裸子植物木质部多达90%由管胞构成，管胞具有水力运输和机械支持的功能[12, 16]，本研究中裸子植物的水力直径、管胞密度在不同生境下的相关性均与Ks、P50保持一致，可能与裸子植物的稳定组织结构有关。其中管胞水力直径与Ks的关系符合Hagen-Poiseuill定律[15]，且更宽的管胞往往更长，管胞的输水效率随管胞直径和长度的增加而增加[40]。此外，不同生境下裸子植物的厚度跨度比与管胞水力直径呈显著负相关，与管胞壁厚度呈显著正相关，表明裸子植物是通过缩小管胞直径而非管胞壁厚度以实现机械强度的增加[41]。本研究中裸子植物的管胞密度均与不同生境Ks呈显著负相关，与P50呈显著正相关，这与上述观点一致。拥有较小管胞直径、较大管胞密度的裸子植物，其栓塞抗性可能更强[28]。具有较高机械强度的植物其栓塞抗性通常较强[14]。本研究中自然生境下植物的P50变异范围较小，这可能导致P50变异与解剖特征无关[31]。此外，被子植物木材结构属性在一定程度决定了P50的变异[42]，针对木质部不同组织结构的投资亦会对P50的变异产生影响[14, 35]，这些因素在一定程度上解释了人工生境下被子植物的厚度跨度比与P50的负相关关系。本研究中除自然生境被子植物外，不同物种、生境下的水力直径均与Ks呈显著正相关。尽管植物平均导管直径和导管密度存在显著差异，但导管横截面积差异可能较小[38]，自然生境下被子植物导管腔面积分数的差异可能导致输水效率并未与水力直径相对应[43]。
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湿润区裸子植物和被子植物在同一生境的水分利用策略相似，自然生境水分有效性较低，植物通过提高输水效率以避免水势的下降，从而降低潜在栓塞风险。裸子植物与被子植物木质部结构与功能的差异可能是同一生境下植物水分策略存在差异的主要原因，导致不同水分环境对植物的驱动差异。植物性状对植物水分策略具有一定指示作用，厚度跨度比在本研究中能较好预测植物栓塞抗性在不同生境的强弱，对植物性状更为深入的研究将有助于提升对植物群落分布的理解。
Relationship between hydraulic properties and xylem anatomical structure of subtropical plants
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摘要:
目的 植物水力系统需要对不断变化的水分环境做出适应性调整，因此，量化植物水力性状与木质部解剖结构在不同水分状况下的关系，将有助于理解植物的适应策略。 方法 以亚热带7种裸子植物和7种被子植物为研究材料，对比分析不同生境中(自然生境和人工生境)植物的栓塞抗性(植物导水率损失50%的水势)、输水效率和解剖结构的性状差异，探究植物水力性状与木质部解剖结构的关系。 结果 ① 在不同生境下，自然生境植物的输水效率(Ks)较大，栓塞抗性(P50)较小，且植物解剖结构性状对不同生境植物水力性状具有一定指示性。② 相关性分析表明：被子植物的导管水力直径、导管密度与Ks、P50呈显著相关(P＜0.05)，但相关性在不同生境下呈相反趋势；裸子植物的管胞水力直径、管胞密度与Ks、P50之间的相关性在不同生境中具有相同趋势。 结论 在湿润区内，植物通过增加输水效率以适应相对干旱环境的生存策略可能较为普遍。木质部结构与功能的差异可能是同一生境下植物水分策略存在差异的原因。图6表2参43 Abstract:Objective Plant hydraulic system needs to adapt to the changing water environment. This study aims to quantify the relationship between plant hydraulic properties and xylem anatomical structure in different habitats, so as to understand the adaptation strategies of plants to water changes. Method Taking 7 species of gymnosperms and 7 species of angiosperms in subtropical zone as research materials, the differences of embolic resistance (water potential with 50% loss of plant hydraulic conductivity, P50), water transport efficiency (Ks) and anatomical structure of plants in different habitats (natural habitat and artificial habitat) were compared and analyzed, and the relationship between plant hydraulic properties and xylem anatomical structure was explored. Result (1) In different habitats, Ks of plants in natural habitat was larger, and P50 was smaller. The plant anatomical structure traits had a certain indication of plant hydraulic traits in different habitats. (2) Correlation analysis showed that the conduit hydraulic diameter and conduit density of angiosperms were significantly correlated with Ks and P50 (P＜0.05), but the correlations showed the opposite trends in different habitats. The correlation of tracheid hydraulic diameter and tracheid density of gymnosperms with Ks and P50 showed the same trend in both habitats. Conclusion It may be common for plants to adapt to relatively arid environment by increasing water transport efficiency in humid areas. The differences in xylem structure and function may be the reason for the differences in plant water strategies in the same habitat. [Ch, 6 fig. 2 tab. 43 ref.] -
Wuschel-related homeobox (WOX)是植物特有的新型转录因子，属于Homepbox (HOX)超家族，包含由60~65个氨基酸组成的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋的保守结构域。WOX家族基因分为3个独立进化支，即现代进化支(modern clade，WUS)，中间进化支(intermediate clade)和远古进化支(ancient clade)[1-3]，其中WUS是最早发现的WOX家族成员[4]。WOXs蛋白在植物胚胎形成[5]、干细胞维持[6]和花发育[7]等方面发挥重要作用。拟南芥Arabidopsis thaliana中WOX家族有15个成员，分别是AtWUS和AtWOX1~AtWOX14[4]，其中，AtWOX10、AtWOX13和AtWOX14蛋白属于远古进化分支，AtWUS和AtWOX1~7等8个蛋白质属于WUS分支，AtWOX8、AtWOX9、AtWOX11和AtWOX12蛋白属于中间进化分支。AtWUS在胚珠、花药和茎尖分生组织中表达，是维持中央分生组织的关键基因，AtWOX11和AtWOX12参与新生根器官发生，在顶端分生组织发育阶段，AtWUS参与干细胞稳态维持[8]。超表达AtWUS促进棉花Gossypium hirsutum体细胞胚胎发育和器官发生[9]。水稻Oryza sativa中，OsWOX11激活冠根的萌发和生长，过表达OsWOX11可促进雌蕊增加[10]；OsWOX3A参与水稻叶片、小穗、分蘖和侧根的发育[11]；在茎顶端分生组织和腋分生组织中OsWOX4正调控干细胞[12]。超表达WOX11 (PeWOX11a和PeWOX11b)或WOX11/12a增加转基因植株不定根数量[13-14]。在小麦Triticum aestivum中超表达TaWUS影响外花轮状器官发育，TaWOX9促进转基因拟南芥根的发育[15]。
WOXs转录因子不仅调控植物生长发育，而且参与胁迫响应。在水稻中OsWOX12A和OsWOX12B等基因的表达受干旱、寒冷和盐胁迫差异调控，超表达OsWOX11通过促进根毛生长发育提高转基因植株干旱胁迫耐受性[16-17]。84K杨树Populus alba×P. glandulosa中，干旱胁迫诱导PagWOX11/12a基因强烈表达，促进根系伸长和生物量生长，上游调控因子PagERF35激活PagWOX11/12a表达[18]，PagWOX11/12a通过调控PagCYP736A12基因表达，调节活性氧(reactive oxygen species，ROS )清除，提高杨树耐盐性[19]。
杜仲Ecommia ulmoides是杜仲科Eucommiaceae杜仲属Eucommia的落叶乔木，为中国二级保护植物，叶片、树皮和果皮中富含杜仲胶，是重要的胶用和药用经济树种，具有极高的开发利用价值[20]。杜仲叶片中含有绿原酸、黄酮类、木脂素类、环烯醚萜类、α-亚麻酸等药用成分，具有抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力等重要作用[21-22]。鉴于WOX基因在拟南芥、水稻、玉米Zea mays、杨树、油菜Brassica napus、铁皮石斛Dendrobium officinale等中的作用，推测WOX家族基因可能在杜仲叶芽的形成和激活过程中起关键作用。本研究以杜仲基因组数据为基础，对杜仲WOX家族基因进行了全基因组鉴定和生物信息学分析，基于转录组分析WOX在杜仲叶片不同发育时期以及杜仲胶形成中的表达模式，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测杜仲WOX基因(EuWOXs)在‘紫叶’杜仲‘Ziye’叶片发育中的表达水平，以期为EuWOXs功能的深入研究奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
自西北农林科技大学苗圃(陕西杨凌)，取生长正常长势一致的2年生‘紫叶’杜仲幼苗的叶芽(茎尖)、生长叶(3 cm长叶片)、幼叶(完全展开的新叶)，用液氮迅速处理，置于−80 ℃冰箱保存。
1.2 方法
1.2.1 杜仲WOX蛋白(EuWOXs)的鉴定及理化性质分析
拟南芥WOX蛋白序列下载于TAIR数据库(
https://www.arabidopsis.org/index.jsp )，根据Pfam号(PF00046)在杜仲基因组数据库中筛选出WOX家族基因候选序列，利用美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的保守结构域搜索服务(Conserved Domain Search Service，CD Search)检测蛋白质保守结构域，筛选出具有完整WOX结构域的蛋白质作为EuWOX家族成员，利用生物信息学方法[23]分析EuWOXs的理化性质。1.2.2 杜仲WOX家族基因染色体定位及系统进化分析
通过杜仲基因组数据库搜索WOX基因在染色体上的位置及每条染色体长度，利用MapGene2Chromosome v2 (
http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/ )软件绘制WOX家族基因染色体定位。利用DNAMAN进行蛋白序列比对，通过Clustal X 1.83对杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白进行多序列比对，利用MEGA 6.0邻接法(neighbor-joining)，重复次数设置为1 000次[24]，构建系统发育树，根据拟南芥同源基因对EuWOXs蛋白命名。1.2.3 EuWOXs的结构、基序及启动子分析
利用GSDS (
http://gsds.gao-lab.org/index.php )软件分析EuWOXs的内含子和外显子分布。利用MEME (http://meme-suite.org/ )软件分析EuWOXs基序，参数设置为：any number of Repetitions，maximum number of Motifs=20，minimum width≥6，and maximum width≤50。分离EuWOXs启动子(ATG)上游2 000 bp序列，利用Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/ )分析EuWOXs启动子顺式作用元件。1.2.4 EuWOXs的表达模式分析
从NCBI的Short Read Arshive (SRA)数据库中下载‘秦仲1号’‘Qinzhong No.1’叶片不同发育时期(叶芽、初生叶、幼叶、老叶)(版本号：SRP218063)[25]及高产胶杜仲品种‘秦仲2号’‘Qinzhong No.2’、低产胶杜仲品种‘小叶’‘Xiaoye’(版本号：SRP158357)[26]的转录组数据，使用每1百万个映射上的碱基中映射到外显子的每1千个碱基上的碱基个数(fragments per kilobase million，FPKM)值表示EuWOXs相对表达丰度，取对数(log2)进行统计分析，利用TBtools工具绘制基因表达图谱[27]。
使用Trizol(天根DP424)提取RNA，反转录成cDNA，通过Primer 3.0软件设计EuWOXs特异性引物(引物序列见表1)，通过Quant Studio 6(新加坡Life Technologies公司)，All-in-One SYBR Premix EX TaqTM kit(美国Gene Copoeia公司)进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应，10 μL反应体系：2× mix 5.00 μL、正向引物/反向引物各0.25 μL、cDNA 2.00 μL、ROX 0.20 μL、双蒸水2.30 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45个循环。以UBCE2为内参基因[26]，通过$2^{-\Delta \Delta C_t} $法对3次生物学重复进行数据分析。
表 1 引物序列Table 1 Primer sequences基因名 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) EuWOX1 ATGGTGGGTGACCAGCTTAG TTCTCTGGCCTTGTGGTTCT EuWOX2 ACCGTACCCCAACCTACTCC ACTTCCCGTTGGATGAAGTG EuWOX4-1 GGAACCCTACGCAAGAACAG GCGCTTCTGCTTTTGTCTCT EuWOX4-2 TAGAGCAGATCACGGCACAG CTAGGGTCGGATGTTGGAGA EuWOX5 GACGGAGCAAGTGAGAGTCC TCTCCCGTGCCTTATGATTC EuWOX11 ACTCGAGTTTTGTGGCCTGT AATTGGAGGCATCTGGATTG EuWOX13-1 GGTCTGAGGGCATGTGTTTT TTGGAGATATGGGTGGTGGT EuWOX13-2 GGGTTGTTCGTCAAGGTCAT GTTGGAATCCACCGTTGTCT UBCE2 AGTGGGTGGTGCTGTAGTCC AACTCCCGTTTCGTTTGTTG 1.2.5 EuWOXs蛋白互作关系分析
通过STRING软件(
https://string-db.org/ )上传EuWOXs蛋白质序列，利用拟南芥数据库，根据拟南芥WOXs蛋白已知互作关系，预测EuWOXs互作蛋白，通过Cytoscape 3.7.0软件对EuWOXs蛋白质互作信息进行评估和预测[28]。2. 结果与分析
2.1 杜仲WOX家族基因鉴定及其蛋白质理化性质
由表2可知：从杜仲基因组中共鉴定到8个EuWOXs，分布在8条染色体上(图1)；均含有HD保守结构域，其中EuWOX1序列最长，编码352个氨基酸，EuWOX13-2序列最短，编码191个氨基酸。EuWOXs分子量为22.12~40.36 kDa，EuWOX11等电点最小，为5.62，EuWOX4-1等电点最大，为9.04；亚细胞定位预测结果显示：EuWOXs均定位在细胞核中，均为亲水性蛋白。
表 2 EuWOXs蛋白质序列特征及亚细胞定位Table 2 Sequence characteristics and subcellular location of E. ulmoides WOX proteins基因号 基因名 拟南芥
同源基因染色体 位置 CDS长度/
bp氨基酸数/
个分子量/
kDa等电点 亚细胞
定位EUC13591-RA EuWOX1 AT3G18010.1 Super-Scaffold_235 3540694-3544292 1059 352 40.36 5.78 细胞核 EUC12552-RA EuWOX2 AT5G59340.1 Scaffold912_obj 156744-159059 810 269 30.16 8.11 细胞核 EUC15721-RA EuWOX4-1 AT1G46480.1 Super-Scaffold_242 604979-606289 618 205 23.48 9.04 细胞核 EUC21176-RA EuWOX4-2 AT1G46480.1 Scaffold272_obj 37477-39280 642 213 24.31 8.82 细胞核 EUC18832-RA EuWOX5 AT3G11260.1 Super-Scaffold_117 336319-340482 549 182 20.70 6.92 细胞核 EUC00362-RA EuWOX11 AT3G03660.1 Super-Scaffold_154 68808-70507 765 254 27.67 5.62 细胞核 EUC00756-RA EuWOX13-1 AT4G35550.1 Super-Scaffold_233 319468-325733 810 269 30.42 6.22 细胞核 EUC02503-RA EuWOX13-2 AT4G35550.1 Super-Scaffold_71 6332599-6364092 576 191 22.11 6.54 细胞核 2.2 EuWOXs的保守结构域
利用DNAMAN软件对8个EuWOXs及12个拟南芥WOXs蛋白(AtWOXs)保守结构域进行序列分析。结果(图2)显示：WOXs蛋白质HD结构域氨基酸及其分布具有显著的相似性，均包含由60个氨基酸组成的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋，螺旋较环和转角保守。谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)和脯氨酸(Pro)是螺旋Ⅰ (Helix Ⅰ)结构域的保守氨基酸，脯氨酸、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸是螺旋Ⅱ (Helix Ⅱ)结构域的保守氨基酸，相比之下，螺旋Ⅲ (Helix Ⅲ)结构域最为保守，其中保守氨基酸有天冬酰胺(N)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、谷氨酰胺、天冬酰胺和精氨酸(R)。EAR-like仅存在于EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX4-2和EuWOX5中，属于WUS，暗示EuWOXs在进化过程中具有保守性。
图 2 拟南芥和杜仲WOXs的蛋白质同源结构域序列分析Figure 2 Sequence analysis of WOX proteins homeo domain in A. thaliana and E. ulmoides2.3 不同物种WOX家族蛋白的系统发育树
对8个杜仲EuWOXs、15个拟南芥AtWOXs、18个毛果杨Populus trichocarpa WOX蛋白(PotriWOXs)、13个水稻OsWOXs、20个玉米ZmWOXs的蛋白质序列进行多重比对，构建无根系统发育树。结果如 图3所示：74个WOXs蛋白共分为3组[远古进化支、中间进化支和现代进化支(WUS)]，其中远古进化支含有12个WOXs蛋白，中间进化支含22个WOXs蛋白，现代进化支包含的蛋白数量最多，共有40个。8个EuWOXs中，EuWOX13-1和EuWOX13-2属于远古进化支，EuWOX11属于中间进化支，EuWOX1、EuWOX2、EuWOX5、EuWOX4-1和EuWOX4-2等5个蛋白质属于WUS。进化结果显示：杜仲与毛果杨亲缘关系最近。
图 3 杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白系统发育树Figure 3 WOX proteins phylogenetic trees of E. ulmoides, A. thaliana, P. trichocar, O. sativa and Z. mays2.4 EuWOXs基因结构及蛋白质的保守结构域
利用GSDS软件构建EuWOXs基因内含子-外显子结构图，结果如图4显示：EuWOXs含有1~3个内含子，EuWOX13-2、EuWOX2和EuWOX5基因含有2个外显子，EuWOX11、EuWOX13-1、EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3个外显子，EuWOX1含有4个外显子。不同进化分支基因结构差异显著，同一分支基因结构也存在差异。属于中间进化支的EuWOX11含有3个外显子，同属远古进化支的EuWOX13-1和EuWOX13-2分别含有3个和2个外显子，在WUS中，EuWOX2和EuWOX5含有2个外显子，EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3个外显子，而EuWOX1含有4个外显子。
蛋白质保守基序分析显示：EuWOXs含有10个保守基序，分别命名为Motif 1~Motif 10 (图5)，其中Motif 1和Motif 2最为保守，是WOX的核心基序，存在于所有EuWOXs中。Motif 6较为保守，存在于4个EuWOXs蛋白质(EuWOX4-2、EuWOX2、EuWOX1和EuWOX5)中。相同分支EuWOXs含有相似的保守基序，不同分支EuWOXs基序之间存在显著差异，Motif 4~Motif 10只存在于现代进化分支，Motif 3只在EuWOX13-1和EuWOX13-2蛋白质中存在。
2.5 杜仲EuWOXs启动子顺式作用元件分析
顺式作用元件分析结果(图6)显示：EuWOXs启动子中主要包括脱落酸(ABRE)和水杨酸反应元件(TCA-element)、厌氧响应元件(ARE)、光响应元件(Box 4)及玉米蛋白代谢调节元件(O2-site)。所有顺式作用元件中光响应元件最多，达77个，其中Box 4元件有26个，所占比例是34%；G-box和GT1-motif元件均有9个，占比为12%，表明EuWOXs基因表达可能与光合作用有关。EuWOXs共含有46个激素响应元件，32个胁迫响应元件，其中ABRE和ARE元件数量最多，均含有14个，所占比例分别为31%和44%，暗示EuWOXs参与杜仲激素及胁迫响应。此外EuWOXs共含有12个生长发育调控相关元件，其中O2-site有6个，占50%。
2.6 EuWOXs基因表达模式分析
利用‘秦仲1号’叶片不同发育时期转录组数据对EuWOXs基因的表达模式进行分析。结果(图7)可见：EuWOXs在叶片不同发育时期表达丰度存在显著差异，EuWOX11和EuWOX2在杜仲叶芽、初生叶、幼叶、老叶时期均不表达，EuWOX5仅在叶芽和老叶中低表达，EuWOX13-2在4个时期中的FPKM值均大于20，推测EuWOX13-2参与杜仲叶片的整个发育过程；EuWOX13-1和EuWOX4-1在叶芽中表达丰度最高，随着叶片发育表达水平逐渐降低，表明EuWOX13-1和EuWOX4-1主要在叶芽中发挥作用；EuWOX1在生长叶中表达量相对较高，其余EuWOXs基因表达丰度较低，FPKM值小于5。
图 7 EuWOXs在杜仲叶片不同发育阶段的表达模式Figure 7 Expression patterns of EuWOXs at different developmental stages in E. ulmoides leaves利用RT-qPCR检测EuWOXs在‘紫叶’杜仲叶片不同发育阶段(叶芽、生长叶、幼叶)的表达水平。结果(图8)可见：EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX5和EuWOX13-2在生长叶中表达量最高，随着叶片发育表达水平呈先升高后降低趋势，EuWOX4-2在幼叶中表达量最高，EuWOX13-1在叶芽中表达量最高，随着叶片发育，表达量逐渐降低，暗示EuWOX13-1在叶片发育的起始阶段发挥重要作用。EuWOX1、EuWOX13-1和EuWOX13-2在‘紫叶’杜仲叶片中的表达趋势与‘秦仲1号’一致。
图 8 杜仲EuWOXs基因在杜仲叶片不同发育时期的表达模式Figure 8 Expression pattern of EuWOX genes in E. ulmoides leaves at different developmental stages利用‘秦仲2号’和‘小叶’杜仲成熟叶片转录组数据检测EuWOXs的表达模式。由如图9可见：大部分EuWOXs转录水平较低，其中有6个EuWOXs基因几乎不表达，EuWOX13-2表达水平最高，FPKM值＞40，不同胶含量样品之间无显著差异，推测EuWOXs在杜仲胶形成过程中发挥作用较小。
图 9 EuWOXs在杜仲胶形成中的表达模式Figure 9 Expression patterns of EuWOX genes in the form of Eu-rubber2.7 EuWOXs蛋白互作网络预测分析
植物WOXs蛋白由多基因家族编码，蛋白质之间可能存在相互作用。利用STRING数据库，构建EuWOXs蛋白相互作用网络。图10显示：该网络包含21个节点(互作蛋白)和82条边(相互作用组合)。EuWOX4-1可与20个蛋白质互作，其中包含干细胞分化抑制因子(CLE41和CLE44)，细胞增殖和愈伤组织形成蛋白(CLV1、CLV3和ACT7)，胚胎发育相关蛋白(TPL、BBM和APM1)，维管组织发育蛋白(PXY、HB-8、ATHB-15、MOL和RUL1)，细胞程序化死亡调控因子(LOL1)，参与DNA的复制和延伸(MCM1、POLD2)以及信号转导蛋白(F14K14)，花药发育关键调控因子(RPK2)，参与DNA的复制植物发育相关转录因子GRAS(HAM3和SCL27)等，推测EuWOXs全面参与了杜仲的生长发育。
图 10 EuWOXs蛋白互作网络预测Figure 10 Prediction of interaction network between EuWOX proteins3. 讨论
WOX蛋白是植物特有的高度保守的一类转录因子，广泛参与植物的生长发育、干细胞维持、组织器官发生和形成等多种生物学过程。到目前为止，WOX家族基因已在多个物种进行了研究报道，如拟南芥中含有15个、毛果杨18个、水稻中有13个、玉米中有20个、毛竹Phyllostachys edulis 中存在27个[29]，小麦中有26个[30]、茶树Camellia sinensis中包含18个[31]，黄瓜Cucumis sativus中有11个[3]，陆地棉Gossypium hirsutum中含有38个[32]。小麦(17 Gb)[33]、玉米(2 300 Mb)[34]和毛竹(2 021 Mb)[35]基因组大于杜仲(1.2 Gb)[36]，拟南芥(164 Mb)[37]、水稻(441 Mb) [38]和毛果杨(392.3 Mb)[39]基因组小于杜仲。杜仲WOX数量低于拟南芥、毛果杨、水稻、玉米、小麦和毛竹，表明WOXs基因的丰富程度与基因组大小无关，这可能与基因重复有关。
杜仲基因组中共鉴定出8个EuWOXs，分布在8条染色体上。EuWOXs均为核定位蛋白，在现代进化支(WUS)、中间进化支和远古进化支分别含有5、1和2个成员，其系统发育模式与拟南芥、水稻、陆地棉等类似[29，31-32]。EuWOXs基因启动子中含有多种生长发育、激素响应、非生物胁迫以及光周期响应元件。在水稻中，WUS的OsWOX5和中间进化支的OsWOX11、OsWOX12A和OsWOX12B基因表达受生长素、细胞分裂素和赤霉素调节，超表达OsWOX11可提高水稻抗旱性[16-17]。细胞分裂素强烈促进苹果Malus pumila WOX1和WOX3基因表达，生长素诱导黄瓜CsWOX1b和CsWOX3基因表达[3]。在拟南芥中，生长素反应因子5 (AUXIN RESPONSE FACTOR，ARF5)上调AtWOX1和PRS (AtWOX3)基因的表达，ARF2、ARF3和ARF4抑制AtWOX1和PRS的表达[40]。OsWOX3A参与水稻器官发育、叶片横向轴伸长、颖花外稃形态发生以及分蘖和侧根发育[10]，MtWOX1的同源基因STENOFOLIA是蒺藜苜蓿Medicago truncatula叶片生长和维管组织形成的必须基因[41]，PttWOX4在杨树形成层中特异表达，PttWOX4a/b RNAi干扰后导致维管形成层宽度缩小，次生生长减弱[42]。推测EuWOXs可能在杜仲生长发育、激素和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。
WOX家族基因参与叶片发育。属于中间支的AtWOX9/STIMPY过表达导致拟南芥叶缘波浪化[43]，SlLAM1主要在番茄Solanum lycopersicum叶片、花和果实中表达，SlLAM1缺失导致叶片变窄，次生小叶数量减少[44]，超表达黄瓜CsWOX9导致转基因拟南芥角果变短，莲座叶和分枝数目增加[3]。来源于WUS的AtWOX3是拟南芥侧托叶发育的必需基因，Atwox1和Atwox3缺失突变体导致叶片和花器官变窄，影响叶片横向扩张和花瓣融合[45-46]；GhWOX9_At，GhWUSa_At和GhWUSb_Dt主要在棉花幼叶中高量表达[47]。远古进化分支中的OsWOX13在水稻叶、茎、根维管组织中表现为空间表达调控，在花和发育中的种子中是时间表达调控[48]。在杜仲中，EuWOX13-1在叶芽中表达量最高，随着叶片发育，转录水平逐渐降低，暗示EuWOX13-1主要在杜仲叶片发育的早期阶段发挥作用。EuWOX13-2在生长叶中表达量较高，在叶片发育过程中呈现先升高后降低的趋势。EuWOX13-1和EuWOX13-2是一对重复基因，其表达水平的差异可能与基因结构不同有关，也可能是EuWOX13-1和EuWOX13-2在重复后发生了功能分化。在甘蓝型油菜Brassica napus中，BnCWOX13a与BnCWOX13c互为同源基因，然而它们的表达趋势完全不同[49]，在拟南芥中，AtWOX13在初生根、侧根、雌蕊和胚发育中动态表达，而AtWOX13的直系同源基因AtWOX14只在侧根形成的早期阶段和发育的花药中特异表达[50]，由此推测EuWOX13-2可能只获得了EuWOX13-1基因的部分功能，具体功能还需要进一步研究。
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图 1 自然与人工生境下7种被子植物的水力功能性状
Figure 1 Hydraulic functional characteristics of 7 species of angiosperms in natural and artificial habitats
图 2 自然与人工生境下7种裸子植物的水力功能性状
Figure 2 Hydraulic functional characteristics of 7 species of gymnosperms in natural and artificial habitats
图 3 不同生境下14种植物的水力功能性状
Figure 3 Hydraulic functional characteristics of 14 studied plants in different habitats
图 4 自然与人工生境下7种被子植物的木质部解剖结构特征
Figure 4 Characteristics of xylem anatomical structure of 7 species of angiosperms in natural and artificial habitats
图 5 自然与人工生境下7种裸子植物的木质部解剖结构特征
Figure 5 Characteristics of xylem anatomical structure of 7 species of gymnosperms in natural and artificial habitats
图 6 被子植物和裸子植物水力功能性状与解剖结构性状的相关性
Figure 6 Correlation analysis between hydraulic function and anatomical structure traits of angiosperms and gymnosperms.
表 1 自然和人工生境的基本特征
Table 1. Basic characteristics for study sites in natural and artificial habitats
生境 经纬度 海拔/m 坡向 坡度/(°) pH 生长季土壤含水量/% 自然生境 30°26′N, 119°73′E 400~450 西南 9~12 4.85±0.16 29.53±1.21 人工生境 30°15′N, 119°43′E 51~74 西南 15~20 5.23±0.12 35.98±1.22 说明：pH和生长季土壤含水量数值为平均值±标准误(n=3) 
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表 2 7种裸子植物和7种被子植物基本概况
Table 2. Basic overview of 7 species of gymnosperms and 7 species of angiospermae
植物 科 植物 生长习性 生活型 裸子植物 杉科 Taxodiaceae 柳杉 Cryptomeria japonica 落叶 乔木 松科 Pinaceae 金钱松 Pseudolarix amabilis 落叶 乔木 杉科 Taxodiaceae 落羽杉 Taxodium distichum 落叶 乔木 杉科 Taxodiaceae 杉木 Cunninghamia lanceolata 常绿 乔木 松科 Pinaceae 雪松 Cedrus deodara 常绿 乔木 柏科 Cupressaceae 日本扁柏 Chamaecyparis obtusa 常绿 乔木 杉科 Taxodiaceae 北美红杉 Sequoia sempervirens 常绿 乔木 被子植物 槭树科 Aceraceae 三角槭 Acer buergerianum 落叶 乔木 大戟科 Euphorbiaceae 重阳木 Bischofia polycarpa 落叶 乔木 胡桃科 Juglandacea 青钱柳 Cyclocarya paliurus 落叶 乔木 壳斗科 Fagaceae 青冈 Cyclobalanopsis glauca 常绿 乔木 木犀科 Oleaceae 女贞 Ligustrum lucidum 常绿 乔木 木兰科 Magnoliaceae 广玉兰 Magnolia grandiflora 常绿 乔木 樟科 Lauraceae 樟树 Cinnamomum bodinieri 常绿 乔木
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