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花榈木Ormosia henryi为豆科Leguminosae红豆属Ormosia重要木本药用植物，主要产于东南亚和南美洲，属于国家二级保护植物，在野外处于中度濒危状态[1]。花榈木常以根、根皮及茎、叶入药。《全国中草药汇编》记述，其性味归经为辛、温，有毒，具有活血化瘀、祛风、消肿之功。研究发现：红豆属植物含有生物碱、黄酮、苯丙素、萜类和挥发油等多种化学成分，其中萜类化合物是一类重要的活性物质[2]。迄今为止，已从红豆属不同植物中发现大量的萜类化合物，如丁香酚、苯乙醇、榄香素和棕榈酸等化合物，并发现多种物质具有消炎、抗氧化、抗菌的作用[3−4]。萜类物质是多种药用植物的主要活性化合物，并且是天然化合物中规模最大种类最多的一类物质[5−6]，了解花榈木中萜类物质能够提高对花榈木的药用认知。
植物萜类化合物主要由甲基赤藓糖磷酸酯 (MEP) 途径或甲羟戊酸 (MVA) 途径产生的二甲基烯丙基二磷酸酯 (DMAPP) 和异戊烯基二磷酸酯 (IPP) 生成[7]。萜类化合物分子骨架是基于异戊二烯或其异构体二甲基烯丙基焦磷酸C5单元构成的，根据骨架碳链长度的不同，主要分为半萜、单萜、二萜、三萜等几种类型的萜类化合物[8]。MEP途径仅发生在质体中，MVA途径却分布在细胞质、内质网和过氧化物酶体之间[9]。IPP与DMAPP通过戊烯基转移酶的催化，缩合产生萜类化合物前体物质香叶酰二磷酸 (GPP)、法呢基二磷酸 (FPP) 和香叶基香叶基焦磷酸 (GGPP)。其中GPP是合成单萜类化合物前体物质，GGPP是合成二萜前体物质，FPP则是合成倍半萜和三萜化合物的前体物质[10−11]。随后通过萜类合成酶 (TPS) 和氧角鲨烯环化酶 (OSCs) 催化前体形成不同种萜类化合物，这2种酶的多样性使得萜类化合物的种类有很多[12−13]。
TPS基因家族主要分为7个亚家族，分别命名为TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g 和 TPS-h。其中TPS-a、TPS-b和TPS-g属于被子植物特有分支，这3个分支完全由专门的单萜、倍半萜或二萜生物合成基因组成，主要在植物生态相互作用中起作用。TPS-d是裸子植物特异性亚家族，主要包含特异性代谢的裸子植物TPSs[14]。TPS-c和TPS-e/f是被子植物与裸子植物所共有的亚家族，TPS-c分支成员只包含“DXDD”序类，是单功能柯巴基焦磷酸合酶 (CPS)。与TPS-c类似，TPS-e/f分支成员只包含“DDXXD”序类，是单功能的贝壳杉烯合成酶 (KS)[15−16]。植物OSC家族是一个超基因家族，主要包含达玛烯二醇合成酶 (DS) [17]、β-香树脂醇合成酶 (β-AS) [18]、α香树脂醇合成酶 (α-AS) [19]和羽扇豆醇合成酶 (LUS) [20]。近些年来对萜类的研究越来越广泛，但是豆科植物花榈木中的萜类化合物种类以及生物合成情况却未见报道。
本研究利用代谢组学测序数据首次对花榈木中的萜类物质进行鉴定，并结合转录组测序结果，利用生物信息学方法分析花榈木中萜类的主要合成情况，分析相关基因在花榈木不同组织部位中的表达水平，为研究花榈木的药用活性物质以及花榈木中萜类的代谢调控途径奠定基础。
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2021年4月23日于华南农业大学 (中国广州) 苗圃中采集3年生花榈木新鲜的根、茎、树皮、老叶和幼叶5个组织部位样品，每样品重复4次，纯净水冲洗干净，立即在液氮中冷冻，并分成2个部分，一部分立即在−80 ℃下保存用于总RNA提取，另一部分在真空下冷冻干燥用于代谢物提取。
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将采摘的根、茎、树皮、老叶和幼叶样品冻干磨粉后，精确称量各个样品粉末0.5 g，分别用5 mL体积分数为80%的HPLC级甲醇提取过夜，其中内标为1 μmol·L−1的白杨素。4 ℃下12 000 g离心30 min，取上清液装入样品瓶中，进行超高效液相色谱质谱 (UHPLC Q-TOF/MS) 分析。为了分离花榈木不同器官的代谢物，采用超高效液相色谱串联质谱法(Q Exactive Plus)进行测定。为保证平行试验每个样品平行4针。将1 μL样品进入2.1 mm×100.0 mm、1.9 μm粒径的Hypersil GOLD色谱柱，柱温30 ℃，流速0.3 mL·min−1。流动相A为体积分数0.1%的HPLC级甲酸，流动相B是HPLC级乙腈。梯度洗脱：0~2.0 min，0~10%流动相B；2.0~10.0 min，10%~55%流动相B；10.0~10.1 min，55%~80%流动相B；10.1~13.0 min，80%流动相B；13.0~14.0 min，80%~95%流动相B；14.0~18.0 min，95%~10%流动相B。全扫描质谱和数据关联扫描(dd-MS2)的分辨率分别设置为70 000和17 500，在正负离子模式下均使用加热的ESI源。在正负模式下，喷雾电压被设定为3.5和3.2 kV。毛细管温度被设定为320 ℃，辅助气体加热器的温度被设定为350 ℃。
使用Compound Discoverer 3.2对原始数据进行分析，然后根据综合分子量、质荷比 (m/z)、保留时间 (RT) 和二级光谱，与代谢物数据库mzCloud、mzVault和Chemspider进行对比。
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总RNA由RNAprep Pure Assay试剂盒提取，RNA质量用NanoPhotometer®分光光度计测定。为了进行转录组测序，样品被送到百迈客生物技术公司。库的制备在Illumina Hiseq 2000平台上进行测序，并产生成对的读长 (reads)。首先，使用内部的perl脚本处理fastq原始数据，以去除含适配器的读数、含ploy-N的读数和低质量读数。经过Trinity软件组装获得一个非冗余的基因数据库 (universal gene, unigene)，并进一步使用HMMER软件与Pfam数据库比对，获得unigene的注释信息。
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以常用的基因表达水平估算方法中每千个碱基转录每百万映射读取的片断(fragments per kilobase million，FPKM) 值进行表达量统计。使用错误发现率(false discovery rate, FDR) ≤0.01 和 |log2CF| ≥2 (CF为差异倍数, fold change) 的阈值，写入R中的DESeq 2包，对花榈木不同部位样本进行差异基因表达分析[21]。使用TBtools构建差异显著基因 (DEGs) 的热图，京都基因和基因组百科全书(KEGG)对DEGs的富集分析是使用R中的Cluster Profiler包进行的，加权基因共表达网络(WGCNA)是在R包WGCNA的帮助下进行的，并使用相关P值建立统计学意义。
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根据总离子流图所得到的化合物精确相对分子质量、出峰时间、二级碎片信息，与mzCloud和mzVault数据库比对，共鉴定出15种萜类化合物(表1)。为了分析花榈木不同组织部位中萜类化合物的分布情况，对5个部位的萜类化合物的相对含量进行了热图分析(图1A)，发现不同部位的萜类相对含量差别较大。能明显看出幼叶、老叶与根中萜类相对含量较高，与之相反的是茎与皮中相对含量比较少，并发现甘草次酸 (enoxolone)、齐墩果酸 (oleanolic acid)、芳樟醇 (linalool) 和二氢丹参酮Ⅰ (dihydrotanshinone Ⅰ) 等具有抗氧化、抗炎免疫调节、抗心血管疾病和镇定作用的萜类化合物[22]，表明萜类化合物可能是花榈木中主要的药用活性物质。
表 1 花榈木中萜类化合物质谱信息
Table 1. Mass spectral information of terpenoids in O. henryi
名称 分子式 质荷比 保留时间/min 峰面积 根 茎 老叶 皮 幼叶 齐墩果酸 C30H48O3 456.360 87 13.411 264 762 138 689 614 4 392 055 4 501 446 1 185 143 二氢丹参酮Ⅰ C18H14O3 278.093 90 7.125 293 469 237 564 453 110 77 252 839 415 872 759 45 119 942 Walleminone C15H24O3 252.172 21 12.877 27 142 310 25 925 485 38 139 793 90 127 128 102 273 216 甘草次酸1 C30H46O4 470.338 67 9.011 10 782 521 10 749 752 19 745 477 26 015 732 10 142 324 熊果酸 C30H48 O3 456.359 91 13.631 40 193 042 1 258 439 318 763 532 2 194 119 2 055 746 京尼平苷酸 C16H22O10 374.121 60 1.932 16 460 987 112 195 727 49 129 697 97 661 105 52 007 928 甘草次酸2 C30H46 O4 470.338 61 13.353 6 685 919 1 285 086 34 589 990 2 917 822 2 213 863 劳丹醇酸 C20H36O3 324.266 84 12.857 1 810 075 2 772 437 427 160 3 608 483 8 629 568 芳樟醇 C10H18O 154.135 49 12.167 2 423 647 2 992 083 1 182 137 4 399 836 13 100 226 脱落酸 C15H20O4 264.136 42 8.304 1 324 567 8 782 319 6 127 101 13 051 696 24 808 273 积雪草苷 C48H78O19 958.511 41 8.844 4 835 086 22 449 131 116 659 465 169 326 989 9 393 498 Lagochilin C20H36O5 356.255 49 12.385 1 032 268 511 236 837 844 660 680 27 515 252 木香烃内酯 C15H20O2 232.146 14 9.727 600 726 697 407 6 046 546 4 143 536 4 973 618 鸡蛋花素 C15H14O6 290.078 91 9.824 1 179 709 9 187 944 17 465 820 14 830 113 618 679 Prespatane C15H24 204.187 43 12.689 15 917 262 1 479 579 2 907 710 4 359 663 8 310 627 
图 1 花榈木不同组织中萜类化合物积累和TPS、OSC基因表达量的热图
Figure 1. Heat map of terpenoid accumulation and TPS and OSC gene expression in different tissues of O. henryi
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为了筛选花榈木中与萜类生物合成相关的潜在基因，利用RNA-seq对花榈木5个部位的所有转录组进行分析。使用Illumina Hiseq 2000平台进行测序，在去除低质量和短的读数后，总共获得了1.9~2.4 M的高质量待分析数据，共获得96 302个最长转录本，并与NR、eggNOG、TrEMBL、Pfam、SwissProt、KEGG、COG、KOG及GO等9个数据库比对，确定编码序类有47 809条，并对其进行功能注释。计算出FPKM值，代表每个基因的表达水平。对花榈木5个部位的转录组进行差异基因分析，共得到13 840个差异显著基因 (DEGs)。在差异基因分析中发现，与其他3个部位样本相比，叶的特异差异基因更多，茎中的特异差异基因最少(图2)。
图 2 花榈木5个组织中的差异基因韦恩图
Figure 2. Venn diagram of differential genes in five organs of O. henryi
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根据其他物种萜类生物合成信息，花榈木萜类物质合成途径大致可分为萜类前体物质的合成、萜骨架的合成和后修饰3个阶段，其中萜类化合物的前体GPP、FPP和GGPP主要来自植物的MVA和MEP途径。MVA通路共鉴定到8个基因，包括2个乙酰辅酶A乙酰转移酶 (AACT, c68943.graph_c2, c73242.graph_c0)、2个羟甲基戊二酰辅酶A合成酶 (HMGS, c57495.graph_c0, c70166.graph_c1)、1个羟甲基戊二酰辅酶A还原酶 (HMGR, c68938.graph_c1)、1个甲羟戊酸激酶 (MK, c70988.graph_c0)、1个磷酸甲羟戊酸激酶 (PMK, c71400.graph_c0)、1个甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 (MVD, c76163.graph_c2)；MEP通路共鉴定到10个基因，包括4个1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXS, c62607.graph_c0, c70494.graph_c2, c75298.graph_c5, c75577.graph_c0)、1个1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶 (DXR, c71705.graph_c2)，1个4-焦磷酸胞苷-2-甲基-D-赤藓醇激酶 (CMK, c73279.graph_c4)、1个2-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸合酶 (MDS, c62387.graph_c0)、1个羟甲基丁烯基-4-焦磷酸合酶 (HDS, c56719.graph_c0)、2个羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶 (HDR, c29394.graph_c0, c70095.graph_c0)。为了更直观地比较萜类生物合成途径主要基因在不同组织中的表达情况，采用FPKM值对花榈木不同组织部位的合成途径基因表达量作图。发现参与MVA途径的基因在幼叶中表达量普遍较高，MEP途径相关基因在老叶中表达量较高，与萜类相对含量比较对应，可能与叶中的萜类化合物的积累有关(图3)。还检测出2个异戊烯基焦磷酸异构酶 (IPPI, c31804.graph_c0, c89450.graph_c0)，它们在叶中的表达量并不高，可能这些基因与萜类化合物相对含量并不密切相关。
图 3 花榈木萜类骨架生物合成途径
Figure 3. Terpene skeleton biosynthesis pathway of O. henryi
MVA和MEP这2个途径后生成萜类化合物的前体，还需要3个比较重要的酶参与：香叶基二磷酸合成酶 (GPPS)、法尼基二磷酸合成酶 (FPPS) 和香叶基香叶基焦磷酸合成酶 (GGPPS)。在花榈木的转录组数据中共检测到2个FPPS基因 (c86328.graph_c0, c75342.graph_c0)，2个GPPS基因 (c36059.graph_c0, c76294.graph_c0)，5个GGPPS基因 (c55157.graph_c0, c71336.graph_c0, c65845.graph_c2, c63610.graph_c0, c69470.graph_c0)，表达情况如图3所示。2个GGPPS基因c55157.graph_c0和c69470.graph_c0在幼叶中表达量比较高，多数二萜在幼叶中的积累量也是最多的(图1)，可能这2个基因是花榈木二萜物质合成的关键酶基因。TPSs是催化合成不同种单帖、二萜和倍半萜类化合物的酶，OSCs可以催化合成三萜类化合物，在花榈木转录组中还鉴定出6个TPSs和8个OSCs基因，其表达谱如图1B所示。这些基因的表达在花榈木中出现了组织差异性，每个组织中都有其表达量高的基因，其中与MVA和MEP途径基因表达情况相似：在幼叶和老叶中表达量高的基因占比较大。这些TPSs和OSCs的组织差异表达可能是导致花榈木中萜类多样性和具有不同积累模式的主要原因。
为了进一步了解研究中6个TPSs的假设功能，根据其蛋白序列，将其与已经在拟南芥Arabidopsis thaliana、葡萄Vitis vinifera和番茄Lycopersicon esculentum等物种中确定的TPS进行系统发育分析(图4)。发现与之前报道相似，花榈木中的TPSs主要分布在TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-e和TPS-g亚家族。c70917.graph_c0和c72335.graph_c1被分类到TPS-b中，可能这2个基因在功能上比较类似；c64128.graph_c1被分到TPS-e亚家族，说明c64128.graph_c1可能在花榈木中行使着KS酶功能；c73567.graph_c1则被分到TPS-c亚家族中，表明它可能有着CPS酶的功能。为了进一步推测花榈木OSCs的功能，对每个基因再次进行了美国国家生物技术信息中心数据库的比对注释，发现除c71944.graph_c0基因是编码LUC的基因外，其他7个都是编码β-AS的基因。
图 4 花榈木TPS基因家族分析
Figure 4. Analysis of TPS gene family of O. henryi
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为进一步分析萜类化合物合成相关基因，利用WGCNA对确定的全部DEGs进行了共表达分析。这些DEGs被聚类为10个分支，每个不同颜色标记的模块代表了1个分支(图5)。模块是由具有相似表达模式的基因簇组成的，MEturquoise模块包含的基因数量最多(3 761个基因)，而MEmagenta模块的基因数量最少(104个基因)。其中有7个模块与一些特定的萜类化合物表现出明显的正相关(相关系数＞0.80)(图5)。除了c63712.graph_c0基因外，共有5个TPSs 和8个OSCs基因表达差异明显，推测这13个差异表达的TPSs和OSCs可能是导致花榈木5个组织部位萜类化合物组成差异的重要候选基因。其中， MEturquoise模块中共有2个TPSs和4个OSCs基因；MEblue模块有2个TPSs和3个OSCs基因。MEturquoise和MEbrown与三萜类化合物的相关性较强(相关性系数＞0.90)，而MEblue、MEblack和MEpink模块与倍半萜化合物有相关性，其中MEblue模块也与二萜和单萜具有相关性。二氢丹参酮Ⅰ这个二萜化合物与MEyellow和MEgrey 2个模块都具有正相关性。这些正相关的模块表明：这些基因在调节花榈木萜类化合物的生物合成中具有潜在的作用。
图 5 花榈木中基因与萜类化合物的共表达网络分析
Figure 5. Co-expression network analysis of genes and terpenoids in O. henryi
上述模块的分析结果表明：MEturquoise模块富集了最多的TPSs和OSCs，并且该模块与乌苏酸和甘草次酸呈正相关，相关性分别为0.95和0.93(图5)；MEblue也富集到了较多的TPSs和OSCs基因，并且与一些倍半萜和二萜成正相关，所以对这2个模块开展进一步的分析。在MEturquoise模块中发现：基因主要富集在次生代谢和信号转导通路，共检测到105个转录因子可能参与TPSs的调控(图6 A和图6 B)：bHLH、WRKY和MYB家族数量最多，分别有10、9和8个，此外C2H2、mTERF、FAR1和bZIP家族数量也达到了6~7个。通过对MEblue模块基因进行KEGG分析，发现基因主要富集在DNA复制、同源重组和修复通路，并检测到152个转录因子，数量最多的是bHLH和MYB家族转录因子 (图7 A和图7 B)。为了进一步研究MEturquoise模块中转录因子与相应TPSs和OSCs基因的关系，构建了一个共表达的网络图，选择了与MEturquoise模块中TPSs和OSCs基因相关性较强的34个转录因子 (边缘权重≥0.4)，包括MYB、WRKY、bHLH、C3H、DBB、HB-HD-ZIP和一些其他家族的转录因子(图8)。最终利用Cytoscape插件CytoHubba的Degree算法分析识别到了6个转录因子，即HB-HD-ZIP (c64527.graph_c1)、GRF (c76195.graph_c0)、DBB (c66970.graph_c2)、DBB (c75593.graph_c0)、HB-HD-ZIP (c63393.graph_c0)和C3H (c70385.graph_c1)。这些转录因子在花榈木中可能与萜类化合物的合成基因有着密切的关系。
图 6 MEturquoise模块基因分析
Figure 6. MEturquoise module gene analysis
图 7 MEblue模块基因分析
Figure 7. MEblue module gene analysis
图 8 萜类化合物合成相关酶基因与转录因子相关性网络图
Figure 8. Network diagram of terpenoid synthesis-related enzyme genes and transcription factor correlation
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目前，天然植物次生代谢物已被广泛应用于抗癌药和治疗感染性疾病的药物[23]。根据合成起始分子不同，植物次生代谢物可以分为生物碱、萜类、苯丙烷类三大类化合物[24]。萜类一直是天然产物中重要的药用化合物，具有多种药理活性，如紫杉醇可以抗肿瘤，青蒿素属于抗疟疾特效药物，雷公藤内酯能够抗炎等[25−26]，但药用木本植物花榈木中的萜类还没有过报道。本研究利用代谢组学技术分析了花榈木中萜类物质在不同部位的积累情况，共检测出比较确定的15种萜类化合物，并发现了甘草次酸、齐墩果、芳樟醇和二氢丹参酮Ⅰ等具有抗氧化、抗炎免疫调节和镇定等药用活性的萜类化合物[27]。通过对花榈木不同组织部位的萜类代谢物热图分析发现，萜类化合物积累具有明显组织特异性，主要积累在幼叶和老叶中，其他部位中积累较少，可能为了保护叶片免遭危害[28]。今后在提取和分析花榈木药用物质时应该更多利用它的叶片。
近些年来，RNA-Seq 高通量测序技术被越来越多地应用于药用植物基因信息解读、新基因发掘与基因功能研究中。人们已对药用植物连翘 Forsythia suspense、银杏 Ginkgo biloba、款冬 Tussilago farfara等进行了转录组的研究，获得了大量有用的基因信息[29−30]。这使得阐明药用植物中活性物质的合成及积累规律成为可能，为增加次生代谢物积累、改善药用植物品质提供更多途径。本研究采用RNA-Seq对花榈木5个不同组织部位进行无参转录组分析，共获得96 302个，在经过与数据库比对后共注释了47 809条转录本。利用FPKM值对基因表达量进行分析比较，共获得显著差异基因13 840个。韦恩图分析发现大量基因表达具有组织特异性，并通过注释信息在差异显著的基因中共鉴定出49个与萜类化合物生物合成相关的基因，包括29个萜类骨架生物合成途径的酶基因，6个单帖、倍半萜和二萜生物合成酶基因，8个三萜生物合成酶基因以及6个可能参与萜类生物合成调控的转录因子，对花榈木的萜类合成有了初步的认识，为后续研究提供了信息资源。
先前的研究表明：MVA途径在许多植物的三萜生物合成中起主导作用，如人参Panax ginseng、三七P. notoginseng和茶树Camellia sinensis等植物[31−32]，MEP途径通常有助于单萜类化合物和二萜类化合物的生物合成[33]。但是本研究利用热图对萜类生物合成基因的表达分析发现：MVA途径相关酶基因大多数在幼叶中表达量较高，MEP途径多数相关基因则集中在老叶中表达。根据相应FPPS、GPPS和GGPPS酶基因的表达情况，以及花榈木中三萜主要在老叶中积累，而二萜、倍半萜和单萜在幼叶中积累较多的情况，推测在花榈木中三萜类化合物前体可能主要由MEP途径生成，而二萜、单帖和倍半萜的前体物质则主要由MVA途径提供。由图4看出：花榈木的TPS基因在进化上相对于各种模式植物来说是相对分离的，也进一步印证了其萜类的合成具有特殊性。也有可能由于转录组学的限制，部分基因没有检测到，且研究中还没有检测到所有的萜类物质，从而导致判断出现误差，所以后续还需要大量的试验来验证其功能，判断花榈木中萜类的具体合成情况。
基因的转录调控一直是植物代谢研究领域的热点。对不同植物的研究表明：参与萜类生物合成的转录因子主要分布在bHLH、AP2/ERF、bZIP和WRKY家族中，如在西洋参P. quinquefolius中转录因子PqWRKY1是三萜人参皂苷生物合成相关的正调节因子[34]，在艾叶Artemisia argyi中AarbHLHs的基因表达与1, 8-桉树烯或β-石竹烯的含量变化呈显著相关[35]。本研究利用WGCNA对差异基因和萜类化合物进行了相关性分析，筛选出一些可能对萜类生物合成的关键酶基因表现重要调控作用的转录因子家族，如MYB、WRKY、bHLH和HB-HD-ZIP转录因子。有研究预测传统中药走马胎Ardisia kteniophylla中AP2/ERF、MYB、WRKY和bHLH转录因子可能调控萜类合成，预测赤桉Eucalyptus camaldulensis中WRKY、MYB、NAC和bHLH转录因子对萜类生物合成中的关键酶基因表现出重要的调控作用[36]。这和本研究预测的结果基本相同。经过分析进一步筛选出6个转录因子处于共表达网络的中心位置，推测这些候选转录因子可能调控了萜类化合物的生物合成，后续还需要进一步的试验证明。
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本研究通过代谢组与转录组学的分析，发现花榈木叶中萜类相对含量最高，并鉴定出49个与萜类化合物生物合成相关的基因。预测了可能调控萜类化合物生物合成的上游转录因子。本研究为花榈木资源活性成分萜类化合物的积累状况、生物合成及调控提供了大量的信息，弥补了花榈木萜类合成研究中的空白，为进一步开展花榈木的主要药用活性物质研究提供基础。
Analysis of candidate genes for terpene synthesis in Ormosia henryi based on metabolome and transcriptome
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摘要:
目的 花榈木Ormosia henryi是重要的木本药用植物。研究花榈木萜类次生代谢物积累规律，分析萜类生物合成通路和相关的关键酶基因，对花榈木药用价值的开发具有重要意义。 方法 采用液相色谱-质谱联用技术与高通量转录组学测序，利用生物信息学分析方法从差异代谢产物和表达基因中寻找萜类生物合成的关联酶基因。 结果 代谢组数据中共检测到了15种萜类化合物，其中含有甘草次酸、齐墩果酸和芳樟醇等具有药用活性的物质，多数在叶片中相对含量高于其他组织部位。转录组数据筛选出49个与萜类合成有关的候选基因，分析后发现：甲羟戊酸(MVA)途径中的差异基因在幼叶中表达较高，甲基赤藓糖磷酸酯(MEP)途径的差异基因在老叶中表达较高。根据加权基因共表达网络(WGCNA)分析，发现MYB、WRKY、bHLH和HB-HD-ZIP等转录因子家族在花榈木的萜类合成中起重要作用，并推测了6个可能与萜类物质生物合成有关的转录因子，即HB-HD-ZIP (c64527.graph_c1)、GRF (c76195.graph_c0)、DBB (c66970.graph_c2)、DBB (c75593.graph_c0)、HB-HD-ZIP (c63393.graph_c0) 和C3H (c70385.graph_c1)。 结论 从花榈木代谢组和转录组数据库中初步获得了重要的萜类物质及可能参与萜类化合物生物合成途径的候选关键酶基因，为进一步阐明花榈木萜类化合物生物合成的分子机制奠定基础。图8表1参36 Abstract:Objective Ormosia henryi is an important woody medicinal plant. This study aims to explore the accumulation pattern of terpene secondary metabolites and analyze the terpene biosynthesis pathway and related key enzyme genes, which is of great significance to the development of medicinal value in O. henryi. Method Liquid chromatography-mass spectrometry and high-throughput transcriptomic sequencing were used to find the associated enzyme genes of terpene biosynthesis from differentially expressed genes based on bioinformatics analysis. Result A total of 15 terpene compounds were detected in the metabolomic data and they contained enoxolone, oleanolic acid, linalool and other substances with medicinal activity, most of which were relatively higher in leaves than in other tissue parts. Transcriptome data screened 49 candidate genes related to terpene synthesis, and after analysis it was found that differential genes in the MVA pathway were highly expressed in young leaves while differential genes in the MEP pathway were highly expressed in old leaves. Based on WGCNA analysis, it was found that transcription factor families such as MYB, WRKY, bHLH and HB-HD-ZIP played an important role in terpene synthesis of O. henryi, and 6 transcription factors that might be related to terpene biosynthesis content were predicted, namely HB-HD-ZIP (c64527.graph_c1), GRF (c76195.graph_c0), DBB (c66970.graph_c2), DBB (c75593.graph_c0), HB-HD-ZIP (c63393.graph_c0) and C3H (c70385.graph_c1). Conclusion Important terpenes and candidate key enzyme genes that may participate in the biosynthesis pathway of these terpenes have been preliminarily obtained from the database of metabolomics and transcriptome of O. henryi . [Ch, 8 fig. 1 tab. 36 ref.] -
Key words:
- Ormosia henryi /
- metabolome /
- transcriptome /
- terpenoids /
- biosynthesis
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西红花Crocus sativus为鸢尾科Iridaceae番红花属Crocus多年生草本植物，又称番红花、藏红花，以干燥柱头入药，属药食同源中药材，被历代医家所推崇，被誉为“红色金子”，2018年被浙江省人民政府认定为新“浙八味”之一。西红花原产于伊朗、希腊、印度、西班牙、意大利、摩洛哥等地[1]，喜冷凉、耐寒、不耐涝，适合在疏松肥沃、腐殖质丰富、排水良好的沙质土壤种植[2]，在中国山东、江苏、北京、河南等20多个省、市都有一定的种植面积。大量研究发现：西红花具有调血脂[3]、抗肿瘤[4]、抗氧化[5-7]、抗癌[8-9]、防治动脉粥样硬化[10]、抗抑郁[11-12]、预防阿尔茨海默症[13]等多种药用活性。除柱头外，副产物花瓣也具有抗氧化的药用活性[14]。但是西红花是三倍体植物，只能通过无性繁殖繁育新球茎，极易积累病害；同时由于西红花种植面积不断扩大，球茎腐烂病逐年加重，大量球茎在田间生长期和收获储藏期腐烂，球茎减产严重，西红花的产量与品质受到影响[15-19]。目前，围绕西红花的研究主要集中于以下方面：①西红花苷、西红花酸等主要药用成分药理活性研究，进一步开发西红花潜在的药用价值[3, 14]。②西红花苷生物合成途径的解析，如对西红花苷生物合成途径相关合成酶基因进行挖掘和功能解析[20-22]。③西红花价格昂贵、产量低，市面上西红花以次充好、品质参差不齐，因此精准、高效地对西红花的真伪进行鉴定显得尤为重要[23-27]。④优化西红花栽培管理模式和施肥方式，以提高西红花的品质，降低病害发生率[28-30]。⑤西红花球茎腐烂病致病菌的分离与鉴定[15]。球茎腐烂病是困扰西红花产业发展的主要问题，致病菌的分离鉴定以及相应杀菌剂或生物农药的开发利用能为产业良性发展提供保障[15]。本研究围绕西红花土壤真菌性病害、西红花内生真菌、西红花真菌性病害生防菌的挖掘鉴定等展开综述，为全面了解西红花真菌性病害、防治现状以及产业化发展提供理论依据。
1. 西红花致病真菌的分离与鉴定
细菌、真菌、病毒等微生物都能引起西红花病害，以真菌引起的病害最为常见，造成的经济损失也最为严重[31]，西红花球茎腐烂病成为当前制约西红花产业发展的主要因素。球茎腐烂病是球茎生长期间的主要病害，常见于连作田及排水差的田块，通常由真菌引起，每年有30%以上的种植面积遭受病害[15]，严重影响球茎、柱头的产量和品质。
西红花球茎腐烂病主要有黑腐病和白腐病2种，其中黑腐病主要发生在球茎休眠期，白腐病主要发生在球茎大田生长期[32]。邹凤莲等[33]从西红花种球中分离到1株链格孢菌Alternaria alternata，回接试验发现其可引起西红花球茎腐烂，并与青霉菌一起感染球茎；相比感染单种真菌病害，腐烂更加严重。表明西红花球茎腐烂病可能是多种致病菌共同作用的结果。张国辉等[34]通过组织分离法从感病球茎中分离得到了2种致病真菌，分别为炭疽菌Anthracnose sp. 和尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum；回接试验发现：这2种真菌共同感染西红花球茎从而引起腐烂病的发生。王海玲[32]从腐烂球茎中分离获得巴西曲霉Aspergillus brasiliensis、尖孢镰刀菌F. oxysporum和桔青霉菌Penicillium citrinum等3种致病菌，但是这3种菌复合接种是否引起球茎腐烂，目前尚无明确的报道。WANI等[35]从健康球茎中分离出内生真菌红棕孔韧革菌CSE26菌株Porostereum sp.，经球茎回接及田间植株回接试验，发现该菌产生的水解酶和氯代甲氧苯基代谢物可引起西红花球茎腐烂，但病症较轻，表明红棕孔韧革菌是一种致病性较弱的病原菌。吴李芳[15]分离得到了尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌F. solani，通过回接试验证明：此2种真菌是新发现的能引起西红花球茎腐烂的致病真菌。ZHANG等[36]从浙江省建德市西红花专业合作社采样，并从黑腐病的球茎中分离鉴定了1种新的能引起西红花球茎腐烂的离生青霉菌菌株P. solitum。迄今为止，已公开报道的引起西红花球茎腐烂的致病菌包括曲霉属Aspergillus sp.、镰刀菌属Fusarium sp.、青霉菌属Penicillium sp.、炭疽菌属Anthracnose sp. 和链格孢菌属Alternaria sp.，其中镰刀菌属还会引起其他药用植物如黄芪Astragalus membranaceus[16]、人参Panax ginseng[19]、半夏Pinellia ternata[37]等根茎的腐烂(表1)。因此，防治镰刀菌属真菌病害可减少西红花田间病害的发生，在生产上具有实际应用价值。
表 1 西红花球茎腐烂致病真菌及其来源Table 1 Summary of pathomycete isolation from rotting bulbs of C. sativus2. 西红花内生真菌的分离与功能鉴定
植物内生真菌是指广泛寄生于植物组织或细胞内部，但不会引起宿主感染的真菌[39]，通常与宿主形成互惠的共生关系[40]。
2.1 西红花内生真菌的分离
研究表明：同一物种内生真菌的种类和数量会受品种、生长条件、取材的组织部位等因素影响，并常存在显著差异[41]。因此，分离西红花内生真菌需要对植株的不同组织部位(如根、茎、叶等)分别取材。目前，西红花内生真菌的分离主要采用组织分离法，即分别将不同部位的西红花组织切成小块彻底消毒后，将其置于马铃薯葡萄糖培养基上25 ℃培养，待其生长出菌落后挑其边缘进行纯化，已纯化的内生真菌还需要进行形态学鉴定和分子水平鉴定。西红花内生真菌形态学鉴定主要包括真菌的宏观和微观特征。宏观特征如菌落正反面颜色、菌落质地(絮状、毛毡状、质密、疏松)、菌落生长速度、菌落表面是否产生液滴等[42-44]；微观特征如菌丝形状、孢子形状(卵形、倒棒形、倒梨形、卵圆形、椭圆形等)、有无隔膜、有无孢子等[45]。西红花内生真菌分子水平鉴定指采用通用引物对真菌基因组DNA特定基因序列进行扩增。目前西红花分子鉴定的引物主要包括：内部转录间隔区引物(ITS)、RNA聚合酶Ⅱ亚基引物(RPB2)和β-微管蛋白基因引物(β-tubulin)[46]。
2.2 西红花内生真菌的功能
内生真菌可从宿主中吸取营养供给自身生长所需，并产生代谢物刺激植物组织的生长与发育，提高宿主对生物或非生物胁迫的耐受性，调控宿主细胞次生代谢产物的生物合成，具有单独生产与宿主相同或相似活性物质的能力，是有益的微生物资源[35]。此外，内生真菌及其代谢产物还具有抑菌[47-49]、固氮[50]、提高植物抗性[50-51]、抗癌[48]等多种功能。可见内生真菌具有促进植物生长、提高抗性的作用。
西红花主要活性成分(如西红花苷、西红花酸等)药用价值较高，但产量低、价格昂贵。因此，许多科研工作者将目光转向了西红花内生真菌的研究。WANI等[52]发现：西红花内生真菌被孢霉Mortierella alpina CS10E4在促进西红花生长、增加类胡萝卜素积累、提高植株抗性等方面具有显著效果；田间试验表明：经过内生处理的西红花植株，球茎总生物量、球茎大小、柱头生物量、顶端出芽芽数、不定根数等形态和生理性状均有显著改善。分子机制可能是该菌通过调控关键代谢途径基因的表达，将代谢流引向促进类胡萝卜素合成的路径，从而显著提高寄主类胡萝卜素的含量。ZHENG等[53]从西红花内生真菌酒色青霉P. vinaceum培养物的活性成分中分离到了喹唑啉生物碱化合物，认为其具有潜在的细胞毒性和抗真菌活性。WANI等[54]研究发现：西红花内生真菌甘瓶霉Phialophora mustea可提高寄主植物对多种环境胁迫因子的耐受性，代谢产物具有潜在的抗菌和抗癌活性。多数内生真菌还会产生大量吲哚乙酸(IAA)以促进宿主植物的生长[42, 54]。此外，WEN等[55]对内生真菌胞外多糖(EPS)的研究发现：EPS能有效清除超氧化物阴离子自由基，是一种潜在的生物活性来源，适用于制药和食品工业。
由此可见，内生菌是重要的生物资源。研究植物内生菌，了解植物与微生物之间的关系，有助于促进西红花的可持续栽培，提高产量。
3. 西红花致病真菌的生物防治
生物防治菌是存在于种植土壤或植物根系表面的微生物，可通过多种机制抑制病原菌，如拮抗作用[56]、溶菌作用、营养和空间竞争[57]、提高植物抗性[58]、促进植物生长[59]、产生抗生素或刺激植物防御反应等。因此，生防菌可作为化学药剂的环保替代品，在降低西红花发病率的同时，对环境和寄主无任何损伤[31]。目前西红花栽培方面研究较为成熟的生防菌有假单胞菌Pseudomonas[60]、木霉菌Trichoderma[61]和芽孢杆菌Bacillus[62]等。
3.1 西红花生防菌的挖掘与验证
芽孢杆菌是一种能够有效防治西红花真菌病害的生防细菌。陶中云等[63]从西红花土壤中分离并鉴定了1株蜂房类芽孢杆菌Paenibacillus alvei ZJUB2011-1菌株，该菌株对西红花球茎腐烂病的防治效率高达57.14%，与多菌灵防治效率相当[64]。吴李芳[15]从西红花根际土壤中分离到1株对西红花球茎腐烂病具有较好防治效果的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C612菌株，发现C612菌株通过产生脂肽类抗生素抑制病原菌的生长，并且对西红花有较好的促生长作用。KOUR等[65]从西红花根际土壤中分离了3种芽孢杆菌，分别为苏云金芽孢杆菌B. thuringiensis DC1菌株、巨大芽孢杆菌B. megaterium VC3菌株和解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens DC8菌株；田间试验发现这3株芽孢杆菌都能明显促进西红花植株生长，降低球茎发病率。此外，GUPTA等[66]发现枯草芽孢杆菌B. subtilis、荧光假单胞菌P. fluorescens和棘孢木霉菌T. asperellum不仅降低了西红花病原菌数量和病害发生率，有效防治西红花球茎腐烂病，还有利于延长西红花的花期(表2)。目前，针对芽孢杆菌生物防治和促进植物生长方面已开展了系统的研究，部分菌株已实现商品化，产生了较大的经济效益[67]。
表 2 已报道的西红花生防菌Table 2 Biocontrol bacterium of C. sativus had been reported菌株名称 菌株类型 来源 作 用 参考文献 蜂房类芽孢杆菌 Paenibacillus alvei ZJUB2011-1 细菌 根际土壤 防治球茎腐烂病 [63] 解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens C612 细菌 根际土壤 抑制病原菌生长 [15] 苏云金芽孢杆菌 B. thuringiensis DC1 细菌 根际土壤 抑制病原菌，促进植株生长 [65] 巨大芽孢杆菌 B. megaterium VC3 细菌 根际土壤 抑制病原菌，促进植株生长 [65] 解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciens DC8 细菌 根际土壤 抑制病原菌，促进植株生长 [65] 枯草芽孢杆菌 B. subtilis 细菌 生防药剂 防治球茎腐烂病 [66] 荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens 细菌 生防药剂 防治球茎腐烂病 [66] 棘孢木霉菌 Trichoderma asperellum 真菌 生防药剂 防治球茎腐烂病 [66] 解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciens W2 细菌 根际土壤 防治球茎腐烂病 [67] 3.2 生防菌在其他药用植物中的挖掘与验证
生防菌作为化学农药的良好替代品，可改善环境污染、降低农药残留，药用植物生防菌的挖掘与验证也是科学研究的热点。ANISHA等[68]从生姜Zingiber officinale中分离到1株顶孢属真菌Acremonium sp.，具有良好的抑菌活性；进一步研究发现：该菌可产生胶霉毒素(gliotoxin)，对病原菌具有较强的拮抗作用，表明该菌具有生物防治潜力。HAN等[69]从人参根际土壤中分离到1株具有较高抗菌活性的紫色色杆菌Chromobacterium sp. JH7菌株，该菌能产生几丁质酶、蛋白酶等抗菌分子，为开发人参生物防治剂提供了理论依据。姜云等[70]研究发现：施用生防菌株FG14可湿性粉剂能有效防治人参锈腐病，效率高达68.69%。将三菌合剂“宁盾”施用于浙贝母Fritillaria thunbergii根腐病地块，发现其对植株有显著促生长、防病作用[71](表3)。综上所述，生防菌对药用植物的绿色高效种植、提升品质具有重要作用和广阔的应用前景。
表 3 生防菌在其他药用植物的挖掘与验证Table 3 The excavation and verification of biocontrol bacteria in other traditional Chinese medicine plants菌株名称 菌株类型 来源 功能 参考文献 顶孢属真菌 Acremonium sp. 真菌 健康生姜 产生胶霉毒素抑制病原菌 [68] 紫色色杆菌 Chromobacterium sp. JH7 细菌 人参根际土壤 产生几丁质酶、蛋白酶抑制病原菌 [69] 深海链霉菌 Streptomyces scopuliridis 细菌 人参根际土壤 产生几丁质酶、蛋白酶抑制病原菌 [69] 灰锈赤链霉菌 S. griseorubiginosus 放线菌 川芎根茎 抑制4种川芎根腐病原菌 [72] 团孢链霉菌 S. agglomeratus 放线菌 川芎根茎 抑制4种川芎根腐病原菌 [72] 解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciens C10 细菌 人参根际土壤 改变真菌群落结构 [73] 萎缩芽孢杆菌 B. atrophaeus SXKF16-1 细菌 黄芪根际土壤 定植于根际土壤，改善土壤微生态环境 [74] 哈茨根霉 Trichoderma harzianum TharDOB-31 真菌 健康姜黄根茎 定植于根茎，产生抗真菌化合物 [75] 4. 展望
西红花优质种质资源匮乏，土地连作障碍，有效的杀菌剂或生物农药匮乏，众多不利因素导致球茎腐烂病日益严重，品质和产量难以保障[15]。要解决这些困扰产业发展的核心问题，可从以下方面集中科研攻关。一是基于现代宏基因组测序技术挖掘西红花球茎腐烂致病菌、生防菌。获得不同菌株并进行功能验证，分析西红花球茎腐烂病与根际土壤微生物群落的关系，为杀菌剂或生物农药的开发提供理论依据[76-77]。如已有研究[76]通过对人参锈腐病的根际土壤、感病人参根部分别进行宏基因组测序，比较土壤微生物群落和感病人参根部微生物群落差异，分析土壤中金属元素等与锈腐病发生的相关性，系统挖掘人参锈腐病的潜在致病菌，探明了连作土壤中金属离子失衡是人参锈腐病的潜在连作障碍诱因。二是基于合成生物学和发酵工程原理，将中药活性物质代谢合成的催化酶基因在大肠埃希菌Escherichia coli、酵母、烟草Nicotiana tabacum等模式原核和真核物种中进行基因表达重构，以实现药效物质的异源高效生物合成，从而解决目前优质中药药源紧缺、药效物质不稳定等问题。目前托品烷生物碱-莨菪碱(hyoscyamine)、青蒿素(artemisinin)等药用活性物质已实现基于合成生物学技术方法的异源生物全合成[78-80]。因此，从分子水平解析西红花苷、西红花酸等主要活性成分代谢合成的催化酶基因或调控基因，能为优质西红花转基因新品种的培育以及基于合成生物学技术手段的西红花主要活性成分的异源生物合成提供理论和应用依据[81-82]。三是脱毒中药种苗的规模化应用可有效缓解中药植物连作引起的病虫害频发的生产问题。目前，滁菊Chrysanthemum morifolium [83]、半夏Pinellia ternata[84]、怀地黄Rehmannia glutinosa [85]等中药材脱毒种苗在生产上的规模化应用有效扭转了土地连作引起的病虫害频发、严重影响生产效能的不利局面。西红花植株病害严重，创制西红花脱毒新种质，能为生产上提供可靠的优质西红花种源，提高生产效益[86-89]。
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图 1 花榈木不同组织中萜类化合物积累和TPS、OSC基因表达量的热图
Figure 1 Heat map of terpenoid accumulation and TPS and OSC gene expression in different tissues of O. henryi
图 2 花榈木5个组织中的差异基因韦恩图
Figure 2 Venn diagram of differential genes in five organs of O. henryi
图 5 花榈木中基因与萜类化合物的共表达网络分析
Figure 5 Co-expression network analysis of genes and terpenoids in O. henryi
图 8 萜类化合物合成相关酶基因与转录因子相关性网络图
Figure 8 Network diagram of terpenoid synthesis-related enzyme genes and transcription factor correlation
表 1 花榈木中萜类化合物质谱信息
Table 1. Mass spectral information of terpenoids in O. henryi
名称 分子式 质荷比 保留时间/min 峰面积 根 茎 老叶 皮 幼叶 齐墩果酸 C30H48O3 456.360 87 13.411 264 762 138 689 614 4 392 055 4 501 446 1 185 143 二氢丹参酮Ⅰ C18H14O3 278.093 90 7.125 293 469 237 564 453 110 77 252 839 415 872 759 45 119 942 Walleminone C15H24O3 252.172 21 12.877 27 142 310 25 925 485 38 139 793 90 127 128 102 273 216 甘草次酸1 C30H46O4 470.338 67 9.011 10 782 521 10 749 752 19 745 477 26 015 732 10 142 324 熊果酸 C30H48 O3 456.359 91 13.631 40 193 042 1 258 439 318 763 532 2 194 119 2 055 746 京尼平苷酸 C16H22O10 374.121 60 1.932 16 460 987 112 195 727 49 129 697 97 661 105 52 007 928 甘草次酸2 C30H46 O4 470.338 61 13.353 6 685 919 1 285 086 34 589 990 2 917 822 2 213 863 劳丹醇酸 C20H36O3 324.266 84 12.857 1 810 075 2 772 437 427 160 3 608 483 8 629 568 芳樟醇 C10H18O 154.135 49 12.167 2 423 647 2 992 083 1 182 137 4 399 836 13 100 226 脱落酸 C15H20O4 264.136 42 8.304 1 324 567 8 782 319 6 127 101 13 051 696 24 808 273 积雪草苷 C48H78O19 958.511 41 8.844 4 835 086 22 449 131 116 659 465 169 326 989 9 393 498 Lagochilin C20H36O5 356.255 49 12.385 1 032 268 511 236 837 844 660 680 27 515 252 木香烃内酯 C15H20O2 232.146 14 9.727 600 726 697 407 6 046 546 4 143 536 4 973 618 鸡蛋花素 C15H14O6 290.078 91 9.824 1 179 709 9 187 944 17 465 820 14 830 113 618 679 Prespatane C15H24 204.187 43 12.689 15 917 262 1 479 579 2 907 710 4 359 663 8 310 627 
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