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瓯柑Citrus suavissima优良新品种‘无子瓯柑’C. suavissima ‘Seedless’是通过芽变选种获得的，其果实无核，遗传性状稳定[1]。与瓯柑相比，两者的花粉量相当，但‘无子瓯柑’花药不易开裂，自然散发的花粉少[2]。形态学和细胞学研究表明：小孢子母细胞减数分裂异常是‘无子瓯柑’雄性不育的重要原因之一[2−3]。瓯柑及‘无子瓯柑’花粉发育早期的花药转录组与蛋白质组关联分析结果表明：差异代谢通路主要富集在苯丙素生物合成、黄酮类化合物生物合成和苯丙氨酸代谢通路[4]。CsRNF217基因是瓯柑与‘无子瓯柑’在小孢子母细胞时期与苯丙素生物合成途径密切关联的重要基因，与瓯柑相比，该基因在同时期的‘无子瓯柑’中显著上调表达；CsRNF217基因的氨基酸序列中存在RING-HC_RBR和IBR 2个结构域，属于典型的单亚基RING-HC E3亚家族，定位于细胞核[5]。
泛素化是真核生物中一种高度通用的翻译后修饰，它介导蛋白酶体降解、细胞运输、蛋白质相互作用和细胞蛋白质的功能激活[6−8]。泛素化级联需要3种不同的酶催化：E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶[9]。其中，E3泛素连接酶具有显著的多样性，它决定了底物的特异性，并作为调节细胞反应的枢纽[10−11]。E3泛素连接酶分为单亚基和多亚基两类。单亚基组由3个主要的亚家族组成：RING、HECT以及U-box结构域家族[11−13]。CsRNF217基因即属于单亚基RING结构域家族。E3泛素连接酶在植物的生长发育过程中起着关键的作用，包括细胞程序性死亡和抗病防御反应[14]、成花调控[15]、生物[16]和非生物应激反应[14]以及花粉发育[17−19]等。其中，在水稻Oryza sativa[17]、拟南芥Arabidopsis thaliana[18]、白菜Brassica campestris ssp. chinensis[19]中发现的RING型E3泛素连接酶基因DSNP1、DAF、Bra015092等在花粉发育过程中起重要作用。
本研究以过表达‘无子瓯柑’CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum植株为材料，通过对基因表达分析、转基因自交1代植株(T1)花粉活力、转基因植株自交及与野生型烟草正反交的结实率等参数的测定，分析过表达CsRNF217对转基因烟草植株育性的影响，为进一步揭示CsRNF217基因在‘无子瓯柑’雌雄败育过程中的重要作用提供参考。
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以野生型烟草(WT)作为对照，采用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法获得过表达CaMV 35S :: CsRNF217的阳性转基因烟草[5](T0)。将T0自交种子穴盘播种获得转基因烟草自交1代植株(T1)。采集T1阳性烟草植株6#、35#、63#株系的叶片及含苞待放花蕾的花药，立即置于液氮中速冻并于−80 ℃保存，用于半定量RT-PCR分析。
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采集野生型烟草及T1烟草植株的叶片，采用CTAB法提取DNA，以pCAMBIA 2300s : CsRNF217质粒作为阳性对照，ddH2O为阴性对照，用35S_F及基因特异引物CsRNF217_R838_S[5](表1)进行PCR检测筛选阳性植株，PCR程序为94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35次循环；72 ℃，10 min；12 ℃保存。
表 1 引物信息
Table 1. Specific primers used in this study
引物名称 引物序列(5′→3′) CsRNF217_R838_S GTCGACTTGCATAGAGCCAATAAA 35S_F ACGCACAATCCCACTATCCTTC CsRNF217_qL2 ACGTGCGAGGGTATGAAAGA CsRNF217_qR2 TACCCTCCATGCCACTTCAG EF1α-F TGGTTGTGACTTTTGGTCCCA EF1α-R ACAAACCCACGCTTGAGATCC -
于晴天10:00采集烟草含苞待放的花蕾，采用亚历山大染色法[20]对野生型烟草及经PCR鉴定的T1阳性植株进行花粉染色活力检测，采用花粉离体培养法[21]对花粉染色活力显著下降的烟草单株进行花粉萌发试验，每个植株随机挑选3朵花作为生物学重复。花粉粒被染为紫红色的视为有活力的花粉粒，花粉管长度大于或等于花粉粒直径视为萌发。花粉染色活力=着色花粉粒数/视野中的花粉粒总数×100%，花粉萌发率=萌发花粉粒数/视野中的花粉粒总数×100%。
使用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa，日本)试剂盒，提取野生型烟草及花粉活力显著下降的T1烟草阳性植株花药RNA，采用EASYScript one-step gDNA removal and cDNA synthesis supermix (TransGen Biotech code#AE311- 03)试剂盒进行cDNA合成，使用CsRNF217基因对引物和烟草内参基因EF1α特异引物(表1)进行半定量RT-PCR分析，程序为94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，29次循环；72 ℃，10 min；12 ℃保存。
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于晴天10:00收集野生型和T1已开花，但未散粉植株的花药于离心管，4 ℃干燥保存备用。于傍晚用干净的小镊子摘去即将开放花蕾的花瓣和雄蕊。次日10:00蘸取花粉轻点已分泌黏液的柱头，套袋，每个植株进行3朵花的正反交重复，3 d后摘去袋子。正反交组合配置中，正交授粉以转基因株系为父本，野生型为母本；反交授粉以野生型为父本，转基因株系为母本。种子成熟时统计每个单株采收的蒴果数，测量蒴果横径、纵径及种子总质量。
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采用SPSS软件对种子萌发率、花粉染色活力、花粉离体萌发率、蒴果横纵径及种子数量等进行了单因素方差分析(one-way ANOVA，LSD)。
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T0烟草种子穴盘播种共获得137个单株，其中6#株系16株，35#株系80株，63#株系41株。以野生型及T0种子播种获得的烟草叶片DNA为模板，经PCR检测，共获得68株阳性植株(表2)。其中，6#株系10株，35#株系33株，63#株系25株，阳性率分别为62.5%、41.2%、61.5%。
表 2 野生型及T1烟草植株阳性率与花粉染色活力
Table 2. Positive rate and pollen viability of wild type and T1 tobacco plants
株系 株数/
株阳性
株数/株植株阳
性率/%花粉染色活力
均值/%6# 16 10 62.5 19.5±2.7 b 35# 80 33 41.2 31.9±2.8 b 63# 41 25 61.5 21.8±2.3 b WT 3 0 0 94.5±2.4 a 说明：同列不同字母表示不同株系间花粉染色活力差异显著(P＜0.05)。WT为野生型株系。 -
T1阳性烟草植株花粉的散粉量与野生型存在差异(图1)。野生型植株花药开裂后，散粉量多，可见大量花粉散布于花瓣及柱头；T1阳性烟草植株花药裂开后，散粉量少，几乎无可见花粉散出。经染色法和花粉离体萌发培养(图2)：T1阳性烟草植株花粉染色活力显著低于野生型植株(图3，P＜0.05)。有活力的花粉粒经亚历山大染色后呈紫红色，无活力的花粉粒呈黄褐色。野生型植株经亚历山大染色后花粉粒大多呈紫红色(94.5%)，阳性植株呈紫红色的花粉粒数量显著少于野生型(图3，P＜0.05)。其中6#株系的14号单株(6#14)、35#株系的4号单株(35#4)、63#株系的4号单株(63#4)的花粉经亚历山大染色后着色率最低，分别为9.6%、12.0%、9.7%。有活力的花粉粒能在适宜的离体条件下萌发，T1阳性植株花粉粒的萌发率显著低于野生型植株(60.3%)。其中6#株系的9号单株(6#9)、6#株系的14号单株(6#14)、63#株系的4号单株(63#4)的花粉粒萌发率在各株系中最低，分别为30.6%、29.0%、33.4%。半定量RT-PCR分析显示(图4)：CsRNF217基因在过表达的各株系中均能表达，其中，外源基因在63#株系各单株花药中的表达量最高。
图 1 野生型与T1阳性植株成熟花药形态及散粉情况
Figure 1. Anther morphology and pollen release of wild type and T1 positive plants
图 2 野生型及T1阳性植株的花粉活力
Figure 2. Pollen viability of wild type and T1 positive plants
图 3 野生型及T1阳性植株的花粉活力
Figure 3. Pollen vitality of wild-type and T1 positive plants
图 4 野生型及T1阳性植株半定量RT-PCR分析
Figure 4. Semi-quantitative RT-PCR of wild type and T1 positive plants
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对花粉染色活力、萌发率都显著低于野生型的T1转基因阳性单株进行授粉(表3，图5)表明：自交和与野生型进行正反交的各授粉组合均能结实，但蒴果大小及种子数量存在较大差异。蒴果横径的比较结果显示：转基因63#株系自交、与野生型进行正反交的蒴果横径均显著小于野生型自交的蒴果(P＜0.05)；35#株系自交蒴果的横径显著小于野生型自交(P＜0.05)。蒴果纵径的比较结果显示：转基因63#株系自交和与野生型反交的蒴果纵径均显著小于野生型自交(P＜0.05)，其余组合与野生型自交无显著差异。根据烟草原始种的种子千粒重(0.087 g)[22]，计算每个株系的单果种子数量。阳性株系自交、与野生型正反交获得的种子数量都显著低于野生型自交种子数(P＜0.05)，但转基因株系之间无显著差异。
表 3 野生型及阳性株系自交及杂交试验的蒴果大小和种子数量
Table 3. Capsule and seed number in selfing and hybridization test
处理 株系 蒴果横径/mm 蒴果纵径/mm 种子数量/(粒·果−1) 自交 WT 9.2±0.2 a 15.8±0.2 a 1 525.7±19.9 a 6# 8.9±0.1 ab 14.9±0.1 ab 1 030.4±105.2 b 35# 8.4±0.1 bcd 14.9±0.1 ab 948.5±37.3 b 63# 8.4±0.0 bcd 14.6±0.1 b 1 006.7±36.0 b 正交 WT (♀) × 6# (♂) 8.5±0.1 abcd 15.2±0.4 ab 845.5±69.4 b WT (♀) × 35# (♂) 8.6±0.2 abc 14.3±0.2 b 924.6±26.7 b WT (♀) × 63# (♂) 8.1±0.2 cd 15.0±0.4 ab 1 049.8±8.0 b 反交 6# (♀) × WT (♂) 8.6±0.2 abc 15.1±0.5 ab 1 103.4±119.8 b 35# (♀) × WT (♂) 9.1±0.3 ab 14.8±0.5 ab 992.3±185.9 b 63# (♀) × WT (♂) 7.8±0.3 d 14.4±0.4 b 914.4±90.7 b 说明：WT表示野生型烟草。同列不同字母表示株系间差异显著(P＜0.05)。 
图 5 野生型与T1阳性植株自交及与野生型正反交授粉后的蒴果及种子
Figure 5. Capsules and seeds of wild type and T1 positive plants after self-crossing and cross-pollination with wild type
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本研究表明：过表达CsRNF217的烟草植株在花粉染色活力、花粉萌发率、蒴果大小及种子数量上均显著低于野生型，说明过表达CsRNF217降低了转基因烟草的小孢子育性，甚至对胚囊育性也存在一定的影响。
近年来的研究表明：RING型E3泛素连接酶基因参与了植物花粉发育[19]、花药开裂[18]、胚囊发育[17]等生命过程。水稻中的RING型E3泛素连接酶DSNP1与水稻减数分裂过程中的联会复合体组装和同源重组关系密切，其突变体dsnp1中形成的稳定同源配对和重组交叉严重减少，并最终形成活性较低的花粉[17]。然而，白菜中过表达E3泛素连接酶基因Bra015092，也降低了转基因白菜的花粉染色活力和萌发率，并导致了花粉外部形态的畸形[19]。前期研究表明：‘无子瓯柑’成熟花粉的染色活力和离体萌发率均显著低于有籽瓯柑，其小孢子母细胞减数分裂异常[2−3]，CsRNF217的表达在小孢子发育早期显著上调[5]。本研究中过表达CsRNF217的烟草花粉离体萌发率为野生型的一半，花粉染色活力则更低。推测CsRNF217基因可能通过负调控小孢子母细胞的减数分裂过程参与‘无子瓯柑’的花粉发育。拟南芥E3泛素连接酶基因DAF在雄蕊中特异表达，并通过正向调控茉莉酸生物合成途径来促进花药开裂，通过干涉实验抑制其表达的植株则表现为雄性不育[18]。‘无子瓯柑’的花药自然开裂难、散粉量低[2−3]，实时定量PCR结果显示：CsRNF217基因在雄蕊的表达丰度显著高于其他花器官[5]。本研究中，过表达CsRNF217的转基因烟草也表现出自然散粉较弱的特性，推测CsRNF217可能参与了花药开裂的调控。
以野生型花粉对水稻不育突变体dsnp1进行授粉，突变体不能结实，表明该突变体既是雄性不育的，也表现出雌性不育[17]，说明该RING型E3泛素连接酶DSNP1对水稻的雌雄育性都有影响。本研究表明：转基因烟草不仅花粉活力显著下降，其种子数量也显著减少，说明CsRNF217的超量表达在负调控花粉育性的同时，对胚囊的育性也存在一定的调控作用。在生产实践中，‘无子瓯柑’在同其他有籽柑橘品种混栽时也表现无籽，说明胚囊败育是‘无子瓯柑’果实无核的重要原因，因此CsRNF217对‘无子瓯柑’胚囊育性的影响值得进一步研究。
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E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草的育性存在显著影响，过表达‘无子瓯柑’CsRNF217的T1烟草阳性植株雌雄育性均显著下降，推测CsRNF217对‘无子瓯柑’的育性存在负调控作用。
Fertility effect of E3 ubiquitin ligase gene CsRNF217 in transgenic tobacco plants
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摘要:
目的 为了验证‘无子瓯柑’Citrus suavissima ‘Seedless’ E3泛素连接酶基因CsRNF217对雄蕊育性的影响，采用异源转化获得过表达CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum，分析其对烟草育性的影响。 方法 采用亚历山大染色法、花粉离体培养法、杂交授粉后的结实率分析野生型烟草及转基因烟草自交1代(T1)阳性株系的花粉活力及胚囊育性，利用半定量RT-PCR分析基因CsRNF217在转基因烟草T1阳性株系花药中的表达强弱。 结果 ‘无子瓯柑’CsRNF217在转基因烟草自交T1株系中高效表达，转基因株系的花粉染色活力和离体萌发率、自交结实率、以及与野生型的正反交结实率均显著低于野生型(P＜0.05)。 结论 过表达CsRNF217的烟草植株花粉育性显著下降，同时伴随胚囊育性下降的现象，推测CsRNF217基因对‘无子瓯柑’雌雄育性存在负向调控的作用。图5表3参22 Abstract:Objective This study, with an investigation into the transgenic plants of tobacco (Nicotiana tabacum) overexpressing CsRNF217, is aimed to verify the effect of the E3 ubiquitin ligase gene CsRNF217 of Citrus suavissima ‘Seedless’ on male sterility. Method First, an analysis was conducted of the pollen viability of wild type (WT) and the positive plants of the 1st generation of selfing of transgenic plants (T1) with the employment Alexander staining and pollen germination in vitro. Then, the seed setting rate was obtained via selfing and reciprocal crosses between transgenic plants and WT. Finally, semi-quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) was used to analyze the relative expression of CsRNF217 in T1 positive tobacco plants. Result CsRNF217 derived from C. suavissima ‘Seedless’ was efficiently expressed in T1 lines. The pollen dyeing viability and in vitro germination rate of T1 lines, selfing seed setting rate of T1 lines, and seed setting rate of T1 lines reciprocal crosses with WT were significantly lower than those of WT (P＜0.05). Conclusion T1 plants overexpressing CsRNF217 had a severe decline in pollen fertility and partial aberrant of embryo sac, suggesting that an up-regulation of CsRNF217 could play a negative regulatory role on male and female fertility of C. suavissima ‘Seedless’. [Ch, 5 fig. 3 tab. 22 ref.] -
Key words:
- Citrus /
- E3 ubiquitin ligase /
- male sterility /
- embryo sac abortion
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杨树为杨柳科Salicaceae杨属Populus植物，共包括五大杨派100余种，在世界范围内广泛分布，以30°~60° N的温带或暖温带地区较为常见[1]，是短期轮伐的造林树种，对解决生态环境治理和木材短缺问题有利[2]。目前中国林业发展中推广的杨树新优品种主要来源于人工杂交选育，具有早期速生、材质好、抗性强等特点，创造了巨大的生态效益、经济效益以及社会效益[3]。因此杂交育种仍然是目前乃至今后培育杨树良种的重要手段。美洲黑杨Populus deltoides原产于北美密西西比河下游地区，是中国引种的南方型平原地区重要速生工业用材树种和绿化造林树种之一，是人工杂交选育新品种的常用亲本。李世峰等[4]发现：美洲黑杨杂交组合苗高和胸径平均值均超过亲本(T120和I-69)。罗敬[5]以美洲黑杨与小叶杨P. simonii为亲本进行杂交发现：获得的130株杂交子代苗高和地径在组合间和组合内都存在广泛变异。李火根等[6]以美洲黑杨与欧美杨P.×euramericana作亲本构建杂交组合，结果发现：得到的F1代13个无性系及亲本I-69杨的生长量和分枝特性在无性系间存在较大差异。王瑞文等[7]以黑杨派不同杂种无性系为亲本开展杂交试验，并估算杂种苗期生长性状遗传参数，结果表明：F1代杂种优势明显，通过综合评价可初步筛选出优良杂交组合及优良无性系。王庆斌等[8]以I-69杨为母本，青杨P. cathayana和小黑杨P. simonii×P. nigra为父本进行杂交，初选了一批杂种新无性系并进行了综合分析评价，为杨树改良和新品种选育提供了指导。但目前杨树发展过程中也存在着一些急需解决的问题，如品种单一，低产林分多，良种化率不高，飘絮严重等，严重影响长江中下游平原地区杨树生产与发展，亟待选育出适合本地速生、优质、高产及无絮的南方型美洲黑杨新品种进行更新换代。本研究选择速生、优质、高产及抗性较好的美洲黑杨作亲本构建杂交组合，对杂种苗期生长性状和叶片性状进行遗传变异分析，并通过综合指数选择法选出生长量较大的优良杂交组合，以期为长江中下游地区杨树良种化生产提供材料。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
研究区位于南京市栖霞区八卦洲街道外沙村南京林业大学无絮杨育种基地(32°13′N，118°48′E)，该地区属亚热带季风气候区，四季分明、温暖湿润、雨量集中，全年平均气温为15.4 ℃，土壤肥沃，土壤结构良好，透气透水性较强，土壤中性偏碱。
1.2 试验材料
2020年3月进行杂交试验。9个杂交组合分别为：NL15 (P. deltoids ‘Nanlin 15’，♀)×S3239(P. deltoides，♂)，SY2(P. deltoids ‘Siyang-2’，♀)×NL447(P. deltoides ‘Nanlin 447’，♂)，NL15(♀)×NL780(P. deltoides ‘Nanlin 780’，♂)，NL15(♀)×SH3(P. deltoids ‘Hong-3’，♂)，NL15(♀)×B106(小叶杨回交F1代，♂)，SY2(♀)×NL3804(P. deltoids ‘Nanlin 3804’，♂)，NL15(♀)×SH2(P. deltoids ‘Hong-2’，♂)，SY2(♀)×SH2(♂)，NL15(♀)×NL447(♂)，各杂交亲本遗传背景信息详见表1。5月收集所有的杂交种子带回实验室处理，随后在研究区河泥苗床上播种育苗，7月初将所有的杂种苗分区移栽到普通苗床上，遮阳数日，苗期正常水分管理。每个杂交组合按单因素随机排列，6株为1小区。
表 1 美洲黑杨杂交亲本信息Table 1 Basic information of parents in hybrid experiment of P. deltoides杂交亲本 来源 S3239、SH3(洪3)、SH2(洪2)、
NL3804(南林3804杨)起源于美国密西西比河下游的美洲黑杨无性系，属美洲黑杨，原产地美国密西西比河下游第38号
洲，1991年从美国南方林业试验站引进，2008年从美洲黑杨种质资源库中选出NL447(南林447杨) 来源于I-69×445杂种无性系(属于欧美杨，开花早) NL780(南林780杨) 来源于85杨半同胞家系 B106 来源于小叶杨与美洲黑杨优良亲本回交F1代杂种无性系 SY2(泗杨2号) 来源于母本I-69杨×S3239杂种无性系 NL15(南林15杨) 来源于I-69×S3244杂种无性系，母本I-69杨来源20世纪70年代引自意大利杨树研究所，父本S3244来 自美国密西西比河下游第32号洲 1.3 试验方法
1.3.1 苗期生长性状测定
2020年10月调查苗高和地径。苗高用精确到1 cm的3 m塔尺测量，地径用精确到1 mm的游标卡尺测量，材积根据王明庥等[9]的方法计算，公式为：V材=πD2H×10−2/12。其中V材为材积(cm3)，H为苗高(cm)，D为地径(mm)。
1.3.2 苗期叶片性状测定
2020年9月，从各杂交组合小区内选取2个标准株，各株采集第5~7片叶。测定叶长(cm)、叶宽(cm)、叶柄长(cm)，叶宽基距(叶最宽处距叶基距离，cm)用直尺测量，侧脉夹角(主脉与最大叶宽处侧脉的夹角，°)用量角器测量，叶面积(cm2)和叶周长(cm)用IMAGE J的图像处理功能计算获得，叶形指数=叶长/叶宽。
1.4 数据处理与分析
采用R语言、DPS软件和Excel 2016对试验数据进行统计分析、处理和绘图。
用R语言进行性状方差分析，线性模型如下：Xijk=μ+ti+bj+eijk，Xij=u+ti+eij。其中：Xij、Xijk为实际观测值，μ为总体平均数，ti为组合效应，bj为区组效应，eij、eijk为随机误差。
遗传参数估计公式：
$$ {h}_{1}^{2}=\frac{r{\sigma }_{\mathrm{f}}^{2}}{{\sigma }_{\mathrm{e}}^{2}+r{\sigma }_{\mathrm{f}}^{2}}\times 100\%; $$ $$ {h}_{2}^{2}=\frac{{\sigma }_{\mathrm{f}}^{2}}{{\sigma }_{\mathrm{e}}^{2}+{\sigma }_{\mathrm{f}}^{2}}\times 100\%; $$ $$ {C}_{\mathrm{v}\mathrm{g}}=\frac{\sqrt{{\sigma }_{\mathrm{s}}^{2}}}{\overline X}\times 100\%; $$ $$ {C}_{\mathrm{v}\mathrm{e}}=\frac{\sqrt{{\sigma }_{\mathrm{e}}^{2}}}{\overline X}\times 100\mathrm{\%}; $$ $$ {C}_{\mathrm{v}\mathrm{p}}=\frac{\sqrt{{\sigma }_{\mathrm{p}}^{2}}}{\overline X}\times 100\%{\text{。}} $$ 其中：
$ {h}_{1}^{2} $ 、$ {h}_{2}^{2} $ 为家系和单株遗传力，r为各组合的重复数，Cvg为遗传变异系数，Cve为环境变异系数，Cvp为表型变异系数，σs为遗传标准差，σe为环境标准差，σp为表型标准差，σf为遗传方差，$ \overline X $ 为各性状的平均值。遗传进度和选择效率计算：
$$ {G_{\rm{s}}} = q \times \sqrt {\sigma _y^2} \times \sqrt {h_y^2} \times 100\% ; $$ $$ {G_{\rm{y}}} = q \times \sqrt {h_x^2} \times \sqrt {h_y^2} \times {r_{xy}} \times \sqrt {\sigma _{{\rm{p}}y}^2} ; $$ $$ E = \left( {{G_{\rm{y}}}/{G_{\rm{s}}}} \right)/100\% {\text{。}} $$ 其中：Gs为直接选择遗传进度，q为选择强度，
$ {\sigma }_{y}^{2} $ 为性状y的遗传方差，$ {h}_{y}^{2} $ 为性状y的遗传力；Gy为相关遗传进度，$ {h}_{x}^{2} $ 为性状x的遗传力，rxy为性状x与性状y的遗传相关，$ {\sigma }_{\mathrm{p}y}^{2} $ 为性状y的表型方差；E为选择效率。通径分析模型。根据遗传相关系数建立多元高斯方程组，求解方程组，计算得到直接通径系数，具体参照王庆斌等[10]方法。计算间接通径系数=rda×baY，其中rda为自变量d与自变量a之间的遗传相关系数，baY为自变量a与响应变量Y之间的直接通径系数。计算遗传增益：△G
$=\dfrac{{h}_{1}^{2}S}{u}\times 100\mathrm{\%}{\text{；其中}}$ S为选择差，u为某一性状总均值。多性状综合指数选择。指数选择法采用Smith-Hazel指数选择对各杂交组合进行综合评价，公式为：
$I=\displaystyle\sum _{g=1}^{n}{b}_{{g}}{x}_{{g}}$ 。其中：I为选择指数值，bg为g性状的指数系数，xg为g性状的表型均值。指数系数计算公式为：bg=P−1GW；其中P为每个性状的表型协方差矩阵，G为遗传协方差矩阵，W为每个性状的经济权重构成的向量；利用等权重法估算杂交组合各性状的经济权重Wg，假设各性状表型标准差的单位变化具有同等重要性，即Wg=1/${\sigma }_{{g}}$ [11]，其中${\sigma }_{g}$ 表示各性状的表型标准差。2. 结果与分析
2.1 美洲黑杨不同杂交组合子代苗期性状遗传变异分析
由表2可知：杂种苗期生长性状与叶片性状在杂交组合间均达到差异极显著水平(P＜0.01)，表明不同杂交组合间子代苗高、地径、材积和各叶片性状均存在较大差异。杂种苗期生长性状和叶片性状的遗传变异分析得出(表3)：9个杂交组合的子代苗高、地径、材积平均值分别为150.10 cm、9.95 mm、41.16 cm3，其中NL3804×SY2子代苗高最大(170.63 cm)，NL447×NL15最小(119.94 cm)，两者相差42.26%。B106×NL15子代地径最大，为11.71 mm，NL447×NL15子代地径最小，为8.23 mm，前者为后者的1.17倍；S3239×NL15子代材积最大(60.62 cm3)，NL447×NL15最小(21.90 cm3)，两者相差2.76倍。叶片长度均值为13.63 cm，B106×NL15平均叶片长度最大，达15.98 cm，超出群体均值的17.24%，是最小组合SH3×NL15(12.04 cm)的1.32倍；叶片宽度均值为13.13 cm，B106×NL15平均叶片宽度最大，为15.25 cm，高于总均值16.14%，是叶片宽度最小组合NL780×NL15 (11.32 cm)的1.34倍；叶长/叶宽平均值为1.041，NL780×NL15长宽比最大，达1.093，SH3×NL15最小，为0.968；叶柄长度平均值为7.27 cm，组合B106×NL15最大(8.64 cm)，超出总均值18.84%，是最小组合NL447×NL15(6.18 cm)的1.76倍；侧脉夹角平均值为72.62°，最大组合为S3239×NL15，达75.42°，最小为NL3804×SY2，只有69.52°；叶宽基距平均值达2.46 cm，最大组合为NL447×SY2，可达 3.05 cm，最小为SH3×NL15，只有2.00 cm；叶面积平均值为142.25 cm2，最大组合B106×NL15 (188.71 cm2)与最小组合NL780×NL15 (110.95 cm2)相差1.70倍；叶周长平均值为 58.59 cm，最大组合B106×NL15 (69.15 cm)与最小组合NL780×NL15 (51.16 cm)相差35.16%。由表3可知：各性状表型变异系数均大于遗传变异系数，其中材积的遗传变异系数(31.13%)和表型变异系数(43.88%)均最大，说明具有较大选择潜力；除叶形指数和侧脉夹角外，其他叶片性状的表型变异系数均大于10%，其中叶面积表型性状变异最大(21.69%)，说明具有较大的选择空间。各性状的家系遗传力均大于单株遗传力，其中苗高、地径、材积、叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长的家系遗传力均大于0.8；单株遗传力为0.503~0.648，均属偏强度遗传控制；叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距的家系遗传力分别为0.743、0.696、0.712，单株遗传力分别为0.419、0.364、0.382，均为中度以上遗传控制。
表 2 美洲黑杨不同杂交组合生长性状与叶片性状方差分析Table 2 Variance analysis of growth and leaf traits of different hybrid combinations in P. deltoides性状 变异来源 自由度 F P 性状 变异来源 自由度 F P 苗高 组合间 8 8.372 0.000*** 叶柄长 组合间 8 6.865 0.000*** 地径 组合间 8 5.951 0.000*** 侧脉夹角 组合间 8 3.288 0.009** 材积 组合间 8 5.055 0.001*** 叶宽基距 组合间 8 3.469 0.007** 叶长 组合间 8 6.696 0.000*** 叶面积 组合间 8 6.748 0.000*** 叶宽 组合间 8 8.097 0.000*** 叶周长 组合间 8 6.677 0.000*** 叶形指数 组合间 8 3.885 0.004** 说明：***表示P＜0.001；**表示P＜0.01 表 3 美洲黑杨杂种苗期生长性状和叶片性状变异分析Table 3 Analysis on variation of growth traits and leaf traits of P. deltoides hybrids at seedling stage性状 苗高/cm 地径/mm 材积/cm3 叶长/cm 叶宽/cm 叶形指数 叶柄长/cm 侧脉夹角/(°) 叶宽基距/cm 叶面积/cm2 叶周长/cm 平均值 150.10 9.95 41.16 13.63 13.13 1.041 7.27 72.62 2.46 142.25 58.59 最小值 119.94 8.23 21.90 12.04 11.32 0.968 6.18 69.52 2.00 110.95 51.16 最大值 170.63 11.71 60.62 15.98 15.25 1.093 8.64 75.42 3.05 188.71 69.15 遗传变异系数/% 12.21 11.97 31.13 8.60 9.37 3.36 10.52 2.56 12.34 16.65 9.45 表型变异系数/% 15.54 16.09 43.88 11.22 11.72 5.18 13.64 4.25 19.98 21.69 12.34 家系遗传力 0.881 0.832 0.802 0.851 0.877 0.743 0.854 0.696 0.712 0.852 0.850 单株遗传力 0.648 0.553 0.503 0.588 0.640 0.419 0.595 0.364 0.382 0.590 0.587 2.2 美洲黑杨杂种苗期叶片性状与生长性状相关分析及间接选择
2.2.1 叶片性状与生长性状的相关性分析
由表4可知：在表型和遗传上，3个生长性状(苗高、地径和材积)之间均呈极显著正相关(P＜0.01)；叶长、叶宽、叶柄长、叶面积、叶周长分别与生长性状间呈显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关。叶形指数与生长性状间在遗传上呈显著负相关(P＜0.05)，在表型上负相关，但相关性不显著；侧脉夹角、叶宽基距与生长性状间相关性均不显著。叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长相互之间存在着显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关，叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距与其余叶片性状间呈较弱相关或负相关，相关性均未达到显著水平，表明叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距与其他性状间的遗传互作较小。
表 4 美洲黑杨不同杂交组合叶片性状与生长性状的相关性分析Table 4 Correlation analysis between leaf and growth traits of different hybrid combinations of P. deltoides性状 苗高 地径 材积 叶长 叶宽 叶形指数 叶柄长 侧脉夹角 叶宽基距 叶面积 叶周长 苗高 0.788** 0.880** 0.653* 0.792** −0.615* 0.708** −0.078 0.089 0.697** 0.735** 地径 0.711** 0.988** 0.857** 0.969** −0.570* 0.960** 0.206 0.287 0.967** 0.978** 材积 0.833** 0.977** 0.882** 1.010** −0.628* 0.958** 0.204 0.311 0.980** 1.004** 叶长 0.543* 0.762** 0.760** 0.941** −0.128 0.990** 0.388 0.404 0.956** 0.969** 叶宽 0.672* 0.881** 0.892** 0.923** −0.454 1.063** 0.359 0.357 0.988** 0.984** 叶形指数 −0.415 −0.395 −0.430 0.069 −0.320 −0.506 0.014 0.057 −0.377 −0.330 叶柄长 0.552* 0.860** 0.847** 0.899** 0.983** −0.329 0.277 0.603* 1.052** 1.050** 侧脉夹角 0.170 0.379 0.389 0.444 0.495 −0.168 0.491 −0.061 0.472 0.507 叶宽基距 −0.142 0.138 0.119 0.353 0.287 0.167 0.408 −0.024 0.329 0.282 叶面积 0.579* 0.872** 0.858** 0.943** 0.985** −0.227 0.974** 0.564* 0.270 1.001** 叶周长 0.606* 0.866** 0.860** 0.957** 0.973** −0.163 0.949** 0.591* 0.228 0.993** 说明：对角线下方为表型相关，对角线上方为遗传相关；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01 2.2.2 叶片性状对生长性状的间接选择
为进一步了解苗期叶片性状对生长性状的相关遗传进度和间接选择效率，参照王明庥[12]方法研究估算5%入选率(选择强度为2.06)下间接选择的相关遗传进度和选择效率。由表5可以看出：利用叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长对生长性状进行间接选择，相关遗传进度较大，苗高、地径、材积分别为26.492~32.615、2.378~2.729、27.106~31.508，间接选择效率苗高、地径、材积分别为74.8%~92.1%、106.27%~121.97%、114.66%~133.28%，其中对材积的选择效率最大。叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距对生长性状的相关遗传进度和间接选择效率均较低，表明叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距不适合作为生长性状的间接选择性状。
表 5 美洲黑杨不同杂交组合叶片性状对生长性状的间接选择Table 5 Indirect selection of leaf traits to growth traits in different hybrid combinations of P. deltoides性状 苗高 地径 材积 相关遗传进度 间接选择效率/% 相关遗传进度 间接选择效率/% 相关遗传进度 间接选择效率/% 叶长 26.492 74.80 2.378 106.27 27.106 114.66 叶宽 32.615 92.10 2.729 121.97 31.508 133.28 叶形指数 −23.310 −65.82 −1.478 −66.03 −18.031 −76.27 叶柄长 28.785 81.28 2.669 119.30 29.505 124.81 侧脉夹角 −2.862 −8.08 0.517 23.10 5.670 23.98 叶宽基距 3.303 9.33 0.728 32.55 8.742 36.98 叶面积 28.295 79.90 2.685 119.99 30.137 127.48 叶周长 29.810 84.17 2.713 121.24 30.847 130.48 2.3 美洲黑杨杂种苗期材积生长量的遗传控制通径分析
单株材积是影响苗期生长量的主要因子。由苗高、地径、叶片性状对材积的遗传作用(表4和表5)可知：苗高、地径、叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长等7个性状对材积生长量具有较强的遗传控制作用。由表6可知：7个性状对材积生长量均呈不同程度的遗传控制，其中地径对材积的直接控制作用最大，通径系数达0.565，其次为苗高，通径系数达0.417，同时苗高通过地径对材积产生较大的间接遗传控制作用；叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长对材积的直接通径系数均较弱，但这些性状通过地径对材积生长量的间接通径系数较大，达0.485~0.554，说明这些性状对材积生长量具有较大的正向间接遗传控制作用，并且这种间接遗传控制作用主要是通过与地径的遗传相关来实现。
表 6 美洲黑杨不同杂交组合各性状对材积的通径分析Table 6 Path analysis of volume in different hybrid combinations of P. deltoides性状 通过叶长 通过叶宽 通过叶柄长 通过叶面积 通过叶周长 通过苗高 通过地径 叶长 0.327 −0.542 0.160 0.269 −0.182 0.272 0.485 叶宽 0.308 −0.575 0.171 0.278 −0.184 0.330 0.548 叶柄长 0.324 −0.612 0.161 0.296 −0.197 0.295 0.543 叶面积 0.313 −0.569 0.170 0.282 −0.187 0.290 0.547 叶周长 0.317 −0.566 0.169 0.282 −0.187 0.307 0.554 苗高 0.213 −0.455 0.114 0.196 −0.138 0.417 0.445 地径 0.281 −0.559 0.155 0.273 −0.184 0.329 0.565 说明：粗体为各性状对材积的直接作用，其他为各性状通过另一性状对材积的间接作用 2.4 美洲黑杨优良杂交组合综合评价与遗传增益估算
采用多性状综合指数选择法对9个杂交组合进行综合评价。由于叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距与生长性状间的遗传互作及对材积生长量的直接或间接遗传控制均较弱，因此利用苗高(X1)、地径(X2)、叶片长(X3)、叶片宽(X4)、叶柄长(X5)、叶面积(X6)和叶周长(X7)等7个性状构建选择指数方程，进行生长性状与叶形性状的联合选择。根据等权重法估算各性状指标的经济权重，经济权重向量分别为W=(0.085，1.059，1.088，1.166，1.721，0.056，0.238)。
不同性状组合的指数选择方程和性状综合育种值选择进展(表7)显示：指数方程I1、I2、I3的综合育种值选择进展(△H)、指数遗传力和综合选择指数的估计准确度均较高，但苗高和地径的偏回归系数均存在负值，即为负向遗传进展；生长性状是育种改良的首要目标，不能以牺牲生长量的改良进行选择，所以这些方程不太理想。以苗高、地径、叶面积和叶柄长构建指数方程I4，其各性状的偏回归系数均为正值，即均为正向选择；综合育种值选择进展为5.71，指数遗传力为0.862，综合选择指数的估计准确度为0.926，方程较为理想。
表 7 不同性状组合指数选择方程Table 7 Index selection equation of different characteristics指数选择方程 综合育种值
选择进展(△H)指数遗
传力综合选择指
数的估计准确度I1=0.0975X1−0.189 0X2+0.6725X3+2.5578X4+2.8459X5+0.1195X6−0.3977X7 10.08 0.868 0.928 I2=0.1047X1−1.1988X2−0.4551X3+2.036 0X4+3.6552X5+0.0774X6 8.62 0.872 0.930 I3=−0.1347X1+4.1451X2+13.6535X4+4.0199X5−0.7178X6 7.35 0.896 0.937 I4=0.0954X1+0.0249X2+2.022 0X5+0.0613X6 5.71 0.862 0.926 根据方程I4计算各杂交组合的选择指数，按30%的入选率[12]选出B106×NL15、S3239×NL15、NL447×SY2 等3个杂交组合(表8)。其中B106×NL15、S3239×NL15的材积和叶面积的遗传增益较大，分别达29.00%、27.82%和37.91%、19.60%。从整体评价效果来看，材积生长量所获得遗传增益最大，达26.90%，超出总均值33.55%；叶片性状中叶面积所获得遗传增益最大，达16.85%，高于总均值19.78%。
表 8 美洲黑杨优良家系生长性状与叶片性状遗传增益估算Table 8 Estimation of genetic gain of growth and leaf characteristics in superior families of P. deltoides杂交组合 苗高/% 地径/% 材积/% 叶柄长/% 叶面积/% B106×NL15 3.06 14.69 29.00 16.07 27.82 S3239×NL15 9.56 14.14 37.91 12.54 19.60 NL447×SY2 8.36 3.27 13.80 3.13 5.89 平均增益/% 6.99 10.70 26.90 11.50 16.85 3. 结论与讨论
选育出速生、优质、高产及无絮的南方型美洲黑杨新品种进行更新换代是目前开展美洲黑杨杂交试验的主要目的，其中生长性状是黑杨派良种选育的首要目标。本研究对美洲黑杨9个杂交组合子代苗期生长性状进了遗传变异分析，发现苗高、地径和材积等3个生长性状在杂交组合间均存在极显著差异，生长性状家系遗传力均达0.80以上，均大于单株遗传力，表明生长性状受强度遗传控制[13]；其中材积性状的遗传变异最大(31.13%)，说明选择潜力较大，苗高次之(12.21%)，地径相对较小(11.97%)。生长性状变异主要来源于杂交组合间基因型的遗传基础差异。叶片是植物重要的营养器官，尤其叶柄和叶面积对林木的同化产物运输、光合产物的积累起着重要作用。本研究中杂交组合间各叶片性状差异显著，叶长、叶宽、叶柄长、叶周长和叶面积的家系遗传力均在0.85以上，表明这些叶片性状受较强的遗传控制[14]；叶柄长和叶面积的表型变异系数和遗传变异系数较大，均超过10%，说明选择空间较大；叶长、叶宽和叶周长的遗传变异系数均低于10%，选择空间相对较小。与李金花等[15]对美洲黑杨与青杨杂交子代叶形、成星奇等[16]对美洲黑杨与小叶杨杂交子代叶片的研究结果类似。叶形指数和侧脉夹角的家系遗传力相对较弱，遗传变异较低，受环境影响较明显。
研究美洲黑杨苗期叶片性状与生长性状间的遗传互作，对美洲黑杨早期选择具有重大意义。本研究中苗高、地径和材积等3个生长性状间的遗传相关和表型相关十分密切。叶片性状中叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长间均呈极显著正遗传相关，并与苗高和地径间也存在极显著或显著正遗传相关，而叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距与其他性状间存在负弱相关或相关性不显著；与张勇等[17]对橡胶树Hevea brasiliensis无性系生长和叶片表型性状的研究结果相类似，表明叶长、叶宽、叶柄长、叶面积、叶周长与生长性状间的遗传互作较明显。通过叶片性状联合对苗高、地径和材积进行间接选择，发现叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长对3个生长性状的遗传相关进度和间接选择效率较大，而叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距的间接选择效率较弱，说明叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距不适合作为评选优良杂交组合的标准。材积是评价苗期生长量的主要因子，利用通径分析方法分析苗高、地径和叶片性状对材积生长量的遗传控制作用大小及控制途径，结果发现苗高、地径对材积的直接遗传控制作用最大，苗高通过地径对材积的间接控制作用也较大，可知苗高和地径是影响材积生长量的首要因子，在综合评价过程中苗高和地径性状可作为主要选择目标；叶片性状中，叶柄长、叶面积对材积的直接通径系数较小，叶宽和叶周长的直接通径系数为负，即为负向选择，但这些叶片性状通过苗高和地径对材积产生的正向间接遗传控制作用较大，说明叶片性状对材积的控制途径主要通过与苗高和地径间的遗传相互作用来实现。这与李春明等[18]对毛白杨Populus tomentosa杂种无性系苗高、地径的构成因素研究结果相类似，表明开展苗期生长性状与叶片性状的联合选择是可行的。
育种目标是杂交亲本选择与选配的首先考虑因素。美洲黑杨作为中国南方型速生工业用材和绿化造林树种，速生、优质和高产是主要育种目标。本研究选用生长量较大、干形圆满通直及抗褐斑病的主要美洲黑杨(S3239、南林3804、南林15杨和泗杨2号等)品种作亲本，研究生长性状与叶形性状间的遗传互作，进行生长性状与叶片性状的联合改良；以苗高、地径作为选择依据，选出B106×NL15、S3239×NL15、NL447×SY2等3个速生、高产的优良杂交组合，同时发现材积生长量获得的遗传增益最大(26.90%)，改良效果较好。但本研究只是1年生苗和单地点试验数据，后续研究需增加多年多点的无性系苗期对比试验，以便选出性状更优良、遗传稳定的优良杂种无性系。
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图 1 野生型与T1阳性植株成熟花药形态及散粉情况
Figure 1 Anther morphology and pollen release of wild type and T1 positive plants
图 4 野生型及T1阳性植株半定量RT-PCR分析
Figure 4 Semi-quantitative RT-PCR of wild type and T1 positive plants
图 5 野生型与T1阳性植株自交及与野生型正反交授粉后的蒴果及种子
Figure 5 Capsules and seeds of wild type and T1 positive plants after self-crossing and cross-pollination with wild type
表 1 引物信息
Table 1. Specific primers used in this study
引物名称 引物序列(5′→3′) CsRNF217_R838_S GTCGACTTGCATAGAGCCAATAAA 35S_F ACGCACAATCCCACTATCCTTC CsRNF217_qL2 ACGTGCGAGGGTATGAAAGA CsRNF217_qR2 TACCCTCCATGCCACTTCAG EF1α-F TGGTTGTGACTTTTGGTCCCA EF1α-R ACAAACCCACGCTTGAGATCC 
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表 2 野生型及T1烟草植株阳性率与花粉染色活力
Table 2. Positive rate and pollen viability of wild type and T1 tobacco plants
株系 株数/
株阳性
株数/株植株阳
性率/%花粉染色活力
均值/%6# 16 10 62.5 19.5±2.7 b 35# 80 33 41.2 31.9±2.8 b 63# 41 25 61.5 21.8±2.3 b WT 3 0 0 94.5±2.4 a 说明：同列不同字母表示不同株系间花粉染色活力差异显著(P＜0.05)。WT为野生型株系。
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表 3 野生型及阳性株系自交及杂交试验的蒴果大小和种子数量
Table 3. Capsule and seed number in selfing and hybridization test
处理 株系 蒴果横径/mm 蒴果纵径/mm 种子数量/(粒·果−1) 自交 WT 9.2±0.2 a 15.8±0.2 a 1 525.7±19.9 a 6# 8.9±0.1 ab 14.9±0.1 ab 1 030.4±105.2 b 35# 8.4±0.1 bcd 14.9±0.1 ab 948.5±37.3 b 63# 8.4±0.0 bcd 14.6±0.1 b 1 006.7±36.0 b 正交 WT (♀) × 6# (♂) 8.5±0.1 abcd 15.2±0.4 ab 845.5±69.4 b WT (♀) × 35# (♂) 8.6±0.2 abc 14.3±0.2 b 924.6±26.7 b WT (♀) × 63# (♂) 8.1±0.2 cd 15.0±0.4 ab 1 049.8±8.0 b 反交 6# (♀) × WT (♂) 8.6±0.2 abc 15.1±0.5 ab 1 103.4±119.8 b 35# (♀) × WT (♂) 9.1±0.3 ab 14.8±0.5 ab 992.3±185.9 b 63# (♀) × WT (♂) 7.8±0.3 d 14.4±0.4 b 914.4±90.7 b 说明：WT表示野生型烟草。同列不同字母表示株系间差异显著(P＜0.05)。
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