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国外学者于20世纪60年代首次发现挥发性有机化合物(VOCs)[1]，之后逐步在VOCs的合成、调控及功能等方面开展研究。中国学者从20世纪80年代开始对VOCs开展研究[2–4]，主要在室内空气污染、工业污染治理、VOCs释放调查分析及测定技术等方面。王泰等[5]分析了工业乡村混合区VOCs垂直分布特征，得出受环境影响，各高度VOCs释放量和组分差异明显。王峰等[6]研究了VOCs源不确定性对臭氧生成及污染防治的影响，发现VOCs源不确定性影响臭氧(O3)形成过程中NOx和VOCs 敏感区的判断。随着环境问题日益严重，VOCs成为研究热点。VOCs按来源分可以分为人为源和植物源，植物源是全球VOCs的最大来源，约占VOCs总释放的90%[3, 7-8]。国内VOCs相关综述主要在人为源VOCs方面的吸附、治理等[9-11]，而对于植物遭受胁迫后，VOCs合成与释放及在植物中的作用尚缺乏相关综述。
植物VOCs主要分为萜类、苯类、苯丙类化合物和脂肪酸衍生物，它们通常是具有低分子量高蒸汽压的亲脂性液体，可以通过膜自由穿梭，在没有扩散屏障的情况下释放到环境中[12-13]。在不同环境中植物VOCs释放发生改变，高温条件下单萜、倍半萜和酚类释放减少，储存在导管中的单萜释放增加，绿叶挥发物(GLVs)释放增加[13-19]，机械损伤后GLVs释放量增加[20-23]。在生物胁迫中，单萜、倍半萜释放增加[24-28]。植物释放VOCs能够帮助植物抵御恶劣环境，也可参与植物直接防御和间接防御。此外，植物VOCs参与大气化学反应，如在臭氧产生和二次气溶胶形成中发挥作用[29-31]。因此，全面了解植物VOCs释放及作用对环境治理具有重要意义。本研究综述了植物VOCs释放受不同环境因素的影响，同时对植物VOCs的合成及储存、生理生态作用进行剖析，为推进植物VOCs领域相关研究提供参考。
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植物VOCs中第一大类是萜类，它们是由2个独立且细胞分区不同的甲基赤藓糖磷酸(methylerythritol phosphate , MEP)途径和甲羟戊酸(mevalonic acid , MVA)途径合成[32-34]。MEP途径位于质体中，包括7步酶促反应，从丙酮酸和甘油醛-3-磷酸(G3P)缩合开始，主要合成挥发性的异戊二烯、单萜和二萜[33-34]。最近研究表明：在金鱼草Antirrhinum majus花中，倍半萜类的生物合成由MEP途径单独完成[35]。MVA途径位于细胞质、过氧化物酶体和线粒体中，包括6种酶促反应，从乙酰辅酶A开始，主要合成挥发性的倍半萜和三萜[34]。MEP和MVA途径之间通过转运体连接，目前，这些转运体还有待进一步研究。植物VOCs的第二大类是苯丙类、苯类，主要分为苯丙烷类、苯类和苯丙类相关化合物[36]。它们的生物合成来自于莽草酸途径产生的苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)，苯丙烷类直接通过Phe合成，苯类和苯丙类相关化合物通过β氧化、非β氧化或者两者结合的方式合成[37]，合成苯丙烷类的基因和酶还需进一步探究。植物VOCs的第三大类是脂肪酸衍生物，包括GLVs和茉莉酸甲酯等，它们由C18不饱和脂肪酸通过脂氧合酶途径合成[38-39]。不饱和脂肪酸进行定向立体氧化形成C13和C9的氢过氧化物中间体，进而在裂解酶作用下形成GLVs，而C13中间体通过环化形成茉莉酸，进而形成茉莉酸甲酯[39]。
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大部分植物VOCs合成后储存并积累在不同的组织结构和细胞中，针叶树储存在导管、树脂管[40]或韧皮薄壁细胞簇[41]；被子植物储存在叶片油腺细胞或腺体[42]。在叶片中VOCs的存储方式有2种：第1种是指特异性储存的VOCs，包括萜类和非萜类化合物(主要是苯类化合物)，它们在叶片中达到较高含量，并且储存是永久性的；第2种是非特定储存的化合物，它们暂时以非常小的含量储存在叶片水相和脂相中，包括水溶性VOCs (如GLVs、丙酮、乙醛、甲醇和芳樟醇等)以及大多数疏水性单萜和倍半萜[43]。
植物几乎所有的器官都释放VOCs[44-45]。大部分VOCs释放发生在植物整个生命周期中，或者特定的发育阶段(如叶片成熟、衰老、花开放和果实成熟)[46]。其他VOCs释放在生物胁迫或非生物胁迫影响后诱导产生。胁迫引起的植物VOCs释放有2种：一种是立即释放，包括储存在特定结构(如针叶树的导管、薄荷Mentha canadensis的腺体等[40, 47])中VOCs的释放，释放原因与胁迫后VOCs的饱和蒸气压发生改变有关，这类VOCs包括单萜、倍半萜，它们在植物抵御胁迫中直接发挥作用或作为信号分子；另一种是很长时间后的释放，即诱导生物合成途径产生VOCs并释放，释放原因与胁迫后能量和碳底物再分配有关，诱导产生的VOCs包括GLVs及萜类等，它们在植物启动防御反应中发挥作用[22]。
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当植物受到食草昆虫破坏时，营养组织释放出VOCs[24-27]，NYKÄNEN等[48]对1980—2000年的数据分析指出：当食草昆虫啃食对植物造成损伤时，植物体内产生的VOCs会有一部分挥发性特别强。植物释放VOCs种类由植物和昆虫种类不同而异：螨虫Eriophyes mites感染椴树Tilia cordata、舞毒蛾Lymantria dispar取食夏栎Quercus robur以及桃蚜Myzus persicae侵害桃树Prunus persica后，单萜、倍半萜及GLVs释放增加[26−27, 49]。舞毒蛾幼虫取食冬青栎Quercus ilex后，茉莉酸甲酯释放增加[22]。白星花金龟侵害玉米Zea mays后，2-甲基丙醇、2-甲基丁醇和顺-3-己烯醇显著增加，它们的释放可能与储存结构中饱和蒸气压改变有关或依赖于生物合成中相关基因表达水平上调有关。而COPOLOVICI等[26]研究发现舞毒蛾取食夏栎后，异戊二烯释放量减少7倍多。
除了食草动物以外，真菌、细菌等病原体感染也会影响植物VOCs释放。锈菌Melampsora epitea侵染杂交柳树Salix burjatica× S. dasyclados后，异戊二烯释放减少，单萜中β-罗勒烯释放增加，总单萜释放量无明显变化，倍半萜和GLVs增加，侵染后6 d，VOCs释放量增加到未侵染时的6倍[28]。线虫Xiphinema index侵染葡萄Vitis vinifera后，β-罗勒烯和柠檬烯释放减少，α-法尼烯和α-佛手烯释放增加[50]。镰刀菌Fusarium spp.侵染小麦Triticum aestivum后，(Z)-3-己烯醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-己烯醇以及芳樟醇和香叶烯释放增加[51]。真菌、细菌等病原体侵染植物后，异戊二烯释放减少，倍半萜及GLVs释放增加。
此外，植物互作对VOCs释放的影响也有研究，但是相对较少[52−53]。桦树Betula verrucosa叶片接收邻近植物产生的VOCs信号并释放特定VOCs以防御食草动物[54]。受损叶片会启动或诱导同一植物的完整叶片或附近未受攻击的植物的防御反应，同一植物完整叶片及邻近植物VOCs释放增加[55−56]。
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光照是影响植物VOCs释放的重要环境因子，不同VOCs释放的光依赖性不同。异戊二烯、β-罗勒烯等组成型VOCs释放依赖于光照，光照强度增加，异戊二烯的释放速率增加，叶片迅速黑暗处理时，异戊二烯的释放量迅速下降至接近零[57]。GUENTHER等[58]研究发现植物释放异戊二烯对光照依赖性与电子传递密切相关。意大利五针松Pinus pinea释放β-罗勒烯依赖于光照[23]。百合Lilium brownii ‘Siberia’花花瓣中单萜的生物合成和释放受光照的影响，光照强度增加触发Ca2+进入细胞质，MEP途径下游单萜合成酶的基因表达被激活，从而调节单萜的生物合成和释放[59]。而储存在导管或油腺细胞中单萜释放不受光照的影响，光照和黑暗都释放，如α-蒎烯、D-柠檬烯[23]。诱导型VOCs释放随着光照增加而增加。番茄Lycopersicon esculentum伞形烯释放随着连续光照胁迫而增加[60]，这种化合物可能是由叶绿体中的光合碳形成，与储存在树脂导管中的其他单萜来源不同。
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CO2是进行光合作用的重要基础物质，CO2浓度影响植物VOCs释放。在较低CO2浓度下，针叶中边合成边释放的芳樟醇和β-法尼烯增加。CO2浓度升高，美洲黑杨Populus deltoides异戊二烯释放减少，这是由于高CO2浓度提高了光合作用，加速植物初级代谢物的积累，碳源更多的偏向初级代谢产物的合成[61]。CO2浓度增加，植物储存结构中VOCs释放增加[62]。CO2浓度升高，樟子松Pinus sylvestris幼树针叶中α-蒎烯释放增加[63]。在高CO2条件下的高光合碳促进柠檬烯的释放。而HUANG等[64]研究发现：CO2浓度改变，在挪威云杉Picea abies针叶中储存的单萜成分保持不变。CO2浓度过高，部分VOCs释放受到抑制。CO2质量浓度为700 mg·L−1时，冬青栎3种单萜合酶活性下降，导致α-蒎烯、β-蒎烯和桧烯释放受到一定程度抑制[65]。
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温度也是影响植物VOCs释放的重要因素。高温下，组成型VOCs释放降低。高温条件下，玉米中边合成边释放的单萜、倍半萜和酚类化合物降低[66]。温度高于45 ℃时，植物释放异戊二烯降低[15]。这是由于当温度高于最适温度时，初级代谢下调或受损，进入MEP途径的光合代谢物供应不足，萜类合成受到抑制。而高温条件，储存型和诱导型VOCs释放增加。随温度升高，挪威云杉单萜和倍半萜释放量增加。温度升高，桉树α-蒎烯释放增加[58]。温度高于45 ℃时，植物释放单萜和GLVs增加[15]。这是由于温度影响植物存储结构中VOCs的饱和蒸汽压，而高温诱导合成途径产生新的VOCs。叶肉细胞中具有临时池可储存一些VOCs，这些VOCs是在浓度驱动下释放，受到气孔导度的限制，高温会影响气孔导度的开合进而影响临时池中VOCs的释放[44]。
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水分是植物生长所必需的因素，水分缺失影响植物VOCs释放。干旱诱导桦树Betula pendula GLVs大量释放，干旱胁迫前2 d，α-蒎烯和桧烯释放增加。干旱胁迫夏栎和黑樱桃Prunus serotina，异戊二烯和水杨酸甲酯释放增加[67]。PARVEEN等[68]研究发现：短期干旱胁迫后，异戊二烯释放增加是因为转录后调控异戊二烯合酶活性影响异戊二烯释放。轻度干旱胁迫下，植物可通过生理调节而不影响植物VOCs的释放；中度干旱胁迫下，植物为了保护细胞抵抗干旱胁迫将更多碳底物分配给VOCs合成，VOCs释放增加；重度干旱胁迫，植物细胞受损，VOCs释放减少[68]，如在严重干旱胁迫下，由于缺乏碳底物和(或)ATP，限制冬青栎单萜的合成，复水后，释放立即恢复，但释放水平低于正常水平[69]。
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机械损伤代表植物受到伤害的临界胁迫，也会影响植物VOCs的释放。机械损伤的植物叶片，储存型VOCs和诱导型VOCs释放增加。通过机械损伤模拟食草动物伤害的研究表明：械损伤后GLVs和单萜释放增加[70]。无论是光照还是黑暗下，机械损伤的针叶导管中单萜类大量释放，主要是柠檬烯和α-蒎烯[23]。FEDERICO等[20]研究发现：机械损伤后GLVs释放瞬时大量增加。HU等[59]研究发现：机械损伤后，杂交杨树Populus simonii×P. pyramidalis释放醛类显著增强，随着时间的变化，这些醛类释放出现2个峰。机械损伤后，植物释放1,8-桉树脑、α-蒎烯和对伞花烃等储存在油细胞中的VOCs、以及(Z)-3-乙酸己烯酯、(E)-2-己烯醛和(Z)-3-己烯-1-醇等诱导产生的VOCs[71]。ASAI等[72]研究发现：机械损伤后，不同柑橘Citrus reticulata损伤叶片都诱导了α-法尼烯释放。
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生物因素对植物VOCs的释放不尽相同。病原体感染与食草动物取食后，同一植物释放VOCs种类差异明显。桦树被食草动物取食后，释放VOCs种类有罗勒烯、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯(DMNT)、芳樟醇和茉莉酸甲酯，而真菌感染后，释放VOCs种类只有罗勒烯和芳樟醇[73]。花生Arachis hypogaea被食草动物取食后仅诱导DMNT，而病原体感染后，VOCs释放种类包括DMNT和水杨酸甲酯[74]。玉米被真菌感染使仅由鳞翅目Lepidoptera昆虫诱导的VOCs释放降低了约50%[75]。
非生物胁迫交互作用中，高温和干旱是夏季影响植物VOCs的主要因素，两者交互作用下，植物VOCs释放增加。刺槐Robinia pseudoacacia异戊二烯释放量增加6~8倍，产生的碳损失相当于同化碳的12%~20%[16]。STAUDT等[17]研究表明：高温和干旱复合胁迫短叶栎Q. pubescens和冬青栎释放异戊二烯增加。在25和35 ℃进行干旱胁迫时，黑杨Populus nigra 释放异戊二烯只有在干旱时间延长时减少，这表明在中度干旱胁迫以及2种温度下，黑杨释放异戊二烯在转录或转录后水平上受到更严格的控制[18]。此外，臭氧与其他胁迫交互作用时，植物VOCs释放受臭氧影响更为明显。不同胁迫下植物释放VOCs随臭氧剂量的变化而变化[30]。干旱与低CO2浓度交互作用时，薄荷中单萜浓度保持相对恒定[76]。
生物与非生物胁迫交互作用下，植物VOCs释放增强。在较高光照强度下受病原体感染的小麦释放VOCs成倍增加[51]。涝害胁迫与病原体感染交互作用时，在一定范围内随着湿度增加，受感染小麦释放VOCs增加[77]。涝害胁迫与食草动物取食交互作用时，蚕豆Vicia faba VOCs释放增加，并吸引了食草动物卵的寄生虫[78]。干旱与昆虫取食交互作用时，欧洲桤木Alnus glutinosa GLVs和单萜释放更强且更早达到最大值，并诱导水杨酸甲酯释放，这表明干旱和草食动物联合胁迫下植物对草食动物的抗性更强[79]。臭氧与机械损伤交互作用时，桉树叶片释放组成性VOCs (异戊二烯)增加，释放诱导型VOCs (LOX产物、萜类和苯类)增加，进一步说明了交互作用在诱导型VOCs释放响应中的重要作用[31]。
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植物通过释放有毒、趋避、反营养的VOCs，防御食草动物和病原体，是一种自我保护。在棉花Gossypium hirsutum中，杜松烯的衍生物棉酚可防御病虫害，体外实验中，发现大量挥发性萜类具有抗微生物的活性[80]。β-石竹烯在拟南芥Arabidopsis thaliana防御病原菌中起到重要作用[81]。除此之外，植物释放VOCs能吸引食草动物的天敌，如寄生蜂Parasitoid wasp或捕食性螨Phytoseiulus persimilis，保护信号植物免受进一步伤害[82]。1980年，PRICE等[83]首次提出植物-昆虫-天敌的三级营养关系，随后DICKE[84]系统地研究并确定了植食性昆虫诱导的植物挥发物(herbivore-induced plant volatiles，HIPVs)在三级营养关系中的信号功能。植物叶片上的昆虫卵可诱导植物释放HIPVs，吸引寄生蜂，保护植物免受其他昆虫伤害。植物释放萜烯具有很强的特异性，过表达萜烯合成酶的转基因植物在三级营养关系中具有相关作用[85]，水稻Oryza sativa中，芳樟醇和β-石竹烯的合成酶不表达时，会引起特定昆虫的聚集，而水稻合成并释放芳樟醇和β-石竹烯能吸引昆虫的捕食者，这突出了植物VOCs在决定昆虫群落结构中的重要性[86]。
VOCs信号在植物间的传递有4个步骤：当食草动物攻击植物后，植物受损组织释放信号、信号传输、同一或邻近植物接收信号并做出相应防御反应。早在1983年已经发现植物受损组织释放VOCs可能刺激邻近植物发生变化，影响植食性昆虫摄食[87]，二斑叶螨Tetranychus urticae攻击植物后，植物释放VOCs可吸引捕食性螨，VOCs作为线索被邻近植物接收，使邻近植物对斑叶螨敏感性降低[88]。食草动物攻击植物，既可诱导局部受损组织释放VOCs，也可诱导系统性未受损组织释放VOCs，并且释放呈现不同的时间模式[89]。烟草Nicotiana tabacum只在夜间释放几种由食草动物诱导的VOCs，它们能击退在夜间寻找产卵的烟芽夜蛾Heliothis virescens[90]。植物释放的VOCs对邻近竞争性植物的萌发、生长和发育能起到化感作用[91]。在自然界中，植物面对许多不同的线索和信号，可以影响或改变植物VOCs生理特征，从而改变它们与邻近植物的相互作用。
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VOCs在植物抵御非生物胁迫中也有重要的作用。植物释放异戊二烯使其具有较高的耐热性[14-15]，红栎Quercus rubra和葛Pueraria lobata叶片用膦胺霉素处理后，短暂高温胁迫光合作用受到抑制，再用外源异戊二烯熏蒸后，光合作用有一定程度的恢复[92]，挥发性萜类可保护植物光合器官和光合作用，从而增强植物在高温下的耐热性[93]，膦胺霉素抑制冬青栎叶片单萜合成，冬青栎叶片光合耐热性下降，而单萜熏蒸后，冬青栎叶片耐热性部分恢复[94]。VOCs也具有抗氧化作用，在强光、高温和严重干旱下，植物释放的异戊二烯可抵御光氧化胁迫[19]，在受氧化应激的植物中，异戊二烯可淬灭氮活性物质，也可以作为信使分子发挥重要作用[95]，植物异戊二烯的生物合成受到抑制后，光合作用下降、活性氧积累并且细胞膜迅速过氧化，表明异戊二烯可保护叶片免受氧化损伤，当膦胺霉素抑制植物单萜类合成时，冬青栎对臭氧很敏感；释放异戊二烯的转基因烟草比非释放异戊二烯的野生型烟草对臭氧毒性更具有抗性[96]。
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在过去的几十年里，国内外对植物VOCs生物合成、储存、释放和功能等方面研究较多，并在植物适应环境与生物防御和抵抗非生物胁迫的生理生态中的作用等方面取得了重要进展。但是，目前对植物VOCs生物合成和释放的分子调控机制研究较少，复合环境因子交互作用对植物VOCs释放及其影响机制等方面研究还处于初步探索阶段。随着全球气温升高，大气CO2浓度升高，以及极端天气的频发，研究多种环境因子对VOCs释放的影响，有助于进一步探究植物-环境间相互作用和植物VOCs的释放变化如何影响环境，进而为保护环境提供新的思路。
Roles of volatile organic compounds in plant adaptation to stress and physiological ecology
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摘要: 挥发性有机化合物(volatile organic compounds，VOCs)是具有低分子量和高蒸气压的亲脂性液体。按来源划分，VOCs可分为人为源和植物源，而植物源是全球大气中VOCs的最大来源。植物VOCs释放受生物和非生物因素影响，它们在大气化学反应、人体健康和植物生理生态中具有重要作用。然而，对于植物VOCs释放受复合环境条件的影响及在生理生态方面的作用尚缺乏全面了解。本研究概述了植物VOCs的合成途径，重点阐述了单一及复合环境因素对VOCs种类及释放量的影响，同时归纳了VOCs在生理生态方面的作用。发现：植物VOCs合成途径已经明确，但其调控的分子机制有待进一步探究。昆虫啃食、高温、干旱、高二氧化碳浓度可降低组成型VOCs (如异戊二烯)释放，增加储存型VOCs (如蒎烯、柠檬烯)释放，同时诱导新的化合物(如绿叶挥发物, GLVs)合成并释放；复合环境对VOCs释放影响是复杂的，有待进一步探索。VOCs在植物防御食草动物或吸引食草动物天敌、介导植物间信号转导、抗氧化、抗旱和增强植物耐热性等方面发挥作用，未来将探究植物VOCs在生态系统中的更多作用。参96Abstract: Volatile organic compounds (VOCs) are lipophilic liquids with low molecular weight and high vapor pressure. According to the source, VOCs can be divided into anthropogenic sources and plant sources, and plant sources are the largest source of VOCs in the global atmosphere. VOCs release from plants is obviously affected by biological and abiotic factors, which play an important role in atmospheric chemical reactions, human health and plant physiology and ecology. However, the effects of complex environmental conditions on VOCs release from plants and their physiological and ecological roles are still not fully understood. In this paper, the synthesis pathways of VOCs in plants are summarized, the effects of single and compound environmental factors on VOCs species and release amount are emphasized, and the role of VOCs in physiology and ecology is summarized. In conclusion, the synthesis pathway of VOCs in plants has been clarified, but the molecular mechanism of VOCs regulation needs to be further explored. Insect feeding, high temperature, drought and high CO2 concentration can reduce the release of constituent VOCs (such as isoprene), increase the release of storage VOCs (such as pinene and limonene), and induce the synthesis and release of new compounds (such as GLVs). However, the effects of complex environment on VOCs release are complex and need to be further explored. VOCs play a role in plant defense against herbivores or attracting herbivores’ natural enemies, mediating interplant signal transduction, anti-oxidation, drought resistance and enhancing plant heat resistance, etc. It is predicted that more roles of plant VOCs in ecosystem will be explored in the future. [Ch, 96 ref.]
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Key words:
- plant /
- VOCs /
- biosynthesis /
- biotic factors /
- abiotic factors /
- review
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山麦冬Liriope spicata为百合科Liliaceae多年生草本植物，在园林绿化中多栽培于林下或林缘半阴处，掩饰裸露土壤，起到补充绿地改善不良景观的作用。山麦冬属Liriope植物只有8种，中国栽培6种，其中包含3个特有种，但山麦冬属植物分布广泛，除极寒地区及高海拔地区外，中国各省均有分布，其地理分布受人为栽培引种因素影响很大，没有特定的地理分布规律[1]。山麦冬成熟时果实表皮由绿转黑，9月结果后观果时期可长达整个冬季，且其花葶较长多矗立于叶子的上方，易于观察，具有很高的园林应用价值。目前，针对山麦冬成熟过程中呈色物质及调控基因尚未报道，但花青素合成途径在植物中是保守的，合成途径中上游合成基因是决定植物组织能否积累花青素的关键[2]，而下游修饰基因的表达常与花青素的积累一致，是加深果色花色的关键基因[3-5]。此外，花青素的积累还受转录因子的调控，其中以MYB转录因子与bHLH转录因子最为常见[6]。
用于基因表达定量分析的方法比较多，其中实时荧光定量PCR(RT-qPCR)由于定量准确、成本低且高通量，被广泛应用于基因表达水平研究。但其结果常受RNA质量、反转录效率、引物特异性、初始样品量及扩增效率等因素的影响[7-8]，需要引入1个或多个表达稳定的内参基因(reference genes, RGs)来评估目的基因的相对表达[9]。在植物学研究中，曾以肌动蛋白(actin，ACT)[10-12]、组蛋白(histone)[11]、蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PP2A)[13]、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)[12]、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme, UBC)[14-15]以及18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA，18S)[16]等基因作为内参基因。但是常见的内参基因也并非适用于任何研究，且目前还未见山麦冬内参基因的报道。鉴于此，本研究基于山麦冬转录组数据，对山麦冬果实发育中稳定表达的内参基因进行研究，为提高果色转变关键基因RT-qPCR分析的准确性提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
在浙江农林大学资源圃，选取生长环境相同，且植株生长状况良好、长势整齐的山麦冬，随机均匀采集15~20株山麦冬植株的各一簇花葶的上、中、下部分果实，基于山麦冬果实生长特性，采集山麦冬幼果期(2020年9月)及成熟期(2020年11月) 2个时期样品，果实从花葶中取下后立即存于−80 ℃冰箱备用。设置3次生物学重复。
1.2 总RNA提取及cDNA合成
使用天根离心柱型RNA试剂盒(天根生物科技有限公司)从每个时期样本中提取总RNA。采用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。总RNA的纯度和质量浓度采用NanoDrop ONE微量核酸蛋白浓度测定仪(Therm，美国)测定。总RNA样本质量浓度均高于4×10−5 ng·L−1以上，总RNA纯度[D(260)/D(280)]为1.9~2.1。cDNA的合成使用PrimerScript™ RT Master Mix cDNA (Perfect Real Time)反转录试剂盒，所有样本总RNA加入量按照3×10−5 ng·L−1稀释至同一质量浓度，cDNA置于−20 ℃冰箱保存。
1.3 候选内参基因的筛选及RT-qRCR
基于已获得的山麦冬转录组数据及京都基因与基因组百科全书(KEGG)注释，筛选了多条通路的基因作为内参基因参考库，包括参与山麦冬果实运输和分解代谢的基因(SLC36等)，参与代谢过程的基因(PP2C、MGL、PDP、G6PD等)，参与信号传导与转运的基因(AUX、GPR107、CNNM等)，参与细胞过程的基因(CFL等)，参与植物免疫的基因(Trx等)，参与遗传信息处理的基因(UGT、PP2A、EF1-α等)共1 648个，参考前人对内参基因的筛选阈值稍作修改后[11-13]，以每千个碱基转录每百万映射读取的片段(FPKM)高于5的基因(低表达的难以检测)、变异系数＜0.1、变化倍数＜0.2为筛选条件，得到前15个候选内参基因(表1)。
表 1 山麦冬15个候选的内参基因Table 1 15 candidate reference genes of L. spicata基因名 基因注释 变异
系数变化
倍数基因名 基因注释 变异
系数变化
倍数SLC36 solute carrier family 36 0.003 0.001 CFL cofilin 0.061 0.178 PP2C protein phosphatase 2C 0.007 0.019 UGT UDP-glucose: glycoprotein glucosyltransferase 0.064 0.184 Trx-1 thioredoxin 0.037 0.107 PP2A protein phosphatase 2A 0.064 0.185 MGL monoacylglycerol Lipase 0.043 0.123 EF1-α elongation factor 1-alpha 0.067 0.193 AUX auxin influx carrier 0.050 0.144 G6PD-1 glucose-6-phosphate dehydrogenase 0.068 0.197 GPR107 G protein-coupled receptor 107 0.056 0.161 G6PD-2 glucose-6-phosphate dehydrogenase 0.045 0.130 PDP pyruvate dehydrogenase phosphatase 0.058 0.169 Trx-2 thioredoxin 1 0.065 0.186 CNNM cation transport mediators 0.061 0.177 根据转录组获得的核酸序列信息，利用primer 5软件设计引物，并交由杭州有康生物技术有限公司合成(表2)。利用TB Green染料(Takara)预反应，体积20 μL，并使用LightCycler® 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(罗氏，瑞士)进行RT-qPCR。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s；60 ℃退火延伸30 s，40个循环。实验设置3次生物学重复。扩增效率(cDNA稀释浓度梯度为5−1、5−2、5−3、5−4、5−5)计算公式为E=[10(−1/K)–1]×100%，其中：E为扩增效率，K为斜率。15个候选内参基因的扩增效率为91.7%~108.0%(表2)。
表 2 15个候选内参基因的引物序列和扩增子特征Table 2 Primer sequences and amplicon characteristics of 15 candidate reference genes基因名 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 产物长度/bp 扩增效率/% 相关系数 SLC36 GTAAGTTTCGCCGAGTGCTT ACTGCAGTAGCAGACCAGTT 148 91.7 0.982 PP2C TGGGCCATGATGTTCCAGAT AGTACACGCAGTCTTCACCT 77 94.8 0.999 Trx-1 TTGTTGGCACCCACAAGTTT CATTCGTGCCACTCCAACAT 72 102.0 0.999 MGL AATGCCTTCACTGGAACAGC GCCGCCAAGTGAGTAAACAA 138 101.0 0.994 AUX TGCAGAGAAACCACCCTTCT CCGAATCCAAATCCGACCAC 99 91.7 0.949 GPR107 ACAGGTGATTGCGAACATCG CTTCGACGTCTCCTTCAACG 166 105.0 0.906 PDP GACGGAGGTCGGTTGGATTT CTGCACATGCATCATCACGA 124 96.2 0.976 CNNM GCTGCACTAACTCCAGCTTC GGCACAACTGTGGTCAACAT 86 96.8 0.999 CFL CGAGGAGAACTGCCAGAAGA GTTGGATCGGTCGCTTGTAG 153 107.0 0.992 UGT TGGAAGCATCCTCACTTGACT TGTCTTCAAATTAGGGTTAGCGA 83 93.5 0.994 PP2A GAGTCGGAGAGGTCGAAGAG GCGGAGCAATTCCTACCATC 121 99.2 0.975 EF1-α CAAGCGTCCCACTGACAAG CCAGGCTTGAGGATACCAGT 111 101.0 0.998 G6PD-1 GATGCAACAGGCCAGAAGAG AGTGCAAACAGTGCAGGAAA 104 97.9 0.996 G6PD-2 ATAACGTTGCCCTCTCCACA ATCCAACTGCAATCCAAGCC 107 108.0 0.999 Trx-2 GTGGTGCACCGTCAGTAAAC CGCTGTGGTTGATGTCTCTG 113 96.0 0.992 1.4 内参基因的稳定性分析及验证
通过4种方法分析内参基因的稳定性：ΔCt值法[17]、geNorm[18]、NormFinder[19]和BestKeeper[20]。利用Excel 2010计算4种方法对候选内参基因几何平均数的排名，综合筛选最适的内参基因。同时根据前期转录组数据筛选了10种目的基因，涵盖花青素合成通路上下游基因以及调控基因。这10种基因在转录组数据加权共表达分析中属于中枢基因，表达量高、与花青素相关性强，且在果实成熟过程中显著上调。目的基因包括C4H、CHS、MT、UFGT、MYB、bHLH，上述基因引物序列及扩增子特征见表3，最后利用SPSS 19.0与Graphpad Prism 8.0分析及作图。
表 3 10个目的基因的引物序列和扩增子特征Table 3 Primer sequences and amplicon characteristics of 10 target genes基因名 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 产物长度/bp 扩增效率/% 相关系数 C4H TCTTTGATCACGGCTTGCAG ATGAGATCGACACCGTCCTC 88 109.0 0.992 CHS-1 TGCATTGCACCAGTAGTAGC GCCCTCCTGATCTCCTCAAC 122 104.0 0.995 CHS-2 TTGTTGGCACCCACAAGTTT CATTCGTGCCACTCCAACAT 82 91.7 0.997 MT CCACCGAGAGCAAGAACAAC GGGTACACACTGGTCTCCAA 112 96.2 0.999 UFGT-1 AGCAAGGTGTTGAAGGAGGA AAATTCCGAACCGAGCTTCC 110 91.7 0.935 UFGT-2 CGACGGATCCCATTCGACTA CGCCGCTCCTCCTATTAAC 57 92.9 0.996 MYB-1 GCAAGATCAGGTCCTCCTCA CAAAGTACGTGGCGAAGGAG 162 107.0 0.975 MYB-2 ATGGGAAGATGGTGGCCTTT GAAGGGTGCACAGCTTCAG 70 91.7 0.986 MYB-3 CGAGGAGAACTGCCAGAAGA GGTGCTTGTTGAGAGAGCTG 172 105.0 0.996 bHLH TGCTTAGCAATGGCAACAGG GGCTGCTGACCAGAAGATTG 123 101.0 0.998 2. 结果与分析
2.1 山麦冬候选内参基因的表达量分析
15个候选内参基因的溶解曲线均为单一峰(图1)，琼脂糖凝胶电泳检测后出现与预期大小一致的单一条带(图2)。该结果表明引物具有良好的特异性。
图 2 15个候选内参基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Figure 2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of the fifteen reference genes根据原始循环阈值(Ct)分布发现：所有候选内参基因的Ct为15.53~28.81，Ct越高，基因的表达量越低，反之表达量越高。本研究中，EF1-α基因表达量最高，PP2C基因表达量最低，其余基因表达量介于两者之间。此外，由箱线图(图3)跨度可初步判定内参基因的稳定性。PP2C、Trx-1、AUX、PP2A、PDP基因的Ct跨度广，不稳定，而GPR107、CNNM、EF1-α、G6PD-2、Trx-2基因最为稳定，其中GPR107、CNNM、G6PD-2基因的Ct中位数与平均数接近，即上述基因相对表达量离散程度低，表达更稳定。然而对原始Ct分析内参基因稳定性的不足，还需引入其他的方法。
2.2 内参基因的稳定性分析
利用ΔCt法、geNorm、NormFider和BestKeeper对15个候选内参基因的稳定性进行分析(表4)。
表 4 4种方法评价15个候选内参基因表达的稳定性Table 4 Expression stability of 15 candidate reference genes evaluated by 4 methods内参基因 ΔCt geNrom NormFinder Beatkeeper 标准差 基因平均表达值 基因稳定值 标准差 变异系数 相关系数 SLC36 2.632 0.854 0.173 0.569 2.523 0.671 PP2C 2.321 0.927 0.416 0.828 3.070 0.824 Trx-1 2.663 1.130 0.510 0.852 3.964 0.832 MGL 2.673 1.007 0.493 0.885 3.918 0.918 AUX 2.652 1.094 0.598 1.063 4.430 0.882 GPR107 2.617 0.817 0.167 0.489 2.253 0.728 PDP 2.737 1.390 0.831 0.642 2.571 0.462 CNNM 2.615 0.847 0.157 0.468 2.015 0.721 CFL 2.274 1.094 0.346 0.532 3.038 0.781 UGT 2.613 0.923 0.237 0.517 2.418 0.651 PP2A 2.693 1.054 0.568 1.057 4.671 0.511 EF1-α 2.127 0.895 0.286 0.393 2.347 0.687 G6PD-1 2.763 1.204 0.692 0.469 2.065 0.009 G6PD-2 2.636 0.880 0.334 0.290 1.323 0.750 Trx-2 2.663 0.989 0.465 0.417 1.790 0.487 ΔCt法是在原始Ct值的基础上，计算每个基因所有样本与其他基因的Ct值之差，并计算其标准差。一般平均标准差越低，基因稳定性越高。该方法中，EF1-α、PP2C、CFL、CNNM是山麦冬果实发育阶段最稳定的内参基因；PDP、G6PD-1、PP2A是最不稳定的内参基因。
geNorm软件通过平均表达值来描述候选内参基因的稳定性，同时还能计算归一化因子之间的两两变异(Vn/n+1，其中n为可使RT-qPCR结果准确的最少基因数目)。该方法中，所有基因的平均表达值都在1.5以下(稳定内参基因的临界值)，即该方法判定下的所有基因都可作为内参基因，其中GPR107(0.817)与CNNM(0.847)基因的平均表达值最低，说明最稳定。同时PDP、G6PD-1基因的平均表达值最高，分别为1.390、1.204，最不稳定，这与ΔCt法判定结果一致。此外，利用geNorm计算2个归一化基因的Vn/n+1，确定适合量化果实生长过程的最优内参基因数目。geNorm首先计算2个最稳定的候选内参基因的归一化因子值，然后将剩余候选内参基因按其表达稳定性下降的顺序依次相加。如果基因之间的Vn/n+1大于或等于0.15，则进行RT-qPCR分析时应该再添加1个基因才能达到可靠的结果，一旦Vn/n+1低于0.15，就不需要添加额外的基因[21]。由图4可见：从V4/5开始Vn/n+1小于0.15，即需要使用4个内参基因才能得到可靠的RT-qPCR结果。
图 4 精确归一化的最佳内参基因数量Figure 4 Optimal number of control genes for accurate normalizationNormFinder软件可分析候选内参基因的两两变异性，其中稳定值越小，候选内参基因越稳定。CNNM与GPR107基因的稳定值最小，分别为0.157、0.167，即CNNM与GPR107基因最稳定，这与geNorm分析结果一致；此外，对最差的内参基因评价也与上述2种方法一致：PDP、G6PD-1、AUX是量化果实发育阶段最不适合的内参基因。
Bestkeeper与geNorm、NormFinder软件不同，需导入原始Ct值平均数，计算候选内参基因在所有样品中的标准差、变异系数、相关系数。一般地，稳定的内参基因拥有低的标准差、变异系数及高的相关系数。在Bestkeeper评价中，与geNorm、NormFinder分析结果一致，CNNM与PDP基因分别还是最稳定与最不稳定的内参基因。除此之外，还发现G6PD-2为该方法中最稳定的内参基因，其标准差与变异系数最低，分别为0.290、1.323，相关系数为0.750。
最后通过几何平均数对这4种方法的分析结果进行综合性排序(表5)。根据表5的排名与geNorm推荐的内参基因数目，筛选CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2作为标准化山麦冬果实RT-qPCR的最优内参组合，PDP为最差内参基因，通过4种算法得出的结果也与最初候选内参基因原始Ct值分布箱线图分析结果一致。
表 5 15个候选内参基因的综合排名Table 5 Comprehensive ranking of reference genes for normalization基因名 几何平均数 排名 基因名 几何平均数 排名 CNNM 2.340 1 PP2C 6.557 9 GPR107 2.913 2 MGL 8.572 10 EF1-α 3.162 3 AUX 10.602 11 G6PD-2 3.722 4 Trx-1 11.199 12 SLC36 5.350 5 G6PD-1 11.977 13 UGT 5.826 6 PP2A 12.368 14 CFL 5.925 7 PDP 14.491 15 Trx-2 6.160 8 2.3 内参基因稳定性的验证
为验证内参基因的有效性，选择10种花青素合成结构基因与调控基因作为目的基因。用单一内参基因：最优内参(CNNM)、最差内参(PDP)，及2种内参组合：排名前2位的内参基因(CNNM、GPR107)和排名前4位的内参基因(CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2)进行归一化。从图5可见：在山麦冬果实花青素合成过程中，使用4种内参方式归一化时，所有的目的基因都上调表达，但变化倍数稍有不同。在山麦冬果实成熟期，使用PDP基因作为内参时，所有目的基因相对表达量均显著高于其他3类，特别是对转录因子bHLH基因的量化时产生严重偏差，使用PDP基因与CNNM+GPR107+EF1-α+G6PD-2基因组合作为内参，bHLH基因的相对表达量分别为6.28与15.70，两者差异高达2.5倍。然而，当使用最优内参基因CNNM进行标准化时，除UFGT基因外，CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2内参组合无显著差异，使用CNNM基因标准化时，UFGT相较幼果期上调表达50.71倍，使用4种内参组合时，UFGT上调72.49倍。此外，本研究还分析了候选内参排名前2位的基因(CNNM、GPR107)作为目的基因的表达量，发现选用2种内参基因与geNorm软件推荐使用4种内参基因，在10个目的基因中均无显著差异。
图 5 不同内参基因归一化后10个目的基因的相对表达量Figure 5 Relative expression levels of ten target genes after normalized by different reference genes从图6可见：利用最差内参PDP得到的目的基因表达量与4种内参基因组合得到的目的基因表达量相关系数为0.868 6 (P＜0.01)，当使用最优基因CNNM作为内参时，与4种内参组合相关系数可达0.991 6 (P＜0.01)。对2种内参组合与geNorm推荐的4个数目内参组合比较发现：通过这2种方法标准化得到的目的基因相关性可达0.999 9 (P＜0.01)，即仅使用CNNM、GPR107基因作为双内参也可达到geNorm软件推荐的4个内参数目组合的效果。
图 6 不同内参基因标准化后10种目的基因表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis for relative expression levels of ten target genes after normalized by different reference genes3. 讨论
山麦冬作为一种优良的地被园林植物及药用植物，研究多集中于提高栽培技术及块茎产量，而针对园林观赏应用的研究较少。在本研究之前没有山麦冬内参的研究报道，作为沿阶草族植物，其近源种也仅有麦冬Ophiopogon japonicus抗逆性研究中曾以微管蛋白基因(tubulin)[22]及Actin [23]作为参考基因。但这2类基因在前期转录组筛选中由于变异系数及变化倍数在候选内参中就已经被排除。本研究根据几何平均数的综合排名，推荐使用内参基因CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2作为研究山麦冬花青素合成的最优内参组合。EF1-α、G6PD-2属于常见的内参基因，在植物生长发育、抗逆反应、代谢合成中已被广泛应用[24-25]。基于前期转录组数据，新型内参基因CNNM、GPR107也可作为RT-qPCR分析的内参基因，CNNM编码过渡金属转运蛋白，可参与多种金属吸收、排除及区分化[26]，GPR107编码G蛋白偶联受体107，广泛存在于细胞表面的膜蛋白，可参与植物体多种细胞信号转导及调控机制保守[27]。上述2种基因在山麦冬果实中表达稳定，其相对表达量平均值与中位数相近，离散程度低，且表达量适中，符合内参基因的标准。在观赏植物中，由于新型内参基因稳定性强于传统内参基因，常被选用标准化目的基因的表达。例如，在异型花柱连翘Forsythia suspensa中，转录组中变化微小的未知基因是研究花开放最适合的内参基因[28]；太行花Taihangia rupestris花器官有复杂的性别决定机制，鉴定两性花与雄性花的内参基因是编码铁硫簇组装蛋白、3-巯基丙酮酸硫转移酶与跨膜蛋白50的新型内参基因[11]。SmDnaJ基因在旱柳Salix matsudana各种非生物胁迫下表达最为稳定[29]。bHLH在观赏百合Lilium oriental×Trumpet hybrid体胚诱导、体胚发育中表达最稳定[30]，但bHLH是植物颜色育种中的重要靶基因，并不适合作为本研究的内参基因候选，这也证实了不同目标性状需采用不同的内参基因，没有一种内参基因是普适的。
花青素合成路径在植物中是保守的，其中MYB转录因子与bHLH转录因子可形成二元复合体，激活花青素合成酶基因[31-32]。大量研究表明：MYB、bHLH转录因子基因与花青素合成酶基因在紫色系植物组织发育过程中协同上调[3, 33-34]。为验证内参基因的结果，挑选了10个在山麦冬花青素合成调控网络的中枢基因(相关性强且表达量高)作为验证，其中包括转录因子与结构基因(C4H、CHS、MT、UFGT、MYB、bHLH)，这10种基因在4种归一化方法下表达模式均显著上调，但趋势稍有不同，选用较差内参PDP标准化结果偏差最大，在山麦冬成熟黑果中所有基因都显著高于其他基因。尽管最优内参基因CNNM对目的基因的归一化可以达到与4种内参组合很高的相关系数，但对UFGT基因的量化存在显著差异，而UFGT基因作为花青素合成通路的下游修饰，对花青素积累至关重要，特别是在山麦冬这类组织颜色深即富含花青素的类型[2, 35]，例如在葡萄Vitis vinifera果皮[36]、玫瑰Rosa rugosa [37]、紫皮石刁柏Asparagus officinalis[33]中UFGT都被验证为关键基因，因此仅选用单一基因作为研究山麦冬果皮花青素积累的内参是不合适的，继而在CNNM基因基础上又引入GPR107来规避单内参基因的误差，该内参组合与geNorm推荐的内参组合相关系数最高，在10种目的基因的验证结果中与4种内参组合均无显著差异，且选用双内参组合比4种内参组合可操作性强，因此判定使用CNNM、GPR107作为双内参即可得到可靠的RT-qPCR结果。双内参组合联合使用可以减少实验因素对基因表达的影响，且结果更为准确。暴露于UV-B辐射下的番茄Lycopersicon esculentum幼苗不同组织都应选用特定的内参组合，例如叶中选用肌动蛋白基因与微管蛋白基因，而根中选用微管蛋白与UV-B抗性位点基因更加适合[38]；UBQ和EF1-α基因由于表达稳定，可作为内参基因用于鹅掌草Anemone flaccida各器官的不同发育阶段[39]。
4. 结论
本研究基于转录组数据筛选了15个候选内参基因，分析其在山麦冬果实不同时期的表达稳定性。经过10种目的基因验证后，表明以CNNM、GPR107基因作为组合是山麦冬果实花青素生物合成研究的最佳内参基因，而常用的内参基因却并不适用于本研究，这为筛选新型内参基因提供了新思路。
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