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楠木自古以来被誉为江南四大名木之首，国家二级保护植物，主要包括樟科Lauraceae润楠属Machilus和桢楠属Phoebe植物，多为高大乔木，树干通直，树型优美，且具有驱虫等功效，深受人们喜爱，是中国重要的景观树种和经济树种[1-2]。炭疽病是近年来危害楠木健康的主要病害之一，侵染叶片边缘、叶尖，病斑呈灰褐色至暗褐色，枝部感染处为黑褐色，病健交界处明显。此前学者在广西南宁市良凤江国家森林苗圃基地和博白县林业科学研究所，以及广东省肇庆市北岭山珍贵树种种植基地调查发现该病害发生严重[3-4]。目前，关于楠木炭疽病防治研究相对较少，且仅限于病原菌鉴定及其发病规律，植物诱导抗性用于楠木病害防治未见报道。化学防治是林业病害防治中最快速、有效的方法。然而，重复使用化学杀菌剂已经导致许多问题，如抗药性、环境污染、化学残留等。植物抗病性是利用植物自身的免疫性来对抗病原物的侵染，是近年来的研究热点。很多研究证明通过天然或化学合成物等可以诱导植物产生抗性，抵抗病原物入侵，从而达到防治效果。水杨酸(SA)是一种内源性激发子，是信号传导系统中的重要组成部分，参与调控植物生理生化等过程[5-6]。水杨酸可以诱导植物局部获得性抗性和系统获得性抗性(SAR)[7-9]，在1979年对感染花叶病毒(TMV)的烟草Nicotiana tabacum 栽培种Xanthi-NC研究中首次证明[10]，随后人们通过大量实验对水杨酸可以提高植物的抗病性加以验证，如山茶Camellia japonica灰斑病[11]、桉树Eucalyptus焦枯病[12]、油茶C. oleifera炭疽病[13]等。本研究分析了SA对楠木炭疽病的诱导抗性，测定可溶性蛋白质、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的变化来探究其作用机理，旨在为病害防治提供依据。
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紫楠Phoebe sheareri又名紫金楠、金丝楠等，由建德市欣林林木服务中心提供，为2年生盆栽苗。供试菌株胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides由浙江农林大学森林保护学科菌种储存室提供。
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配制质量浓度为500、200、100、50 mg·L−1水杨酸溶液(pH 6.8)进行喷雾试验，约30 mL·株−1，1 d后重复喷洒，并设置无菌水对照。5 d后采集叶片，选择心叶下完全展开的功能叶片，用灭菌剪刀取样，样品成熟度保持一致。每处理3株，4次重复。采用孢子悬浮液进行离体刺伤接种，以不刺穿叶片为宜。于25 ℃下12 h光照12 h黑暗保湿培养，7 d后统计叶片发病情况，采用网格法测病斑面积，重复3次取平均值，计算病斑减小率。病斑减小率 = (对照处理病斑面积−诱导处理病斑面积)/对照处理病斑面积×100%
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选取长势良好大小一致的2年生紫楠植株，配置SA的最终质量浓度为500、200、100、50 mg·L−1，均匀喷洒于植株上，以溶液布满叶片不流下为宜。以无菌水喷洒作为对照，1 d后重复喷洒，使植物充分吸收，5 d后采集长势均一的成熟叶片进行生理测定，包括可溶性蛋白质、SOD、POD、CAT，每处理3次重复。可溶性蛋白质采用紫外吸收法测定[14]。取紫楠叶片0.5 g，按照1∶9的体积比加入9倍体积0.1 mol·L−1磷酸缓冲液(pH 7)，5 000 r·min−1离心10 min，上清液为蛋白质提取液。取蛋白质原液0.5 mL稀释至5 mL，利用紫外分光光度计测取280 nm及260 nm处的光密度D(280)和D(260)，以pH=7.0磷酸缓冲液进行空白调0。蛋白质质量浓度(g·L−1)=1.45×D(280)−0.74×D(260)。其中1.45和0.74为校正值。SOD活性测定：本研究通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，氧化羟胺形成子纠缠亚硝酸盐，在显色剂的反应下呈现紫红色，根据南京建成生物工程研究所测试盒步骤进行测定，用可见光分光光度计测其光密度。组织中SOD活力定义：每克组织在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活力单位(1 U=16.67 nkat)。SOD活力(16.67 nkat·g−1)=[(对照光密度−测定光密度)÷对照光密度]÷50% ×反应液总体积(mL)÷取样量(mL)÷匀浆液浓度(kg·L−1)。CAT活性测定：CAT分解过氧化氢(H2O2)的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，按照南京建成生物工程研究所测试盒处理结果在405 nm处测定其变化量，可计算出CAT的活力。CAT活力定义：每毫克组织蛋白每秒种分解1 μmol的H2O2的量为1个活力单位。CAT活力(16.67 nkat·g−1)=(对照光密度−测定光密度)×271÷60÷取样量(mL)÷匀浆液浓度(kg·L−1)。POD活性测定：过氧化氢酶可催化过氧化氢反应，根据南京建成生物工程研究所测试盒测定420 nm处可见光光密度变化来计算酶活性。组织中POD活力定义：在37 ℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1 μg底物的酶量定义为一个活力单位(1 U=16.67 nkat)。POD活力(16.67 nkat·g−1)=[(对照光密度−测定光密度)÷(12×1 cm比色光径)]×反应液总体积(mL)÷取样量(mL)÷反应时间(30 min)÷匀浆液浓度(kg·L−1)×1 000。
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为确定SA对孢子萌发是否有影响，配置含SA的最终质量浓度为0、50、100、200、500 mg·L−1的楠木炭疽病病原菌孢子悬浮液，采用凹玻片萌发法[14]，调节pH至6.8进行25 ℃全黑暗保湿培养，每处理3次重复，12 h后观察孢子萌发情况，计算孢子萌发率。孢子萌发率 = 已萌发孢子数/观察孢子总数×100%；
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根据质量浓度诱导结果，选用最适宜质量浓度SA进行喷雾处理，1 d后重复喷施，对照为等量无菌水。本实验共设置4个处理：在第2次SA处理2 h后活体接种(A)；SA处理不接种(B)；无菌水处理并接种(C)；无菌水处理不接种(ck)。每处理3株，4次重复。采用孢子悬浮液针刺接种，脱脂棉保湿处理。不同处理在第2次SA或无菌水喷施后1、2、3、5、7、10、15 d采集生长状况一致的叶片，于−80 ℃冰箱保存备用，进行后续生理指标变化测定。
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由图1可以看出：不同质量浓度的SA对紫楠均具有诱导作用，对病斑抑制效果差异显著(P＜0.05)。与无菌水喷洒处理相比SA质量浓度为100 mg·L−1诱导植物叶片病斑减小率最高，达64.28%，其次是50和200 mg·L−1，诱导效果为59.8%、56.72%，500 mg·L−1诱导效果最差，其中各质量浓度诱导植物病斑大小差异显著。
图 1 不同质量浓度SA处理对病斑大小及孢子萌发的影响
Figure 1. Effect of different concentrations of SA treatment on lesion size and spore germination
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结果表明(图1)：低质量浓度SA处理孢子萌发率与对照相比无显著差异，即对孢子萌发无明显抑制作用，当SA质量浓度为200、500 mg·L−1时抑制作用显著(P＜0.05)，分别为69.58%和34.75%，同低质量浓度相比差异较大。
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从图2可以看出：不同质量浓度SA均可诱导可溶性蛋白质的增加(P＜0.05)，100 mg·L−1所诱导的蛋白质质量浓度是对照的2.11倍，50和200 mg·L−1的诱导效果差异不显著，与对照相比差异显著，分别是对照的1.77和1.69倍。500 mg·L−1 SA诱导后，可溶性蛋白质质量浓度较其他处理低，但显著高于对照(P＜0.05)。
图 2 不同质量浓度SA处理对可溶性蛋白质、SOD、CAT和POD的影响
Figure 2. Effect of different concentrations of SA treatment on soluble protein, SOD, CAT and POD
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SOD是植物体内重要的抗氧化酶，SA施用后引起植株SOD活性升高(图2)。其中500和200 mg·L−1与对照之间无显著差异，SA质量浓度为100 mg·L−1时酶活性高于50 mg·L−1时的酶活性，差异显著(P＜0.05)。表明不同质量浓度SA对植物中SOD酶活性的影响不同。
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CAT活性随SA质量浓度的上升表现出先升高后降低的趋势(图2)，500 mg· L−1质量浓度处理与对照的CAT相比无显著差异，200、100、50 mg·L−1处理差异显著(P＜0.05)，均能使CAT活性增加。其中100 mg·L−1的SA处理对楠木植株CAT活性诱导效果最好，是对照的2.03倍。
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不同质量浓度SA处理对POD活性的影响与CAT趋势相似(图2)，均为随SA质量浓度的增加表现为先上升后下降。100 mg·L−1SA诱导的POD活性最高，是对照的1.3倍。200和50 mg·L−1诱导的CAT活性无显著差异，但显著高于500 mg·L−1和对照处理。不同质量浓度SA均可引起POD活性增加。上述研究表明：不同质量浓度SA对楠木诱导效果均存在差异，500 mg·L−1诱导效果最差，100 mg·L−1诱导效果最好，因此选择100 mg·L−1的SA进行下一步实验。
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从图3可以看出：不同处理均可引起紫楠叶片可溶性蛋白质质量浓度的增加。SA处理后其蛋白质质量浓度在1~5 d持续增加，5 d时达峰值，处理A在第7天达峰值，随后下降，可溶性蛋白质质量浓度显著高于未经SA处理过的处理C和ck。处理A效果最好，第7天时是ck的2.57倍，经SA处理过的植株第15天可溶性蛋白质质量浓度仍显著高于对照，处理C在第1~3天升高随后下降，趋势相较于A处理和B处理趋势较为平缓。15 d时SA处理过的植株可溶性蛋白质质量浓度显著高于对照，因此SA可以诱导紫楠植株可溶性蛋白质增加。
图 3 不同处理对可溶性蛋白质、SOD、CAT和POD的影响
Figure 3. Effect of different treatments on soluble protein, SOD, CAT and POD
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本研究SA处理均可引起紫楠叶片SOD活性增加(图3)，随SA的作用时间先逐渐升高后缓慢下降。当SA作用时间为7 d时，处理A的SOD活性达最大值，是ck的1.21倍，之后开始下降，处理A和处理B的SOD活性始终显著高于处理C和ck。
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SA诱导后可引起紫楠体内CAT活性增加(图3)，有利于增强植株抗病性。紫楠叶片经SA处理和接种处理后，CAT活性在第5天达到峰值，处理A是ck的2.04倍，处理B是ck的1.63倍，5 d后CAT活性下降。处理C的CAT活性虽有增加但到后期与ck相比差异不显著。
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100 mg·L−1的SA诱导后，植株POD活性迅速升高(图3)，处理A与处理B的POD活性具有基本相似的变化趋势，处理A相较于处理B迟一些达到最大值，且POD活性是ck的1.46倍，SA诱导15 d后的植株POD活性仍显著高于未诱导的植株。
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诱抗剂有着更好的抗病性和低毒性[15-16]。目前，诱导剂在农业等方面应用广泛，在林业方面研究相对较少。将诱导剂应用于林业实践可减少化学杀菌剂的使用，与杀菌剂、生物防治等相结合可达到更好的效果[17-19]。当SA质量浓度低于500 mg·L−1时对孢子萌发无影响，可以证明低质量浓度外源SA的施用对病原菌孢子无直接毒力。本研究证实：不同质量浓度SA对紫楠均具有诱导抗性作用。100 mg·L−1为SA最适宜质量浓度，酶活性均达到最大值，差异显著。SA处理后可溶性蛋白质质量浓度，SOD、CAT、POD活性先上升然后下降至稳定水平，实验持续了15 d，所测结果仍高于正常水平，其中CAT变化最为明显，经SA诱导的紫楠接种或不接种处理，生理指标活性均显著高于对照，这与山茶[11]、橡胶树Hevea brasiliensis [20]等抗性诱导研究结果一致。
SA是存在于植物体内的内源性生长物质，可以引起植物体内H2O2浓度升高，促进H2O2生成的化合物，诱导SAR相关蛋白及防御酶等活性的增加，促进相关基因的表达[21-22]。外源SA可以诱发植物触发病理相关蛋白基因的表达，在诱导植物产生抗病性的同时大量积累病程相关蛋白。外源SA的应用可诱导植物内源性CAT和POD活性增加，以及相关基因的表达，能引发植物的诱导抗性[23]。POD除了具有解毒作用外，还是植物体内多种次生代谢产物生物合成的关键调控酶之一，植物次生代谢产物参与了植物对病原体的防御反应，SOD在清除高毒性和不稳定活性氧中起重要作用，CAT、POD和SOD被认为是保护细胞免受氧化损伤的主要抗氧化系统，多种酶活性的升高可能是使植物体产生抗性，抵抗病原菌侵染的重要原因。因此，SA可以诱导楠木对病原菌的入侵产生抗性，为防治提供依据。
Resistance of Phoebe sheareri to anthracnose induced by salicylic acid
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摘要:
目的 探究水杨酸(SA)诱导紫楠Phoebe sheareri对炭疽病的抗性。 方法 以2年生紫楠为材料，用0、50、100、200、500 mg·L−1质量浓度SA对紫楠进行喷雾处理，以无菌水喷洒不接种为对照(ck)。喷雾后选择不同时间采集紫楠叶片，采用离体刺伤接种法测定对炭疽病病斑的抑制作用，并测定了紫楠叶片中可溶性蛋白质、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的变化。 结果 不同质量浓度SA处理的紫楠叶片均对炭疽病病斑有抑制作用，100 mg·L−1 SA处理对病斑抑制率达64.28%，在SA喷雾的同时接种炭疽病孢子悬浮液后，叶片的可溶性蛋白质、SOD、CAT和POD在1~7 d内升高，达到峰值时可溶性蛋白质为ck的2.57倍，SOD活性为ck的1.21倍，CAT活性为ck的2.04倍，POD活性为ck的1.46倍，7 d后呈下降趋势，15 d内各生理指标均显著高于ck。 结论 SA可诱导紫楠叶片可溶性蛋白质、SOD、CAT和POD升高，对炭疽病产生抗病性。图3参23 Abstract:Objective The objective is to investigate the resistance of Phoebe sheareri to anthracnose induced by salicylic acid (SA). Method The 2-year old P. sheareri was used as material, spayed with 100, 200, 500 mg·L−1 SA. After 5 days, the leaves were collected and in vitro puncture inoculation method was used to determine the inhibition of anthracnose lesions, changes in soluble protein, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and peroxidase (POD) in the leaves. Result Leaves treated with different concentrations of SA could inhibit the anthracnose lesions, and the lesion inhibition rate with 100 mg·L−1 SA treatment reached 64.28%. After SA spray and inoculation with anthracnose, soluble protein, SOD, CAT and POD in leaves increased in 1−7 days, and decreased after 7 days. At the peak, the soluble protein was 2.57 times of ck, SOD was 1.21 times of ck, CAT was 2.04 times of ck, and POD was 1.46 times of ck. All physiological indexes were higher than those of ck within 15 days. Conclusion SA can induce the increase of soluble protein, SOD, CAT and POD of P. sheareri and produce disease resistance.[Ch, 3 fig. 23 ref.] -
喜树Camptotheca acuminata是中国特有树种，属于蓝果树科Nyssaceae喜树属Camptotheca植物，因叶片含有抗癌物质喜树碱（camptothecin），被认为是重要药用植物。施肥是高效培育喜树、增加叶片产量的重要措施之一[1]。氮素是植物生长和产量形成的首要因素，植物吸收氮素的形式主要有铵态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3--N）。研究表明：合理增施氮肥可以促进植物生长，提升植物品质[2]；除了影响光合作用，氮素还影响植物中抗氧化酶和膜脂过氧化物的生理代谢。过量氮肥会打破植物内活性氧代谢的平衡，破坏膜系统结构[3]，导致植物生理系统的紊乱，影响植物类囊体数量和类囊体蛋白形成。psbA，psbB和psbC是光系统Ⅱ核心复合体（PSⅡ）中重要的蛋白编码基因。卡尔文循环中，核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶（rubisco）是光合特性中碳同化的关键酶，主要由大、小2个亚基组成，在植物碳同化过程中具有重要作用，影响植物的光合特性[4]。不同植物在不同环境和生育期表现出对不同氮素形态吸收的显著性差异[5-6]。三叶青Tetrastigma hemsleyanum[7]和铁核桃Juglans sigillata[8]都表现出对NO3--N吸收的偏向性，而水稻Oryza sativa的叶绿素荧光动力学参数在2种氮素营养下没有差异[9]；出现差异的原因可能与研究对象和条件都存在一定的相关性[10]，但氮素形态对植物叶绿素荧光动力学过程及其参数的影响机制，目前尚无明确定论。总的来说，不同植物对氮素形态吸收具有偏向性，而后者直接影响了植物生长和叶绿素荧光特性，从而影响植物生长的产量和品质，因此合适的氮肥水平及形态对植物生长具有重要意义。近年来，关于氮肥对喜树生长的研究，主要集中在氮肥处理的不同水平[11]，而尚未采用不同氮素形态的不同水平对喜树进行处理研究。因此，本研究以2年生喜树实生苗为实验材料，采用不同水平的铵态氮和硝态氮施肥处理，通过研究叶片生长、叶绿素荧光特性和叶绿体相关基因的表达，来探究适于喜树生长的最佳氮素水平和氮素形态，为喜树施肥栽培提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 供试材料与试验方法
于2017年4月5日选取无病虫害、生长健壮、规格基本一致的优质2年生喜树实生苗270株（江西九江森淼绿化苗木公司），栽植在直径30.0 cm，高40.0 cm的花盆中。栽植基质为V（泥炭）:V（珍珠岩）:V（园土）＝1:1:3，填土（10.0±0.2）kg·盆-1，土壤pH值为6.8，土壤电导率（EC）为0.305 mS·cm-1，水解氮为86.6 mg·kg-1，速效磷为3.2 mg·kg-1，速效钾为94.6 mg·kg-1。苗木于浙江农林大学平山试验基地（30°15′50.09″N，119°42′54.67″E）缓苗2月，缓苗期间正常浇水，待全部成活后，于6月18日搬于浙江农林大学温室内（30°15′30.39″N，119°43′26.92″E）进行施肥处理。
试验以清水组为对照（ck），铵态氮处理组使用硫酸铵[（NH4）2SO4]施肥，施氮量分别为2.5（T1），5.0（T2），7.5（T3）和10.0（T4）g·株-1，硝态氮处理组使用硝酸钾（KNO3）施肥，施氮量分别为2.5（W1），5.0（W2），7.5（W3）和10.0（W4）g·株-1。所有盆栽苗均随机摆放，叶片之间无重叠，各盆配有直径40.0 cm的托盘，防止养分流失，每处理设置10株，重复3次。试验从6月18日至10月4日，隔15 d施肥1次。供试氮肥均为分析纯（AR99%），购自国药（硫酸铵CAS#: 7783-20-2，硝酸钾CAS: 7757-7）。施铵态肥时，肥料中加入7.0 μmol·L-1二氰二氨（C2H4N4, DCD）以抑制硝化反应，于0，30，60，90，105 d测定相关数据。试验期间进行正常的管理。
1.2 测定项目和方法
叶长：分别于处理前后（0，105 d）选第2轮叶的倒数第3，4，5片叶子，用直尺测量苗木的叶长（测量3株，取平均值），从叶片与叶柄连接基部到叶片尖端，精确到0.1 cm。叶面积：于处理前后（0，105 d）选第2轮叶的倒数第3，4，5片叶子，用方格纸测定苗木的叶面积（测量3株，取平均值），从叶片与叶柄连接基部到叶片尖端的整个范围，精确到0.01 cm2。叶绿素a和叶绿素b：采集喜树顶端第5，6片叶，参照李合生[12]乙醇浸提法测定叶绿素质量分数。叶绿素荧光参数：采用Li-6400便携式光合仪（LI-COR，Lincoln，美国），于晴天上午9：00-11：00测定植株上位叶（第2轮叶倒数3，4片）叶绿素荧光参数。叶片暗适应30 min后测定初始荧光产量（Fo），随后施加1次强闪光（6 000 μmol·m-2·s-1，脉冲时间0.7 s）测最大荧光产量（Fm），然后在自然光下适应20 min，待荧光基本稳定再测得稳态荧光产量（Fs），最后给予1次强闪光，获得光适应下的最大荧光产量（Fm′）和最小荧光（Fo′）。各处理均3次重复。暗反应下PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm，光系统下PSⅡ最大捕获效率Fv′/Fm′=（Fm′-Fo′）/Fm′，光化学猝灭系数qP＝（Fm′-Fs）/（Fm′-Fo′），非光化学猝灭系数qNP＝1-Fv′/Fm′[13]。测定叶绿素荧光参数时，同时任选3株，从各株顶端6~9片叶中任意采集3片，放入液氮罐中带回实验室置于-80 ℃冰箱中保存，用于测定光合酶基因的表达。叶绿体基因的表达：采用RNAperp Pure Plant Kit（TIANGEN，北京）试剂提取喜树RNA；参照Reverse Transcriptase M-MLV（Takara，大连）试剂说明书合成cDNA，于-20 ℃储存备用。从美国国立生物技术信息中心（NCBI）上获得喜树叶绿体基因序列，以Actin为内参基因，用Primer Express software（Applied Bio systems）设计引物（表 1）。反转录产物cDNA稀释10倍后，用SYBR®Primix Ex TaqTM试剂盒（Takara，大连）进行实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR），利用Light Cycler 480 Ⅱ（Roche）荧光定量仪器进行目的基因qRT-PCR表达分析，反应体系为20.0 μL，其中SYBR®Primix Ex TaqTM荧光染料10.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，双蒸水6.4 μL。两步法PCR扩增标准程序：预变性95 ℃ 30 s；聚合酶链式反应95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s，40个循环，每个样品重复3次，采用2-ΔΔCt算法分析结果。
表 1 荧光定量PCR引物Table 1. Primers sequence of target genes基因 正向引物（5′→3′） 反向引物（5′→3′） psbA ACAGATTCGGTCAAGAGGAAGA CAGTGAACCAGATACCTACTACAG psbB GGAGGAATCGCTTCTCATCATAT CGGACGCTAAGATGGAATAGAC psbC GTCAATTATGTCTCGCCTAGAAGT GACCTACGAAGAAGAAGAATCCTAA RbcL CTTGGCAGCATTCCGAGTAAC GTTGTCCATGTACCAGTAGAAGATT Actin GGTACTCGTTCACAACAACTGCTG CTGTCCATCGGGCAACTCATAG 1.3 数据统计与分析
采用Excel 2007和SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。采用单因素（one-way ANOVA）和Duncan法进行方差分析和多重比较（α＝0.05）。利用Origin 9.0软件作图。图表中数据为平均值±标准差。
2. 结果与分析
2.1 氮素处理水平对喜树叶片生长的影响
表 2显示：喜树生长至105 d，叶长和叶面积均增加，处理组叶长和叶面积均显著高于ck（P＜0.05）。随着氮素处理水平的提高，叶长和叶面积均呈先上升后下降趋势。与其他处理相比，T3和W3叶长和叶面积最大，叶长较ck（8.10±0.02）cm分别增加了32.3%和78.5%，叶面积较ck（25.43±0.15）cm2依次增加了130.0%和242.0%；且硝态氮处理水平下的叶长和叶面积均高于铵态氮，说明硝态氮更有利于植物生长。
表 2 氮素处理水平对喜树叶长和叶面积的影响Table 2. Effects of different concentrations of ammonium nitrogen and nitrate on leaf lengh of Camptotheca acuminata处理 叶长/cm 叶面积/cm2 ck 13.00 ± 0.12 Ad 58.83 ± 0.14 Ae T1 15.80 ± 0.12 Ac 79.07 ± 0.08 Bd T2 16.70 ± 0.03 Bb 98.93 ± 0.08 Bc T3 16.70 ± 0.03 Bb 124.03 ± 0.12 Ba T4 16.40 ± 0.05 Bb 116.37 ± 0.31 Bb ck 13.00 ± 0.12 Ad 53.83 ± 0.14 Ae W1 19.20 ± 0.06 Ac 139.73 ± 0.24 Ad W2 20.80 ± 0.08 Ab 152.07 ± 0.35 Ab W3 23.20 ± 0.21 Aa 184.30 ± 0.05 Aa W4 20.50 ± 0.03 Ab 150.97 ± 0.12 Ac 说明:不同小写字母表示同种氮素不同水平间差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示同种氮素相同水平下与ck差异显著(P < 0.05) 2.2 氮素处理水平对喜树叶片叶绿素质量分数的影响
2.2.1 铵态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素质量分数的影响
由表 3可知：随生长时长，植株叶片叶绿素质量分数总体升高，除T4外，其他处理叶绿素质量分数60 d较30 d时有所下降，90 d时又有所上升，至105 d时达到最大值。相同生长时长下，不同处理水平间差异较小。生长至105 d时，T3叶绿素质量分数显著高于其余处理（P＜0.05），较ck，T1，T2和T4依次上升了35.2%，17.2%，23.8%和15.2%。
表 3 不同铵态氮处理水平对喜树叶片叶绿素质量分数的影响Table 3. Effects of different concentrations of ammonium nitrogen and nitrate on chlorophyll content in C. acuminata处理 w叶绿素/（mg·g－1） 0 d 30 d 60 d 90 d 105 d ck 1.61 ± 0.26 Da 1.90 ± 0.26 Db 2.80 ± 0.10 Cb 3.96 ± 0.22 Ba 4.38 ± 0.16 Ac T1 1.63 ± 0.19 Da 4.54 ± 0.83 Aa 4.30 ± 0.08 Ca 3.72 ± 0.85 Ca 5.05 ± 0.12 ABb T2 1.61 ± 0.09 Da 4.78 ± 0.49 Aa 4.36 ± 0.19 Ca 4.72 ± 0.39 Ca 5.14 ± 0.36 ABb T3 1.67 ± 0.14 Da 5.25 ± 0.32 Ba 4.53 ± 0.17 Ca 4.80 ± 0.32 Ca 5.92 ± 0.11 Aa T4 1.61 ± 0.11 Da 4.88 ± 0.11 Ba 4.39 ± 0.15 ABa 4.26 ± 0.23 ABa 4.78 ± 0.22 Ab 说明：不同小写字母表示同种氮素不同水平间差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示同种氮素相同水平下与ck差异显著(P < 0.05) 2.2.2 硝态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素质量分数的影响
表 4表明：随处理时间的延长，硝态氮处理下喜树叶片叶绿素质量分数变化显著；但不同处理水平相比，质量分数差异较小。处理30~60 d，所有铵态氮处理下叶绿素质量分数均显著高于ck，各处理水平相比，W3处理下叶绿素质量分数最高，较ck和其他处理依次高出73.9%，44.5%，10.2%和31.3%。处理90~105 d，ck和W1的叶绿素质量分数继续上升，W2，W3和W4先上升后下降，105 d时，W1叶绿素质量分数高于其他处理，W4最低。
表 4 不同硝态氮处理水平对喜树叶片叶绿素质量分数的影响Table 4. Effects of different concentrations of ammonium nitrogen and nitrate on the chlorophyll content in C. acuminata处理 w叶绿素/（mg·g－1） 0 d 30 d 60 d 90 d 105 d ck 1.61 ± 0.17 Ca 1.90 ± 0.26 Ba 2.80 ± 0.10 ABc 4.38 ± 0.16 Ba 3.69 ± 0.22 Aab W1 1.65 ± 0.24 Ca 2.97 ± 0.84 Ba 3.37 ± 0.16 Ab 4.39 ± 0.10 Aa 4.41 ± 0.13 ABa W2 1.63 ± 0.12 Ba 3.84 ± 0.09 Aa 4.42 ± 0.38 Aab 3.68 ± 0.11 Abc 3.95 ± 0.11 Aa W3 1.67 ± 0.19 Ca 3.89 ± 0.14 Aa 4.87 ± 0.23 Aa 3.15 ± 0.49 Ac 3.83 ± 0.29 Ba W4 1.61 ± 0.11 Ba 3.45 ± 0.10 Aa 3.71 ± 0.28 Ab 3.22 ± 0.13 Ac 3.80 ± 0.35 Aa 说明:不同小写字母表示同种氮素不同水平间差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示同种氮素相同水平下与ck差异显著(P < 0.05) 2.3 氮素处理水平对喜树叶片叶绿素荧光参数的影响
2.3.1 铵态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素荧光参数的影响
由图 1可知：至30 d，Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP呈显著上升趋势（P＜0.05），qNP呈下降趋势，T4处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP达到最大。到60 d时，T2和T3处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP达到最大值，与ck相比，依次提高了1.4%，9.2%和84.8%。60 d时T3处理组各测试参数显著高于其他处理（P＜0.05），T4显著低于其他处理。处理90~105 d，T2，T3和T4处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP值呈下降趋势，T1处理下Fv/Fm下降，Fv′/Fm′和qP值呈上升趋势，T3依然高于其余处理。90 d时，T3处理下qNP显著低于其他同类处理，与ck相比下降了12.9%；105 d时，T4处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP降到最小，显著低于其他处理；与ck相比，依次下降了11.1%，3.3%和5.6%。
图 1 铵态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素荧光参数的影响Figure 1. Effects of different concentrations of ammonium nitrogen on chlorophyll fluorescence characteristics of Camptotheca acuminata2.3.2 硝态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素荧光参数的影响
图 2显示：30 d时，不同硝态氮处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP显著上升，qNP显著下降，其中W4处理Fv/Fm和Fv′/Fm′达到最大值，此后显著下降（P＜0.05）。60 d时，W2和W3处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP达到最大值，与ck相比，依次上升了2.6%，12.3%和115.8%；此时W3处理下这3个参数值显著高于其他处理。处理90~105 d，W2，W3和W4处理Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP值呈下降趋势；W1处理Fv/Fm下降，Fv′/Fm′和qP值上升；W3处理Fv′/Fm′和qP值依然高于其他处理，qNP显著低于其他处理，与ck相比下降了29.9%。至105 d时，W4处理Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP显著低于其他处理，与ck相比，依次下降了11.1%，3.3%和5.6%。
图 2 铵态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素荧光参数的影响Figure 2. Effects of different concentrations of nitrate nitrogen on chlorophyll fluorescence characteristics of C. acuminata2.4 氮素形态和处理水平对喜树叶片核心复合体叶绿体基因和光合酶基因表达的影响
以不同处理在0 d时的表达量为ck，增施氮肥对PSⅡ蛋白编码基因psbA（图 3A和图 3B），psbB（图 3C和图 3D），psbC（图 3E和图 3F）和光合酶基因RbcL（图 3G和图 3H）表达的影响显著（P＜0.05）。由图 3可知：生长30 d，所有基因表达量显著提高。处理60 d时，T3处理下psbA表达上调，其余处理下所有基因表达显著下调（P＜0.05），T3和W3处理下psbA，psbC和RbcL表达量显著高于其他同类处理（P＜0.05），所有铵态氮处理psbB随处理水平的升高而升高，T2处理psbB表达量显著低于其他同类处理（P＜0.05）；与T1，T2和T4相比，T3处理psbA表达量上升了76.3%，50.8%和55.6%，psbC表达量上升了15.8%，16.5%和52.5%，RbcL表达量上升了66.8%，34.4%和39.9%。与W1，W2和W4相比，W3处理psbA表达量上升了71.9%，57.9%和75.6%；psbC表达量上升了8.7%，61.7%和15.4%；RbcL表达量上升了47.1%，22.3%和79.1%，处理90~105 d，T3和W3也保持显著优势，90 d时，T3较T1，T2和T4依次增加了88.9%，28.7%，379.1%，W3较W1，W2，W4依次增加了201.8%，52.3%和45.5%。105 d时，T4处理psbA和RbcL表达量显著低于其他同类水平处理，达到最小值。
图 3 氮素形态和氮素水平对喜树叶绿体基因和光合酶基因表达的影响Figure 3. Effects of different ammonium nitrogen and nitrate on the expression of chloroplast genes and photosynthetic enzyme genes in C. acuminata3. 讨论
植物不同生长过程对氮肥需求不同，在合理范围内增施氮肥，可以显著促进植物生长，提高植物的产量和品质[14]。研究认为：与铵态氮相比，硝态氮具有更好的亲和力、氮转运和吸收效果[15]。本研究发现：铵态氮和硝态氮均提高了喜树的叶面积和叶长生长量，以T3和W3优势最为明显；相比而言，硝态氮处理下喜树生长更优；随着氮素水平的继续提高，喜树叶长和叶面积显著下降，说明植物吸收利用氮素存在一定限度，过量添加不利于生物量的积累[16]。
叶绿素参与光能的吸收传递及分配，是重要的光合色素；不同氮素形态对植物叶绿素合成及对光能吸收、传递、捕获和转换具有重要影响[17]。研究表明：适量增加氮素可促进米老排Mytilaria laosensis[18]和菘蓝Isatis indigotica[19]叶绿素合成，提高光合效率。本研究发现：合理范围内（T1~T3，W1~W3）增施氮肥，喜树叶片叶绿素合成和光合效率显著提高，以T3和W3效果最佳。对油麦菜Lactuca sativa var. longifoliaf[20]和黄瓜Cucumis sativus[21]而言，硝态氮处理下叶绿素相对含量和叶绿素荧光参数高于铵态氮处理；本研究同样发现，处理初期，相同氮素水平下，硝态氮处理组叶绿素质量分数和叶绿素荧光参数显著高于铵态氮，这可能与植物对氮素形态的吸收代谢有关。李晓静等[22]发现铵态氮以被动吸收为主，扩散进入生物膜并破坏生物膜结构，阻碍质子动力势的建立和碳同化物的形成；而硝态氮以主动吸收为主，进入生物膜并储存于液泡中，对植物体内离子平衡、碳同化物的形成有利。RAAB等[23]研究发现：高氮会造成叶绿素酶失活，叶绿素分解，光系统Ⅱ遭到破环，光子传递受阻，使植物发生光抑制现象；如小麦Triticum aestivum在高氮处理下，植物光合结构和功能受到伤害，光合特性降低[24]。本研究发现，处理中后期（60~105 d）高氮水平下（T4和W4），喜树的叶绿素质量分数、叶绿素荧光特性显著下降。原因可能是高铵态氮造成铵离子在体内积累，类囊体结构被破坏，质子形成受阻，形成氧化磷酸化，破坏碳水化合物的形成，导致叶绿素合成受阻和植物光合特性降低[25]；高硝态氮处理破坏土壤理化性质，造成喜树缺素症，表现出对铁、镁等元素吸收的拮抗作用，从而影响植物光合特性[26]。不同氮素形态或水平对qNP影响无显著规律，其原因还需要进一步研究。
光系统Ⅱ（PSⅡ）由多亚基复合组成，吸收外界光能并将激发能转移到反应中心；psbA，psbB和psbC是编码PSⅡ反应中心蛋白质基因，RbcL基因编码核酮糖二磷酸羧化酶的大亚基。研究发现：增施氮肥可以提高植物碳同化能力，促进RbcL表达[27]。以甜菜Beta vulgaris[28]为例，铵态氮处理，其叶片中Rubisco酶基因表达高于硝态氮处理。本研究中，处理初期（30 d）不同氮素形态处理均促进了叶绿体基因的表达，相同水平下硝态氮处理RbcL的表达高于铵态氮；至中后期，T1和W1处理下RbcL的表达显著高于其他同类处理，说明适宜的铵态氮和硝态氮处理提高了植物的碳同化能力；相比之下，硝态氮较铵态氮更有利于提高喜树的碳同化能力，进一步说明了喜树是喜硝植物[29]。叶绿素荧光过程极其复杂，受各种刺激调控，植物碳同化和氮同化可能存在相应的竞争关系。本试验60 d时，叶绿体基因表达下调，可能原因是随着植物对长期环境变化的响应和适应，相关叶绿体基因表达受到影响[30-31]。环境胁迫造成PSⅡ中的蛋白质破坏，受蛋白编码基因刺激表达的影响，受损的蛋白质不断被新合成的蛋白质替代。SHAO等[32]发现：2.0 mg·L-1氮处理下，连苯三酚引起的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa损害可通过psbA的刺激表达弥补。本实验中psbA，psbB和psbC在不同氮素水平处理下表达差异不显著，可能是氮素刺激了PSⅡ的蛋白质合成，形成自我保护机制[33]。高氮处理下，植物光电子传递受阻、热耗散能力显著下降、碳同化能力下降，发生了明显的光抑制现象[34]，也会造成叶绿体基因的表达显著下调。高铵态氮下铵离子的积累破坏了类囊体蛋白，降低了Rubisco酶活力，而高硝态氮下，植物对三价铁离子、二价镁离子的吸收下降，Rubisco酶活力受损，导致叶绿体基质中类囊体光驱电子的转移受阻碍，从而影响质子中铁硫-氧化蛋白的还原[35]。
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图 1 不同质量浓度SA处理对病斑大小及孢子萌发的影响
Figure 1 Effect of different concentrations of SA treatment on lesion size and spore germination
图 2 不同质量浓度SA处理对可溶性蛋白质、SOD、CAT和POD的影响
Figure 2 Effect of different concentrations of SA treatment on soluble protein, SOD, CAT and POD
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[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志: 第31卷[M]. 北京: 科学出版社, 1982. [2] 郑万钧. 中国树木志: 第1卷[M]. 北京: 中国林业出版社, 1983. [3] 吴奉奇.几种珍贵阔叶树种炭疽病分子鉴定研究[D]. 广州: 华南农业大学, 2016. WU Fengqi. Molecular Identification of Anthracnose pathogen on Several Precious Broad Leaf Tree Species[D]. Guangzhou: South China Agricultural University, 2016. [4] 张艳明. 广西珍贵树种病害调查及柚木两种叶斑病病菌的生物学特性测定[D]. 南宁: 广西大学, 2015. ZHANG Yanming. Invertigation on Diserases of Precious Trees in Guangxi and the Study on the Biological Characteristcs of Pathogens of Two Tectona grandis Leaf Spots[D]. Nanning: Guangxi University, 2015. [5] KLESSIG D F, CHOI H W, DEMPSEY D M A. Systemic acquired resistance and salicylic acid: past, present, and future [J]. Mol Plant-microbe Interaction, 2018, 31(9): 871 − 888. [6] VENUGOPAL S C, JEONG R D, MANDAL M K, et al. Enhanced disease susceptibility 1 and salicylic acid act redundantly to regulate resistance gene-mediated signaling [J]. PLoS Genet, 2009, 5(7): e1000545. [7] DURRANT W E, DONG X. Systemic acquired resistance [J]. Annu Rev Phytopathol, 2004, 42: 185 − 209. [8] 洪剑明,邱泽生,柴晓清. 植物的诱导抗病性[J]. 植物学通报, 1997, 14(2): 24 − 30. HONG Jianming, QIU Zesheng, CHAI Xiaoqing. Induced disease resistance of plant [J]. Chin Bull Bot, 1997, 14(2): 24 − 30. [9] HE Junyu, REN Yanfang, CHEN Chen, et al. Defense responses of salicylic acid in mango fruit against postharvest anthracnose, caused by Colletotrichum gloeosporioides and its possible mechanism [J]. J Food Saf, 2017, 37(1): e12294. [10] 丁秀英,张军,苏宝林,等. 水杨酸在植物抗病中的作用[J]. 植物学通报, 2001, 18(2): 163 − 168. DING Xiuying, ZHANG Jun, SU Baolin, et al. Role of salicylic acid in plant disease resistance [J]. Chin Bull Bot, 2001, 18(2): 163 − 168. [11] 李姝江,朱天辉,黄艳娜,等. 水杨酸诱导山茶抗灰斑病的作用及生理生化响应[J]. 林业科学, 2012, 48(2): 103 − 109. LI Shujiang, ZHU Tianhui, HUANG Yanna, et al. Roles of salicylic acid in inducing resistance of Camellia to the gray spot and the biochemical resp [J]. Sci Silv Sin, 2012, 48(2): 103 − 109. [12] 郭朦朦,陈慧洁,冯丽贞,等. 茉莉酸甲酯诱导桉树对焦枯病的抗性研究[J]. 江西农业大学学报, 2018, 40(1): 103 − 108. GUO Mengmeng, CHEN Huijie, FENG Lizhen, et al. A Study on the induced resistance of Eucalyptus against Calonectria pseudoreteaudi by MEJA [J]. Acta Agric Univ Jiangxi, 2018, 40(1): 103 − 108. [13] 王军,陈绍红,黄永芳,等. 水杨酸诱导油茶抗炭疽病的研究[J]. 林业科学研究, 2006, 19(5): 629 − 632. WANG Jun, CHEN Shaohong, HUANG Yongfang, et al. Induced resistance to anthracnose of Camelia oleifera by salicylic acid [J]. For Res, 2006, 19(5): 629 − 632. [14] 方中达. 植病研究方法[M]. 北京: 农业出版社, 1998: 151 − 154. [15] MEJRI S, SIAH A, ABUHAIE C M, et al. New salicylic acid and pyroglutamic acid conjugated derivatives confer protection to bread wheat against Zymoseptoria tritici [J]. J Sci Food Agric, 2018, 99(4): 1780 − 1786. [16] ARGUS CEZAR D R N, MARCELO M, ROBSON MARCELO D P. Antifungal activity of salicylic acid against Penicillium expansum and its possible mechanisms of action [J]. Int J Food Microbiol, 2015, 215: 64 − 70. [17] ABO-ELYOUSR K A M, IBRAHIM Y E, BALABEL N M. Induction of disease defensive enzymes in response to treatment with acibenzolar-S-methyl (ASM) and Pseudomonas fluorescens Pf2 and inoculation with Ralstonia solanacearum race 3, biovar 2(phylotype Ⅱ) [J]. J Phytopathol, 2012, 160(7/8): 382 − 389. [18] MYRESIOTIS C K, KARAOGLANIDIS G S, VRYZAS Z, et al. Evaluation of plant-rowth-promoting rhizobacteria, acibenzolar-S-methyl and hymexazol for integrated control of Fusarium crown and root rot on tomato [J]. Pest Manage Sci, 2012, 68(3): 404 − 411. [19] SALDAJENO M G B, HYAKUMACHI M. The plant growth-promoting fungus Fusarium equiseti and the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae stimulate plant growth and reduce severity of anthracnose and damping‐off diseases in cucumber (Cucumis sativus) seedlings [J]. Ann Appl Biol, 2011, 159(1): 28 − 40. [20] DEENAMO N, KUYYOGSUY A, KHOMPATARA K, et al. Salicylic acid induces resistance in rubber tree against Phytophthora palmivora [J]. Int J Mol Sci, 2018, 19(7): 1883. [21] LIN Jinhe, GONG Deqiang, ZHU Shijiang, et al. Expression of PPO and POD genes and contents of polyphenolic compounds in harvested mango fruits in relation to Benzothiadiazole-induced defense against anthracnose [J]. Sci Hortic, 2011, 130(1): 85 − 89. [22] ZHANG Zhaengke, YANG Dongping, YANG Bo, et al. β-Aminobutyric acid induces resistance of mango fruit to postharvest anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides and enhances activity of fruit defense mechanisms [J]. Sci Hortic, 2013, 160: 78 − 84. [23] WEN Pengfei, CHEN Jianye, KONG Weifu, et al. Salicylic acid induced the expression of phenylalanine ammonia-lyase gene in grape berry [J]. Plant Sci, 2005, 169(5): 928 − 934. 期刊类型引用(13)
1. 张兴月，陈金鑫，刘国元，余春梅，张健，姚彬，魏辉. 有刺枸骨和无刺枸骨在不同CO_2浓度下的光合能力分析. 安徽农学通报. 2024(04): 49-54 . 
百度学术2. 张彬润. 叶面喷施氨基酸水溶肥对喜树生长及喜树碱含量的影响. 特种经济动植物. 2023(06): 73-74+77 . 百度学术3. 廖向研，谭鹰，邬桥平，刘志贤. 外源钙对干旱胁迫下喜树幼苗缓解效应. 温带林业研究. 2023(04): 21-26 . 百度学术4. 陈志青，刘梦竹，王锐，崔培媛，卢豪，魏海燕，张洪程，张海鹏. 纳米镁对水稻产量形成和氮素吸收利用的影响. 中国水稻科学. 2022(02): 195-206 . 百度学术5. 张海鹏，陈志青，王锐，卢豪，崔培媛，杨艳菊，张洪程. 氮肥配施纳米镁对水稻产量、品质和氮肥利用率的影响. 作物杂志. 2022(04): 255-261 . 百度学术6. 杜明慧，成玉婷，吴小莲，霍锦林，何子豪，陈永骥，何坤航，洪文泓，王海龙. 不同形态氮肥降低菜心吸收累积环丙沙星(CIP)的生理生化机制. 安徽农业大学学报. 2022(04): 630-637 . 百度学术7. 马道承，庞艳萍，田湘，王凌晖. 植物不同氮素形态配比施肥及其分子机制研究进展. 西部林业科学. 2022(05): 164-170 . 百度学术8. 崔云浩，刘俊清，张帆，王军娥，王艳芳，石玉. 不同氮素形态配比对辣椒幼苗生长及生理特性的影响. 江苏农业科学. 2022(20): 161-168 . 百度学术9. 郑钢，顾翠花，林琳，王杰. 20种千屈菜科植物rbcL基因密码子使用偏好性分析. 浙江农林大学学报. 2021(03): 476-484 . 本站查看10. 逯玉兰，李广，闫丽娟，燕振刚，聂志刚，董莉霞. 基于APSIM模型的不同氮肥方案小麦叶面积指数的模拟研究. 甘肃农业大学学报. 2020(03): 38-44+53 . 百度学术11. 时怡，梁博文，胡俊峰，董玥琪，杜培华，李中勇，张学英，徐继忠. 不同形态及浓度氮素对矮砧红富士苹果幼树生长和氮素吸收、运转的影响. 河南农业科学. 2020(09): 112-119 . 百度学术12. 刘向东，尹陈茜，陈雪峰，甘德欣，于晓英，许璐. 废弃物基质对高温气候下‘金丝皇菊’生长的影响. 江西农业大学学报. 2020(04): 707-717 . 百度学术13. 林劲草，肖莉，吴酬飞，张绍勇，杨惠宁，张立钦. 基于响应面法的马比木中喜树碱提取工艺的优化. 浙江农林大学学报. 2020(05): 1014-1019 . 本站查看其他类型引用(17)
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