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楠木自古以来被誉为江南四大名木之首，国家二级保护植物，主要包括樟科Lauraceae润楠属Machilus和桢楠属Phoebe植物，多为高大乔木，树干通直，树型优美，且具有驱虫等功效，深受人们喜爱，是中国重要的景观树种和经济树种[1-2]。炭疽病是近年来危害楠木健康的主要病害之一，侵染叶片边缘、叶尖，病斑呈灰褐色至暗褐色，枝部感染处为黑褐色，病健交界处明显。此前学者在广西南宁市良凤江国家森林苗圃基地和博白县林业科学研究所，以及广东省肇庆市北岭山珍贵树种种植基地调查发现该病害发生严重[3-4]。目前，关于楠木炭疽病防治研究相对较少，且仅限于病原菌鉴定及其发病规律，植物诱导抗性用于楠木病害防治未见报道。化学防治是林业病害防治中最快速、有效的方法。然而，重复使用化学杀菌剂已经导致许多问题，如抗药性、环境污染、化学残留等。植物抗病性是利用植物自身的免疫性来对抗病原物的侵染，是近年来的研究热点。很多研究证明通过天然或化学合成物等可以诱导植物产生抗性，抵抗病原物入侵，从而达到防治效果。水杨酸(SA)是一种内源性激发子，是信号传导系统中的重要组成部分，参与调控植物生理生化等过程[5-6]。水杨酸可以诱导植物局部获得性抗性和系统获得性抗性(SAR)[7-9]，在1979年对感染花叶病毒(TMV)的烟草Nicotiana tabacum 栽培种Xanthi-NC研究中首次证明[10]，随后人们通过大量实验对水杨酸可以提高植物的抗病性加以验证，如山茶Camellia japonica灰斑病[11]、桉树Eucalyptus焦枯病[12]、油茶C. oleifera炭疽病[13]等。本研究分析了SA对楠木炭疽病的诱导抗性，测定可溶性蛋白质、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的变化来探究其作用机理，旨在为病害防治提供依据。
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紫楠Phoebe sheareri又名紫金楠、金丝楠等，由建德市欣林林木服务中心提供，为2年生盆栽苗。供试菌株胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides由浙江农林大学森林保护学科菌种储存室提供。
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配制质量浓度为500、200、100、50 mg·L−1水杨酸溶液(pH 6.8)进行喷雾试验，约30 mL·株−1，1 d后重复喷洒，并设置无菌水对照。5 d后采集叶片，选择心叶下完全展开的功能叶片，用灭菌剪刀取样，样品成熟度保持一致。每处理3株，4次重复。采用孢子悬浮液进行离体刺伤接种，以不刺穿叶片为宜。于25 ℃下12 h光照12 h黑暗保湿培养，7 d后统计叶片发病情况，采用网格法测病斑面积，重复3次取平均值，计算病斑减小率。病斑减小率 = (对照处理病斑面积−诱导处理病斑面积)/对照处理病斑面积×100%
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选取长势良好大小一致的2年生紫楠植株，配置SA的最终质量浓度为500、200、100、50 mg·L−1，均匀喷洒于植株上，以溶液布满叶片不流下为宜。以无菌水喷洒作为对照，1 d后重复喷洒，使植物充分吸收，5 d后采集长势均一的成熟叶片进行生理测定，包括可溶性蛋白质、SOD、POD、CAT，每处理3次重复。可溶性蛋白质采用紫外吸收法测定[14]。取紫楠叶片0.5 g，按照1∶9的体积比加入9倍体积0.1 mol·L−1磷酸缓冲液(pH 7)，5 000 r·min−1离心10 min，上清液为蛋白质提取液。取蛋白质原液0.5 mL稀释至5 mL，利用紫外分光光度计测取280 nm及260 nm处的光密度D(280)和D(260)，以pH=7.0磷酸缓冲液进行空白调0。蛋白质质量浓度(g·L−1)=1.45×D(280)−0.74×D(260)。其中1.45和0.74为校正值。SOD活性测定：本研究通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，氧化羟胺形成子纠缠亚硝酸盐，在显色剂的反应下呈现紫红色，根据南京建成生物工程研究所测试盒步骤进行测定，用可见光分光光度计测其光密度。组织中SOD活力定义：每克组织在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活力单位(1 U=16.67 nkat)。SOD活力(16.67 nkat·g−1)=[(对照光密度−测定光密度)÷对照光密度]÷50% ×反应液总体积(mL)÷取样量(mL)÷匀浆液浓度(kg·L−1)。CAT活性测定：CAT分解过氧化氢(H2O2)的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，按照南京建成生物工程研究所测试盒处理结果在405 nm处测定其变化量，可计算出CAT的活力。CAT活力定义：每毫克组织蛋白每秒种分解1 μmol的H2O2的量为1个活力单位。CAT活力(16.67 nkat·g−1)=(对照光密度−测定光密度)×271÷60÷取样量(mL)÷匀浆液浓度(kg·L−1)。POD活性测定：过氧化氢酶可催化过氧化氢反应，根据南京建成生物工程研究所测试盒测定420 nm处可见光光密度变化来计算酶活性。组织中POD活力定义：在37 ℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1 μg底物的酶量定义为一个活力单位(1 U=16.67 nkat)。POD活力(16.67 nkat·g−1)=[(对照光密度−测定光密度)÷(12×1 cm比色光径)]×反应液总体积(mL)÷取样量(mL)÷反应时间(30 min)÷匀浆液浓度(kg·L−1)×1 000。
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为确定SA对孢子萌发是否有影响，配置含SA的最终质量浓度为0、50、100、200、500 mg·L−1的楠木炭疽病病原菌孢子悬浮液，采用凹玻片萌发法[14]，调节pH至6.8进行25 ℃全黑暗保湿培养，每处理3次重复，12 h后观察孢子萌发情况，计算孢子萌发率。孢子萌发率 = 已萌发孢子数/观察孢子总数×100%；
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根据质量浓度诱导结果，选用最适宜质量浓度SA进行喷雾处理，1 d后重复喷施，对照为等量无菌水。本实验共设置4个处理：在第2次SA处理2 h后活体接种(A)；SA处理不接种(B)；无菌水处理并接种(C)；无菌水处理不接种(ck)。每处理3株，4次重复。采用孢子悬浮液针刺接种，脱脂棉保湿处理。不同处理在第2次SA或无菌水喷施后1、2、3、5、7、10、15 d采集生长状况一致的叶片，于−80 ℃冰箱保存备用，进行后续生理指标变化测定。
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由图1可以看出：不同质量浓度的SA对紫楠均具有诱导作用，对病斑抑制效果差异显著(P＜0.05)。与无菌水喷洒处理相比SA质量浓度为100 mg·L−1诱导植物叶片病斑减小率最高，达64.28%，其次是50和200 mg·L−1，诱导效果为59.8%、56.72%，500 mg·L−1诱导效果最差，其中各质量浓度诱导植物病斑大小差异显著。
图 1 不同质量浓度SA处理对病斑大小及孢子萌发的影响
Figure 1. Effect of different concentrations of SA treatment on lesion size and spore germination
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结果表明(图1)：低质量浓度SA处理孢子萌发率与对照相比无显著差异，即对孢子萌发无明显抑制作用，当SA质量浓度为200、500 mg·L−1时抑制作用显著(P＜0.05)，分别为69.58%和34.75%，同低质量浓度相比差异较大。
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从图2可以看出：不同质量浓度SA均可诱导可溶性蛋白质的增加(P＜0.05)，100 mg·L−1所诱导的蛋白质质量浓度是对照的2.11倍，50和200 mg·L−1的诱导效果差异不显著，与对照相比差异显著，分别是对照的1.77和1.69倍。500 mg·L−1 SA诱导后，可溶性蛋白质质量浓度较其他处理低，但显著高于对照(P＜0.05)。
图 2 不同质量浓度SA处理对可溶性蛋白质、SOD、CAT和POD的影响
Figure 2. Effect of different concentrations of SA treatment on soluble protein, SOD, CAT and POD
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SOD是植物体内重要的抗氧化酶，SA施用后引起植株SOD活性升高(图2)。其中500和200 mg·L−1与对照之间无显著差异，SA质量浓度为100 mg·L−1时酶活性高于50 mg·L−1时的酶活性，差异显著(P＜0.05)。表明不同质量浓度SA对植物中SOD酶活性的影响不同。
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CAT活性随SA质量浓度的上升表现出先升高后降低的趋势(图2)，500 mg· L−1质量浓度处理与对照的CAT相比无显著差异，200、100、50 mg·L−1处理差异显著(P＜0.05)，均能使CAT活性增加。其中100 mg·L−1的SA处理对楠木植株CAT活性诱导效果最好，是对照的2.03倍。
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不同质量浓度SA处理对POD活性的影响与CAT趋势相似(图2)，均为随SA质量浓度的增加表现为先上升后下降。100 mg·L−1SA诱导的POD活性最高，是对照的1.3倍。200和50 mg·L−1诱导的CAT活性无显著差异，但显著高于500 mg·L−1和对照处理。不同质量浓度SA均可引起POD活性增加。上述研究表明：不同质量浓度SA对楠木诱导效果均存在差异，500 mg·L−1诱导效果最差，100 mg·L−1诱导效果最好，因此选择100 mg·L−1的SA进行下一步实验。
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从图3可以看出：不同处理均可引起紫楠叶片可溶性蛋白质质量浓度的增加。SA处理后其蛋白质质量浓度在1~5 d持续增加，5 d时达峰值，处理A在第7天达峰值，随后下降，可溶性蛋白质质量浓度显著高于未经SA处理过的处理C和ck。处理A效果最好，第7天时是ck的2.57倍，经SA处理过的植株第15天可溶性蛋白质质量浓度仍显著高于对照，处理C在第1~3天升高随后下降，趋势相较于A处理和B处理趋势较为平缓。15 d时SA处理过的植株可溶性蛋白质质量浓度显著高于对照，因此SA可以诱导紫楠植株可溶性蛋白质增加。
图 3 不同处理对可溶性蛋白质、SOD、CAT和POD的影响
Figure 3. Effect of different treatments on soluble protein, SOD, CAT and POD
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本研究SA处理均可引起紫楠叶片SOD活性增加(图3)，随SA的作用时间先逐渐升高后缓慢下降。当SA作用时间为7 d时，处理A的SOD活性达最大值，是ck的1.21倍，之后开始下降，处理A和处理B的SOD活性始终显著高于处理C和ck。
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SA诱导后可引起紫楠体内CAT活性增加(图3)，有利于增强植株抗病性。紫楠叶片经SA处理和接种处理后，CAT活性在第5天达到峰值，处理A是ck的2.04倍，处理B是ck的1.63倍，5 d后CAT活性下降。处理C的CAT活性虽有增加但到后期与ck相比差异不显著。
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100 mg·L−1的SA诱导后，植株POD活性迅速升高(图3)，处理A与处理B的POD活性具有基本相似的变化趋势，处理A相较于处理B迟一些达到最大值，且POD活性是ck的1.46倍，SA诱导15 d后的植株POD活性仍显著高于未诱导的植株。
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诱抗剂有着更好的抗病性和低毒性[15-16]。目前，诱导剂在农业等方面应用广泛，在林业方面研究相对较少。将诱导剂应用于林业实践可减少化学杀菌剂的使用，与杀菌剂、生物防治等相结合可达到更好的效果[17-19]。当SA质量浓度低于500 mg·L−1时对孢子萌发无影响，可以证明低质量浓度外源SA的施用对病原菌孢子无直接毒力。本研究证实：不同质量浓度SA对紫楠均具有诱导抗性作用。100 mg·L−1为SA最适宜质量浓度，酶活性均达到最大值，差异显著。SA处理后可溶性蛋白质质量浓度，SOD、CAT、POD活性先上升然后下降至稳定水平，实验持续了15 d，所测结果仍高于正常水平，其中CAT变化最为明显，经SA诱导的紫楠接种或不接种处理，生理指标活性均显著高于对照，这与山茶[11]、橡胶树Hevea brasiliensis [20]等抗性诱导研究结果一致。
SA是存在于植物体内的内源性生长物质，可以引起植物体内H2O2浓度升高，促进H2O2生成的化合物，诱导SAR相关蛋白及防御酶等活性的增加，促进相关基因的表达[21-22]。外源SA可以诱发植物触发病理相关蛋白基因的表达，在诱导植物产生抗病性的同时大量积累病程相关蛋白。外源SA的应用可诱导植物内源性CAT和POD活性增加，以及相关基因的表达，能引发植物的诱导抗性[23]。POD除了具有解毒作用外，还是植物体内多种次生代谢产物生物合成的关键调控酶之一，植物次生代谢产物参与了植物对病原体的防御反应，SOD在清除高毒性和不稳定活性氧中起重要作用，CAT、POD和SOD被认为是保护细胞免受氧化损伤的主要抗氧化系统，多种酶活性的升高可能是使植物体产生抗性，抵抗病原菌侵染的重要原因。因此，SA可以诱导楠木对病原菌的入侵产生抗性，为防治提供依据。
Resistance of Phoebe sheareri to anthracnose induced by salicylic acid
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摘要:
目的 探究水杨酸(SA)诱导紫楠Phoebe sheareri对炭疽病的抗性。 方法 以2年生紫楠为材料，用0、50、100、200、500 mg·L−1质量浓度SA对紫楠进行喷雾处理，以无菌水喷洒不接种为对照(ck)。喷雾后选择不同时间采集紫楠叶片，采用离体刺伤接种法测定对炭疽病病斑的抑制作用，并测定了紫楠叶片中可溶性蛋白质、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的变化。 结果 不同质量浓度SA处理的紫楠叶片均对炭疽病病斑有抑制作用，100 mg·L−1 SA处理对病斑抑制率达64.28%，在SA喷雾的同时接种炭疽病孢子悬浮液后，叶片的可溶性蛋白质、SOD、CAT和POD在1~7 d内升高，达到峰值时可溶性蛋白质为ck的2.57倍，SOD活性为ck的1.21倍，CAT活性为ck的2.04倍，POD活性为ck的1.46倍，7 d后呈下降趋势，15 d内各生理指标均显著高于ck。 结论 SA可诱导紫楠叶片可溶性蛋白质、SOD、CAT和POD升高，对炭疽病产生抗病性。图3参23 Abstract:Objective The objective is to investigate the resistance of Phoebe sheareri to anthracnose induced by salicylic acid (SA). Method The 2-year old P. sheareri was used as material, spayed with 100, 200, 500 mg·L−1 SA. After 5 days, the leaves were collected and in vitro puncture inoculation method was used to determine the inhibition of anthracnose lesions, changes in soluble protein, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and peroxidase (POD) in the leaves. Result Leaves treated with different concentrations of SA could inhibit the anthracnose lesions, and the lesion inhibition rate with 100 mg·L−1 SA treatment reached 64.28%. After SA spray and inoculation with anthracnose, soluble protein, SOD, CAT and POD in leaves increased in 1−7 days, and decreased after 7 days. At the peak, the soluble protein was 2.57 times of ck, SOD was 1.21 times of ck, CAT was 2.04 times of ck, and POD was 1.46 times of ck. All physiological indexes were higher than those of ck within 15 days. Conclusion SA can induce the increase of soluble protein, SOD, CAT and POD of P. sheareri and produce disease resistance.[Ch, 3 fig. 23 ref.] -
城市园林绿化事业的快速发展导致园林废弃物的数量日益增多[1]。堆肥已成为园林废弃物资源化利用的主要方式之一[2-5]。园林废弃物中的木本植物残体存在大量难降解的木质素。这些木质素溶解性差，没有任何易被水解的键，分子结构复杂且不规则，含有各种稳定的复杂键型，微生物及其分泌的酶不易与之结合[6]。这些木质素还包裹着纤维素，即使微生物可分解单独存在的纤维素，但细胞壁中木质素对纤维素起到保护作用，纤维素的降解仍受到限制[7-8]，严重影响堆肥进程，因此促进木质素降解是加快堆肥进程和提高堆肥产品品质的重要环节[9]。自然界中的真菌、细菌及相应微生物群落可通过产生分解木质素的酶系统(漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶)将木质素完全降解，且大多数真菌降解效果强于细菌[6, 10]。堆肥中添加微生物菌剂可显著提高木质素降解率，加快堆肥进程[8, 11]。YU等[12]通过二次回归正交设计研制出了一种园林废弃物专用复合菌剂，其木质素降解能力强于有效微生物复合菌(EM菌)。何慧中等[13]开发出一种复合功能菌剂，添加到桉树Eucalyptus皮堆肥中，木质素降解效果显著，与对照相比木质素含量下降了78.78%。目前，有关木质素降解的菌剂研究多集中在液体菌剂，但液体菌剂存在生产工序复杂，易污染，易失活，不便于保存等缺点。因此，有必要将木质素降解菌制成固体菌剂，弥补液体菌剂的不足。微生物固定化技术是指通过物理或化学的手段将游离的微生物限定在一定的空间区域，保持其生物活性并能反复利用的方法[14]。将菌株运用固定化方式制成的固体菌剂，具有生产成本低，耐储存，不易失活，便于运输等优点，有利于菌剂在更大范围内推广和应用[15]。然而，固体菌剂的产品质量受多种因素影响，如接菌量、保护剂浓度和含水率可直接影响菌剂产品的稳定性和应用效果，而且国内外关于木质素降解菌固定化的研究尚不充分，有关园林废弃物堆肥的报道更为鲜见。鉴于此，本研究将1株木质素降解菌通过固定化的方式制成固体菌剂，以有效活菌数为评价指标，对菌剂制作过程中的主要影响因素进行优化，再通过正交试验获得最佳固体菌剂的制备条件，将其应用到园林废弃物堆肥中进行效果检验，以期为该类菌剂的研制与应用提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 材料
菌种为曲霉属Aspergillus sp.真菌No.11[1]，目前保存于北京林业大学林学院土壤生物学实验室。堆肥原料来源于北京植物园，主要为花草树木的人工修剪物和自然生长产生的枯枝落叶，粉碎成1~2 cm粒径。培养基：马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。载体与保护剂：通过预实验确定生物质炭和米糠为固定化载体，海藻糖为保护剂，载体混合质量比为1∶1。
1.2 方法
1.2.1 种子液的制备
将4 ℃保存的菌株No.11接种到PDA培养基上，28 ℃下培养3 d完成活化。将活化后的菌株No.11挑取至装有100 mL PDB培养基的摇瓶中，置于28 ℃、200 r·min−1的摇床中培养48 h(对数生长期末)获得种子液备用。
1.2.2 单因素优化试验
接菌量试验：按照载体质量的5%、10%、15%、20%和25%接种种子液，调节料水质量比为1.0∶0.8，搅拌均匀，28 ℃培养48 h。培养完成后放在40 ℃烘箱中完全烘干，在室温下干燥密封保存30 d后，测定有效活菌数。
保护剂体积分数试验：种子液中分别添加体积分数为0、4%、8%、12%、16%和20%的保护剂，按载体质量的10%接种到载体中，调节料水质量比为1.0∶0.8，混匀后，28 ℃培养48 h。培养完成后放在40 ℃烘箱中完全烘干，在室温下干燥密封保存30 d后，测定有效活菌数。
含水率试验：向载体中接种质量分数为10%的种子液，调节料水质量比为1.0∶0.8，混合均匀，28 ℃培养48 h之后，放在40 ℃烘箱中烘至含水率为5%、10%、15%、20%和25%，在室温下干燥密封保存30 d后，测定有效活菌数。
1.2.3 正交试验设计
根据1.2.2节试验结果确定优化范围，其中接菌量为5%、10%、15%，保护剂体积分数为0、4%、8%，含水率为10%、15%、20%，进行3因素3水平正交试验设计。具体方案见表1。根据表1，向载体中接种相应水平的种子液和保护剂，调节料水质量比为1.0∶0.8，混合均匀，28 ℃培养48 h，之后放在40 ℃烘箱中烘至该处理对应的含水率。将制备好的固体菌剂在室温环境下干燥密封保存30 d，测定有效活菌数，确定最佳菌剂的制备条件。
表 1 正交试验设计Table 1 Design of the orthogonal experiment水平 因素 接菌量/% 保护剂/% 含水率/% 1 5 0 10 2 10 4 15 3 15 8 20 1.2.4 固体菌剂堆肥效果验证
堆肥模拟试验。将粉碎后的园林废弃物分别装入500 mL锥形瓶，装80 g·瓶−1，调节含水率达60%，共4组处理，分别为不添加菌剂(ck)、添加质量分数为0.5%市售EM菌剂(T1)、添加质量分数为0.5%自制固体菌剂(T2)、添加质量分数为1.0%自制固体菌剂(T3)。各组处理3次重复。搅拌均匀后用8层纱布封好瓶口，置于恒温培养箱中避光培养。为模拟堆肥过程中的升温、高温和降温阶段，弥补堆肥模拟试验中因堆体较小，无法自主升温的缺陷，人工进行培养箱温度的调节：温度从25 ℃逐渐上升至50 ℃，再逐渐降至30 ℃。各阶段经历时间分别为5、30、5 d。
样品采集。采集第1、8、16、24、32、40 天的堆肥样品鲜样1 g，测定木质素降解相关酶的酶活力；采集第1 天和第40 天堆肥样品测定pH、电导率(EC)、D(465)/D(665)[样品滤液在465 nm处吸光度D(465)和665 nm处吸光度D(665)的比值]、种子发芽指数(IG)、木质素质量分数和纤维素质量分数等指标。
木质素降解相关酶活力测定。漆酶、锰过氧化物酶和木素过氧化物酶活力测定参照田林双[16]的木质素降解相关酶类测定标准方法。
堆肥腐熟指标测定。pH和EC测定：称取待测样品5 g，置于100 mL塑料瓶中，加入50 mL蒸馏水，200 r·min−1振荡1 h，过滤其上清液，用pH 400防水型笔式pH计和EC 400防水型笔式电导率/TDS/盐度计分别测定各样品的pH和EC；样品滤液在465 nm处吸光度D(465)和665 nm处吸光度D(665)测定：用UV-6100紫外可见分光光度计 (上海元析仪器有限公司)测定样品滤液在465 nm处吸光度D(465)和665 nm处吸光度D(665)；IG测定：取5 g鲜样置于100 mL塑料瓶中，加入50 mL蒸馏水，振荡1 h后获取上清液，将2张滤纸平铺到直径为9 cm的培养皿中，滤纸上加入5 mL上清液，以蒸馏水为空白对照，播撒白菜Brassica chinensis种子20粒·皿−1，置于25 ℃培养箱中培养48 h后记录发芽率和根长。计算IG，IG=(上清液处理的发芽率×根长)/(空白组的发芽率×根长)×100%。木质素、纤维素降解率测定：木质素、纤维素质量分数分别用硝酸-乙醇法和72%硫酸法进行测定[17]。
1.2.5 数据分析
采用Excel 2010 和SPSS 22.0 软件对数据进行分析处理。
2. 结果与讨论
2.1 单因素优化试验结果
接菌量可直接影响固体菌剂的质量。接菌量过少会延长菌株的生长停滞期，过大会增加生产成本，也会增强微生物之间的竞争作用[18]。由图1A可知：固体菌剂中的有效活菌数随接菌量的增加呈先增加后减少的趋势，接菌量为10%时有效活菌数最高，达3.73×1010 CFU·g−1；其次是接菌量为5%和15%时，有效活菌数达2.50×1010 CFU·g−1以上；当接菌量超过15%时，菌剂中的有效活菌数逐渐降低，低于2.50×1010 CFU·g−1。因此，选用接菌量5%、10%和15%作为正交试验的3个水平。
图 1 接菌量、保护剂体积分数和含水率对有效活菌数的影响Figure 1 Effect of inoculation amount, protective agent concentration and water content on living bacteria count微生物菌剂中添加一定量的保护剂可以增强其耐储藏性和稳定性，能直接影响菌剂的产品质量与应用效果[19]。由图1B可看出：当保护剂体积分数为8%时，活菌数最高达7.10×1010 CFU·g−1，保护剂体积分数＜8%时，有效活菌数随保护剂体积分数升高而增多；当保护剂体积分数＞8%后，随着保护剂体积分数的升高，有效活菌数显著(P＜0.05)降低，低于4.00×1010 CFU·g−1。因此，选用0、4%和8%作为正交试验的3个水平。
含水率对固体菌剂的储存有很大影响。含水率过高容易滋生杂菌，使固体菌剂受到污染影响应用效果，含水率过低不利于菌株的生存，一段时间后有效活菌数会大幅度降低[20]。由图1C可知：随着含水率的提高，固体菌剂中有效活菌数呈先升高后降低的趋势，含水率为15%时有效活菌数最高，可达5.17×1010 CFU·g−1；含水率为10%和20%时，固体菌剂中有效活菌数可达4.00×1010 CFU·g−1以上；含水率为5%和25%时，固体菌剂的储存效果最差，有效活菌数仅为2.00×1010 CFU·g−1左右。综上可知，当固体菌剂含水率为10%~20%时，有效活菌数较高，因此，选用10%、15%、20%作为正交试验中的3个水平。
2.2 正交设计试验结果
由表2可知：在接菌量、保护剂体积分数和含水率等3种因素中，影响程度最大的是接菌量，其次是含水率，影响程度最小的是保护剂体积分数。固体菌剂制备的最佳配方为A2B3C2，即：接菌量10%、保护剂体积分数8%、含水率15%。该条件下，菌剂中有效活菌数达1.26×1011 CFU·g−1，符合GB 20287−2006《农用微生物菌剂》的标准(＞0.50×108 CFU·g−1)。
表 2 正交试验的极差分析Table 2 Range analysis of orthogonal test处理 接菌量
(A)/%保护剂
(B)/%含水率
(C)/%有效活菌数/
(×1010 CFU·g−1)1 5 0 10 5.87±0.17 b 2 5 4 15 1.03±0.09 d 3 5 8 20 2.23±0.12 c 4 10 0 20 0.53±0.05 e 5 10 4 10 6.23±0.17 b 6 10 8 15 12.57±0.05 a 7 15 0 15 2.30±0.36 c 8 15 4 20 0.50±0.08 e 9 15 8 10 1.17±0.31 d K1 9.13 8.70 13.27 K2 19.33 7.76 15.90 K3 3.97 15.97 3.26 平均K1 3.04 2.90 4.42 平均K2 6.44 2.59 5.30 平均K3 1.32 5.32 1.09 极差R 5.12 2.74 4.21 说明：不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05) 2.3 堆肥试验结果
2.3.1 堆肥腐熟指标
pH是评价堆肥腐熟程度的指标之一。堆肥腐熟后，pH一般为7.0~8.5[21]。由表3可知：堆肥结束时各处理pH均在8.0左右，符合NY 525−2002《有机肥料》标准。
表 3 堆肥腐熟指标测定结果Table 3 Determination results of composting maturity index处理 pH EC/(mS·cm−1) D(465)/D(665) IG/% ck 7.89±0.04 a 0.35±0.00 a 5.85±0.53 a 106.00±15.31 a T1 8.01±0.13 a 0.34±0.02 a 6.22±0.06 a 114.00±21.44 a T2 8.01±0.03 a 0.34±0.01 a 6.26±0.11 a 118.00±3.55 a T3 7.97±0.06 a 0.32±0.01 a 6.46±0.09 a 112.00±10.93 a 说明：相同小写字母表示不同处理间差异不显著(P＞0.05) EC可以表示堆肥中可溶性总盐的含量，其大小能影响植物的生长，EC过高的堆肥产品可以影响土壤理化性质，使植物生长受到毒害。EC小于4.00 mS·cm−1，表明堆肥已达到腐熟，对植物生长无毒害[22]。由表3可知：ck处理EC为0.35 mS·cm−1，各处理的EC相近，均小于4.00 mS· cm−1，在腐熟标准之内。
D(465)/D(665)能反映出胡敏酸分子的稳定程度，D(465)/D(665)较大说明胡敏酸相对稳定，较小说明胡敏酸结构简单，因此可用来分析评价堆肥的腐殖化作用大小[9]。由表3可知：堆肥结束时，各处理的D(465)/D(665)均为6.0左右。
IG是判断堆肥产品是否腐熟的生物学指标。堆肥产品未腐熟时会产生对植物生长有毒有害的物质，抑制植物的生长。一般情况下，当IG大于80%就可认为产品已达到腐熟[23]。由表3可知：各处理的IG均超过80%，堆肥产品对植物无毒。
综上可知，堆肥进行40 d后，各处理的pH和EC均达到腐熟标准且无显著差异，但添加菌剂后可以缩短堆肥腐熟的时间[24]。各处理的D(465)/D(665)均为6.0左右，说明其缩合度和芳构化仍很低，这也从另一方面表明腐殖质活性较强[9]。各处理的IG均超过80%，这与ZHANG等[25]测定的园林废弃物堆肥产品IG一致。
2.3.2 木质素酶活力测定结果
堆肥过程中微生物会分泌各种酶，从而将木质素类大分子物质转化成腐殖质等促进植物生长的物质[26]。与木质素降解相关的生物酶主要包括漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶[27]。
在堆肥过程中，漆酶对木质素的降解起着非常重要的作用，研究漆酶活力的变化对评价堆肥进程及微生物活动强度至关重要[28]。由图2A可看出：除T3外，其余处理漆酶活力在初始阶段相差不大，呈现先降后升趋势，与陈建军等[29]研究结果一致。可能是堆肥材料中某些小分子物质先降解，之后微生物再降解木质素类难降解的大分子物质。T3酶活力先升后降，可能与其开始微生物数量较多，分解速率较高有关。堆肥进行到24 d时，T1、T2和T3漆酶活力远超过ck，说明添加自制菌剂与市售菌剂都可大大增强堆肥中微生物的活动强度，随着微生物菌落增多，产酶能力也增加。第24 天之后，T3酶活力下降，ck酶活力上升，T1与T2酶活力变化不大，且大小相当，均达80 U·L−1(1 U=16.67 nkat)左右。菌株No.11的研究结果也显示：与可高效降解木质素的黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium相比，此菌株有更强的产酶能力，也进一步说明自制固体菌剂有更大的应用潜力。
图 2 堆肥过程中漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶酶活力变化Figure 2 Changes of laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase activity during composting锰过氧化物酶是一种酚氧化物酶，可与其他酶共同作用提高对木质素的降解作用[10]。由图2B可看出：添加菌剂的处理组锰过氧化物酶活力均高于ck，说明添加菌剂可以提高堆肥中锰过氧化物酶的酶活力。堆肥初始阶段，所有处理组的锰过氧化物酶活力均出现先降后升趋势，可能与堆肥中的氮素含量有关，氮素含量会影响微生物分泌锰过氧化物酶[27]。第8 天后所有处理组酶活力又出现了上升趋势，说明微生物代谢活动增强，开始分泌锰过氧化物酶，T2与T3在第16天时达到峰值，T1的峰值出现在第24天左右。这表明添加自制固体菌剂后菌株可较快适应环境分泌锰过氧化物酶。有研究表明：锰过氧化物酶在限氮高锰培养基中产量较高[10]，因此制备此类菌剂时，可通过优化含氮量提高产锰过氧化物酶的能力。
木质素过氧化物酶是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，可直接与芳香底物发生反应，也可通过氧化低分子量的中介体而间接地发挥作用[30]。由图2C可看出：所有处理组木质素过氧化物酶活力均呈现先升后降趋势，添加菌剂的处理组酶活力的峰值出现时间均早于ck，且峰值高于ck，表明加入菌剂后可明显提高微生物分泌木质素过氧化酶的速率[31]。堆肥的后期，木质素过氧化酶显著降低，分析原因可能与此时碳氮比的变化有关。
2.3.3 木质素和纤维素降解率测定结果
木质素是一种在自然界中广泛存在的有机高分子化合物，多存在于植物的细胞壁中[32]。木质素的完全降解由细菌、放线菌和真菌共同参与，其中真菌起重要作用[33]。由图3可看出：添加菌剂的处理木质素与纤维素降解率均高于ck，T3木质素降解率达46.65%，其次是T2，木质素降解率为30.43%，而T1的木质素降解率仅为21.74%。
图 3 不同处理的木质素和纤维素降解率Figure 3 Degradation rate of lignin and cellulose in different treatments纤维素是植物细胞壁的主要结构成分，通常与半纤维素和木质素结合在一起[34]。自然界中有许多微生物可以通过酶的作用分解植物残体中的纤维素，但细胞壁中木质素对纤维素起到保护作用，所以木质素和纤维素的分解都受到限制[6]。由图3可知：添加菌剂后可提高园林废弃物堆肥中纤维素降解率，其中T1降解率为18.33%，T2降解率为16.67%，T3纤维素降解率最高，达30.00%。
综上可知，T2木质素降解率高于T1，说明自制固体菌剂对园林废弃物中木质素的降解效果较好。纤维素降解率结果显示：T1略强于T2，这可能是因为市售菌剂中的菌株对纤维素降解能力较好，而自制固体菌剂中的菌株主要产生木质素降解相关酶，对木质素的降解效果较好。T3的木质素降解率与纤维素降解率均高于T2，说明在考虑成本的前提下，需进一步研究自制固体菌剂的添加量，以获得最大经济效益。与王顺利等[35]制备出堆肥菌剂CC-1相比，接菌量相当的情况下添加自制固体菌剂可使纤维素降解率提高11.68%，木质素降解率提高46.65%。这可能与菌株No.11的特殊菌丝结构有关，同时说明自制固体菌剂可高效降解木质素和纤维素。与尹爽等[36]研制的复合菌剂相比，添加自制固体菌剂木质素降解率较高，可能是因为自制固体菌剂更易于微生物在堆肥中均匀生长，能极大程度地发挥降解作用。自制固体菌剂可以较好地分解园林废弃物中的木质素，并能提高纤维素降解率。
3. 结论
木质素降解菌No.11的最佳固定化条件为：接菌量10%、保护剂体积分数8%、含水率15%。在此条件下，获得的固体菌剂成品保存30 d后，其有效活菌数达1.26×1011 CFU·g−1，符合GB 20287−2006《农用微生物菌剂》的要求。
添加自制固体菌剂的堆肥产品pH为8.01，达到NY 525−2002《有机肥料》标准，EC为0.34 mS·cm−1，D(465)/D(665)为6.26，IG达118%，对植物无毒。
堆肥中添加自制木质素降解固体菌剂有利于木质素降解酶系的产生，漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的酶活力均得到提升。与不添加菌剂相比，木质素降解率提高23.91%，纤维素降解率提高8.34%；0.5%接种比例下，与EM菌相比，纤维素降解率未提高，木质素降解率提高8.69%。
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图 1 不同质量浓度SA处理对病斑大小及孢子萌发的影响
Figure 1 Effect of different concentrations of SA treatment on lesion size and spore germination
图 2 不同质量浓度SA处理对可溶性蛋白质、SOD、CAT和POD的影响
Figure 2 Effect of different concentrations of SA treatment on soluble protein, SOD, CAT and POD
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