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瓯柑Citrus suavissima优良新品种‘无子瓯柑’C. suavissima ‘Seedless’是通过芽变选种获得的，其果实无核，遗传性状稳定[1]。与瓯柑相比，两者的花粉量相当，但‘无子瓯柑’花药不易开裂，自然散发的花粉少[2]。形态学和细胞学研究表明：小孢子母细胞减数分裂异常是‘无子瓯柑’雄性不育的重要原因之一[2−3]。瓯柑及‘无子瓯柑’花粉发育早期的花药转录组与蛋白质组关联分析结果表明：差异代谢通路主要富集在苯丙素生物合成、黄酮类化合物生物合成和苯丙氨酸代谢通路[4]。CsRNF217基因是瓯柑与‘无子瓯柑’在小孢子母细胞时期与苯丙素生物合成途径密切关联的重要基因，与瓯柑相比，该基因在同时期的‘无子瓯柑’中显著上调表达；CsRNF217基因的氨基酸序列中存在RING-HC_RBR和IBR 2个结构域，属于典型的单亚基RING-HC E3亚家族，定位于细胞核[5]。
泛素化是真核生物中一种高度通用的翻译后修饰，它介导蛋白酶体降解、细胞运输、蛋白质相互作用和细胞蛋白质的功能激活[6−8]。泛素化级联需要3种不同的酶催化：E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶[9]。其中，E3泛素连接酶具有显著的多样性，它决定了底物的特异性，并作为调节细胞反应的枢纽[10−11]。E3泛素连接酶分为单亚基和多亚基两类。单亚基组由3个主要的亚家族组成：RING、HECT以及U-box结构域家族[11−13]。CsRNF217基因即属于单亚基RING结构域家族。E3泛素连接酶在植物的生长发育过程中起着关键的作用，包括细胞程序性死亡和抗病防御反应[14]、成花调控[15]、生物[16]和非生物应激反应[14]以及花粉发育[17−19]等。其中，在水稻Oryza sativa[17]、拟南芥Arabidopsis thaliana[18]、白菜Brassica campestris ssp. chinensis[19]中发现的RING型E3泛素连接酶基因DSNP1、DAF、Bra015092等在花粉发育过程中起重要作用。
本研究以过表达‘无子瓯柑’CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum植株为材料，通过对基因表达分析、转基因自交1代植株(T1)花粉活力、转基因植株自交及与野生型烟草正反交的结实率等参数的测定，分析过表达CsRNF217对转基因烟草植株育性的影响，为进一步揭示CsRNF217基因在‘无子瓯柑’雌雄败育过程中的重要作用提供参考。
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以野生型烟草(WT)作为对照，采用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法获得过表达CaMV 35S :: CsRNF217的阳性转基因烟草[5](T0)。将T0自交种子穴盘播种获得转基因烟草自交1代植株(T1)。采集T1阳性烟草植株6#、35#、63#株系的叶片及含苞待放花蕾的花药，立即置于液氮中速冻并于−80 ℃保存，用于半定量RT-PCR分析。
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采集野生型烟草及T1烟草植株的叶片，采用CTAB法提取DNA，以pCAMBIA 2300s : CsRNF217质粒作为阳性对照，ddH2O为阴性对照，用35S_F及基因特异引物CsRNF217_R838_S[5](表1)进行PCR检测筛选阳性植株，PCR程序为94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35次循环；72 ℃，10 min；12 ℃保存。
表 1 引物信息
Table 1. Specific primers used in this study
引物名称 引物序列(5′→3′) CsRNF217_R838_S GTCGACTTGCATAGAGCCAATAAA 35S_F ACGCACAATCCCACTATCCTTC CsRNF217_qL2 ACGTGCGAGGGTATGAAAGA CsRNF217_qR2 TACCCTCCATGCCACTTCAG EF1α-F TGGTTGTGACTTTTGGTCCCA EF1α-R ACAAACCCACGCTTGAGATCC -
于晴天10:00采集烟草含苞待放的花蕾，采用亚历山大染色法[20]对野生型烟草及经PCR鉴定的T1阳性植株进行花粉染色活力检测，采用花粉离体培养法[21]对花粉染色活力显著下降的烟草单株进行花粉萌发试验，每个植株随机挑选3朵花作为生物学重复。花粉粒被染为紫红色的视为有活力的花粉粒，花粉管长度大于或等于花粉粒直径视为萌发。花粉染色活力=着色花粉粒数/视野中的花粉粒总数×100%，花粉萌发率=萌发花粉粒数/视野中的花粉粒总数×100%。
使用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa，日本)试剂盒，提取野生型烟草及花粉活力显著下降的T1烟草阳性植株花药RNA，采用EASYScript one-step gDNA removal and cDNA synthesis supermix (TransGen Biotech code#AE311- 03)试剂盒进行cDNA合成，使用CsRNF217基因对引物和烟草内参基因EF1α特异引物(表1)进行半定量RT-PCR分析，程序为94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，29次循环；72 ℃，10 min；12 ℃保存。
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于晴天10:00收集野生型和T1已开花，但未散粉植株的花药于离心管，4 ℃干燥保存备用。于傍晚用干净的小镊子摘去即将开放花蕾的花瓣和雄蕊。次日10:00蘸取花粉轻点已分泌黏液的柱头，套袋，每个植株进行3朵花的正反交重复，3 d后摘去袋子。正反交组合配置中，正交授粉以转基因株系为父本，野生型为母本；反交授粉以野生型为父本，转基因株系为母本。种子成熟时统计每个单株采收的蒴果数，测量蒴果横径、纵径及种子总质量。
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采用SPSS软件对种子萌发率、花粉染色活力、花粉离体萌发率、蒴果横纵径及种子数量等进行了单因素方差分析(one-way ANOVA，LSD)。
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T0烟草种子穴盘播种共获得137个单株，其中6#株系16株，35#株系80株，63#株系41株。以野生型及T0种子播种获得的烟草叶片DNA为模板，经PCR检测，共获得68株阳性植株(表2)。其中，6#株系10株，35#株系33株，63#株系25株，阳性率分别为62.5%、41.2%、61.5%。
表 2 野生型及T1烟草植株阳性率与花粉染色活力
Table 2. Positive rate and pollen viability of wild type and T1 tobacco plants
株系 株数/
株阳性
株数/株植株阳
性率/%花粉染色活力
均值/%6# 16 10 62.5 19.5±2.7 b 35# 80 33 41.2 31.9±2.8 b 63# 41 25 61.5 21.8±2.3 b WT 3 0 0 94.5±2.4 a 说明：同列不同字母表示不同株系间花粉染色活力差异显著(P＜0.05)。WT为野生型株系。 -
T1阳性烟草植株花粉的散粉量与野生型存在差异(图1)。野生型植株花药开裂后，散粉量多，可见大量花粉散布于花瓣及柱头；T1阳性烟草植株花药裂开后，散粉量少，几乎无可见花粉散出。经染色法和花粉离体萌发培养(图2)：T1阳性烟草植株花粉染色活力显著低于野生型植株(图3，P＜0.05)。有活力的花粉粒经亚历山大染色后呈紫红色，无活力的花粉粒呈黄褐色。野生型植株经亚历山大染色后花粉粒大多呈紫红色(94.5%)，阳性植株呈紫红色的花粉粒数量显著少于野生型(图3，P＜0.05)。其中6#株系的14号单株(6#14)、35#株系的4号单株(35#4)、63#株系的4号单株(63#4)的花粉经亚历山大染色后着色率最低，分别为9.6%、12.0%、9.7%。有活力的花粉粒能在适宜的离体条件下萌发，T1阳性植株花粉粒的萌发率显著低于野生型植株(60.3%)。其中6#株系的9号单株(6#9)、6#株系的14号单株(6#14)、63#株系的4号单株(63#4)的花粉粒萌发率在各株系中最低，分别为30.6%、29.0%、33.4%。半定量RT-PCR分析显示(图4)：CsRNF217基因在过表达的各株系中均能表达，其中，外源基因在63#株系各单株花药中的表达量最高。
图 1 野生型与T1阳性植株成熟花药形态及散粉情况
Figure 1. Anther morphology and pollen release of wild type and T1 positive plants
图 2 野生型及T1阳性植株的花粉活力
Figure 2. Pollen viability of wild type and T1 positive plants
图 3 野生型及T1阳性植株的花粉活力
Figure 3. Pollen vitality of wild-type and T1 positive plants
图 4 野生型及T1阳性植株半定量RT-PCR分析
Figure 4. Semi-quantitative RT-PCR of wild type and T1 positive plants
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对花粉染色活力、萌发率都显著低于野生型的T1转基因阳性单株进行授粉(表3，图5)表明：自交和与野生型进行正反交的各授粉组合均能结实，但蒴果大小及种子数量存在较大差异。蒴果横径的比较结果显示：转基因63#株系自交、与野生型进行正反交的蒴果横径均显著小于野生型自交的蒴果(P＜0.05)；35#株系自交蒴果的横径显著小于野生型自交(P＜0.05)。蒴果纵径的比较结果显示：转基因63#株系自交和与野生型反交的蒴果纵径均显著小于野生型自交(P＜0.05)，其余组合与野生型自交无显著差异。根据烟草原始种的种子千粒重(0.087 g)[22]，计算每个株系的单果种子数量。阳性株系自交、与野生型正反交获得的种子数量都显著低于野生型自交种子数(P＜0.05)，但转基因株系之间无显著差异。
表 3 野生型及阳性株系自交及杂交试验的蒴果大小和种子数量
Table 3. Capsule and seed number in selfing and hybridization test
处理 株系 蒴果横径/mm 蒴果纵径/mm 种子数量/(粒·果−1) 自交 WT 9.2±0.2 a 15.8±0.2 a 1 525.7±19.9 a 6# 8.9±0.1 ab 14.9±0.1 ab 1 030.4±105.2 b 35# 8.4±0.1 bcd 14.9±0.1 ab 948.5±37.3 b 63# 8.4±0.0 bcd 14.6±0.1 b 1 006.7±36.0 b 正交 WT (♀) × 6# (♂) 8.5±0.1 abcd 15.2±0.4 ab 845.5±69.4 b WT (♀) × 35# (♂) 8.6±0.2 abc 14.3±0.2 b 924.6±26.7 b WT (♀) × 63# (♂) 8.1±0.2 cd 15.0±0.4 ab 1 049.8±8.0 b 反交 6# (♀) × WT (♂) 8.6±0.2 abc 15.1±0.5 ab 1 103.4±119.8 b 35# (♀) × WT (♂) 9.1±0.3 ab 14.8±0.5 ab 992.3±185.9 b 63# (♀) × WT (♂) 7.8±0.3 d 14.4±0.4 b 914.4±90.7 b 说明：WT表示野生型烟草。同列不同字母表示株系间差异显著(P＜0.05)。 
图 5 野生型与T1阳性植株自交及与野生型正反交授粉后的蒴果及种子
Figure 5. Capsules and seeds of wild type and T1 positive plants after self-crossing and cross-pollination with wild type
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本研究表明：过表达CsRNF217的烟草植株在花粉染色活力、花粉萌发率、蒴果大小及种子数量上均显著低于野生型，说明过表达CsRNF217降低了转基因烟草的小孢子育性，甚至对胚囊育性也存在一定的影响。
近年来的研究表明：RING型E3泛素连接酶基因参与了植物花粉发育[19]、花药开裂[18]、胚囊发育[17]等生命过程。水稻中的RING型E3泛素连接酶DSNP1与水稻减数分裂过程中的联会复合体组装和同源重组关系密切，其突变体dsnp1中形成的稳定同源配对和重组交叉严重减少，并最终形成活性较低的花粉[17]。然而，白菜中过表达E3泛素连接酶基因Bra015092，也降低了转基因白菜的花粉染色活力和萌发率，并导致了花粉外部形态的畸形[19]。前期研究表明：‘无子瓯柑’成熟花粉的染色活力和离体萌发率均显著低于有籽瓯柑，其小孢子母细胞减数分裂异常[2−3]，CsRNF217的表达在小孢子发育早期显著上调[5]。本研究中过表达CsRNF217的烟草花粉离体萌发率为野生型的一半，花粉染色活力则更低。推测CsRNF217基因可能通过负调控小孢子母细胞的减数分裂过程参与‘无子瓯柑’的花粉发育。拟南芥E3泛素连接酶基因DAF在雄蕊中特异表达，并通过正向调控茉莉酸生物合成途径来促进花药开裂，通过干涉实验抑制其表达的植株则表现为雄性不育[18]。‘无子瓯柑’的花药自然开裂难、散粉量低[2−3]，实时定量PCR结果显示：CsRNF217基因在雄蕊的表达丰度显著高于其他花器官[5]。本研究中，过表达CsRNF217的转基因烟草也表现出自然散粉较弱的特性，推测CsRNF217可能参与了花药开裂的调控。
以野生型花粉对水稻不育突变体dsnp1进行授粉，突变体不能结实，表明该突变体既是雄性不育的，也表现出雌性不育[17]，说明该RING型E3泛素连接酶DSNP1对水稻的雌雄育性都有影响。本研究表明：转基因烟草不仅花粉活力显著下降，其种子数量也显著减少，说明CsRNF217的超量表达在负调控花粉育性的同时，对胚囊的育性也存在一定的调控作用。在生产实践中，‘无子瓯柑’在同其他有籽柑橘品种混栽时也表现无籽，说明胚囊败育是‘无子瓯柑’果实无核的重要原因，因此CsRNF217对‘无子瓯柑’胚囊育性的影响值得进一步研究。
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E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草的育性存在显著影响，过表达‘无子瓯柑’CsRNF217的T1烟草阳性植株雌雄育性均显著下降，推测CsRNF217对‘无子瓯柑’的育性存在负调控作用。
Fertility effect of E3 ubiquitin ligase gene CsRNF217 in transgenic tobacco plants
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摘要:
目的 为了验证‘无子瓯柑’Citrus suavissima ‘Seedless’ E3泛素连接酶基因CsRNF217对雄蕊育性的影响，采用异源转化获得过表达CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum，分析其对烟草育性的影响。 方法 采用亚历山大染色法、花粉离体培养法、杂交授粉后的结实率分析野生型烟草及转基因烟草自交1代(T1)阳性株系的花粉活力及胚囊育性，利用半定量RT-PCR分析基因CsRNF217在转基因烟草T1阳性株系花药中的表达强弱。 结果 ‘无子瓯柑’CsRNF217在转基因烟草自交T1株系中高效表达，转基因株系的花粉染色活力和离体萌发率、自交结实率、以及与野生型的正反交结实率均显著低于野生型(P＜0.05)。 结论 过表达CsRNF217的烟草植株花粉育性显著下降，同时伴随胚囊育性下降的现象，推测CsRNF217基因对‘无子瓯柑’雌雄育性存在负向调控的作用。图5表3参22 Abstract:Objective This study, with an investigation into the transgenic plants of tobacco (Nicotiana tabacum) overexpressing CsRNF217, is aimed to verify the effect of the E3 ubiquitin ligase gene CsRNF217 of Citrus suavissima ‘Seedless’ on male sterility. Method First, an analysis was conducted of the pollen viability of wild type (WT) and the positive plants of the 1st generation of selfing of transgenic plants (T1) with the employment Alexander staining and pollen germination in vitro. Then, the seed setting rate was obtained via selfing and reciprocal crosses between transgenic plants and WT. Finally, semi-quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) was used to analyze the relative expression of CsRNF217 in T1 positive tobacco plants. Result CsRNF217 derived from C. suavissima ‘Seedless’ was efficiently expressed in T1 lines. The pollen dyeing viability and in vitro germination rate of T1 lines, selfing seed setting rate of T1 lines, and seed setting rate of T1 lines reciprocal crosses with WT were significantly lower than those of WT (P＜0.05). Conclusion T1 plants overexpressing CsRNF217 had a severe decline in pollen fertility and partial aberrant of embryo sac, suggesting that an up-regulation of CsRNF217 could play a negative regulatory role on male and female fertility of C. suavissima ‘Seedless’. [Ch, 5 fig. 3 tab. 22 ref.] -
Key words:
- Citrus /
- E3 ubiquitin ligase /
- male sterility /
- embryo sac abortion
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桂花Osmanthus fragrans为木犀科Oleaceae木犀属Osmanthus，是中国十大传统名花之一，也是园林造景常用植物。根据开花时间不同，桂花可以分为秋桂和四季桂；根据花色差异，秋桂又可以分为丹桂、金桂和银桂。已有研究分析了桂花不同花色品种呈色物质成分，证实类胡萝卜素的种类及其质量分数是决定桂花花色的最主要因素[1−2]。目前，桂花类胡萝卜素的定性定量及其代谢途径中相关催化酶基因已被陆续分离得到[3−5]。桂花不同花色品种花瓣所含的类胡萝卜素中，β-胡萝卜素相对含量最高[1]。桂花番茄红素β-环化酶OfLCYB具备使番茄红素两端环化转化为β-胡萝卜素的能力，且OfLCYB对番茄红素的底物亲和性强于其他番茄红素环化酶，是桂花类胡萝卜素代谢途径中的关键催化酶[6−7]。沈子又等[8]分离得到了OfLCYB基因启动子，发现其启动子序列均包含有TATA-box、CAAT-box响应元件及水杨酸、赤霉素、脱落酸等激素响应元件等，但目前有关桂花OfLCYB基因上游转录因子的筛选及鉴定鲜见报道。
已有研究认为：ERF[9]、MYB[10]、NAC[11]等转录因子参与调控植物类胡萝卜素代谢。AP2/ERF转录因子家族具有众多的家族成员。根据AP2/ERF结构域的数目和序列特征，AP2/ERF家族转录因子分为AP2、ERF、CBF/DREB、RAV和Soloist这5个亚组，其中ERF类转录因子仅含有1个AP2/ERF结构域。ERF转录因子通过结合下游靶基因的GCC (GCCGCC)或DRE (CCGAC)序列[12]调节基因的表达，参与调节植物生长发育、生物或非生物胁迫应答、调控果实成熟等。此外，在拟南芥Arabidopsis thaliana[9]、番茄Solanum lycopersicum[13]和苹果Malus domestica[14]中还发现B2亚组的ERF转录因子具有调控植物类胡萝卜素合成的功能。拟南芥B2亚组ERF转录因子包括At3g16770.1(AtERF72/AtRAP2.3)、At1g72360.2 (AtERF73)、At1g53910.1 (AtERF74/AtRAP2.2)等5个成员。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。在黄龙胆Gentiana lutea[16]中，GlLCYB、GlLCYE、GlZEP、GlPDS、GlZDS、GlBCH基因的启动子上均存在ATCTA作用元件，说明ATCTA元件广泛存在于类胡萝卜素合成基因启动子上，表明B2亚组的ERF转录因子可能对一系列类胡萝卜素代谢基因具有调控作用。
本研究以桂花丹桂品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhong Gui’为材料，首先对OfLCYB基因启动子的ATCTA顺式作用元件进行分析，再对桂花B2亚组的ERF转录因子基因进行序列分析和表达分析，利用酵母单杂交技术筛选和鉴定与OfLCYB互作的关键B2亚组的OfERF转录因子，不仅可以扩展桂花花色研究领域，同时为揭示桂花类胡萝卜素代谢的调控网络提供理论依据，为桂花品种培育和种质创新提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料
选择浙江农林大学桂花资源圃生长状况良好的地栽桂花品种‘堰虹桂’为材料，分别采集‘堰虹桂’的新鲜嫩叶以及顶壳期(S1)、铃梗期(S2)、初花期(S3)、盛开期(S4)的花瓣样品[17]，每个样品3次生物学重复，取样时间均为10:00。上述叶片与花瓣样品快速采集后放入液氮冷冻，随后保存于−80 ℃超低温冰箱，供后续使用。
1.2 方法
1.2.1 OfLCYB启动子序列分析、克隆及OfLCYB基因表达分析
根据诺禾致源的Ultraclean plant DNA purification Kit试剂盒操作说明提取‘堰虹桂’的嫩叶鲜样DNA。借助PlantCARE数据库(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )分析启动子顺式作用元件。根据OfLCYB的启动子序列信息[8]设计引物，以‘堰虹桂’嫩叶DNA为模板扩增得到其启动子。以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以OfLCYB基因序列设计表达引物，以桂花OfACT基因[18]为内参基因，按照TB Green® Premix Ex TM TapⅡ说明进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析。引物序列见表1。利用参照基因的2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。表 1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences引物名称 引物序列(5′→3′) LCYB-PRO-GW-F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGCTTCTTGTTGTTGTACG LCYB-PRO-GW-R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCAATTTTGGCATGTTCTTAG OfLCYB-qF GAAAGGAGACGCCAAAGGGAG OfLCYB-qR GGAAGAAATAGCCGAGATGATAAGA 说明：小写字母表示部分attB序列。 1.2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
使用天根公司RNA perp Pure Plant Kit试剂盒，根据产品说明提取‘堰虹桂’不同时期的花瓣RNA。随后用紫外分光光度计和质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量。按照PrimeScriptTM RT Master Mix说明书将检验合格的盛花期RNA进行反转录。
应用Prot-Param在线软件 (
http://web.expasy.org/protparam/ ) 预测所编码蛋白的分子量、理论等电点、不稳定系数等；采用MEGAX软件中的邻位相邻法(NJ)进行同源聚类，建立系统发育树，并采用Bootstrap法(重复1 000次) 评估检测系统进化树。运用DNAMAN 7.0对4个OfERF基因推测所得的序列进行多序列比对分析。1.2.3 B2亚组OfERFs表达分析
以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以筛选得到的桂花B2亚组OfERFs序列设计引物，以桂花OfACT为内参基因。分析方法参照1.2.1。引物序列见表2。
表 2 OfERFs基因RT-qPCR引物序列Table 2 RT-qPCR primer sequences of OfERFs引物名称 引物序列(5′→3′) 引物名称 引物序列(5′→3′) OfERF73a-qF CTGAAGAGAAACCGCCAACAA OfERF72a-qR GGGTAGTAAACTTCTTGTTGCTGCGTA OfERF73a-qR TTAACGCCATCAGAAGACACAAGT OfERF72b-qF CAAATATCCTATGTTCAGAGG OfERF73b-qF AATTGGGATGCCGCCTCA OfERF72b-qR ATAGCATACCATAACATACCA OfERF73b-qR TTAAATCCCACCAAACATAGCACT OfACT-qF CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT OfERF72a-qF CCAACCCCACCGGCTC OfACT-qR ACCCCATCACCAGAATCAAGAA 1.2.4 OfERFs与OfLCYB启动子酵母互作验证
通过Gateway方法构建pAbAi-OfLCYB-pro载体，之后利用限制性内切酶BstB I线性化质粒pAbAi-OfLCYB-pro、阳性对照p53-AbAi以及阴性对照pAbAi载体。按照Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 User Manual产品说明制备酵母感受态，并将线性化的质粒转入感受态细胞中，涂布于尿嘧啶缺陷培养基(SD/-Ura)酵母板筛选培养基上，28 ℃倒置培养2~3 d。挑取单菌落扩大培养，提取酵母DNA。以粗提酵母DNA为模板，进行PCR检验。用质量分数为0.9% 的无菌氯化钠溶液稀释菌液，D(600)=0.002时，均匀涂布于金担子素A (AbA)不同浓度的SD/-Ura固体培养基上，倒置于28 ℃培养箱内培养2~3 d，以检测AbAr基因本底表达水平。将pGADT7-OfERF72a、pGADT7-OfERF72b、pGADT7-OfERF73a、pGADT7-OfERF73b和pGADT7-53、pGADT7分别转入诱饵菌株pAbAi-OfLCYB-pro和阳性对照p53-AbAi、阴性对照pAbAi的酵母感受态细胞，悬浮液均匀涂布于SD/-Leu缺陷培养基上，倒置于30 ℃培养箱内培养3~5 d，再将长出的单菌落分别在亮氨酸缺陷培养基(SD/-Leu)与含300 μg·L−1的亮氨酸缺陷培养基[SD/-Leu/AbA(300 μg·L−1)]点斑检测其互作情况。
2. 结果与分析
2.1 OfLCYB启动子序列分析及表达分析
由图1可见：桂花OfLCYB基因启动子序列含有2个ATCTA顺式作用元件。
图 1 OfLCYB启动子的ATCTA顺式作用元件分析Figure 1 Analysis of ATCTA cis-acting elements of the OfLCYB promoter通过荧光定量检测‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfLCYB的表达水平(图2)，发现OfLCYB的表达量从顶壳期到盛开期逐渐升高，在盛开期表达量最高。
图 2 OfLCYB在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 2 Expression of OfLCYB at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
通过对桂花转录组数据库分析，筛选获得4个B2亚组ERF有关的Unigene序列。利用MEGAX软件对4个桂花OfERFs氨基酸全长和拟南芥ERF家族的122个成员的氨基酸序列构建系统进化树，结果显示：4个桂花OfERFs与5个拟南芥ERF序列聚集在B2亚组(图3)。其中CL2088.Contig2和CL2088.Contig3聚为一小支，与拟南芥At3g16770.1 (AtERF72)的关系最为接近，将CL2088.Contig2和CL2088.Contig3分别命名为OfERF72a和OfERF72b。此外，CL550.Contig3、Unigene4342与拟南芥At1g72360.2 (AtERF73)关系较近，将CL550.Contig3和Unigene4342分别命名为OfERF73a和OfERF73b。
图 3 桂花B2亚组OfERFs系统发育分析Figure 3 Phylogenetic analysis of OfERFs in subgroup B2 of O. fragrans多序列比对分析发现(图4) ：4个OfERF基因均包含1个AP2保守结构域。4个OfERFs蛋白序列的基本理化性质(表3)分析发现：OfERF72a基因的氨基酸数量为232个，分子量为26 144 Da；OfERF72b基因的氨基酸数量为228个，分子量为25 841 Da；OfERF73a基因的氨基酸数量为386个，分子量为43 632 Da；OfERF73b基因的氨基酸数量为375个，分子量为41 607 Da。4个OfERF的理论等电点为4.63~5.33，均属于偏酸性蛋白质；总平均亲水指数均为负值，都属于亲水性蛋白。OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a不稳定系数分别为43.67、54.42、43.21，判断为不稳定的蛋白质；OfERF73b不稳定系数为38.40，判断为稳定的蛋白质。
图 4 B2亚组OfERFs氨基酸序列比对分析Figure 4 Amino acid multiple sequence alignment analysis of OfERFs of subgroup B2表 3 B2亚组OfERFs基本理化性质分析Table 3 Analysis of basic physicochemical properties OfERFs of subgroup B2基因名称 氨基酸数量/个 分子量/Da 理论等电点 不稳定系数 总平均亲水指数 OfERF72a 232 26 144 5.33 43.67 −0.744 OfERF72b 228 25 841 5.30 54.42 −0.796 OfERF73a 386 43 632 4.63 43.21 −0.739 OfERF73b 375 41 607 5.01 38.40 −0.710 2.3 B2亚组OfERFs表达分析
利用RT-qPCR技术分析‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b相对表达量(图5)发现：从顶壳期到盛开期，OfERF72a、OfERF72b的相对表达量基本呈现逐渐下降的趋势，OfERF73a的相对表达量在顶壳期、铃梗期与盛花期之间差异较小，在初花期相对表达量略有下降。OfERF73b的相对表达量在顶壳期、铃梗期较高，随后在初花期相对表达量显著下降(P＜0.05)。
图 5 B2亚组OfERF在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 5 Expression of OfERF genes of subgroup B2 at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’为了验证OfERFs与OfLCYB之间的关系，用y表示OfERFs的相对表达量取以10为底的对数，用x表示OfLCYB相对表达量取以10为底的对数进行相关性分析(图6)。其中，OfERF72a直线回归方程为y= − 0.987 6x − 0.010 0，决定系数(R2)为0.933 6，P=0.033 8；OfERF72b直线回归方程为y= − 1.208 0x − 0.077 9，R2=0.941 6，P=0.029 6。OfLCYB的表达水平与OfERF72a、OfERF72b呈显著负相关。
图 6 OfERFs与OfLCYB相对表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis of relative expression levels of OfERFs with OfLCYB2.4 酵母单杂交分析B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子互作
为了探究B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子之间是否存在物理互作，同时将阴性对照pAbAi+pGADT7、阳性对照p53-AbAi+pGADT7-Rec-p53以及实验组pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF分别接种于SD/-Leu与SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)的酵母培养基上，于30 ℃倒置培养3~5 d。结果发现(图7)：在SD/-Leu培养基上，酵母均能正常生长，而在SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)培养基上，只有阳性对照与pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF72b正常生长，其余酵母菌均不能生长，表明OfERF72b可以与OfLCYB启动子物理结合。
图 7 OfERF蛋白与OfLCYB启动子互作验证Figure 7 Verification of physical interaction between OfERF proteins and OfLCYB promoter3. 讨论
本研究得到4个桂花‘堰虹桂’B2亚组的OfERFs基因，编码区长度为687~1 161 bp，编码228~386个氨基酸残基。拟南芥B2亚组ERF At1g53910.1、At1g72360.2、At2g47520.1、At3g14230.1以及At3g16770.1分别编码358、262、171、397和248个氨基酸残基[15]。牡丹Paeonia suffruticosa ERF家族中B2亚组基因PsERF1编码区长度为1 158 bp，编码385个氨基酸残基[19]。在番木瓜Carica papaya中，属于B2亚组的基因CpERF4、CpERF6、CpERF9则分别编码431、253、234个氨基酸残基[20]。而在番茄ERF中，其B2亚组的SlERF6、SlERF.E.1、SlERF90、SlERF91、SlERF.A.3分别编码255、260、386、1 454和372个氨基酸残基[21]。由此可以发现：同一物种B2亚组ERF基因编码不同长度的氨基酸序列，推测其不同成员的功能存在差异。
对4个桂花OfERFs基因的氨基酸序列进行系统进化分析，发现OfERFs与拟南芥B2亚组ERF聚集在一起，说明它们的同源性较高。其中2个基因与At3g16770.1 (AtERF72/AtRAP2.3)聚为一支，2个基因与At1g72360.2 (AtERF73/AtRAP2.2)聚为另一小支。据此将4个OfERFs基因分别命名OfERF72a与OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b。桂花OfERF72与OfERF73均存在2个拷贝，说明桂花OfERF基因家族成员在进化和扩张过程中与基因重复事件有着紧密联系。在拟南芥中，AtERF72能够与缺铁反应基因IRT1、HA2和CLH1的启动子区域结合，负调控拟南芥的缺铁响应。与野生型植株相比，AtERF72突变体中铁和镁质量分数显著增加[22]。AtRAP2.3的同源基因SlERF6被证实是番茄中类胡萝卜素合成的负调控因子[13]。此外，在苹果中也有研究证明：AtRAP2.3的同源基因AP2D15可以负调控苹果PSY1和PSY2基因启动子序列中的ATCTA顺式作用元件[14]。拟南芥AtRAP2.2可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上调控基因的表达，过表达AtRAP2.2后导致植物体内类胡萝卜素降低[15]。
桂花花瓣中主要类胡萝卜素为β-胡萝卜素，其生物合成由OfLCYB直接催化生成，是桂花花瓣中类胡萝卜素代谢的重要催化酶[23]。OfLCYB基因启动子中存在2个ATCTA顺式作用元件，推测其响应B2亚组ERF转录因子的调控。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。进一步研究发现：OfERF72a和OfERF72b的表达趋势与OfLCYB基因呈显著负相关。酵母单杂交结果表明：OfERF72b与OfLCYB启动子存在物理结合，表明B2亚组的OfERF72b可能通过结合OfLCYB基因启动子ATCTA顺式作用元件调控其表达。ATCTA元件也存在于桂花OfPSY[24]和OfCCD1[25]等其他类胡萝卜素代谢基因的启动子上，其是否响应B2亚组的ERF转录因子的调控需要进一步研究。
4. 结论
本研究基于桂花‘堰虹桂’转录组数据筛选了4个OfERF基因，OfERF72a与OfERF72b基因表达量均随着开花进程逐渐下降，与OfLCYB基因的表达量显著负相关。OfLCYB基因启动子含有2个ATCTA顺式作用元件，OfERF72b与OfLCYB启动子之间存在互作，表明OfERF72b可能参与调控OfLCYB的表达。
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图 1 野生型与T1阳性植株成熟花药形态及散粉情况
Figure 1 Anther morphology and pollen release of wild type and T1 positive plants
图 4 野生型及T1阳性植株半定量RT-PCR分析
Figure 4 Semi-quantitative RT-PCR of wild type and T1 positive plants
图 5 野生型与T1阳性植株自交及与野生型正反交授粉后的蒴果及种子
Figure 5 Capsules and seeds of wild type and T1 positive plants after self-crossing and cross-pollination with wild type
表 1 引物信息
Table 1. Specific primers used in this study
引物名称 引物序列(5′→3′) CsRNF217_R838_S GTCGACTTGCATAGAGCCAATAAA 35S_F ACGCACAATCCCACTATCCTTC CsRNF217_qL2 ACGTGCGAGGGTATGAAAGA CsRNF217_qR2 TACCCTCCATGCCACTTCAG EF1α-F TGGTTGTGACTTTTGGTCCCA EF1α-R ACAAACCCACGCTTGAGATCC 
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表 2 野生型及T1烟草植株阳性率与花粉染色活力
Table 2. Positive rate and pollen viability of wild type and T1 tobacco plants
株系 株数/
株阳性
株数/株植株阳
性率/%花粉染色活力
均值/%6# 16 10 62.5 19.5±2.7 b 35# 80 33 41.2 31.9±2.8 b 63# 41 25 61.5 21.8±2.3 b WT 3 0 0 94.5±2.4 a 说明：同列不同字母表示不同株系间花粉染色活力差异显著(P＜0.05)。WT为野生型株系。
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表 3 野生型及阳性株系自交及杂交试验的蒴果大小和种子数量
Table 3. Capsule and seed number in selfing and hybridization test
处理 株系 蒴果横径/mm 蒴果纵径/mm 种子数量/(粒·果−1) 自交 WT 9.2±0.2 a 15.8±0.2 a 1 525.7±19.9 a 6# 8.9±0.1 ab 14.9±0.1 ab 1 030.4±105.2 b 35# 8.4±0.1 bcd 14.9±0.1 ab 948.5±37.3 b 63# 8.4±0.0 bcd 14.6±0.1 b 1 006.7±36.0 b 正交 WT (♀) × 6# (♂) 8.5±0.1 abcd 15.2±0.4 ab 845.5±69.4 b WT (♀) × 35# (♂) 8.6±0.2 abc 14.3±0.2 b 924.6±26.7 b WT (♀) × 63# (♂) 8.1±0.2 cd 15.0±0.4 ab 1 049.8±8.0 b 反交 6# (♀) × WT (♂) 8.6±0.2 abc 15.1±0.5 ab 1 103.4±119.8 b 35# (♀) × WT (♂) 9.1±0.3 ab 14.8±0.5 ab 992.3±185.9 b 63# (♀) × WT (♂) 7.8±0.3 d 14.4±0.4 b 914.4±90.7 b 说明：WT表示野生型烟草。同列不同字母表示株系间差异显著(P＜0.05)。
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