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‘无子瓯柑’E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草育性的影响

叶潇铃 赵宇虹 姜楠 张敏 张迟

叶潇铃, 赵宇虹, 姜楠, 张敏, 张迟. ‘无子瓯柑’E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草育性的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(6): 1181-1187. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220710
引用本文: 叶潇铃, 赵宇虹, 姜楠, 张敏, 张迟. ‘无子瓯柑’E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草育性的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(6): 1181-1187. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220710
YE Xiaoling, ZHAO Yuhong, JIANG Nan, ZHANG Min, ZHANG Chi. Fertility effect of E3 ubiquitin ligase gene CsRNF217 in transgenic tobacco plants[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(6): 1181-1187. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220710
Citation: YE Xiaoling, ZHAO Yuhong, JIANG Nan, ZHANG Min, ZHANG Chi. Fertility effect of E3 ubiquitin ligase gene CsRNF217 in transgenic tobacco plants[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(6): 1181-1187. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220710

‘无子瓯柑’E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草育性的影响

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220710
基金项目: 浙江省基础公益研究计划项目(LGN18C160005,LGN22C150006);浙江省育种专项(2021C02066-1)
详细信息
    作者简介: 叶潇铃(ORCID: 0000-0001-7548-7878),从事柑橘分子生物学研究。E-mail: 2020601042053@stu.zafu.edu.cn
    通信作者: 张迟(ORCID: 0000-0003-3760-7917),副教授,博士,从事柑橘分子生物学研究。E-mail: zhangchi1978@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S722.3

Fertility effect of E3 ubiquitin ligase gene CsRNF217 in transgenic tobacco plants

  • 摘要:   目的  为了验证‘无子瓯柑’Citrus suavissima ‘Seedless’ E3泛素连接酶基因CsRNF217对雄蕊育性的影响,采用异源转化获得过表达CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum,分析其对烟草育性的影响。  方法  采用亚历山大染色法、花粉离体培养法、杂交授粉后的结实率分析野生型烟草及转基因烟草自交1代(T1)阳性株系的花粉活力及胚囊育性,利用半定量RT-PCR分析基因CsRNF217在转基因烟草T1阳性株系花药中的表达强弱。  结果  ‘无子瓯柑’CsRNF217在转基因烟草自交T1株系中高效表达,转基因株系的花粉染色活力和离体萌发率、自交结实率、以及与野生型的正反交结实率均显著低于野生型(P<0.05)。  结论  过表达CsRNF217的烟草植株花粉育性显著下降,同时伴随胚囊育性下降的现象,推测CsRNF217基因对‘无子瓯柑’雌雄育性存在负向调控的作用。图5表3参22
  • 图  1  野生型与T1阳性植株成熟花药形态及散粉情况

    Figure  1  Anther morphology and pollen release of wild type and T1 positive plants

    图  2  野生型及T1阳性植株的花粉活力

    Figure  2  Pollen viability of wild type and T1 positive plants

    图  3  野生型及T1阳性植株的花粉活力

    Figure  3  Pollen vitality of wild-type and T1 positive plants

    图  4  野生型及T1阳性植株半定量RT-PCR分析

    Figure  4  Semi-quantitative RT-PCR of wild type and T1 positive plants

    图  5  野生型与T1阳性植株自交及与野生型正反交授粉后的蒴果及种子

    Figure  5  Capsules and seeds of wild type and T1 positive plants after self-crossing and cross-pollination with wild type

    表  1  引物信息

    Table  1.   Specific primers used in this study

    引物名称引物序列(5′→3′)
    CsRNF217_R838_S GTCGACTTGCATAGAGCCAATAAA
    35S_F ACGCACAATCCCACTATCCTTC
    CsRNF217_qL2 ACGTGCGAGGGTATGAAAGA
    CsRNF217_qR2 TACCCTCCATGCCACTTCAG
    EF1α-F TGGTTGTGACTTTTGGTCCCA
    EF1α-R ACAAACCCACGCTTGAGATCC
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    表  2  野生型及T1烟草植株阳性率与花粉染色活力      

    Table  2.   Positive rate and pollen viability of wild type and T1 tobacco plants      

    株系株数/
    阳性
    株数/株
    植株阳
    性率/%
    花粉染色活力
    均值/%
    6#161062.519.5±2.7 b
    35#803341.231.9±2.8 b
    63#412561.521.8±2.3 b
    WT30094.5±2.4 a
      说明:同列不同字母表示不同株系间花粉染色活力差异显著(P<0.05)。WT为野生型株系。
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    表  3  野生型及阳性株系自交及杂交试验的蒴果大小和种子数量

    Table  3.   Capsule and seed number in selfing and hybridization test

    处理株系蒴果横径/mm蒴果纵径/mm种子数量/(粒·果−1)
    自交 WT 9.2±0.2 a 15.8±0.2 a 1 525.7±19.9 a
    6# 8.9±0.1 ab 14.9±0.1 ab 1 030.4±105.2 b
    35# 8.4±0.1 bcd 14.9±0.1 ab 948.5±37.3 b
    63# 8.4±0.0 bcd 14.6±0.1 b 1 006.7±36.0 b
    正交 WT (♀) × 6# (♂) 8.5±0.1 abcd 15.2±0.4 ab 845.5±69.4 b
    WT (♀) × 35# (♂) 8.6±0.2 abc 14.3±0.2 b 924.6±26.7 b
    WT (♀) × 63# (♂) 8.1±0.2 cd 15.0±0.4 ab 1 049.8±8.0 b
    反交 6# (♀) × WT (♂) 8.6±0.2 abc 15.1±0.5 ab 1 103.4±119.8 b
    35# (♀) × WT (♂) 9.1±0.3 ab 14.8±0.5 ab 992.3±185.9 b
    63# (♀) × WT (♂) 7.8±0.3 d 14.4±0.4 b 914.4±90.7 b
      说明:WT表示野生型烟草。同列不同字母表示株系间差异显著(P<0.05)。
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  • [1] 徐象华, 颜福花, 叶荣华, 等. 瓯柑研究进展[J]. 浙江林业科技, 2008, 28(3): 75 − 77.

    XU Xianghua, YAN Fuhua, YE Ronghua, et al. Advances in researches of Citrus reticulata cv. suavissima [J]. Journal of Zhejiang Forestry Science and Technology, 2008, 28(3): 75 − 77.
    [2] 曾燕如, 张炼炳, 斯金平, 等. 无籽瓯柑无核原因的研究[J]. 浙江林学院学报, 2005, 22(4): 359 − 362.

    ZENG Yanru, ZHANG Lianbing, SI Jinping, et al. Preliminary study on seedlessness of seedless Ougan [J]. Journal of Zhejiang Forestry College, 2005, 22(4): 359 − 362.
    [3] 张迟, 张敏, 朱铨, 等. ‘瓯柑’及其无子突变体花粉发育的细胞学观察[J]. 果树学报, 2014, 31(2): 265 − 269.

    ZHANG Chi, ZHANG Min, ZHU Quan, et al. Cytological observation of pollen development in ‘Ougan’ (Citrus suavissima Hort. ex Tanaka) and its seedless mutant [J]. Journal of Fruit Science, 2014, 31(2): 265 − 269.
    [4] ZHANG Chi, YU Dihu, KE Fuzhi, et al. Seedless mutant ‘Wuzi Ougan’ (Citrus suavissima Hort. ex Tanaka ‘seedless’) and the wild type were compared by iTRAQ-based quantitative proteomics and integratedly analyzed with transcriptome to improve understanding of male sterility [J/OL]. BMC Genetics, 2018, 19(1): 106[2022-11-10]. doi: 10.1186/s12863-018-0693-9.
    [5] 孙明艳, 叶潇铃, 蔡子涵, 等. 无子瓯柑E3泛素连接酶基因CsRNF217的克隆与功能分析[J]. 果树学报, 2022, 39(2): 845 − 855.

    SUN Mingyan, YE Xiaoling, CAI Zihan, et al. Cloning and functional analysis of E3 ubiquitin ligase gene CsRNF217 in Wuzi Ougan (Citrus suavissima) [J]. Journal of Fruit Science, 2022, 39(2): 845 − 855.
    [6] FOOT N, HENSHALL T, KUMAR S. Ubiquitination and the regulation of membrane proteins [J]. Physiological Reviews, 2017, 97(1): 253 − 281.
    [7] SASAKI A T, CARRACEDO A, LOCASALE J W, et al. Ubiquitination of K-Ras enhances activation and facilitates binding to select downstream effectors [J/OL]. Science Signaling, 2011, 4(163): ra13[2022-11-10]. doi: 10.1126/scisignal.2001518.
    [8] SHARMA B, JOSHI D, YADAV P K, et al. Role of ubiquitin-mediated degradation system in plant biology [J/OL]. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 806[2022-11-10]. doi: 10.3389/fpls.2016.00806.
    [9] GUERRA D D, CALLIS J. Ubiquitin on the move: the ubiquitin modification system plays diverse roles in the regulation of endoplasmic reticulum- and plasma membrane-localized proteins [J]. Plant Physiology, 2012, 160(1): 56 − 64.
    [10] BUETOW L, HUANG D T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases [J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2016, 17(10): 626 − 642.
    [11] SHU Kai, YANG Wenyu. E3 ubiquitin ligases: ubiquitous actors in plant development and abiotic stress responses [J]. Plant and Cell Physiology, 2017, 58(9): 1461 − 1476.
    [12] DESHAIES R J, JOAZEIRO C A. RING domain E3 ubiquitin ligases [J]. Annual Review of Biochemistry, 2009, 78: 399 − 434.
    [13] MARÍN I. Evolution of plant HECT ubiquitin ligases [J/OL]. PLoS One, 2013, 8(7): e68536[2022-11-10]. doi: 10.1371/journal.pone.0068536.
    [14] SHIRSEKAR G S, VEGA-SANCHEZ M E, BORDEOS A, et al. Identification and characterization of suppressor mutants of spl11-mediated cell death in rice [J]. Molecular Plant-microbe Interactions, 2014, 27(6): 528 − 536.
    [15] LU Dongping, LIN Weiwei, GAO Xiquan, et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity [J]. Science, 2011, 332(6036): 1439 − 1442.
    [16] LUO Hongli, LALUK K, LAI Zhibin, et al. The arabidopsis botrytis susceptible1 interactor defines a subclass of RING E3 ligases that regulate pathogen and stress responses [J]. Plant Physiology, 2010, 154(4): 1766 − 1782.
    [17] REN Lijun, ZHAO Tingting, ZHAO Yangzi, et al. The E3 ubiquitin ligase DESYNAPSIS1 regulates synapsis and recombination in rice meiosis [J/OL]. Cell Reports, 2021, 37(5): 109941[2022-11-10]. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109941.
    [18] PENG Yanjhu, SHIH Chingfang, YANG Junyi, et al. A RING-type E3 ligase controls anther dehiscence by activating the jasmonate biosynthetic pathway gene DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 in Arabidopsis [J]. The Plant Journal, 2013, 74(2): 310 − 327.
    [19] TIAN Aimei, YU Hui, CUI Zhuoyue. Functional characterization of E3 ubiquity ligase Bra015092 in pollen development of Brassica campestris ssp. Chinensis [J/OL]. Physiologia Plantarum, 2022, 174(6): e13808[2022-11-10]. doi: 10.1111/ppl.13808.
    [20] PETERSON R, SLOVIN J P, CHEN Changbin. A simplified method for differential staining of aborted and nonaborted pollen grains [J/OL]. International Journal of Plant Biology, 2010, 1(2): e13[2022-11-10]. doi: 10.4081/pb.2010.e13.
    [21] 牛永志, 陈志芸, 索文龙, 等. 不同培养基组分对烟草花粉管生长的影响[J]. 云南农业大学学报, 2020, 35(1): 82 − 87.

    NIU Yongzhi, CHEN Zhiyun, SUO Wenlong, et al. The influence of medium composition on the growth of tobacco pollen tube [J]. Journal of Yunnan Agricultural University, 2020, 35(1): 82 − 87.
    [22] 李佛琳, 马宇雷, 张国锋. 烟草种子含钾量和千粒重的基因型差异[J]. 种子, 2000(6): 18 − 21.

    LI Folin, MA Yulei, ZHANG Guofeng. Genotypic differences in potassium contents and weight of tobacco seeds [J]. Seed, 2000(6): 18 − 21.
  • [1] 林怡馨, 陈丹丹, 刘宏波, 柯星星, 郑月萍, 郑志富.  拟南芥和油菜3-磷酸甘油酰基转移酶的关键活性位点鉴定 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(4): 695-706. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220764
    [2] 郑刘辉, 詹利云, 侯宇, 喻卫武, 曾燕如, 戴文圣.  雄性榧树遗传多样性的SSR荧光标记分析 . 浙江农林大学学报, 2022, 39(2): 329-337. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210279
    [3] 吴羽晨, 蔺芳, 张家洋, 张路路.  3种药用植物单/混播对沙化土壤碳、氮质量分数及酶活性的影响 . 浙江农林大学学报, 2021, 38(2): 329-335. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200486
    [4] 詹利云, 刘琏, 曾燕如, 喻卫武, 戴文圣.  雄性榧树天然居群表型多样性及优株初选 . 浙江农林大学学报, 2020, 37(6): 1120-1127. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20190676
    [5] 蒋仲龙, 叶柳欣, 刘军, 林松, 徐旻昱, 吴家森, 刘娟, 刘海英.  封育年限对毛竹林凋落物和土壤持水效能的影响 . 浙江农林大学学报, 2020, 37(5): 860-866. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20190603
    [6] 王丽媛, 孙鹏, 李华威, 傅建敏, 刁松锋, 韩卫娟, 索玉静, 买旖旎.  柿性器官败育及相关基因的表达 . 浙江农林大学学报, 2019, 36(2): 236-246. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.02.004
    [7] 俞狄虎, 张迟, 柯甫志, 敬露阳, 顾雪娇, 吴宝玉, 张敏.  ‘无子瓯柑’CHS基因家族的克隆和表达分析 . 浙江农林大学学报, 2019, 36(5): 943-949. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.05.013
    [8] 蔡煜, 王景燕, 龚伟, 吕向楠, 舒正悦, 闫思宇, 赵昌平.  柑橘林下养鸡对土壤团粒结构分形特征的影响 . 浙江农林大学学报, 2017, 34(2): 225-232. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.02.004
    [9] 沈辰, 裘佳妮, 黄坚钦.  山核桃COP1 E3连接酶的全长克隆及表达分析 . 浙江农林大学学报, 2014, 31(6): 831-837. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.06.002
    [10] 王国立, 安华明, 秦巧平, 李孟娇, 刘真真, 陈佳莹, 周倩, 张岚岚.  柑橘果实成熟特异基因CsPMEI/InvI的克隆与序列分析 . 浙江农林大学学报, 2013, 30(3): 336-342. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2013.03.005
    [11] 汪敏华, 周静, 崔键.  红壤水分条件对春季柑橘叶片生长形态 . 浙江农林大学学报, 2009, 26(1): 17-21.
    [12] 胡滨, 陈观平, 施农农, 卢江杰, 王慧中.  植物细胞质雄性不育及其在育种中的应用 . 浙江农林大学学报, 2006, 23(6): 689-693.
    [13] 沈哲红, 姜年春, 陈黎, 李文珠, 俞友明.  E1 级防潮型中密度纤维板的工艺因子对甲醛释放量的影响 . 浙江农林大学学报, 2005, 22(2): 203-206.
    [14] 曾燕如, 胡瑛, 斯金平, 徐象华.  浙江丽水16 个柑橘特色品种的RAPD 分析 . 浙江农林大学学报, 2005, 22(5): 481-485.
    [15] 李根有, 金水虎, 钱新标, 吴家森, 吴忠东.  白花败酱的家化栽培技术 . 浙江农林大学学报, 2001, 18(3): 267-270.
    [16] 谢寅峰, 沈惠娟.  水分胁迫下3 种针叶树幼苗抗旱性与硝酸还原酶和超氧化物歧化酶活性的关系 . 浙江农林大学学报, 2000, 17(1): 24-27.
    [17] 仲山民, 林海萍, 李根有, 石云波.  即食败酱软包装产品的研制 . 浙江农林大学学报, 2000, 17(4): 389-391.
    [18] 黄国洋, 徐展华, 方志刚.  浙江省柑橘全爪螨抗药性研究 . 浙江农林大学学报, 1999, 16(3): 252-259.
    [19] 陈志生.  铜铵合剂防治柑橘溃疡病 . 浙江农林大学学报, 1998, 15(1): 108-110.
    [20] 何福基, 余象煌, 李平.  杉木雄性不育性遗传机理初步分析* . 浙江农林大学学报, 1995, 12(2): 219-220.
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-11-21
  • 修回日期:  2023-05-04
  • 录用日期:  2023-07-11
  • 网络出版日期:  2023-11-23
  • 刊出日期:  2023-11-23

‘无子瓯柑’E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草育性的影响

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220710
    基金项目:  浙江省基础公益研究计划项目(LGN18C160005,LGN22C150006);浙江省育种专项(2021C02066-1)
    作者简介:

    叶潇铃(ORCID: 0000-0001-7548-7878),从事柑橘分子生物学研究。E-mail: 2020601042053@stu.zafu.edu.cn

    通信作者: 张迟(ORCID: 0000-0003-3760-7917),副教授,博士,从事柑橘分子生物学研究。E-mail: zhangchi1978@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S722.3

摘要:   目的  为了验证‘无子瓯柑’Citrus suavissima ‘Seedless’ E3泛素连接酶基因CsRNF217对雄蕊育性的影响,采用异源转化获得过表达CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum,分析其对烟草育性的影响。  方法  采用亚历山大染色法、花粉离体培养法、杂交授粉后的结实率分析野生型烟草及转基因烟草自交1代(T1)阳性株系的花粉活力及胚囊育性,利用半定量RT-PCR分析基因CsRNF217在转基因烟草T1阳性株系花药中的表达强弱。  结果  ‘无子瓯柑’CsRNF217在转基因烟草自交T1株系中高效表达,转基因株系的花粉染色活力和离体萌发率、自交结实率、以及与野生型的正反交结实率均显著低于野生型(P<0.05)。  结论  过表达CsRNF217的烟草植株花粉育性显著下降,同时伴随胚囊育性下降的现象,推测CsRNF217基因对‘无子瓯柑’雌雄育性存在负向调控的作用。图5表3参22

English Abstract

叶潇铃, 赵宇虹, 姜楠, 张敏, 张迟. ‘无子瓯柑’E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草育性的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(6): 1181-1187. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220710
引用本文: 叶潇铃, 赵宇虹, 姜楠, 张敏, 张迟. ‘无子瓯柑’E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草育性的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(6): 1181-1187. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220710
YE Xiaoling, ZHAO Yuhong, JIANG Nan, ZHANG Min, ZHANG Chi. Fertility effect of E3 ubiquitin ligase gene CsRNF217 in transgenic tobacco plants[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(6): 1181-1187. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220710
Citation: YE Xiaoling, ZHAO Yuhong, JIANG Nan, ZHANG Min, ZHANG Chi. Fertility effect of E3 ubiquitin ligase gene CsRNF217 in transgenic tobacco plants[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(6): 1181-1187. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220710
  • 瓯柑Citrus suavissima优良新品种‘无子瓯柑’C. suavissima ‘Seedless’是通过芽变选种获得的,其果实无核,遗传性状稳定[1]。与瓯柑相比,两者的花粉量相当,但‘无子瓯柑’花药不易开裂,自然散发的花粉少[2]。形态学和细胞学研究表明:小孢子母细胞减数分裂异常是‘无子瓯柑’雄性不育的重要原因之一[23]。瓯柑及‘无子瓯柑’花粉发育早期的花药转录组与蛋白质组关联分析结果表明:差异代谢通路主要富集在苯丙素生物合成、黄酮类化合物生物合成和苯丙氨酸代谢通路[4]CsRNF217基因是瓯柑与‘无子瓯柑’在小孢子母细胞时期与苯丙素生物合成途径密切关联的重要基因,与瓯柑相比,该基因在同时期的‘无子瓯柑’中显著上调表达;CsRNF217基因的氨基酸序列中存在RING-HC_RBR和IBR 2个结构域,属于典型的单亚基RING-HC E3亚家族,定位于细胞核[5]

    泛素化是真核生物中一种高度通用的翻译后修饰,它介导蛋白酶体降解、细胞运输、蛋白质相互作用和细胞蛋白质的功能激活[68]。泛素化级联需要3种不同的酶催化:E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶[9]。其中,E3泛素连接酶具有显著的多样性,它决定了底物的特异性,并作为调节细胞反应的枢纽[1011]。E3泛素连接酶分为单亚基和多亚基两类。单亚基组由3个主要的亚家族组成:RING、HECT以及U-box结构域家族[1113]CsRNF217基因即属于单亚基RING结构域家族。E3泛素连接酶在植物的生长发育过程中起着关键的作用,包括细胞程序性死亡和抗病防御反应[14]、成花调控[15]、生物[16]和非生物应激反应[14]以及花粉发育[1719]等。其中,在水稻Oryza sativa[17]、拟南芥Arabidopsis thaliana[18]、白菜Brassica campestris ssp. chinensis[19]中发现的RING型E3泛素连接酶基因DSNP1、DAFBra015092等在花粉发育过程中起重要作用。

    本研究以过表达‘无子瓯柑’CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum植株为材料,通过对基因表达分析、转基因自交1代植株(T1)花粉活力、转基因植株自交及与野生型烟草正反交的结实率等参数的测定,分析过表达CsRNF217对转基因烟草植株育性的影响,为进一步揭示CsRNF217基因在‘无子瓯柑’雌雄败育过程中的重要作用提供参考。

    • 以野生型烟草(WT)作为对照,采用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法获得过表达CaMV 35S :: CsRNF217的阳性转基因烟草[5](T0)。将T0自交种子穴盘播种获得转基因烟草自交1代植株(T1)。采集T1阳性烟草植株6#、35#、63#株系的叶片及含苞待放花蕾的花药,立即置于液氮中速冻并于−80 ℃保存,用于半定量RT-PCR分析。

    • 采集野生型烟草及T1烟草植株的叶片,采用CTAB法提取DNA,以pCAMBIA 2300s : CsRNF217质粒作为阳性对照,ddH2O为阴性对照,用35S_F及基因特异引物CsRNF217_R838_S[5](表1)进行PCR检测筛选阳性植株,PCR程序为94 ℃,5 min;94 ℃,30 s,55 ℃,30 s,72 ℃,1 min,35次循环;72 ℃,10 min;12 ℃保存。

      表 1  引物信息

      Table 1.  Specific primers used in this study

      引物名称引物序列(5′→3′)
      CsRNF217_R838_S GTCGACTTGCATAGAGCCAATAAA
      35S_F ACGCACAATCCCACTATCCTTC
      CsRNF217_qL2 ACGTGCGAGGGTATGAAAGA
      CsRNF217_qR2 TACCCTCCATGCCACTTCAG
      EF1α-F TGGTTGTGACTTTTGGTCCCA
      EF1α-R ACAAACCCACGCTTGAGATCC
    • 于晴天10:00采集烟草含苞待放的花蕾,采用亚历山大染色法[20]对野生型烟草及经PCR鉴定的T1阳性植株进行花粉染色活力检测,采用花粉离体培养法[21]对花粉染色活力显著下降的烟草单株进行花粉萌发试验,每个植株随机挑选3朵花作为生物学重复。花粉粒被染为紫红色的视为有活力的花粉粒,花粉管长度大于或等于花粉粒直径视为萌发。花粉染色活力=着色花粉粒数/视野中的花粉粒总数×100%,花粉萌发率=萌发花粉粒数/视野中的花粉粒总数×100%。

      使用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa,日本)试剂盒,提取野生型烟草及花粉活力显著下降的T1烟草阳性植株花药RNA,采用EASYScript one-step gDNA removal and cDNA synthesis supermix (TransGen Biotech code#AE311- 03)试剂盒进行cDNA合成,使用CsRNF217基因对引物和烟草内参基因EF1α特异引物(表1)进行半定量RT-PCR分析,程序为94 ℃,5 min;94 ℃,30 s,55 ℃,30 s,72 ℃,1 min,29次循环;72 ℃,10 min;12 ℃保存。

    • 于晴天10:00收集野生型和T1已开花,但未散粉植株的花药于离心管,4 ℃干燥保存备用。于傍晚用干净的小镊子摘去即将开放花蕾的花瓣和雄蕊。次日10:00蘸取花粉轻点已分泌黏液的柱头,套袋,每个植株进行3朵花的正反交重复,3 d后摘去袋子。正反交组合配置中,正交授粉以转基因株系为父本,野生型为母本;反交授粉以野生型为父本,转基因株系为母本。种子成熟时统计每个单株采收的蒴果数,测量蒴果横径、纵径及种子总质量。

    • 采用SPSS软件对种子萌发率、花粉染色活力、花粉离体萌发率、蒴果横纵径及种子数量等进行了单因素方差分析(one-way ANOVA,LSD)。

    • T0烟草种子穴盘播种共获得137个单株,其中6#株系16株,35#株系80株,63#株系41株。以野生型及T0种子播种获得的烟草叶片DNA为模板,经PCR检测,共获得68株阳性植株(表2)。其中,6#株系10株,35#株系33株,63#株系25株,阳性率分别为62.5%、41.2%、61.5%。

      表 2  野生型及T1烟草植株阳性率与花粉染色活力      

      Table 2.  Positive rate and pollen viability of wild type and T1 tobacco plants      

      株系株数/
      阳性
      株数/株
      植株阳
      性率/%
      花粉染色活力
      均值/%
      6#161062.519.5±2.7 b
      35#803341.231.9±2.8 b
      63#412561.521.8±2.3 b
      WT30094.5±2.4 a
        说明:同列不同字母表示不同株系间花粉染色活力差异显著(P<0.05)。WT为野生型株系。
    • T1阳性烟草植株花粉的散粉量与野生型存在差异(图1)。野生型植株花药开裂后,散粉量多,可见大量花粉散布于花瓣及柱头;T1阳性烟草植株花药裂开后,散粉量少,几乎无可见花粉散出。经染色法和花粉离体萌发培养(图2):T1阳性烟草植株花粉染色活力显著低于野生型植株(图3P<0.05)。有活力的花粉粒经亚历山大染色后呈紫红色,无活力的花粉粒呈黄褐色。野生型植株经亚历山大染色后花粉粒大多呈紫红色(94.5%),阳性植株呈紫红色的花粉粒数量显著少于野生型(图3P<0.05)。其中6#株系的14号单株(6#14)、35#株系的4号单株(35#4)、63#株系的4号单株(63#4)的花粉经亚历山大染色后着色率最低,分别为9.6%、12.0%、9.7%。有活力的花粉粒能在适宜的离体条件下萌发,T1阳性植株花粉粒的萌发率显著低于野生型植株(60.3%)。其中6#株系的9号单株(6#9)、6#株系的14号单株(6#14)、63#株系的4号单株(63#4)的花粉粒萌发率在各株系中最低,分别为30.6%、29.0%、33.4%。半定量RT-PCR分析显示(图4):CsRNF217基因在过表达的各株系中均能表达,其中,外源基因在63#株系各单株花药中的表达量最高。

      图  1  野生型与T1阳性植株成熟花药形态及散粉情况

      Figure 1.  Anther morphology and pollen release of wild type and T1 positive plants

      图  2  野生型及T1阳性植株的花粉活力

      Figure 2.  Pollen viability of wild type and T1 positive plants

      图  3  野生型及T1阳性植株的花粉活力

      Figure 3.  Pollen vitality of wild-type and T1 positive plants

      图  4  野生型及T1阳性植株半定量RT-PCR分析

      Figure 4.  Semi-quantitative RT-PCR of wild type and T1 positive plants

    • 对花粉染色活力、萌发率都显著低于野生型的T1转基因阳性单株进行授粉(表3图5)表明:自交和与野生型进行正反交的各授粉组合均能结实,但蒴果大小及种子数量存在较大差异。蒴果横径的比较结果显示:转基因63#株系自交、与野生型进行正反交的蒴果横径均显著小于野生型自交的蒴果(P<0.05);35#株系自交蒴果的横径显著小于野生型自交(P<0.05)。蒴果纵径的比较结果显示:转基因63#株系自交和与野生型反交的蒴果纵径均显著小于野生型自交(P<0.05),其余组合与野生型自交无显著差异。根据烟草原始种的种子千粒重(0.087 g)[22],计算每个株系的单果种子数量。阳性株系自交、与野生型正反交获得的种子数量都显著低于野生型自交种子数(P<0.05),但转基因株系之间无显著差异。

      表 3  野生型及阳性株系自交及杂交试验的蒴果大小和种子数量

      Table 3.  Capsule and seed number in selfing and hybridization test

      处理株系蒴果横径/mm蒴果纵径/mm种子数量/(粒·果−1)
      自交 WT 9.2±0.2 a 15.8±0.2 a 1 525.7±19.9 a
      6# 8.9±0.1 ab 14.9±0.1 ab 1 030.4±105.2 b
      35# 8.4±0.1 bcd 14.9±0.1 ab 948.5±37.3 b
      63# 8.4±0.0 bcd 14.6±0.1 b 1 006.7±36.0 b
      正交 WT (♀) × 6# (♂) 8.5±0.1 abcd 15.2±0.4 ab 845.5±69.4 b
      WT (♀) × 35# (♂) 8.6±0.2 abc 14.3±0.2 b 924.6±26.7 b
      WT (♀) × 63# (♂) 8.1±0.2 cd 15.0±0.4 ab 1 049.8±8.0 b
      反交 6# (♀) × WT (♂) 8.6±0.2 abc 15.1±0.5 ab 1 103.4±119.8 b
      35# (♀) × WT (♂) 9.1±0.3 ab 14.8±0.5 ab 992.3±185.9 b
      63# (♀) × WT (♂) 7.8±0.3 d 14.4±0.4 b 914.4±90.7 b
        说明:WT表示野生型烟草。同列不同字母表示株系间差异显著(P<0.05)。

      图  5  野生型与T1阳性植株自交及与野生型正反交授粉后的蒴果及种子

      Figure 5.  Capsules and seeds of wild type and T1 positive plants after self-crossing and cross-pollination with wild type

    • 本研究表明:过表达CsRNF217的烟草植株在花粉染色活力、花粉萌发率、蒴果大小及种子数量上均显著低于野生型,说明过表达CsRNF217降低了转基因烟草的小孢子育性,甚至对胚囊育性也存在一定的影响。

      近年来的研究表明:RING型E3泛素连接酶基因参与了植物花粉发育[19]、花药开裂[18]、胚囊发育[17]等生命过程。水稻中的RING型E3泛素连接酶DSNP1与水稻减数分裂过程中的联会复合体组装和同源重组关系密切,其突变体dsnp1中形成的稳定同源配对和重组交叉严重减少,并最终形成活性较低的花粉[17]。然而,白菜中过表达E3泛素连接酶基因Bra015092,也降低了转基因白菜的花粉染色活力和萌发率,并导致了花粉外部形态的畸形[19]。前期研究表明:‘无子瓯柑’成熟花粉的染色活力和离体萌发率均显著低于有籽瓯柑,其小孢子母细胞减数分裂异常[23]CsRNF217的表达在小孢子发育早期显著上调[5]。本研究中过表达CsRNF217的烟草花粉离体萌发率为野生型的一半,花粉染色活力则更低。推测CsRNF217基因可能通过负调控小孢子母细胞的减数分裂过程参与‘无子瓯柑’的花粉发育。拟南芥E3泛素连接酶基因DAF在雄蕊中特异表达,并通过正向调控茉莉酸生物合成途径来促进花药开裂,通过干涉实验抑制其表达的植株则表现为雄性不育[18]。‘无子瓯柑’的花药自然开裂难、散粉量低[23],实时定量PCR结果显示:CsRNF217基因在雄蕊的表达丰度显著高于其他花器官[5]。本研究中,过表达CsRNF217的转基因烟草也表现出自然散粉较弱的特性,推测CsRNF217可能参与了花药开裂的调控。

      以野生型花粉对水稻不育突变体dsnp1进行授粉,突变体不能结实,表明该突变体既是雄性不育的,也表现出雌性不育[17],说明该RING型E3泛素连接酶DSNP1对水稻的雌雄育性都有影响。本研究表明:转基因烟草不仅花粉活力显著下降,其种子数量也显著减少,说明CsRNF217的超量表达在负调控花粉育性的同时,对胚囊的育性也存在一定的调控作用。在生产实践中,‘无子瓯柑’在同其他有籽柑橘品种混栽时也表现无籽,说明胚囊败育是‘无子瓯柑’果实无核的重要原因,因此CsRNF217对‘无子瓯柑’胚囊育性的影响值得进一步研究。

    • E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草的育性存在显著影响,过表达‘无子瓯柑’CsRNF217的T1烟草阳性植株雌雄育性均显著下降,推测CsRNF217对‘无子瓯柑’的育性存在负调控作用。

参考文献 (22)

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