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玉米Zea mays是主要的食品、饲料和工业原料作物，在粮食安全中发挥着至关重要的作用。容重作为玉米商品质量的重要指标，已成为国际贸易中质量分级的重要因素[1]。容重由单位容积内的粒数和质量决定，在生长发育过程中，受到多种因素的影响，包括玉米整株的外形、吐丝期、抽雄期、灌浆期等[1]。前人研究发现：籽粒灌浆率是影响作物籽粒容重的关键因素[2]。授粉 2~3周后，籽粒的灌浆速度较快，内部物质在此期间迅速积累[3]。由于玉米胚乳质量占籽粒质量的85%，玉米籽粒的饱满度主要受胚乳的影响[3]。胚乳细胞的增殖和发育决定了籽粒的质量和品质，玉米胚乳的发育包括籽粒库容建成和籽粒库充实[4]。籽粒库容的建成主要是胚乳细胞的增殖和生长扩张，以及胚乳细胞中淀粉颗粒的发育；籽粒库的充实主要通过淀粉的持续合成和积累，以及胚乳中淀粉颗粒的逐渐膨胀[5]。胚乳淀粉质量分数为70%~75%[5]，由此可知，玉米中淀粉质量分数与容重紧密相关，容重可以反映籽粒的品质和成熟度[6]。以往研究对玉米品质的研究主要集中在营养品质和加工品质方面，对容重的研究较少。
籽粒容重与其他品质性状间有着密不可分的联系。在玉米中，吴春胜等[7]发现籽粒容重与蛋白质、脂肪含量负相关；张丽等[8]发现容重与蛋白质、淀粉含量正相关；张静等[9]发现容重与蛋白质含量负相关，与脂肪、淀粉含量正相关；而DORSEY-REDDING等[10]则发现容重与淀粉含量负相关。综上所述，玉米容重与其他品质性状之间的相关性存在争议。
前期通过数量性状基因座(QTL)或全基因组关联 (GWAS) 分析发现容重在小麦Triticum aestivum和玉米中具有高度遗传性，并且筛选到一些关键 QTLs、单核苷酸多态性位点(SNPs)或基因[11−16]。在玉米中，ZHANG等[11]对 B73 × Mo17构建的IBMSyn10 DH群体对容重性状进行关联分析，筛选到17个候选基因，其中包括 ATHB-4 (Zm00001d044081)。DING等[17]利用 Chang 7-2 × Zheng 58 构建的 225 个自交系群体通过混合模型(MLM)进行 QTL 分析，鉴定到 5 个与容重相关的 QTLs。LIU等[18]利用 10 个重组自交系群体进行 QTL 分析，在玉米中鉴定出 70 个 QTLs。由于容重是一个复杂的数量性状，目前关于控制容重的关键基因鉴定进展缓慢。
本研究使用 517份玉米种质对容重与粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪、直链淀粉进行相关性分析，并选取极端种质进行转录组测序(RNA-Seq) 分析，挖掘控制容重的关键基因，为容重调控机制研究和高容重新品种选育提供候选基因和优异种质。
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以 517 份玉米种质资源为材料，其中包括 368 份浙江地方玉米种质以及 149 份国内外骨干自交系。对玉米种质进行自交授粉 4 代。2022年4月种植于浙江省东阳市(29.28′N，120.33′E)、11月种植于海南省乐东县(18.52′N，108.93′E)和7月种植于浙江省杭州市临安区(30.23′N，119.72′E)。玉米种质在每个地点种植设3个随机区组重复。每个材料每行种植 20 株，选取9 个授粉良好的果穗进行测定。
B73作为玉米重要的骨干自交系，被广泛用于品种选育及各种基础研究的参考品种，因此以B73作为参照，以便监测和标准化不同批次样品的品质性状数据。
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玉米果穗脱粒后去除杂质，自然干燥后含水量降至14%以下。用 GHCS-1000AP KTW 测定仪(浙江托普云农科技股份有限公司)按照 SAC 方法(GB 1353—2009《玉米》)检测容重。从 9 个果穗的混合籽粒中随机采集约50 g种子，用磨样机粉碎成粉末，进行其他品质性状测定。
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取 10 g样本，用电热鼓风干燥器(DHG9030A，浙江托普云农科技股份有限公司)通过高温烘干法测定含水量。
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含氮量按照改进的凯氏定氮法[19]，使用全自动凯氏定氮仪(K9860，海能仪器股份有限公司)进行测定。取约 0.100 0 g的样本，籽粒中粗蛋白是检测含氮量的 6.25倍。
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玉米籽粒粗脂肪的测定采用改良索氏抽提法[20]，参考GB 2906—1982《粮油作物种子粗脂肪测定方法》，用索氏脂肪抽提仪(SOX606，海能仪器股份有限公司)提取2.000 0 g籽粒中的粗脂肪，然后用烘箱(XMTD-8222，上海精宏实验设备有限公司)去除脂肪抽提剂石油醚。
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籽粒粗淀粉的测定参考ISO 10520: 1997《本地淀粉 淀粉含量的测定 旋光法》和GB 5006—1985《谷物籽粒粗淀粉测定法》。将 2.5000 g样本通过氯化钙-乙酸溶液水解，然后使用硫酸锌和亚铁氰化钾溶液进行提取，使用全自动旋光仪(P850，海能仪器股份有限公司)进行测定。
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直链淀粉的测定参考GB 7648—1987《水稻、玉米和谷子籽粒直链淀粉测定法》的改进方法[21]。用 Synergy H1 多模式微孔板酶标仪(BioTek 仪器公司)测定直链淀粉-碘复合物在 720 nm 波长处的吸光度。
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支链淀粉质量分数的计算方法是从粗淀粉中减去直链淀粉质量分数。每个样品测定2个重复，如果2次重复偏差超过5%，重复测定1次。直支比为直链淀粉质量分数与支链淀粉的比值。
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授粉20~25 d是玉米种子发育和灌浆的重要阶段[22−23]，因此RNA提取自授粉20 d的籽粒。2023年8月，将517份玉米种质种植于浙江省杭州市临安区，种植区域与2022年相同，进行3个随机区组重复，每个材料每行种植 20 株。 根据2022年品质分析结果，从具有极端表型的种质中分离籽粒，筛选4个容重较高、粗淀粉质量分数较高、粗蛋白质量分数较低、粗脂肪质量分数较低的种质(梅玉米、F1白轴、 CML324、975-12)，以及 4 个容重较低、粗淀粉质量分数较低、粗蛋白质量分数较高、粗脂肪质量分数较高的种质(浙单14、M270、孝丰白马玉米、金辉黑糯玉米)，上述8个极端种质的生育期均为101 d。将9个果穗的籽粒混合作为1个重复。提取的RNA送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行RNA-Seq测序和分析。
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授粉 20 d后，采集籽粒并保存在−80 ℃冰箱。使用 TransZol Up Plus RNA试剂盒(北京全式金生物科技股份有限公司)提取总RNA。使用 Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 逆转录试剂盒(上海翌圣生物技术有限公司)将 RNA 反转录为 cDNA，使用稀释的 cDNA 进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)鉴定。以玉米管家基因ZmGAPDH作为内参，对样本进行RT-qPCR鉴定。引物组合：Zm00001d043468，使用引物1F 和1R；Zm00001d028709，使用引物2F和2R；Zm00001d021653，使用引物3F和3R；Zm00001d004438，使用引物 4F 和 4R；Zm00001d043511，使用引物 5F 和 5R； Zm00001d041775 使用引物 6F 和 6R；Zm00001d032224 使用引物 7F 和 7R；Zm00001d035156 使用引物 8F 和 8R；ZmGAPDH 使用引物 9F 和 9R，检测各基因表达。每个样品包含3个生物学重复，3个玉米的籽粒作为1个生物学重复。
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利用Excel和SPSS 19.0进行数据分析，计算最大值、最小值、平均数、标准差、变异系数，绘制群体频率分布图，对玉米籽粒品质性状数据进行联合方差分析和相关性分析等。
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从表1可见：玉米籽粒容重最大值和最小值均在东阳，分别为 904.00和 254.55 g·L−1。东阳容重的变异系数最大，临安的变异系数最小。经过最佳线性无偏预测法(BLUP)分析后，容重为431.41~798.55 g·L−1，变异系数降至 8.47%。粗蛋白质量分数最大值在乐东，最小值在东阳。东阳粗蛋白质量分数的变异系数最大，临安的变异系数最小。经 BLUP 分析，粗蛋白质量分数为6.17%~17.89%，变异系数降至 10.09%。粗脂肪质量分数最大值和最小值均在东阳，分别为 14.57%和 2.01%。东阳的粗脂肪质量分数变异系数最大，而临安最小。经 BLUP 分析，粗脂肪质量分数为 2.64%~12.99%，变异系数降至 29.01%。粗淀粉质量分数最大值在乐东，最小值在东阳。东阳的变异系数最大，临安的变异系数最小。经 BLUP 分析，粗淀粉质量分数为 12.45%~71.25%，变异系数降至 11.04%。直链淀粉质量分数最大值和最小值均在东阳，分别为 36.44% 和 2.66%。东阳的直链淀粉质量分数变异系数最大，而临安最小。经 BLUP 分析，直链淀粉质量分数在 5.70%~32.68%，变异系数降至 26.44%。支链淀粉质量分数最大值和最小值均在乐东，分别为65.94%和18.66%。经 BLUP 分析，支链淀粉质量分数为 16.65%~61.79%，变异系数降至 16.65%。直支比最大值在东阳，最小值在乐东。东阳的变异系数最大，而乐东的变异系数最小。经 BLUP 分析，直支比为 0.16~2.30，变异系数降至 33.08%。
表 1 玉米籽粒容重和其他品质性状统计及分析
Table 1. Descriptive statistics for maize test weight and other quality traits
项目 地点 容重/(g·L−1) 质量分数/% 直支比 粗蛋白 粗脂肪 粗淀粉 直链淀粉 支链淀粉 均值±标准差 东阳 606.84±101.03 12.48±2.08 4.98±2.00 62.73±9.64 21.87±8.94 40.83±10.64 0.60±0.32 乐东 692.46±69.45 13.98±2.08 5.01±1.70 64.23±6.00 21.89±6.77 42.35±8.30 0.55±0.21 临安 712.90±52.82 12.77±1.35 5.03±1.17 64.88±4.25 21.06±6.85 43.75±8.06 0.52±0.21 BLUP 664.42±56.29 13.17±1.33 5.04±1.46 63.21±6.98 22.10±5.84 41.46±6.90 0.58±0.19 数值范围 东阳 254.55~904.00 7.66~20.30 2.01~14.57 19.95~72.46 2.66~36.44 4.98~65.13 0.07~3.00 乐东 366.67~840.00 9.05~20.70 2.46~13.61 34.36~77.08 3.20~34.12 18.66~65.94 0.06~1.10 临安 431.82~871.43 9.72~17.91 3.13~12.00 36.76~72.17 4.36~31.50 20.70~64.65 0.07~1.17 BLUP 431.41~798.55 6.17~17.89 2.64~12.99 12.45~71.25 5.70~32.68 16.65~61.79 0.16~2.30 变异系数/% 东阳 16.65 16.66 40.13 15.37 40.88 26.07 53.39 乐东 10.03 14.85 33.83 9.34 30.95 19.59 37.44 临安 7.41 10.58 23.29 6.55 32.50 18.41 40.06 BLUP 8.47 10.09 29.01 11.04 26.44 16.65 33.08 -
如图1所示：容重主要分布在 650.00~700.00 g·L−1，群体分布呈标准正态分布。粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、直链淀粉、支链淀粉质量分数和直支比分别主要分布在 12.00%~13.00%、4.00%~5.00%、64.00%~68.00%、24.00%~27.00%，40.00%~46.00%，0.60~0.80内。粗蛋白、粗淀粉质量分数的群体分布呈正态分布，粗脂肪、直链淀粉质量分数和直支比的群体分布呈偏态分布。
图 1 不同种质籽粒品质性状的群体分布图
Figure 1. Histogram of frequency distribution of kernel test weight and quality traits in different inbred lines
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品质性状作为因变量，品种和环境作为自变量进行分析(表2)发现：容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境以及品种与环境交互作用的极显著影响(P＜0.01)。直链淀粉和支链淀粉的质量分数受品种影响极显著(P＜0.01)，但不受环境以及品种与环境间交互作用的影响。粗蛋白质量分数、直支比受品种和环境的显著影响(P＜0.01或P＜0.05)，但不受品种和环境之间交互作用的影响。
表 2 不同试验点玉米种质籽粒容重和其他品质性状的联合分析
Table 2. Joint analysis of kernel test weight and other quality traits of maize inbred lines in different experimental sites
性状 变异来源 平方和 F P 性状 变异来源 平方和 F P 容重 品种 415221.072 100.721 ＜0.001** 直链淀粉 品种 4869.787 135.622 ＜0.001** 环境 159948.328 38.799 ＜0.001** 环境 91.143 2.538 0.112 品种×环境 13620.659 3.304 0.003** 品种×环境 65.838 1.834 0.140 粗蛋白 品种 171.774 50.379 ＜0.001** 支链淀粉 品种 5845.288 86.835 ＜0.001** 环境 94.612 27.749 ＜0.001** 环境 59.727 0.887 0.347 品种×环境 4.487 1.316 0.268 品种×环境 80.387 1.194 0.311 粗脂肪 品种 317.333 171.032 ＜0.001** 直支比 品种 3.630 71.754 ＜0.001** 环境 14.765 7.958 0.005** 环境 0.284 5.613 0.018* 品种×环境 7.527 4.057 0.007** 品种×环境 0.038 0.758 0.518 粗淀粉 品种 6118.363 164.49 ＜0.001** 环境 330.135 8.876 0.003** 品种×环境 240.086 6.455 ＜0.001** 说明：*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。 -
相关性分析(图2)显示：容重与粗蛋白、粗脂肪质量分数呈极显著负相关(P＜0.01)，而与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉质量分数呈极显著正相关(P＜0.01)。容重与直支比之间无相关性。粗蛋白、粗脂肪质量分数与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉呈极显著负相关(P＜0.01)，而粗蛋白与粗脂肪质量分数呈极显著正相关(P＜0.01)。粗淀粉与直链淀粉、支链淀粉质量分数呈极显著正相关(P＜0.01)，而与直支比呈极显著负相关(P＜0.01)。直链淀粉与支链淀粉质量分数呈极显著负相关(P＜0.01)，而与直支比呈极显著正相关(P＜0.01)。支链淀粉质量分数与直支比呈极显著负相关(P＜0.01)。
图 2 籽粒容重与其他品质性状的相关性分析
Figure 2. Correlation coefficients between kernel test weight and other quality traits
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通过主成分分析，容重较高、粗淀粉质量分数较高、粗蛋白质量分数较低的种质被划分为 A 组，而容重较低、粗淀粉质量分数较低、粗蛋白质量分数较高的种质被划分为 B 组(图3A)，说明 A 组和 B 组之间的基因表达量有显著性差异。在主成分分析中，PC1 可解释 43.9% 的表型，PC2 可解释 15.7% 的表型(图3B)。与 A 组相比，B1、B2、B3、B4中分别有1 847、4 729、2 273、1 918个基因上调，而 B1、B2、 B3 、 B4 中分别有 391 、 350 、 433 、 352 个基因下调(图3C~D)。经过韦恩分析发现：其中140个基因在B组中共同上调，19个基因受到下调。对上述159个基因进行基因本体(GO)富集分析，发现分别有 50 和 47 个基因富集于细胞过程、生物过程的代谢，54 个基因富集在细胞构造及组成中，46 个基因分别具有结合和催化活性的分子功能(图3E)。通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，有 7 个基因富集于糖酵解/葡萄糖生成(ko00010)，5 个基因富集于光合生物碳固定(ko00710)，8 个基因富集于碳代谢(ko01200)，7 个基因富集于氨基酸生物合成中的碳固定(ko01230) (图3F)。
图 3 转录组分析筛选控制容重和品质性状的候选基因
Figure 3. Transcriptome screening of control genes for traits such as bulk density and quality
为了进一步挖掘控制容重和品质性状的关键基因，从与碳代谢、光合组织中的碳固定以及氨基酸的生物合成相关途径中筛选出 8 个候选基因，通过 RT-qPCR 或 RNA-Seq 进行了验证分析。通过 RT-qPCR 分析，编码6-磷酸海藻糖合酶6的 Zm00001d043468 在 B2 中的表达量是 A2 的 3.7 倍。RNA-Seq 数据中，Zm00001d043468 的表达水平在 B 组中较 A 组升高 2.8 倍，而通过RT-qPCR检测发现该基因在 B 组中的表达量是 A 组的 2.7 倍 (图4A)。通过 RT-qPCR 分析，编码抗坏血酸过氧化物酶同源基因-3的Zm00001d028709在B1和B4组的表达量是 A1 组的51倍。通过 RNA-Seq 分析发现，Zm00001d028709 的表达水平在 B 组较 A 组升高 3.1 倍，而RT-qPCR分析显示该基因在 B 组中表达量是 A 组的 4.9 倍 (图4B)。通过RT-qPCR 分析，编码葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体-2 的 Zm00001d021653 在 B4 组的表达量是 A4 组的 21.4 倍。通过 RNA-Seq分析发现 Zm00001d021653 的表达水平在B 组较 A 组升高 10.2 倍，而RT-qPCR实验验证发现该基因在 B 组表达量是 A 组的 4.6倍 (图4C)。通过 RT-qPCR 分析，编码普鲁兰酶型淀粉脱支酶 1 的 Zm00001d004438 在 A4 组的表达量是 B3 组的 1.4 倍。通过 RNA-Seq 分析发现 Zm00001d004438在A 组的表达量较 B 组升高 2.3 倍，而使用RT-qPCR验证发现该基因在 A 组的表达量是 B 组的1.9倍 (图4D)。通过 RT-qPCR分析，编码己糖激酶-6 的 Zm00001d043511 在 B3 组的表达量是 A2 组的 6.9 倍。通过 RNA-Seq 分析发现Zm00001d043511在 B 组的表达量较A 组升高 2.1 倍，而RT-qPCR验证该基因在 B 组表达量是 A 组的 2.6 倍 (图4E)。通过RT-qPCR分析，编码2-脱氢-3-脱氧磷酰辛酸醛缩酶的 Zm00001d041775 在 B2 中的表达量是A2的17倍。通过 RNA-Seq 分析发现Zm00001d041775在 B 组中的表达量较 A 组升高 3.4 倍，而 RT-qPCR检测该基因在B 组的表达量是 A 组的 3.4 倍 (图4F)。通过RT-qPCR分析，编码丙酮酸脱氢酶复合体叶绿体二氢脂酰赖氨酸-残基乙酰转移酶组分-4的 Zm00001d032224 在 B4 组的表达量是A2组的 46.9倍。通过 RNA-Seq 分析发现 Zm00001d032224 在B 组的表达量较 A 组升高 1.8倍，而 RT-qPCR检测该基因在B 组的表达量是 A 组的 4.6倍 (图4G)。通过 RT-qPCR 分析，编码细胞膜甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPC2的Zm00001d035156在B4组的表达量是A4组的25.6倍。通过 RNA-Seq分析发现：Zm00001d035156在B组的表达量较A组升高 2.8 倍，而RT-qPCR显示该基因在B组的表达量是 A 组的3.4倍 (图4H)。从以上结果可以看出：RT-qPCR和 RNA-Seq 检测基因表达的趋势是一致的。相关性分析发现：RT-qPCR 和 RNA-Seq 数据具有很高的相关性，R2 为 0.831 8 (图4I)。
图 4 通过RNA-Seq和RT-qPCR检测候选基因的相对表达量
Figure 4. Relative expression of candidate genes detected by RNA-Seq and RT-qPCR
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容重是一个复杂的数量性状，受多因素影响，但与其他品质性状的关系仍有争议。在玉米中，张丽等[8]研究表明：容重与蛋白质质量分数呈正相关，也有研究发现容重与蛋白质质量分数呈负相关[7, 9]。本研究发现玉米籽粒容重与粗蛋白质量分数呈负相关。向日葵Helianthus annuus中粗脂肪质量分数与容重呈正相关，但在燕麦Avena sativa中无显著关系，在大豆Glycine max中呈负相关[24−26]。在玉米中，吴春胜等[7]发现籽粒容重与脂肪质量分数呈负相关，张静等[9]发现容重与脂肪质量分数呈正相关。本研究发现玉米容重与粗脂肪质量分数呈负相关。玉米籽粒主要由胚和胚乳组成，胚乳质量占了85%，且以淀粉为主，而胚的主要成分是蛋白质、脂肪和水。这可能有助于解释容重与粗脂肪和粗蛋白质量分数之间的负相关关系。张丽等[8]利用29个山东省审定玉米品种研究发现玉米籽粒容重和淀粉呈正相关关系，但是DORSEY-REDDING 等[10]分别使用183和195个玉米杂交种发现玉米籽粒容重和淀粉呈负相关。本研究利用517个玉米种质发现淀粉质量分数和容重呈正相关。此外，容重与直链淀粉或支链淀粉的质量分数之间存在弱的正相关性，而容重与直支比之间没有相关性。这表明容重可能是由淀粉质量分数决定，而不是由淀粉类型决定。
容重是一个可遗传的数量性状，但它也受环境因素的影响。本研究表明：容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境或品种和环境交互作用的影响，而直链淀粉和支链淀粉只受品种影响，不受环境影响。这些结果说明在不同环境下的容重可能受到粗蛋白、粗脂肪或粗淀粉质量分数的影响，而不受到直链淀粉和支链淀粉的影响。
在玉米中，ZHANG等[11]利用 B73 × Mo17(IBM)Syn10 DH群体进行 QTL 关联分析，筛选到3个与容重相关的候选基因 ZmSWEET4c、ZmYUC1和 ZmTCRR，这些基因均与胚乳发育及碳代谢有关[11, 27−28]。本研究通过RT-qPCR 方法筛选并验证了 8 个与碳代谢和氨基酸代谢相关的基因。其中，与碳代谢相关的海藻糖-6-磷酸对胚发育、产量形成和非生物胁迫耐受性非常重要[29−30]。在水稻Oryza sativa中，OsTPS8在耐盐性和糖分积累方面起着重要作用[31]。本研究发现编码6-磷酸海藻糖合酶6的 Zm00001d043468与容重和品质性状有关。在拟南芥Arabidopsis thaliana中，基质抗坏血酸过氧化物酶(s-APX)已被证明可通过调节抗坏血酸的生物合成来控制碳水化合物的供应[32]。编码抗坏血酸过氧化物酶同源物 3 并与碳水化合物代谢(K00434)相关的 Zm00001d028709在容重较低的种质中上调，该基因位于容重相关QTL位点 PZE-103144282或qKTW3-2附近[11]。在拟南芥中，葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体 2(GPT2)可增加叶绿体内膜的碳还原，影响光合作用和植物生长[33]。在玉米中，编码葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体2的 Zm00001d021653可能是容重增加的原因。Zm00001d004438编码普鲁兰酶型淀粉脱分支酶1 (Zpu1)，可能在胚乳发育过程中起重要作用[34]，在容重较高的种质中高表达，该基因位于已报道容重关联位点 SYN18432、qKTW7和phi082-umc1799附近[11, 17]。ZmHXK3a 催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸在淀粉代谢中发挥关键作用[35]。本研究表明编码己糖激酶-6的Zm00001d043511在容重和粗淀粉质量分数较高的种质中高表达。在桑Marus alba叶中，编码 2-脱氢-3-脱氧磷酸醛缩酶的 KdsA 在高盐和干旱胁迫下下调[36]。本研究发现编码 2 -脱氢- 3 -脱氧磷酰辛酸醛缩酶的 Zm00001d041775与容重和品质性状的形成有关，该基因位于容重关联位点PZE-10314428和qKTW3-2附近[11]。在拟南芥中，细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPC2在细胞代谢和种子脂肪积累中起着重要作用[37]。本研究发现编码细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPC2 的 Zm00001d035156 在容重较高的种质中高表达。
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群体结构分析表明：玉米籽粒容重，粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、直链淀粉、支链淀粉质量分数和直支比的主要分布符合正态分布或近似正态分布。联合方差分析表明：容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境以及品种与环境交互作用的显著影响；直链淀粉和支链淀粉的质量分数受品种影响较大，但不受环境以及品种与环境间交互作用的影响；粗蛋白质量分数、直支比受品种和环境的显著影响，但不受品种和环境之间交互作用的影响。品质性状之间相关性分析表明：容重与粗蛋白、粗脂肪质量分数呈显著负相关，而与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉质量分数呈显著正相关。容重与直支比之间无相关性。
进一步对极端玉米种质籽粒进行RNA-Seq，共鉴定到8个与碳代谢和氨基酸代谢途径相关的基因，并利用RT-qPCR验证其在极端种质中的表达差异，发现这些基因在不同种质中的表达变化规律与品质性状差异变化趋势一致，其中Zm00001d021653、Zm00001d004438、Zm00001d043511、Zm00001d035156可能在碳还原、胚乳发育、淀粉代谢、细胞代谢和种子脂肪积累中起着重要作用。
本研究筛选获得了可能与品质性状相关的候选基因，可以为高品质玉米新品种选育提供特异性种质资源及候选基因，但是对于这些基因调控玉米籽粒品质性状的分子机制仍然不够清晰，还需要进一步通过分子生物学实验来鉴定这些基因的功能，以揭示玉米籽粒品质性状的分子调控机制。
Correlation analysis of test weight and other quality traits and candidate gene mining in 517 maize germplasms
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摘要:
目的 玉米Zea mays籽粒容重是国家玉米区试标准中品质性状的重要指标之一，是一个复杂的数量性状，目前其影响因素和调控机制尚未完全解析。淀粉、蛋白质、脂肪等品质性状是影响容重的重要因素，但其与容重的关系仍存在争议。本研究旨在阐明容重与其他品质性状之间的相关性，揭示容重的调控机制。 方法 测定以浙江省地方玉米种质资源为主要构成的 517 份玉米种质的容重，粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪、直链淀粉质量分数等性状，并进行相关性分析。在此基础上，选取 4 个高容重、高淀粉质量分数、低粗蛋白质量分数、低脂肪质量分数的玉米种质籽粒和 4 个低容重、低淀粉质量分数、高粗蛋白质量分数、高脂肪质量分数的玉米种质籽粒进行转录组测序(RNA-Seq)分析。 结果 容重与总淀粉质量分数呈显著正相关(P＜0.01)，而容重与粗蛋白和粗脂肪质量分数呈显著负相关(P＜0.01)。对极端种质进行RNA-Seq 分析，共筛选获得 159 个差异表达基因，这些基因主要参与碳代谢、光合组织中的碳固定、氨基酸生物合成等过程。进一步实时荧光定量PCR对其中与碳代谢或氨基酸生物合成相关的8个候选基因表达量进行验证，发现这些基因在不同种质中的表达变化规律与容重差异变化趋势一致。 结论 阐明了玉米籽粒容重与其他品质性状之间的相关性，为高品质玉米新品种选育提供特异性种质及8个在碳还原、胚乳发育、淀粉代谢、细胞代谢和种子脂肪积累中起着重要作用的候选基因。图4表2参40 Abstract:Objective As an important factor of quality traits in national maize standard regional tests, test weight is a complex quantitative trait, and its influencing factor and regulatory mechanism is still unclear. Quality traits such as starch, protein, and fat content are important factors affecting test weight, but the relationship between them is still unclear. Method This research determined the test weight, starch, crude protein, gross fat, and amylose content of 517 maize germplasms mainly composed of local maize germplasm resources in Zhejiang Province. On the basis of correlation analysis, the kernels of four germplasms with higher test weight, higher starch content, lower protein content, lower fat content, and four germplasms with opposite phenotypes were selected for RNA-Seq analysis. Result By correlation analysis, this research found there was a significant positive correlation between test weight and starch content, while a negative correlation was found between test weight and protein or fat content. RNA-Seq analysis was performed for the extreme germplasm, a total of 159 differentially expressed genes were screened between 2 groups, and 8 candidate genes related to carbon metabolism or amino acid biosynthesis were used for further analysis. The expression difference of these genes was consistent with the change of test weight in different inbred lines by RT-qPCR. Conclusion The correlation between test weight and other quality traits was preliminarily clarified, providing superior germplasms and 8 candidate genes that play important roles in carbon reduction, endosperm development, starch metabolism, cellular metabolism, and seed fat accumulation for the selection of new high-quality maize cultivars. [Ch, 4 fig. 2 tab. 40 ref.] -
Key words:
- maize /
- kernel test weight /
- quality traits /
- regulation mechanism
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在植物细胞中，内膜系统(endomembrane system)是一个由多种细胞器组成的精密网络，负责囊泡运输和细胞内物质的精确分配。这一系统在植物的生长发育以及应对各种环境胁迫(如高温、干旱等)起着不可或缺的作用[1]。这些细胞器包括内质网(endoplasmic reticulum, ER)，高尔基体(golgi)，反式高尔基体网络/早期内吞体(trans-golgi network/early endosome, TGN/EE)，液泡前体/多囊泡体/晚期内吞体(prevacuolar compartment/multivesicular body/late endosome, PVC/MVB/LE)，自噬体(autophagosome)和液泡(vacuole)等[2]。在液泡转运途径(vacuolar transport pathway)中，蛋白质在内质网中合成，然后被包装进COPⅡ (coat proten Ⅱ)囊泡中，运送到高尔基体进行进一步的修饰。经过TGN/EE的转运，这些蛋白质被分选到MVB/PVC/LE中，最终运输至液泡行使功能或降解。内吞体分选转运复合物(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)是一类在真核细胞内质膜系统中高度保守的蛋白质复合物[3]。ESCRT特异性调控PVC/MVB/LE的生成以及从PVC/MVB到液泡/溶酶体的蛋白质分选[4−5]。它在细胞质或质膜中的蛋白质修饰和运输中发挥关键作用，对蛋白质分泌途径、内吞作用以及各种重要的信号通路都有重要贡献[3, 6−7]。
作为固着生物，植物需要不断监测环境变化，这些变化的环境往往不利于植物的生长发育，包括非生物胁迫如盐胁迫、干旱胁迫，生物胁迫如病原体感染。植物为了应对这些不利条件，已经进化出有效而复杂的响应系统[8−9]。在干旱条件下，植物细胞中的脱落酸(abscisic acid, ABA)开始积累，形成ABA-PYRABACTIN RESISTANCE (PYR)/PYR-LIKE (PYL)/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS (RCAR)-2C型蛋白磷酸酯酶(2C-type protein phosphatases, PP2C)三元复合物和SnRK2 (SNF1-related protein kinase 2) 结合。这种结合导致SnRK2被磷酸化，激活下游基因，积极调控ABA信号响应基因表达[10]。在盐胁迫条件下，植物感知到过量的Na+ 并激活盐过度敏感(salt over-sensitivity, SOS)途径，随后SOS2激酶和质膜定位的Na+ 抗转运蛋白SOS1发挥作用，将多余的Na+ 排出细胞，促进植物的生存和生长[8−9, 11]。植物在与病原体长期的“博弈”中演化出2套免疫系统，即模式诱导免疫(pattern-triggered immunity, PTI)和效应诱导免疫(effector-triggered immunity, ETI)。植物通过细胞膜上的受体蛋白识别病原体携带的一些分子，激活PTI以抵抗病原体入侵。另一类受体，核苷酸结合亮氨酸重复蛋白(nucleotide-binding leucine-rich repeat protein, NLR)，感知毒性蛋白，触发ETI，随后激活更强烈的免疫反应[12−13]。
植物细胞中，内膜运输和泛素介导的蛋白质降解途径在胁迫相关货物分子的正确递送中起着重要作用。ESCRT复合体是调节货物蛋白运输和降解的蛋白复合物之一。本研究总结了近年来ESCRT介导的内膜运输系统在植物胁迫响应中的研究进展，以期为构建精准的ESCRT介导逆境响应分子调控网络提供参考。
1. ESCRT复合物的组成和生物学功能
在后生动物和真菌中，ESCRT复合体主要由5个亚基组成：ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ和VPS4 (vacuolar protein sorting 4)/SKD1 (suppressor of K+ transport growth defect 1)[7, 14]。然而，在植物中没有发现ESCRT-0亚基的同源蛋白，但是拟南芥Arabidopsis thaliana基因组编码9种TOLs蛋白 (TOM1-like proteins)[15−16]。TOLs蛋白具有保守的VHS[VPS27, HRS (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate)]和STAM (signal transducing adaptor molecule)结构域，能有效地与泛素结合并行使与ESCRT-0类似的功能[16−18]。此外，在植物中鉴定了其他ESCRT相关蛋白，包括FREE1 (FYVE domain protein required for endosomal sorting 1)[2, 4]、ALIX (apoptosis-linked gene-2 interacting protein X)[19]、PROS (SKD1 positive regulatory factor)[20−21] 和BRAF (Bro1-domain protein as FREE1 suppressor)[22]。
1.1 ESCRT-0
ESCRT-0复合物是由2个异聚亚基VPS27/HRS和Hse1 (Hbp STAM, EAST1)/STAM按照数量1∶1构成的多价泛素结合蛋白复合体[5, 23]。VPS27含有1个PSAP基序，可与ESCRT-Ⅰ亚基Vps23结合，从而募集异四聚体ESCRT-Ⅰ [24]。ESCRT-0含有GAT (GGA and Tom1)结构域[25]和多个泛素结合结构域，包括UIM (ubiquitin-interacting motif)结构域和位于氨基末端的VHS结构域[23]。它的主要功能是识别泛素化蛋白并富集底物[2]，除此以外，还具有招募网格蛋白(clathrin)、泛素化连接酶及去泛素化酶的作用[26]。
1.2 ESCRT-Ⅰ
ESCRT-Ⅰ复合物由亚基VPS23/TSG101、VPS28、VPS37和MVB12 (MVB sorting factor of 12 kDa)按照1∶1∶1∶1 的数量比组装而成[14, 27]。ESCRT-Ⅰ与位于复合物两端的ESCRT-0和ESCRT-Ⅱ相互作用[28]。酵母细胞中，在VPS23/TSG101的N末端的UEV (ubiquitin E2 variant)结构域与ESCRT-0的P[S/T]-AP基序相互作用[2]。VPS28通过C末端四螺旋束与ESCRT-Ⅱ组分VSP36中的GLUE (GRAM-like ubiquitin binding in EAP45)结构域相互作用[29]。VPS37含有位于N端的碱性α螺旋(N-terminal basic helix, NTBH)，能结合酸性膜脂，通过高度柔性区域连接到核心结构[25]。ESCRT-Ⅰ负责将泛素化的膜货物分子分拣到MVB[14, 27]。
1.3 ESCRT-Ⅱ
ESCRT-Ⅱ复合物是一种Y型异源四聚体，由亚基VPS22/EAP30、VPS36/EAP45和VPS25/EAP20以1∶1∶2的数量比例组成的。VPS22通过CC (coiled-coil)结构域与VPS36的C末端结合形成主干[30]。VPS36通过其N端GLUE结构域与ESCRT-Ⅰ组分蛋白VPS28相互作用，从而识别泛素化蛋白。VPS25通过与VPS20相互作用，促进ESCRT-Ⅲ复合物组分的募集和组装[30]。ESCRT-Ⅱ主要通过与ESCRT-Ⅰ协同，有选择地招募泛素化货物分子。
1.4 ESCRT-Ⅲ
ESCRT-Ⅲ复合物由4个核心亚基组成，即VPS2/CHMP2 (charged multivesicular body protein 2)、VPS20/CHMP6、VPS24/CHMP3和SNF7/CHMP4。此外还有3种辅助蛋白，即Did2 (Doa4-independent degradation2)/CHMP1、VPS60/CHMP5和IST1 (increased sodium tolerance 1)。ESCRT-Ⅲ的MIM (MIT interacting motif )可以与VPS4结合，中间柔性区域包括至少1个CC结构域[31−32]。ESCRT通路激活后，VPS20首先被VPS25招募并激活，然后SNF7被多聚化[28]。随后，VPS24桥接SNF7与VPS2[33]，进入内吞体后VPS24与VPS2结合。最后，VPS2招募ATP酶VPS4，而Did2招募Vta1或IST1完成组装[26]。ESCRT-Ⅲ主要驱动PVC/MVB腔内囊泡 (intraluminal vesicle, ILV)的形成[31−32]。
1.5 VPS4/SKD1
VPS4/SKD1复合物属于AAA-ATP酶蛋白家族。该复合物也被称为VPS4/SKD1-LIP5 (lyst-interacting protein 5)，通过水解ATP促进ESCRT-Ⅲ复合物从PVC/MVB上脱落，分解进入下一个循环[33]。SKD1通过C端的富含α螺旋结构域与LIP5相互作用[34]。LIP5丰度的增加可能会增强SKD1的活性，有助于植物在逆境条件下的耐受性[34]。VPS4/SKD1在维持细胞内ESCRT复合物的稳定性和参与细胞内物质的降解中起着至关重要的作用。
1.6 FREE1
FREE1是双子叶植物中特有的ESCRT蛋白，在酵母和动物中均未发现其同源蛋白。FREE1的N端区域具有富含脯氨酸和谷氨酰胺的内在无序区(intrinsically disordered region, IDR)、1个保守的FYVE结构域和C端的CC结构域[4, 35]。FREE1通过N端富含脯氨酸的区域(proline-rich region)与ALIX相互作用[21]，通过FYVE结构域，FREE1选择性地识别并结合磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidyl inositol-3-phosphate, PI3P)，最终定位于MVB [36]。FREE1在植物的生长发育过程、泛素化蛋白的内吞体分选等细胞活动中都是必不可少的[36]。此外，FREE1能与植物自噬调节蛋白SH3P2 (SH3 domain-containing protein 2)发生相互作用，并与磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase, PI3K)复合物结合，调节植物自噬降解[37−38]。
1.7 ALIX
ALIX代表了一种进化上保守的ESCRT-Ⅲ相关蛋白，可介导G蛋白偶联受体PAR1和 P2Y1的泛素非依赖性分选到ILV进行降解[39]。在结构上，ALIX具有N端Bro1结构域、中央V结构域和柔性的C端富含脯氨酸的区域[40]。Bro1结构域负责将SNF7募集到囊泡膜上[33]，V结构域充当泛素结合结构域，促进ALIX与泛素化蛋白的相互作用[41]。在货物蛋白运输过程中，ALIX严格调节了ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅲ复合物的活性，这在控制ABA受体蛋白的丰度和促进其降解等方面起着重要作用[41]。最近的研究阐明了ALIX的非常规ESCRT功能，ALIX通过与逆转运复合体(retromer complex)的核心亚基相互作用来调节可溶性蛋白质的液泡分选[2, 42]。这项研究进一步揭示了植物中液泡运输和内吞体循环途径之间存在交互关系。
2. ESCRT复合体调节植物干旱胁迫反应
干旱是影响植物正常生长发育的非生物胁迫之一。干旱能破坏渗透调节系统，导致细胞脱水并合成ABA，进而导致气孔闭合、活性氧(ROS)积累和光合作用抑制[10]。ABA信号通路的核心成分包括可溶性ABA受体PYR/PYL/RCAR、PP2C和SnRK2。 PYR/PYL/RCAR受体通过PP2C依赖性SnRK2激活调节ABA转录反应[43−44]。在干旱条件下，ABA浓度的升高导致ABA与PYR/PYL/RCAR受体直接结合，形成ABA-PYR/PYL/RCAR复合物。该复合物抑制PP2C，将SnRK2维持在磷酸化的活性状态，随后激活下游转录因子AREB (ABA responsive element binding protein)/ABF(ABRE binding factor)和阴离子通道SLAC1 (Slow anion channel 1)[45]，正向调节ABA响应基因的表达[10, 46]。
PYR/PYL/RCAR受体(PYR1、PYL4、PYL8和PYL9)的泛素化发生在质膜上，由CRL4 (Cullin4-RING E3 ubiquitin ligase)和 RSL1(E3 ubiquitin ligase RING finger of seed longevity 1)触发网格蛋白介导的内吞作用，进而促使了PYR1和PYL4进入囊泡递送至液泡降解，导致ABA信号衰减。ABA受体从质膜到内吞体的转运依赖于ESCRT组分(FYVE1、VPS23A和ALIX)(图1)。这些ESCRT组分直接与未修饰的PYL相互作用[35, 41, 47]，随后ABA受体通过26S蛋白酶体或液泡途径降解。
图 1 ESCRT复合体调控植物ABA信号通路Figure 1 ESCRT complex regulates ABA signaling pathway in plant2.1 VPS23A
VPS23A具有一个泛素偶联酶变体UEV结构域，其中缺乏泛素偶联(ubiquitin-conjugating, UBC)结构域中保守的半胱氨酸，暗示其具有泛素结合能力[48]。作为ESCRT-Ⅰ复合物的组分，VPS23A主要参与质膜货物分子的运输和降解，负调控ABA 信号转导[48]。敲除VPS23A能增强ABA信号通路中关键激酶OST1 (open stomata 1)的活性。VPS23A通过调节OST1的上游关键调控因子，进而在转录和翻译水平上影响关键转录因子的表达。这一过程中，VPS23A不仅识别PYL4，还能识别K63连接的泛素链。此外，VPS23A影响PYR1的亚细胞定位和PYL4的稳定性。说明VPS23A可能识别植物中泛素化和非泛素化的PYLs，从而促进PYLs与PP2C的结合并影响ABA受体的稳定性，从而调节ABA信号转导和抗旱性[47]。此外，有研究表明：去泛素化酶 UBP12/UBP13与E3泛素连接酶XBAT35.2协同调控VPS23A的去泛素化[10]。然而，ubp12和ubp13突变体表现出与vps23a突变体类似的ABA敏感和耐旱性的表型。过表达VPS23A能恢复这些表型。但是VPS23A蛋白的稳定性随着ABA诱导 UBP12/UBP13 蛋白水平的升高而降低。UBP12/UBP13的积累增强了VPS23A的E3连接酶XBAT35.2的去泛素化。XBAT35.2微妙地调节了VPS23A的蛋白质水平，对ABA反应起到了正调节作用[10, 48]。总而言之，UBP12/UBP13通过对VPS23A进行精确的泛素化修饰，间接调控ABA信号转导。这对ABA通路和ESCRT复合体之间的相互作用提供了新的思路。
2.2 FREE1
FREE1蛋白N端(含有1个IDR)以不依赖ABA的方式与ABA受体相互作用[35]，随后RSL1蛋白将PYL4募集到内吞体表面。在干旱条件下，FREE1可通过异位磷酸化激活，与RSL1形成复合物，并将磷酸化信号转导至RSL1。从而启动钙信号、ROS通路等关键胁迫信号通路，激活靶基因，增强抵御外界环境胁迫的能力。有研究表明：free1突变体表现出对ABA的超敏反应[50]。free1突变体中ABA受体的液泡运输受阻，导致PYL4积累和对ABA的反应性增强。这项研究证明了FREE1在ABA受体从质膜转运到内吞体/液泡降解中的功能。此外，FREE1还在细胞核中转录抑制ABA信号转导作用[50−51]。ABA处理后，SnRK2激酶与FREE1相互作用，磷酸化C端CC结构域中的丝氨酸残基。随后FREE1向细胞核中迁移。进入细胞核后，FREE1就会与碱性亮氨酸拉链转录因子(basic leucine zipper transcription factor, bZIP) ABA反应元件结合因子4 (ABA-responsive element binding factor 4, ABF4)和ABA不敏感因子5 (ABA-insensitive 5, ABI5)相互作用，减弱它们与顺式调节序列下游基因的结合，从而抑制转录活性，削弱ABA反应并减轻ABA对植物生长的抑制[11]。具有C端部分缺失或磷酸化丝氨酸位点突变的free1-c端突变体植物，避免了free1功能缺失突变体的胚胎致死性，并在正常生长条件下表现出正常的液泡分选和植物发育。这些研究证明了FREE1磷酸化的缺失和入核受阻会增强植物对ABA的响应，说明了内膜转运和ABA信号在转录水平上相互关联。暗示了植物ESCRT蛋白FREE1在细胞质和细胞核中具有双重功能[50]。
2.3 ALIX
有研究表明：ALIX参与调节植物气孔开闭和ABA受体的降解。ALIX能直接与 PYR/PYL/RCAR受体相互作用，通过抑制CRL4和E3泛素连接酶来促进PYL8的积累[52−53]。ALIX与PYL的相互作用可能依赖于C端的IDR区域。ALIX的Bro1结构域中260位的甘氨酸突变为天冬氨酸能破坏其与PYL和VPS23A的相互作用，暗示了这个在维持货物与受体复合物完整性中的作用，并为alix-1突变体对ABA的超敏反应提供了分子基础[41, 54]。ALIX功能受损会导致亚细胞定位发生改变，进而过度积累PYR/PYL/RCAR受体，这意味着ALIX作为负调节因子参与ABA信号通路的调控[41]。
2.4 LIP5
LIP5 (lyst-interacting protein 5)作为SKD1的正调节因子，激活SDK1的ATP酶活性[55]。LIP5属于Vtal家族，是一种参与各种生物过程的ESCRT-Ⅲ相关蛋白。它在ABA介导的信号转导中发挥关键作用来正向调节抗旱性[56]。在正常条件下，LIP5蛋白不稳定，细胞中丰度较低[57]。LIP5的表达受到ABA和干旱的诱导，其过表达会导致植物的ABA超敏反应，造成气孔过度闭合，减少水分流失，从而提高耐旱性。相反，lip5突变体表现出ABA不敏感的表型，这个表型进一步说明了LIP5在抗旱中的作用[56]。
3. ESCRT复合体调节植物盐胁迫响应
土壤盐碱化是严重影响植物生长发育的非生物胁迫之一，在世界范围内给作物生产造成了巨大损失[58−59]。盐胁迫会升高细胞渗透压，导致钠积累。遭受盐胁迫后，植物可通过调节离子稳态、激活渗透胁迫途径、激活激素信号通路，以及调节细胞骨架动力学和细胞壁组成等多种机制进行应对[60]。作为保守的盐胁迫响应信号途径，SOS信号通路由钠转运蛋白SOS1、调节蛋白SOS2和SOS3，以及SOS3钙结合蛋白8 (SOS3-like calcium-binding protein 8/ calcineurin b-like protein10, SCaBP8/CBL10)组成。受到盐胁迫后，植物细胞通过SOS3/SCaBP8-SOS2-SOS1的顺序激活而将胞内过量 Na+ 排出，以维持 K+/Na+平衡，保护植物免受盐胁迫[9, 11]。
3.1 SOS信号通路的核心组成部分
SOS途径通过调节盐胁迫下Na+/H+逆向转运蛋白活性来维持离子稳态。SOS1是植物耐盐能力的关键Na+/H+反向转运蛋白，能利用H+梯度来驱动Na+排出细胞，其由定位于质膜的具有12个跨膜结构域的N端和定位于细胞质C端自抑制区域组成[61]。过表达SOS1能维持较高的K+/Na+，因而增强了植物的耐盐性[62]。SOS2被NaCl激活，随后磷酸化SOS3/SCaBP8。被招募到质膜后，SOS2能激活质膜H+-ATP酶，为SOS1的Na+转运活性提供能量[63−64]。SOS3/SCaBP8可以感知盐胁迫诱导的Ca2+升高，在结合Ca2+时与SOS2相互作用，并磷酸化SOS2。SOS3蛋白的中间区域能通过肉豆蔻酰化与质膜相连，并因此将 SOS3/SCaBP8-SOS2复合物招募到质膜，最终磷酸化SOS1增强其Na+/H+逆向转运活性[61]。
盐胁迫可以刺激植物细胞ESCRT复合物的活性和组装，从而促进质膜定位的转运蛋白的内吞作用和降解。因此，盐胁迫信号通路与ESCRT复合体之间的联系对于理解植物响应盐胁迫的机制尤为重要(图2)。
3.2 VPS23A
ESCRT-Ⅰ组分VPS23A通过增强SOS途径调节植物耐盐性[11]。VPS23A与SOS2、SOS3之间均存在相互作用，但不与SOS1互作。VPS23A与SOS2互作促进其泛素化，从而调控SOS2蛋白向质膜的循环再利用。而VPS23A功能缺失突变体对盐胁迫敏感，由于SOS2细胞膜定位减少，导致SOS1的磷酸化水平降低，SOS1活性受到抑制，使得Na+外排能力降低，从而影响植物对盐胁迫的响应。因此，VPS23A的功能是促进SOS2/SOS3复合体的结合来驱动SOS2定位到细胞膜[11]。
3.3 LIP5
LIP5调控的内吞体分选途径是植物响应非生物胁迫的关键细胞过程之一[55]。LIP5与SKD1相互作用提高植物的盐耐受性。LIP5是盐诱导的细胞内活性氧增加所必需的，与盐胁迫反应的信号转导有关。盐胁迫在很大程度上依赖于LIP5刺激植物细胞内吞作用和囊泡运输。在缺乏功能性丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 3/6, MAPK3/6)的情况下，LIP5蛋白会被快速降解[36]。在盐胁迫下，LIP5被MAPK磷酸化的水平增加，同时稳定性也增加，因而蛋白水平升高。然而LIP5中MAPK磷酸化位点的突变降低了LIP5的稳定性，并破坏了LIP5突变体盐敏感表型回补的可能性[36, 55]。
4. ESCRT参与调控植物的先天免疫
植物在自然生境中会遭受各种生物胁迫，包括各种微生物、病原菌的侵染和植食性昆虫的取食等。植物免疫系统是植物在自然生态系统中生存和生产的基础。植物为抵抗病原菌的入侵，进化出2层先天免疫系统来检测和应对各种生物攻击，分别由细胞表面定位的模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs)和细胞内核苷酸结合域富含亮氨酸重复序列的受体(nucleotide-binding leucine-rich repeat proteins, NLRs)启动[66]。
4.1 植物先天免疫系统
第1层免疫系统通过PRRs直接识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)，触发PTI [13]。PTI具有较低的病原体识别特异性，早期不诱导强烈的免疫反应。PTI通过细菌鞭毛蛋白等PAMPs激活MAPK依赖和MAPK不依赖的信号通路[12]。PTI在抑制病原体入侵和维持植物叶片微生物群落的动态平衡方面发挥着重要作用。为了抑制PTI，病原体通常会向植物细胞传递效应物，这些效应物可能被NLR受体蛋白直接或间接识别并激活第2层更强的免疫信号ETI [13]，ETI具有较高的病原体识别特异性，通常表现为与快速程序性细胞死亡相关的超敏反应[12]。PRRs和NLRs发起的信号传导导致了大量重叠的下游细胞反应，包括防御基因表达、ROS产生和胼胝质沉积[13, 67]。在免疫反应早期，NADPH氧化酶RBOHD介导的ROS产生是连接PRR和NLR介导的免疫反应的关键。此外，受体样细胞质激酶BIK1 (Botrytis-induced kinase 1)是ETI期间RBOHD、基因表达和细菌抗性充分激活所必需的[66−67]。flg22是细菌鞭毛蛋白中的一个保守的小肽，它通过识别PRR蛋白FLS2 (flagellin sensing 2)及其共受体BAK1引发免疫反应。flg22是研究最多的PAMP，其诱导的免疫是研究植物与微生物相互作用的最常使用的模式系统之一。
4.2 VPS37-1和 VPS28-2
ESCRT复合体亚基及其相关蛋白的突变通常会导致严重的发育缺陷，然而，vps37-1和vps28-2突变体没有明显的发育缺陷，但都对病原菌感染更敏感，可见VPS37-1和 VPS28-2调控了FLS2的MVB分选，在flg22激活的气孔防御和植物免疫中起着至关重要的作用[68]。
4.3 LIP5
拟南芥LIP5是植物基础防御中病原响应MAPK级联反应的关键靶点，正向调节MVB的生物发生。正常情况下LIP5表达水平较低， 但病原菌诱导后LIP5与MAPK3/6相互作用并磷酸化，LIP5蛋白稳定性和含量得到提升，这对病原体诱导的囊泡运输和植物基础免疫力都非常重要[36]。如盐胁迫响应通路一样，LIP5在植物免疫系统中的关键作用也依赖于其与SKD1的相互作用，进而刺激SKD1的ATP酶活性。虽然LIP5蛋白的MAPK磷酸化位点突变不会影响其与SKD1互作，但会降低其稳定性[36, 55, 69]。
4.4 酵母ESCRT蛋白Vps23、Vps24、Snf7和Vps4
酵母ESCRT蛋白Vps23、Vps24、Snf7和Vps4的表达抑制了病毒在植物宿主中的复制。对番茄丛状突病毒(tomato bushy stunt tombusvirus, TBSV)的全基因组筛选确定了7种参与病毒复制和复制酶复合物组装的ESCRT蛋白[70]。TBSV p33复制蛋白可直接与酵母ESCRT组分Vps23和Bro1相互作用，将Vps23招募到病毒复制相关的过氧化物酶体上。在缺乏ESCRT蛋白的情况下，病毒RNA更容易被核糖核酸酶降解，ESCRT蛋白在复制酶复合体中对病毒RNA起到了保护作用。并且复制酶复合体的精确组装可能依赖于ESCRT蛋白，这种依赖关系可能帮助病毒逃避宿主防御监视系统的识别，并防止基因沉默机制对其RNA的破坏[70]。
5. 总结与展望
随着全球气候变化和生态压力的增加，植物如何应对各种逆境胁迫已经成为植物学和农学领域的重要研究课题。最新研究发现：ESCRT复合体在调控植物胁迫响应中起着关键作用。例如，在干旱胁迫条件下，ESCRT通过调节ABA的积累和运输来帮助植物适应水分不足的环境。在盐胁迫下，ESCRT复合体参与Na+的排出和细胞壁的修复，以减轻盐害对植物的影响。此外，ESCRT还在生物胁迫中发挥作用，如参与植物与病原菌之间的相互作用。本研究总结了ESCRT复合体和相关蛋白参与调控植物非生物和生物胁迫响应分子机制的最新研究(表1)。
表 1 调控逆境胁迫响应的ESCRT复合体蛋白Table 1 ESCRT machineries regulating stress responsesESCRT亚基 基因名(基因编号) 调控胁迫响应中发挥的功能 参考文献 ESCRT-Ⅰ VPS23A(AT3G12400) 与SOS2/SOS3复合物相互作用进而增强耐盐性 [11] 与ABA受体相互作用并介导其液泡降解 [10, 11, 47] VPS28-2(AT4G05000)
VPS37-1(AT3G53120)调节病毒的基因表达，参与病毒粒子的组装和释放 [68] ESCRT-Ⅲ Vps24(AT5G22950)
Snf7(AT2G19830)
Vps4(AT2G27600)保护病毒RNA不受核糖核酸酶的影响 [70] VPS4/SKD1 LIP5(AT4G26750) 调节离子平衡、渗透势和应激相关基因的表达 [36, 55] 促进ABA的合成和信号转导 [56] 影响植物免疫应答的其他信号转导途径 [36, 55, 69] ESCRT相关蛋白 FREE1(AT1G20110) 利用内吞体和非内吞体功能反向调节ABA信号 [35, 50−51] ALIX(AT1G15130) 控制ABA受体的积累 [41, 52−53] 尽管现有的研究已经揭示了诸如FREE1、VPS23A等ESCRT蛋白在植物应对逆境胁迫中的重要作用，但是鉴于ESCRT复合体的复杂性和多样性，其余ESCRT蛋白应对逆境胁迫的功能探索尚处于初级阶段。此外，植物ESCRT蛋白有着数量不等的同源基因，如ESCRT-Ⅰ蛋白VPS23A和VPS23B、ESCRT-Ⅲ蛋白SNF7-1和SNF7-2等，这些同源基因编码的蛋白在调控逆境胁迫响应过程中是发挥不同的功能还是功能冗余尚不清楚。因此有必要深入发掘ESCRT调控植物逆境胁迫响应的分子机制。随着研究技术的更新迭代，超分辨显微镜、3D电子断层扫描成像、光电联用显微镜等更高分辨率的成像技术逐渐应用到细胞生物学领域。在纳米级分辨率下解析不同细胞器的形态特征变化，可以更加透彻地了解ESCRT和PVC/MVB/LE在植物逆境胁迫响应中的功能。总之，对ESCRT介导的内膜运输在调控植物应对逆境胁迫中的研究为农业生产和环境保护提供更多创新的思路和方法。
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图 1 不同种质籽粒品质性状的群体分布图
Figure 1 Histogram of frequency distribution of kernel test weight and quality traits in different inbred lines
图 2 籽粒容重与其他品质性状的相关性分析
Figure 2 Correlation coefficients between kernel test weight and other quality traits
图 3 转录组分析筛选控制容重和品质性状的候选基因
Figure 3 Transcriptome screening of control genes for traits such as bulk density and quality
图 4 通过RNA-Seq和RT-qPCR检测候选基因的相对表达量
Figure 4 Relative expression of candidate genes detected by RNA-Seq and RT-qPCR
表 1 玉米籽粒容重和其他品质性状统计及分析
Table 1. Descriptive statistics for maize test weight and other quality traits
项目 地点 容重/(g·L−1) 质量分数/% 直支比 粗蛋白 粗脂肪 粗淀粉 直链淀粉 支链淀粉 均值±标准差 东阳 606.84±101.03 12.48±2.08 4.98±2.00 62.73±9.64 21.87±8.94 40.83±10.64 0.60±0.32 乐东 692.46±69.45 13.98±2.08 5.01±1.70 64.23±6.00 21.89±6.77 42.35±8.30 0.55±0.21 临安 712.90±52.82 12.77±1.35 5.03±1.17 64.88±4.25 21.06±6.85 43.75±8.06 0.52±0.21 BLUP 664.42±56.29 13.17±1.33 5.04±1.46 63.21±6.98 22.10±5.84 41.46±6.90 0.58±0.19 数值范围 东阳 254.55~904.00 7.66~20.30 2.01~14.57 19.95~72.46 2.66~36.44 4.98~65.13 0.07~3.00 乐东 366.67~840.00 9.05~20.70 2.46~13.61 34.36~77.08 3.20~34.12 18.66~65.94 0.06~1.10 临安 431.82~871.43 9.72~17.91 3.13~12.00 36.76~72.17 4.36~31.50 20.70~64.65 0.07~1.17 BLUP 431.41~798.55 6.17~17.89 2.64~12.99 12.45~71.25 5.70~32.68 16.65~61.79 0.16~2.30 变异系数/% 东阳 16.65 16.66 40.13 15.37 40.88 26.07 53.39 乐东 10.03 14.85 33.83 9.34 30.95 19.59 37.44 临安 7.41 10.58 23.29 6.55 32.50 18.41 40.06 BLUP 8.47 10.09 29.01 11.04 26.44 16.65 33.08 
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表 2 不同试验点玉米种质籽粒容重和其他品质性状的联合分析
Table 2. Joint analysis of kernel test weight and other quality traits of maize inbred lines in different experimental sites
性状 变异来源 平方和 F P 性状 变异来源 平方和 F P 容重 品种 415221.072 100.721 ＜0.001** 直链淀粉 品种 4869.787 135.622 ＜0.001** 环境 159948.328 38.799 ＜0.001** 环境 91.143 2.538 0.112 品种×环境 13620.659 3.304 0.003** 品种×环境 65.838 1.834 0.140 粗蛋白 品种 171.774 50.379 ＜0.001** 支链淀粉 品种 5845.288 86.835 ＜0.001** 环境 94.612 27.749 ＜0.001** 环境 59.727 0.887 0.347 品种×环境 4.487 1.316 0.268 品种×环境 80.387 1.194 0.311 粗脂肪 品种 317.333 171.032 ＜0.001** 直支比 品种 3.630 71.754 ＜0.001** 环境 14.765 7.958 0.005** 环境 0.284 5.613 0.018* 品种×环境 7.527 4.057 0.007** 品种×环境 0.038 0.758 0.518 粗淀粉 品种 6118.363 164.49 ＜0.001** 环境 330.135 8.876 0.003** 品种×环境 240.086 6.455 ＜0.001** 说明：*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20240145
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