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氧化亚氮(N2O)是一种长效温室气体，其增温潜势约为二氧化碳(CO2)的298倍[1-2]，对全球气候变暖具有较大的推动作用[3-4]。同时，大气中N2O浓度的上升对臭氧层造成显著的破坏，并且对生态环境也产生一系列的负面影响[5]。土壤是N2O的主要排放源，其排放量约占总排放量的70%[6]。因此，在土壤N2O排放日趋严重的背景下，研发土壤N2O减排技术是当前亟待解决的热点问题[7-8]。
生物质炭(biochar)是生物质在限氧或无氧环境中通过高温裂解而成的一类具有强吸附性，化学结构稳定且富含碳素的芳香态化合物[9]。生物质炭施用可以显著改善土壤性质，并在土壤N2O减排方面具有巨大潜力[10-11]。然而，生物质炭所含的矿质养分数量和类型较为匮乏，难以满足植物生长所需的营养需求。传统化肥的施用，可为植物生长提供养分，但却增加了土壤N2O的排放[12]。生物质炭基肥是一种新型肥料，可在改善土壤理化性质的同时，提供充足的养分，有效地弥补生物质炭速效养分不足的问题[11,13]。然而，与传统化肥相比，施用生物质炭基肥到底是促进还是抑制土壤N2O排放，尚不明确。此外，生物质炭基肥的施用会显著影响土壤的理化和微生物学性质，而上述性质的改变对土壤N2O排放的影响机制未有定论。
毛竹Phyllostachys edulis是中国亚热带地区重要的森林资源，其种植面积已超过400万hm2，约占竹类面积的72%[14]。毛竹能在短期内快速增加植被碳储量，因此，在碳汇功能方面具有独特的优势[15-18]。毛竹的生长对氮素养分的需求量较大。尿素的施用，一方面可以促进毛竹的生长，从而增加毛竹林的固碳量，但另一方面却增加了毛竹林土壤的N2O排放[19-22]。生物质炭基肥具有提供有效养分与减少温室气体排放的双重功效，但生物质炭基肥对毛竹林土壤N2O通量的影响机制尚不明确。基于此，本试验以亚热带地区毛竹林为研究对象，比较研究了生物质炭基尿素(以下称炭基尿素)和普通尿素(以下称尿素)施用对毛竹林土壤N2O通量、土壤温度、含水量、不同氮组分以及脲酶活性和蛋白酶活性的影响，分析土壤N2O通量与上述土壤环境因子之间的关系，旨在为研发森林土壤N2O减排的施肥技术提供参考。
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试验样地位于杭州市临安区青山镇亚热带典型毛竹林示范样地(30°13′N, 119°47′E)。该区域的年均气温为15.9 ℃，年均降水量为1420 mm。试验区的土壤类型为红壤，基本理化性质如下：土壤容重为1.14 g·cm−3，砂粒为48.7%，粉粒为33.1%，黏粒为18.2%，pH 为4.87，有机碳为18.2 g·kg−1，全氮为1.76 g·kg−1，碱解氮为106.9 mg·kg−1，有效磷为7.64 mg·kg−1，速效钾为90.5 mg·kg−1。
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试验地毛竹林由常绿阔叶林于2006年转化而来，其平均胸径9.8 cm，密度3 000株·hm−2。在该区域布置试验处理小区。试验包含5个处理：①对照(不施肥，ck)；②低水平尿素(100 kg·hm−2，LU)；③高水平尿素(300 kg·hm−2，HU)；④低水平炭基尿素(100 kg·hm−2，LBU)；⑤高水平炭基尿素(300 kg·hm−2，HBU)。随机区组设计(小区面积为120 m2)，重复3次。本试验中，炭基尿素制备流程为：将水稻Oryza sativa秸秆生物质炭(＜2 mm)以一定比例与尿素进行粉碎处理，放置造粒机中完成造粒，最后烘干至恒量。炭基尿素肥料中氮和碳的质量分数分别为32%和10%；用于制备炭基尿素的生物质炭的碳和氮的质量分数分别为5.8和569 g·kg−2。每个小区中心放置1个静态箱底座，分别在试验处理后的第1、7、28天采样气体和土壤样品，之后每月采样1次。采集的土壤样品用来测定土壤含水量、铵态氮(NH4 +-N)、硝态氮(NO3 –-N)、水溶性有机氮(WSON)、微生物量氮(MBN)、脲酶活性和蛋白酶活性。
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本试验采用静态箱-气相色谱法测定土壤N2O排放通量[23]。采集气体时间为9:00—11:00。使用注射器在0、10、20和30 min进行气体采集，随后注入真空气袋。在采集气体的同时，测定静态箱内温度和土壤表层5 cm处温度。气袋中N2O体积分数使用岛津GC-2014气相色谱仪测定。土壤N2O通量的计算如下[23-24]：
$$ F=\rho\times \frac{V}{A}\times \frac{P}{P_{0}} \times\frac{T_{0}}{T} \times\frac{\mathrm{d} C_{t}}{\mathrm{d} t} 。 $$ (1) 式(1)中：F为N2O(μg·m−2·h−1)的排放通量；ρ为标准状况下N2O气体的密度(mg·m−3)；V为静态箱体积(m3)；A为静态箱底部区域面积(m2)；T0和P0分别为标准状态下的绝对温度和气压；
$\dfrac{\mathrm{d} C_{t}}{\mathrm{~d} t}$ 为单位时间内取样箱内N2O气体体积分数的变化(m3·m−3·h−1)，t为取样时静态箱密闭时间(h)，Ct为该段时间内N2O气体体积分数变化值(m3·m−3)；T和P分别表示测定箱内的绝对温度(K)和大气压(Pa)。土壤N2O累积排放通量的计算公式如下：$$ M_{\mathrm{g}}=\sum_{i=1}^{{n}}\left(R_{i+1}+R_{i}\right) / 2 \times\left(t_{i+1}-t_{i}\right) \times 24 \times 10^{-5} 。 $$ (2) 式(2)中：Mg为N2O累积排放通量(kg·hm−2·a−1)，R为土壤N2O通量(μg·m−2·h−1)，i为采样次数，t为采样时间，n为总测定次数，ti+1−ti为2次采样的间隔天数[23-24]。
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在试验处理前，对样地表层土壤(0~20 cm)进行取样并测定相关指标。土壤含水量采用烘干法测定，有机碳和全氮质量分数使用元素分析仪测定，有效磷质量分数采用钼锑抗显色法[25]测定，速效钾质量分数采用火焰光度法测定[26]，碱解氮质量分数采用碱解扩散法测定[27]。在气体采样结束后立即采集土壤样品并进行分析测定。土壤WSON质量分数测定采用LI等[28]的方法测定，土壤MBN采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法测定[29]，NH4 +-N和NO3 –-N质量分数测定参照ZHOU等[30]的方法测定。土壤脲酶活性用靛酚蓝比色法[31]测定，蛋白酶活性的分析参照GREENFIELD等[32]的方法。
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数据处理与统计分析应用SPSS 23.0软件进行。应用重复测量方差分析确定试验处理、时间以及试验处理与时间的交互作用对土壤N2O通量的影响，应用单因素方差分析结合最小显著性差异法，分析试验处理对土壤N2O年均排放速率、年累积排放量以及其他土壤环境因子年均值的影响。应用一元线性回归方程，分析土壤N2O通量与土壤温度、含水量、氮组分、脲酶活性和蛋白酶活性之间的相关性。
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由表1可知：试验处理、处理后时间及两者交互作用对N2O具有极显著影响(P＜0.01)。在ck、LU、HU、LBU、HBU处理下，土壤N2O通量具有相似的季节变化规律(图1)。总体来看，土壤N2O排放通量在7—9月最大，在1—2月最小。毛竹林土壤N2O排放通量在尿素处理下显著增加，且随尿素用量增加而增加。然而，炭基尿素处理使毛竹林土壤N2O排放通量显著降低，其降低幅度随炭基尿素用量增加而增强。与ck相比，LU、HU处理使毛竹林土壤N2O的年均排放通量增加14.6%和31.9%；而LBU、HBU处理使毛竹林土壤N2O的年均排放通量降低了3.51%和14.4%(图2)。
表 1 不同施肥处理对9个响应变量影响的重复测量方差分析
Table 1. Repeated measures ANOVA for the effects of different fertilization treatments on nine response variables
项目 土壤温度 土壤含水量 NH4 +-N NO3 −-N WSON MBN 脲酶 蛋白酶 N2O 处理 ns ns ** ** ** ns ** ** ** 处理后时间 ** ** ** ** ** ** ** ** ** 处理×处理后时间 ** * ** ** ** ** ** ** ** 说明：ns表示影响不显著; *表示影响显著(P＜0.05); **表示影响极显著(P＜0.01) 
图 1 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤N2O通量的影响
Figure 1. Effects of biochar-based urea and common urea on soil N2O fluxes in a Ph. edulis forest
图 2 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤N2O年累积排放量的影响
Figure 2. Biochar-based urea and common urea effects on annual cumulative soil N2O effluxes in a Ph. edulis forest
如图2所示：毛竹林土壤N2O年累积排放量在尿素处理下显著增加，且随尿素用量增加而增加。然而，炭基尿素处理降低了毛竹林土壤N2O年累积排放量。相比于ck，低水平和高水平尿素处理导致土壤N2O年累积排放通量分别提高了17.3%和36.0%，低水平和高水平炭基尿素处理导致土壤N2O年累积排放通量分别减少了3.1%和16.9%。
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由表1可知：试验处理与处理后时间的交互作用对土壤含水量有显著影响(P＜0.05)，对土壤温度和MBN均具有极显著影响(P＜0.01)；试验处理、处理后时间及两者交互作用对土壤NH4 +-N、NO3 –-N和WSON质量分数以及脲酶和蛋白酶活性的影响达到极显著水平(P＜0.01)。在本试验5种处理下，毛竹林土壤温度均具有显著的季节性变化特征(图3A)。7—9月土壤温度最高，1—2月最低，但不同处理间土壤温度无显著性差异。由图3B可见：在ck、LU、HU、LBU、HBU处理下，土壤含水量年均值分别为282.2、284.7、286.9、289.9和287.4 g·kg−1。与ck相比，施肥处理对土壤含水量年均值无显著影响(表1)。
图 3 炭基尿素和普通尿素对毛竹林土壤温度和含水量的影响
Figure 3. Biochar-based urea and common urea effects on soil temperature and moisture content in a Ph. edulis forest
与ck相比，LU、HU、LBU和HBU处理下毛竹林土壤NH4 +-N质量分数年均值分别增加了36.9%、70.2%、18.5%和27.3%；使土壤NO3 –-N质量分数年均值分别增加了44.3%、53.6%、26.4%和17.6%(图4，表2)。与ck相比，LU、HU处理使毛竹林土壤WSON质量分数分别增加了3.3%和15.2%，而LBU、HBU处理使毛竹林土壤WSON含量分别降低了6.4%和13.2%(表2)。另外，炭基尿素和尿素处理均对土壤MBN质量分数无显著影响(表2)。
图 4 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤不同形态氮组分的影响
Figure 4. Biochar-based urea and common urea effects on different soil N fractions in a Ph. edulis forest
表 2 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤环境因子年均值的影响
Table 2. Biochar-based urea and common urea effects on annual mean value of soil environmental factors in a Ph. edulis forest
处理 NH4 +-N/
(mg·kg−1)NO3 −-N/
(mg·kg−1)WSON/
(mg·kg−1)MBN/
(mg·kg−1)脲酶/
(μmol·g−1·h−1)蛋白酶/
(μmol·g−1·h−1)ck 6.96 d 2.44 e 15.5 b 42.3 ab 1.15 b 0.88 c LU 9.52 b 3.34 b 16.1 b 43.1 a 1.28 a 0.97 b HU 11.84 a 3.60 a 16.9 a 43.3 a 1.33 a 1.03 a LBU 8.72 c 2.85 d 14.5 c 41.1 b 1.11 b 0.86 d HBU 9.14 bc 3.02 c 13.5 d 42.4 ab 1.00 c 0.77 e 说明：不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05) 由图5可见：脲酶与蛋白酶活性随季节变化呈现夏季高、冬季低的规律特征。相比于ck，LU和HU处理导致脲酶活性年均值分别提高了11.1%和15.6%；LBU和HBU处理使毛竹林土壤脲酶活性年均值分别降低了3.5%和12.9%(表2)。相比于ck，LU和HU处理均导致蛋白酶活性年均值显著增加，增幅分别为10.2%和17.0%；LBU和HBU处理则降低了土壤蛋白酶活性年均值，降幅为2.3%和12.5% (表2)。
图 5 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤脲酶和蛋白酶活性的影响
Figure 5. Biochar-based urea and common urea effects on activities of urease and protease in Ph. edulis forest soil
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由表3可见：在所有处理下，土壤N2O通量与土壤温度、WSON、脲酶和蛋白酶活性均呈极显著相关(P＜0.01)；与NH4 +-N质量分数呈现显著相关性(P＜0.05)；但与土壤含水量均无显著相关性。在ck、HU、LBU和HBU处理下，毛竹林土壤N2O排放通量与土壤NO3 −-N和MBN质量分数均呈显著相关(P＜0.05)，在LU处理下毛竹林土壤N2O排放通量与土壤NO3 −-N和MBN质量分数无显著相关性。
表 3 毛竹林土壤N2O通量与土壤因子的相关性
Table 3. Relationships between soil N2O efflux and environmental factors in a Ph. edulis forest
土壤因子 各处理土壤N2O与土壤因子的相关性 ck LU HU LBU HBU R2 P R2 P R2 P R2 P R2 P 土壤温度 0.75 ＜0.01 0.68 ＜0.01 0.77 ＜0.01 0.78 ＜0.01 0.62 ＜0.01 土壤含水量 0.18 ＞0.05 0.13 ＞0.05 0.16 ＞0.05 0.24 ＞0.05 0.20 ＞0.05 土壤NH4 +-N 0.73 ＜0.01 0.32 ＜0.05 0.30 ＜0.05 0.51 ＜0.01 0.46 ＜0.01 土壤NO3 −-N 0.47 ＜0.01 0.23 ＞0.05 0.31 ＜0.05 0.51 ＜0.01 0.52 ＜0.01 土壤WSON 0.46 ＜0.01 0.71 ＜0.01 0.68 ＜0.01 0.59 ＜0.01 0.48 ＜0.01 土壤MBN 0.51 ＜0.01 0.23 ＞0.05 0.35 ＜0.05 0.66 ＜0.01 0.76 ＜0.01 土壤脲酶 0.77 ＜0.01 0.52 ＜0.01 0.69 ＜0.01 0.90 ＜0.01 0.89 ＜0.01 土壤蛋白酶 0.78 ＜0.01 0.50 ＜0.01 0.62 ＜0.01 0.82 ＜0.01 0.75 ＜0.01 -
本研究发现，不同水平尿素处理均显著提高了毛竹林土壤N2O年累积排放量；高水平炭基尿素处理显著减少了土壤N2O年累积排放量。CORRÊA等[33]研究发现：尿素施用显著增加了暖季牧场土壤N2O的排放，李正东等[34]对小麦Triticum aestivum田土壤添加不同类型的炭基肥，发现与常规施肥相比，炭基复合肥显著降低了土壤N2O的排放通量，减排幅度为56.0%~65.4%，这与本研究结果相似。施用炭基尿素减少土壤N2O排放的原因可能是炭基尿素中的生物质炭增加了土壤孔隙结构，改善了土壤通气性，吸附了大量活性氮组分，从而显著降低了土壤反硝化速率，在一定程度上降低了N2O的排放速率[35-36]。
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本研究中，在ck、LU、HU、LBU和HBU处理下，土壤温度与毛竹林土壤N2O通量均呈现极显著相关性。该结果与DENG等[37]的研究结果相一致。DUAN等[38]研究温室菜地土壤发现：土壤N2O排放通量与土壤温度也具有十分密切的关系。因此，土壤温度是驱动土壤N2O排放变化的重要环境因子。但是，本研究结果发现不同处理之间的土壤温度没有显著差异，说明炭基尿素和尿素并不是通过改变土壤温度来影响土壤N2O排放。这一发现与BAYER等[39]的结果一致，其研究表明土壤N2O排放受不同管理措施影响，但这种影响不是通过改变土壤温度所致。
另外，本研究中，在ck、LU、HU、LBU和HBU处理下，土壤N2O通量与含水量之间的相关性均未达到显著水平。以往的研究结果也表明：人为管理的草甸草原土壤N2O排放与土壤含水量之间也无相关性[40]；而ADELEKUN等[41]的研究结果表明：尿素处理下，土壤水分与N2O通量存在显著相关性。不同研究结果的差异可能是由土壤类型、植被类型、集约管理措施和气候条件的差异所致[42-43]。在本研究中，土壤N2O排放与含水量之间无相关性可能是因为在亚热带地区降雨量充足，大部分季节土壤含水量均较高[44-45]，因此，土壤含水量可能不是驱动土壤N2O排放变化的关键因子。
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本研究发现，相比于ck，炭基尿素和尿素处理下的土壤NH4 +-N和NO3 –-N质量分数均显著增加，其原因可能是炭基尿素和尿素中的氮素成分可以显著增加土壤有机氮库[46]。另外，本研究结果表明：在ck、HU、LBU和HBU处理中，土壤NH4 +-N和NO3 –-N质量分数与N2O通量存在显著相关；在LU处理中，土壤NH4 +-N质量分数与N2O通量也存在显著相关。但尿素处理增加了N2O通量，炭基尿素处理降低了N2O通量。上述结果表明：尿素处理通过增加NH4 +-N和NO3 –-N质量分数来增加土壤N2O排放[43]；而炭基尿素处理并不是通过影响NH4 +-N和NO3 –-N质量分数来降低土壤N2O排放。
与ck相比，HU处理显著增加了土壤WSON质量分数，而炭基尿素处理显著降低了土壤WSON质量分数，并且土壤N2O通量与WSON质量分数极显著相关。WSON质量分数降低的可能原因可能是：①炭基尿素减少了土壤中有机氮化合物的降解[47]；②炭基尿素中生物质炭成分具有很高的比表面积，可以吸附可溶性的有机氮，从而降低WSON质量分数[28]。这些结果表明：炭基尿素处理可能是通过减少土壤WSON质量分数从而降低土壤N2O通量。
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本研究发现：炭基尿素处理显著降低了蛋白酶活性，HBU处理显著降低了土壤脲酶活性。这与ZHOU等[43]的结果相一致。炭基尿素处理下脲酶和蛋白酶活性降低的原因可能是：①炭基尿素处理中生物质炭成分具有较高的比表面积和阳离子交换量，可以吸附活性有机碳和有机氮，从而降低其对土壤微生物的生物有效性[48-50]；②炭基尿素处理中生物质炭成分对有机物的吸附作用，降低了参与氮循环过程中的土壤酶活性[50-53]。另外，本研究发现：在炭基尿素处理中土壤N2O通量与脲酶和蛋白酶活性极显著相关。这表明炭基尿素处理抑制脲酶和蛋白酶活性可能是其减少土壤N2O通量的机制之一。
尿素处理显著增加了土壤蛋白酶和脲酶活性，这与LIU等[54]的结果相一致。LIU等[54]的研究表明：化肥处理显著提高了玉米Zea mays土壤脲酶活性。SAHA等[55]也发现：在旱作大豆Glycine max-小麦轮作体系中，施用化肥显著提高了土壤蛋白酶活性。尿素处理下土壤脲酶和蛋白酶活性升高的机制可能是由于尿素施入提高了土壤氮素的有效性，从而增加了氮循环过程中相关酶的底物，提高了酶的活性[5,10]。此外，尿素处理下，土壤N2O通量与脲酶和蛋白酶活性极显著相关。上述结果说明：尿素处理刺激脲酶和蛋白酶活性可能是其提高土壤N2O通量的机制之一。
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尿素处理显著增加了毛竹林土壤N2O的年累积排放量，而炭基尿素处理显著降低了毛竹林土壤N2O的年累积排放量。这表明：相比于尿素，施用炭基尿素可以减缓毛竹林土壤N2O的排放。此外，本研究结果表明：炭基尿素减少土壤WSON质量分数以及抑制脲酶和蛋白酶活性可能是其降低土壤N2O排放的重要机制；尿素处理增加土壤N2O排放的重要机制是其提高了土壤WSON和NH4 +-N质量分数以及脲酶和蛋白酶活性。综上所述，在人工林经营管理实践中，采取施用炭基尿素来代替施用尿素的措施，在给植物提供充足氮素养分并改善土壤理化性质的同时，可以减少土壤温室气体的排放。
Effects of biochar-based urea and common urea on soil N2O flux in Phyllostachys edulis forest soil
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摘要:
目的 探索生物质炭基尿素和普通尿素的施用对毛竹Phyllostachys edulis林土壤氧化亚氮(N2O)通量与环境因子的影响效应与作用机制，为研发减缓土壤N2O排放的施肥技术提供科学依据。 方法 2018年9月至2019年9月，在杭州市临安区青山镇亚热带典型毛竹林样地布置野外控制试验。试验设5个处理：对照(不施肥)、低水平尿素(100 kg·hm−2)、高水平尿素(300 kg·hm−2)、低水平炭基尿素(100 kg·hm−2)和高水平炭基尿素(300 kg·hm−2)。采用静态箱—气相色谱法测定毛竹林土壤N2O排放速率，分析在上述施肥处理下土壤N2O通量、温度、含水量、氮素形态及相关酶活性的动态变化规律。 结果 低水平尿素和高水平尿素处理使毛竹林土壤N2O的年累积排放通量增加了17.3%和36.0%，而低水平炭基尿素和高水平炭基尿素处理分别使其降低了3.1%和16.9%。尿素和炭基尿素处理均显著提高土壤铵态氮(NH4 +-N)和硝态氮(NO3 –-N)质量分数(P＜0.05)；尿素处理显著增加了土壤水溶性有机氮质量分数以及脲酶和蛋白酶活性，而炭基尿素处理显著降低了上述3个指标(P＜0.05)。另外，在上述5个处理下，毛竹林土壤N2O排放速率与土壤温度、NH4 +-N、水溶性有机氮、脲酶活性和蛋白酶活性均存在显著相关性(P＜0.05)。 结论 与尿素相比，炭基尿素对毛竹林土壤N2O具有显著的减排效应，主要机制是其降低了土壤水溶性有机氮质量分数和氮循环相关酶活性。图5表3参55 Abstract:Objective The aim of this study is to explore the effect and mechanism of the application of biochar-based urea and common urea on soil N2O flux and environmental factors in Phyllostachys edulis forest, so as to provide scientific basis for the development of fertilization technology to reduce soil N2O emissions. Method A field control experiment was carried out in a typical subtropical Ph. edulis forest in Qingshan Town, Lin’an District of Hangzhou from September 2018 to September 2019. 5 treatments were set up: control (ck), low-level urea (100 kg·hm−2), high-level urea (300 kg·hm−2), low-level biochar-based urea (100 kg·hm−2) and high-level biochar-based urea (300 kg·hm−2). Soil N2O flux of Ph. edulis forest was determined by static chamber-gas chromatography, and the dynamic changes of soil N2O flux, temperature and water content, nitrogen forms and related enzyme activities were analyzed under the above fertilization treatments. Result Low-level urea and high-level urea treatments increased the annual cumulative N2O emission by 17.3% and 36.0%, while low-level biochar-based urea and high-level biochar-based urea treatments reduced it by 3.1% and 16.9%, respectively. Both urea and biochar-based urea treatments significantly increased soil NH4 +-N and NO3 –-N concentrations (P＜0.05). Urea treatment significantly increased the concentration of soil water-soluble organic nitrogen and activities of urease and protease, while biochar-based urea treatment significantly decreased the values of these 3 indicators (P＜0.05). In addition, under the above 5 treatments, there was a significant correlation between soil N2O emission rate and soil temperature, NH4 +-N, water-soluble organic nitrogen, urease and protease activities. Conclusion Compared with urea, biochar-based urea has a significant reduction effect on soil N2O flux in Ph. edulis forest, and the key mechanism lies in that biochar-based urea reduces concentration of soil water-soluble organic nitrogen and activities of N-cycling enzymes. [Ch, 5 fig. 3 tab. 55 ref.] -
Key words:
- Phyllostachys edulis forest /
- N2O /
- biochar-based urea /
- N form /
- fertilization
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桂花Osmanthus fragrans为木犀科Oleaceae木犀属Osmanthus，是中国十大传统名花之一，也是园林造景常用植物。根据开花时间不同，桂花可以分为秋桂和四季桂；根据花色差异，秋桂又可以分为丹桂、金桂和银桂。已有研究分析了桂花不同花色品种呈色物质成分，证实类胡萝卜素的种类及其质量分数是决定桂花花色的最主要因素[1−2]。目前，桂花类胡萝卜素的定性定量及其代谢途径中相关催化酶基因已被陆续分离得到[3−5]。桂花不同花色品种花瓣所含的类胡萝卜素中，β-胡萝卜素相对含量最高[1]。桂花番茄红素β-环化酶OfLCYB具备使番茄红素两端环化转化为β-胡萝卜素的能力，且OfLCYB对番茄红素的底物亲和性强于其他番茄红素环化酶，是桂花类胡萝卜素代谢途径中的关键催化酶[6−7]。沈子又等[8]分离得到了OfLCYB基因启动子，发现其启动子序列均包含有TATA-box、CAAT-box响应元件及水杨酸、赤霉素、脱落酸等激素响应元件等，但目前有关桂花OfLCYB基因上游转录因子的筛选及鉴定鲜见报道。
已有研究认为：ERF[9]、MYB[10]、NAC[11]等转录因子参与调控植物类胡萝卜素代谢。AP2/ERF转录因子家族具有众多的家族成员。根据AP2/ERF结构域的数目和序列特征，AP2/ERF家族转录因子分为AP2、ERF、CBF/DREB、RAV和Soloist这5个亚组，其中ERF类转录因子仅含有1个AP2/ERF结构域。ERF转录因子通过结合下游靶基因的GCC (GCCGCC)或DRE (CCGAC)序列[12]调节基因的表达，参与调节植物生长发育、生物或非生物胁迫应答、调控果实成熟等。此外，在拟南芥Arabidopsis thaliana[9]、番茄Solanum lycopersicum[13]和苹果Malus domestica[14]中还发现B2亚组的ERF转录因子具有调控植物类胡萝卜素合成的功能。拟南芥B2亚组ERF转录因子包括At3g16770.1(AtERF72/AtRAP2.3)、At1g72360.2 (AtERF73)、At1g53910.1 (AtERF74/AtRAP2.2)等5个成员。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。在黄龙胆Gentiana lutea[16]中，GlLCYB、GlLCYE、GlZEP、GlPDS、GlZDS、GlBCH基因的启动子上均存在ATCTA作用元件，说明ATCTA元件广泛存在于类胡萝卜素合成基因启动子上，表明B2亚组的ERF转录因子可能对一系列类胡萝卜素代谢基因具有调控作用。
本研究以桂花丹桂品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhong Gui’为材料，首先对OfLCYB基因启动子的ATCTA顺式作用元件进行分析，再对桂花B2亚组的ERF转录因子基因进行序列分析和表达分析，利用酵母单杂交技术筛选和鉴定与OfLCYB互作的关键B2亚组的OfERF转录因子，不仅可以扩展桂花花色研究领域，同时为揭示桂花类胡萝卜素代谢的调控网络提供理论依据，为桂花品种培育和种质创新提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料
选择浙江农林大学桂花资源圃生长状况良好的地栽桂花品种‘堰虹桂’为材料，分别采集‘堰虹桂’的新鲜嫩叶以及顶壳期(S1)、铃梗期(S2)、初花期(S3)、盛开期(S4)的花瓣样品[17]，每个样品3次生物学重复，取样时间均为10:00。上述叶片与花瓣样品快速采集后放入液氮冷冻，随后保存于−80 ℃超低温冰箱，供后续使用。
1.2 方法
1.2.1 OfLCYB启动子序列分析、克隆及OfLCYB基因表达分析
根据诺禾致源的Ultraclean plant DNA purification Kit试剂盒操作说明提取‘堰虹桂’的嫩叶鲜样DNA。借助PlantCARE数据库(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )分析启动子顺式作用元件。根据OfLCYB的启动子序列信息[8]设计引物，以‘堰虹桂’嫩叶DNA为模板扩增得到其启动子。以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以OfLCYB基因序列设计表达引物，以桂花OfACT基因[18]为内参基因，按照TB Green® Premix Ex TM TapⅡ说明进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析。引物序列见表1。利用参照基因的2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。表 1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences引物名称 引物序列(5′→3′) LCYB-PRO-GW-F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGCTTCTTGTTGTTGTACG LCYB-PRO-GW-R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCAATTTTGGCATGTTCTTAG OfLCYB-qF GAAAGGAGACGCCAAAGGGAG OfLCYB-qR GGAAGAAATAGCCGAGATGATAAGA 说明：小写字母表示部分attB序列。 1.2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
使用天根公司RNA perp Pure Plant Kit试剂盒，根据产品说明提取‘堰虹桂’不同时期的花瓣RNA。随后用紫外分光光度计和质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量。按照PrimeScriptTM RT Master Mix说明书将检验合格的盛花期RNA进行反转录。
应用Prot-Param在线软件 (
http://web.expasy.org/protparam/ ) 预测所编码蛋白的分子量、理论等电点、不稳定系数等；采用MEGAX软件中的邻位相邻法(NJ)进行同源聚类，建立系统发育树，并采用Bootstrap法(重复1 000次) 评估检测系统进化树。运用DNAMAN 7.0对4个OfERF基因推测所得的序列进行多序列比对分析。1.2.3 B2亚组OfERFs表达分析
以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以筛选得到的桂花B2亚组OfERFs序列设计引物，以桂花OfACT为内参基因。分析方法参照1.2.1。引物序列见表2。
表 2 OfERFs基因RT-qPCR引物序列Table 2 RT-qPCR primer sequences of OfERFs引物名称 引物序列(5′→3′) 引物名称 引物序列(5′→3′) OfERF73a-qF CTGAAGAGAAACCGCCAACAA OfERF72a-qR GGGTAGTAAACTTCTTGTTGCTGCGTA OfERF73a-qR TTAACGCCATCAGAAGACACAAGT OfERF72b-qF CAAATATCCTATGTTCAGAGG OfERF73b-qF AATTGGGATGCCGCCTCA OfERF72b-qR ATAGCATACCATAACATACCA OfERF73b-qR TTAAATCCCACCAAACATAGCACT OfACT-qF CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT OfERF72a-qF CCAACCCCACCGGCTC OfACT-qR ACCCCATCACCAGAATCAAGAA 1.2.4 OfERFs与OfLCYB启动子酵母互作验证
通过Gateway方法构建pAbAi-OfLCYB-pro载体，之后利用限制性内切酶BstB I线性化质粒pAbAi-OfLCYB-pro、阳性对照p53-AbAi以及阴性对照pAbAi载体。按照Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 User Manual产品说明制备酵母感受态，并将线性化的质粒转入感受态细胞中，涂布于尿嘧啶缺陷培养基(SD/-Ura)酵母板筛选培养基上，28 ℃倒置培养2~3 d。挑取单菌落扩大培养，提取酵母DNA。以粗提酵母DNA为模板，进行PCR检验。用质量分数为0.9% 的无菌氯化钠溶液稀释菌液，D(600)=0.002时，均匀涂布于金担子素A (AbA)不同浓度的SD/-Ura固体培养基上，倒置于28 ℃培养箱内培养2~3 d，以检测AbAr基因本底表达水平。将pGADT7-OfERF72a、pGADT7-OfERF72b、pGADT7-OfERF73a、pGADT7-OfERF73b和pGADT7-53、pGADT7分别转入诱饵菌株pAbAi-OfLCYB-pro和阳性对照p53-AbAi、阴性对照pAbAi的酵母感受态细胞，悬浮液均匀涂布于SD/-Leu缺陷培养基上，倒置于30 ℃培养箱内培养3~5 d，再将长出的单菌落分别在亮氨酸缺陷培养基(SD/-Leu)与含300 μg·L−1的亮氨酸缺陷培养基[SD/-Leu/AbA(300 μg·L−1)]点斑检测其互作情况。
2. 结果与分析
2.1 OfLCYB启动子序列分析及表达分析
由图1可见：桂花OfLCYB基因启动子序列含有2个ATCTA顺式作用元件。
图 1 OfLCYB启动子的ATCTA顺式作用元件分析Figure 1 Analysis of ATCTA cis-acting elements of the OfLCYB promoter通过荧光定量检测‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfLCYB的表达水平(图2)，发现OfLCYB的表达量从顶壳期到盛开期逐渐升高，在盛开期表达量最高。
图 2 OfLCYB在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 2 Expression of OfLCYB at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
通过对桂花转录组数据库分析，筛选获得4个B2亚组ERF有关的Unigene序列。利用MEGAX软件对4个桂花OfERFs氨基酸全长和拟南芥ERF家族的122个成员的氨基酸序列构建系统进化树，结果显示：4个桂花OfERFs与5个拟南芥ERF序列聚集在B2亚组(图3)。其中CL2088.Contig2和CL2088.Contig3聚为一小支，与拟南芥At3g16770.1 (AtERF72)的关系最为接近，将CL2088.Contig2和CL2088.Contig3分别命名为OfERF72a和OfERF72b。此外，CL550.Contig3、Unigene4342与拟南芥At1g72360.2 (AtERF73)关系较近，将CL550.Contig3和Unigene4342分别命名为OfERF73a和OfERF73b。
图 3 桂花B2亚组OfERFs系统发育分析Figure 3 Phylogenetic analysis of OfERFs in subgroup B2 of O. fragrans多序列比对分析发现(图4) ：4个OfERF基因均包含1个AP2保守结构域。4个OfERFs蛋白序列的基本理化性质(表3)分析发现：OfERF72a基因的氨基酸数量为232个，分子量为26 144 Da；OfERF72b基因的氨基酸数量为228个，分子量为25 841 Da；OfERF73a基因的氨基酸数量为386个，分子量为43 632 Da；OfERF73b基因的氨基酸数量为375个，分子量为41 607 Da。4个OfERF的理论等电点为4.63~5.33，均属于偏酸性蛋白质；总平均亲水指数均为负值，都属于亲水性蛋白。OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a不稳定系数分别为43.67、54.42、43.21，判断为不稳定的蛋白质；OfERF73b不稳定系数为38.40，判断为稳定的蛋白质。
图 4 B2亚组OfERFs氨基酸序列比对分析Figure 4 Amino acid multiple sequence alignment analysis of OfERFs of subgroup B2表 3 B2亚组OfERFs基本理化性质分析Table 3 Analysis of basic physicochemical properties OfERFs of subgroup B2基因名称 氨基酸数量/个 分子量/Da 理论等电点 不稳定系数 总平均亲水指数 OfERF72a 232 26 144 5.33 43.67 −0.744 OfERF72b 228 25 841 5.30 54.42 −0.796 OfERF73a 386 43 632 4.63 43.21 −0.739 OfERF73b 375 41 607 5.01 38.40 −0.710 2.3 B2亚组OfERFs表达分析
利用RT-qPCR技术分析‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b相对表达量(图5)发现：从顶壳期到盛开期，OfERF72a、OfERF72b的相对表达量基本呈现逐渐下降的趋势，OfERF73a的相对表达量在顶壳期、铃梗期与盛花期之间差异较小，在初花期相对表达量略有下降。OfERF73b的相对表达量在顶壳期、铃梗期较高，随后在初花期相对表达量显著下降(P＜0.05)。
图 5 B2亚组OfERF在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 5 Expression of OfERF genes of subgroup B2 at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’为了验证OfERFs与OfLCYB之间的关系，用y表示OfERFs的相对表达量取以10为底的对数，用x表示OfLCYB相对表达量取以10为底的对数进行相关性分析(图6)。其中，OfERF72a直线回归方程为y= − 0.987 6x − 0.010 0，决定系数(R2)为0.933 6，P=0.033 8；OfERF72b直线回归方程为y= − 1.208 0x − 0.077 9，R2=0.941 6，P=0.029 6。OfLCYB的表达水平与OfERF72a、OfERF72b呈显著负相关。
图 6 OfERFs与OfLCYB相对表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis of relative expression levels of OfERFs with OfLCYB2.4 酵母单杂交分析B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子互作
为了探究B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子之间是否存在物理互作，同时将阴性对照pAbAi+pGADT7、阳性对照p53-AbAi+pGADT7-Rec-p53以及实验组pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF分别接种于SD/-Leu与SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)的酵母培养基上，于30 ℃倒置培养3~5 d。结果发现(图7)：在SD/-Leu培养基上，酵母均能正常生长，而在SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)培养基上，只有阳性对照与pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF72b正常生长，其余酵母菌均不能生长，表明OfERF72b可以与OfLCYB启动子物理结合。
图 7 OfERF蛋白与OfLCYB启动子互作验证Figure 7 Verification of physical interaction between OfERF proteins and OfLCYB promoter3. 讨论
本研究得到4个桂花‘堰虹桂’B2亚组的OfERFs基因，编码区长度为687~1 161 bp，编码228~386个氨基酸残基。拟南芥B2亚组ERF At1g53910.1、At1g72360.2、At2g47520.1、At3g14230.1以及At3g16770.1分别编码358、262、171、397和248个氨基酸残基[15]。牡丹Paeonia suffruticosa ERF家族中B2亚组基因PsERF1编码区长度为1 158 bp，编码385个氨基酸残基[19]。在番木瓜Carica papaya中，属于B2亚组的基因CpERF4、CpERF6、CpERF9则分别编码431、253、234个氨基酸残基[20]。而在番茄ERF中，其B2亚组的SlERF6、SlERF.E.1、SlERF90、SlERF91、SlERF.A.3分别编码255、260、386、1 454和372个氨基酸残基[21]。由此可以发现：同一物种B2亚组ERF基因编码不同长度的氨基酸序列，推测其不同成员的功能存在差异。
对4个桂花OfERFs基因的氨基酸序列进行系统进化分析，发现OfERFs与拟南芥B2亚组ERF聚集在一起，说明它们的同源性较高。其中2个基因与At3g16770.1 (AtERF72/AtRAP2.3)聚为一支，2个基因与At1g72360.2 (AtERF73/AtRAP2.2)聚为另一小支。据此将4个OfERFs基因分别命名OfERF72a与OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b。桂花OfERF72与OfERF73均存在2个拷贝，说明桂花OfERF基因家族成员在进化和扩张过程中与基因重复事件有着紧密联系。在拟南芥中，AtERF72能够与缺铁反应基因IRT1、HA2和CLH1的启动子区域结合，负调控拟南芥的缺铁响应。与野生型植株相比，AtERF72突变体中铁和镁质量分数显著增加[22]。AtRAP2.3的同源基因SlERF6被证实是番茄中类胡萝卜素合成的负调控因子[13]。此外，在苹果中也有研究证明：AtRAP2.3的同源基因AP2D15可以负调控苹果PSY1和PSY2基因启动子序列中的ATCTA顺式作用元件[14]。拟南芥AtRAP2.2可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上调控基因的表达，过表达AtRAP2.2后导致植物体内类胡萝卜素降低[15]。
桂花花瓣中主要类胡萝卜素为β-胡萝卜素，其生物合成由OfLCYB直接催化生成，是桂花花瓣中类胡萝卜素代谢的重要催化酶[23]。OfLCYB基因启动子中存在2个ATCTA顺式作用元件，推测其响应B2亚组ERF转录因子的调控。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。进一步研究发现：OfERF72a和OfERF72b的表达趋势与OfLCYB基因呈显著负相关。酵母单杂交结果表明：OfERF72b与OfLCYB启动子存在物理结合，表明B2亚组的OfERF72b可能通过结合OfLCYB基因启动子ATCTA顺式作用元件调控其表达。ATCTA元件也存在于桂花OfPSY[24]和OfCCD1[25]等其他类胡萝卜素代谢基因的启动子上，其是否响应B2亚组的ERF转录因子的调控需要进一步研究。
4. 结论
本研究基于桂花‘堰虹桂’转录组数据筛选了4个OfERF基因，OfERF72a与OfERF72b基因表达量均随着开花进程逐渐下降，与OfLCYB基因的表达量显著负相关。OfLCYB基因启动子含有2个ATCTA顺式作用元件，OfERF72b与OfLCYB启动子之间存在互作，表明OfERF72b可能参与调控OfLCYB的表达。
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图 1 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤N2O通量的影响
Figure 1 Effects of biochar-based urea and common urea on soil N2O fluxes in a Ph. edulis forest
图 2 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤N2O年累积排放量的影响
Figure 2 Biochar-based urea and common urea effects on annual cumulative soil N2O effluxes in a Ph. edulis forest
图 3 炭基尿素和普通尿素对毛竹林土壤温度和含水量的影响
Figure 3 Biochar-based urea and common urea effects on soil temperature and moisture content in a Ph. edulis forest
图 4 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤不同形态氮组分的影响
Figure 4 Biochar-based urea and common urea effects on different soil N fractions in a Ph. edulis forest
图 5 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤脲酶和蛋白酶活性的影响
Figure 5 Biochar-based urea and common urea effects on activities of urease and protease in Ph. edulis forest soil
表 1 不同施肥处理对9个响应变量影响的重复测量方差分析
Table 1. Repeated measures ANOVA for the effects of different fertilization treatments on nine response variables
项目 土壤温度 土壤含水量 NH4 +-N NO3 −-N WSON MBN 脲酶 蛋白酶 N2O 处理 ns ns ** ** ** ns ** ** ** 处理后时间 ** ** ** ** ** ** ** ** ** 处理×处理后时间 ** * ** ** ** ** ** ** ** 说明：ns表示影响不显著; *表示影响显著(P＜0.05); **表示影响极显著(P＜0.01) 
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表 2 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤环境因子年均值的影响
Table 2. Biochar-based urea and common urea effects on annual mean value of soil environmental factors in a Ph. edulis forest
处理 NH4 +-N/
(mg·kg−1)NO3 −-N/
(mg·kg−1)WSON/
(mg·kg−1)MBN/
(mg·kg−1)脲酶/
(μmol·g−1·h−1)蛋白酶/
(μmol·g−1·h−1)ck 6.96 d 2.44 e 15.5 b 42.3 ab 1.15 b 0.88 c LU 9.52 b 3.34 b 16.1 b 43.1 a 1.28 a 0.97 b HU 11.84 a 3.60 a 16.9 a 43.3 a 1.33 a 1.03 a LBU 8.72 c 2.85 d 14.5 c 41.1 b 1.11 b 0.86 d HBU 9.14 bc 3.02 c 13.5 d 42.4 ab 1.00 c 0.77 e 说明：不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)
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表 3 毛竹林土壤N2O通量与土壤因子的相关性
Table 3. Relationships between soil N2O efflux and environmental factors in a Ph. edulis forest
土壤因子 各处理土壤N2O与土壤因子的相关性 ck LU HU LBU HBU R2 P R2 P R2 P R2 P R2 P 土壤温度 0.75 ＜0.01 0.68 ＜0.01 0.77 ＜0.01 0.78 ＜0.01 0.62 ＜0.01 土壤含水量 0.18 ＞0.05 0.13 ＞0.05 0.16 ＞0.05 0.24 ＞0.05 0.20 ＞0.05 土壤NH4 +-N 0.73 ＜0.01 0.32 ＜0.05 0.30 ＜0.05 0.51 ＜0.01 0.46 ＜0.01 土壤NO3 −-N 0.47 ＜0.01 0.23 ＞0.05 0.31 ＜0.05 0.51 ＜0.01 0.52 ＜0.01 土壤WSON 0.46 ＜0.01 0.71 ＜0.01 0.68 ＜0.01 0.59 ＜0.01 0.48 ＜0.01 土壤MBN 0.51 ＜0.01 0.23 ＞0.05 0.35 ＜0.05 0.66 ＜0.01 0.76 ＜0.01 土壤脲酶 0.77 ＜0.01 0.52 ＜0.01 0.69 ＜0.01 0.90 ＜0.01 0.89 ＜0.01 土壤蛋白酶 0.78 ＜0.01 0.50 ＜0.01 0.62 ＜0.01 0.82 ＜0.01 0.75 ＜0.01
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