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防腐处理可以提高木材抗真菌、抗虫等性能[1]，使木材免受生物危害，从而延长木材的使用年限，是减少木材使用量和延长木材储碳周期的重要途径[2]。木材防腐行业经过几十年的发展取得了显著进步，目前逐渐朝着对人和环境友好的方向发展，有机防腐剂因具有高效、环保的优点而成为研究热点[3−6]。多数有机防腐剂来源于工业和农用杀菌剂，嘧菌酯(azoxystrobin)是一种低毒、高效、广谱的杀菌剂，它对非靶标生物安全，具有环境相容性好的优点[7−8]。嘧菌酯用于木竹材保护[4, 9]的研究表明：嘧菌酯对木材腐朽菌表现出较优的抑制效果，载药量为0.22~0.44 kg·m−3的防腐处理辐射松Pinus radiata 在腐朽菌侵染后的质量损失率均小于8%，且嘧菌酯对串珠镰刀菌Fusarium moniliforme和可可球二孢Botryodiplodia theobromae等木竹材霉变菌具有较好的防治效果；同时，嘧菌酯和有机碘化合物复配(质量分数为0.1%)对竹材霉菌的防治效率在90%以上[10]，因此可作为新型木材防腐剂进行开发利用。良好的抗流失性能是防腐木材保持较长耐久性的重要因素[11−14]，因此进行嘧菌酯处理木材的抗流失性能研究非常必要。
防腐材中防腐剂流失率测试的关键在于准确分析其含量。嘧菌酯检测可采用气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)分析方法[15]，HPLC分析方法因具有使用条件便捷、定量准确度高的优点成为常用的分析方法[16−17]。木材存在丰富的抽提物，处理材流失液中抽提物的色谱峰可能会对HPLC分析嘧菌酯造成干扰，所以检测处理材流失液中的嘧菌酯，需要建立一种准确、快捷的分析方法。鉴于此，本研究建立了嘧菌酯的HPLC分析方法，并对方法精准性进行评价。同时制备了嘧菌酯水基化制剂，探究水基化制剂和乙醇溶解药剂处理材抗流失性能差异；选择马尾松Pinus massoniana、杉木Cunninghamia lanceolata和107杨Populus×euramericana为处理材研究对象，探究树种类型和药剂质量分数对处理材中嘧菌酯抗流失性能的影响，旨在为嘧菌酯的户外使用提供研究基础。
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马尾松产自广西派阳山林场，树龄为38 a，气干密度为0.70 g·cm−3，含水率为8.2%；杉木产自湖南，树龄为23 a，气干密度为0.37 g·cm−3，含水率为9.2%；107杨产自山东，树龄为15 a，气干密度为0.44 g·cm−3，含水率为8.0%。选取无明显节子、年轮分布均匀的边材作为试验用材，锯切制成规格为20 mm × 20 mm × 20 mm (纵向×弦向×径向)的试件。
药剂主要为甲醇(色谱纯)和嘧菌酯(有效成分≥98%，白色粉末)，其他试剂均为分析纯。
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前期研究发现：质量分数为0.040%~0.056%的嘧菌酯处理木材(载药量为0.31~0.44 kg·m−3)，室内耐腐效果较优[4]。考虑户外处理木材的使用条件不同，本研究流失试验药剂质量分数设置为0.05%和0.15%共2个水平。
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使用Elite P230高效液相色谱仪、UV230+紫外-可见光检测器等仪器，在参考文献[15−17]的基础上，结合本研究各种木材的抽提物分离条件，确定如下色谱条件：依利特Supersil ODS2 C18色谱柱为250.0 mm×4.6 mm，5 μm；柱温为30 ℃；V(甲醇)∶V(水)=80∶20为流动相；流速为0.8 mL·min−1；检测波长为220 nm；进样量为20 μL；保留时间约6.1 min。
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准确称取0.050 0 g的嘧菌酯标准品，置于50 mL容量瓶中，加入少量甲醇使之溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀；移取上述溶液2 mL，用甲醇和水(体积比为80∶20)的混合溶剂定容至10 mL，配制成200 mg·L−1的标准溶液，再用上述混合溶剂稀释，配得质量浓度为80、40、20、5、1 mg·L−1的嘧菌酯系列标准溶液，在上述色谱条件下进样分析，绘制标准曲线。
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①嘧菌酯制剂。参考张景朋等[9]的方法，称取1.00 g嘧菌酯原药于25 mL锥形瓶中，缓慢加入1.00 g乙腈和3.00 g乙酸乙酯，在45 ℃下搅拌溶解，依次加入3.00 g乳化剂、2.00 g蒸馏水，充分搅拌后得质量分数为10%的嘧菌酯制剂。选用苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚和辛基酚聚氧乙烯醚为乳化剂，分别制备A1和A2共2种制剂，使用建立的HPLC分析方法对制剂的质量分数进行分析。2种制剂均分别用水稀释200倍、67倍得到质量分数为0.05%和0.15%的防腐工作液。②嘧菌酯乙醇溶液。称取1.00 g嘧菌酯原药，加入9.00 g乙醇溶解，搅拌均匀后得质量分数为10%的嘧菌酯乙醇溶液。使用乙醇稀释分别配置成质量分数为0.05%和0.15%的防腐工作液。
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防腐处理参照GB/T 29905—2013《木材防腐剂流失率试验方法》进行[18]。处理前将试件进行编号、称量(精确至0.01 g)，将试件放入500 mL烧杯中，用重物压稳，注入防腐处理液，置于真空干燥箱中，抽真空至−0.09 MPa，保持10 min，卸压后常压浸泡5 min。处理完毕后取出试件，用滤纸擦去表面残留药液，称取处理后质量(精确至0.01 g)，于常温下气干至含水率小于20%。
试件中嘧菌酯总质量计算公式为：m=(m2－m1) ×c×1 000。其中：m为试件中嘧菌酯的总质量(mg)；m1为试件处理前质量(g)；m2为试件处理后质量(g)；c为防腐液中嘧菌酯的质量分数(%)。
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流失试验参照GB/T 29905—2013《木材防腐剂流失率试验方法》进行[18]。将相同处理条件的6块试样作为1组，置于500 mL烧杯中，加入180 mL蒸馏水，试样浸没在蒸馏水液面以下，用磁力搅拌器搅拌，在6、24、48 h时更换1次蒸馏水，之后每隔48 h更换1次蒸馏水，共计14 d。收集每次更换的滤出液，合并后用于质量浓度分析。
分别取各组收集的流失液50 mL，用旋转蒸发器除水后，加入适量色谱甲醇和蒸馏水混合溶剂充分溶解，经0.45 μm聚四氟乙烯膜过滤后用于HPLC分析。采用外标法，根据1.2.2绘制的标准曲线和HPLC色谱图面积计算流失液中嘧菌酯质量浓度，流失液分析进行3次重复，计算平均值。
嘧菌酯流失率计算公式为：L = kv/m × 100%。其中：L为防腐剂的流失率(%)；k为流失液中待测成分的质量浓度(mg·L−1)；v为流失液的体积(L)；m为试件中嘧菌酯总质量(mg)。
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将甲醇溶解的嘧菌酯标准溶液放置于石英比色皿，以甲醇作为空白样，采用紫外-可见光分光光度计，测定嘧菌酯标准溶液在波长190~900 nm下的吸光度。得到嘧菌酯的全波长扫描图(图1)，发现嘧菌酯的吸收峰在220 nm处获得较高的灵敏度，因此本研究选择220 nm作为检测波长。
图 1 嘧菌酯的全波长扫描图
Figure 1. Full wavelength scanning of azoxystrobin
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木材抽提物色谱峰一般出峰时间较早[19]，分析条件要首先保证抽提物色谱峰和嘧菌酯色谱峰完全分开，同时能使嘧菌酯较早出峰，可以节省分析时间。采用V(甲醇)∶V(水)=80∶20为流动相，流速为0.8 mL·min−1的分析条件。从图2A可见：甲醇溶解的嘧菌酯标准溶液的色谱图中，基线较稳，保留时间为6.14 min，无拖尾，但是出现前沿峰。前沿峰的出现会造成定量分析准确性下降，这一般是由于样品溶剂的洗脱能力大大强于流动相或者柱效能下降造成的[20]。此处可能是使用了甲醇溶解嘧菌酯，因为甲醇洗脱能力强于流动相造成前沿峰的出现。如图2B所示：流动相溶解嘧菌酯进样分析的色谱图中，前沿峰消失，峰形对称，保留时间为6.11 min，同时用流动相溶解稀释制剂A1和A2进行分析，发现除了嘧菌酯色谱峰外，无其他辅助成分的干扰峰(图2C和2D)，可实现嘧菌酯的准确分析。
图 2 嘧菌酯样品色谱图
Figure 2. Chromatograms of azoxystrobin samples
此外，检测流失液中的嘧菌酯质量浓度，需确保木材抽提物的色谱峰对嘧菌酯色谱峰定量分析无影响。将马尾松、杉木和107杨防腐处理材的流失液进行液相分析(图3)可见：3种处理材流失液的高效液相色谱图中，虽然不同木材的抽提物种类不同，但是3种木材总抽提物的色谱峰均在5 min之前出峰完成，对嘧菌酯定量分析无干扰，所以此色谱条件能实现对流失液中嘧菌酯的准确分析。
图 3 防腐材流失液色谱图
Figure 3. Chromatograms of treated woods
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在1.2.1的色谱条件下，对不同质量浓度的嘧菌酯标准溶液进行测定，以质量浓度(x，mg·L−1)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线如图4。在嘧菌酯为1~80 mg·L−1时，得到线性方程为y=135.610x −18.537，决定系数(R2)=0.999 6，线性相关性强。
图 4 嘧菌酯标准曲线
Figure 4. Standard curve of azoxystrobin
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准确称取0.106 0 g制剂A1，置于20 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，再将此溶液用流动相稀释10倍，制得待分析样品，取6份平行试样进行HPLC分析；准确称取0.111 2 g的制剂A2，进行上述相同操作。从表1可见：制剂A1中嘧菌酯的平均质量分数为10.15%，标准偏差为0.06%，变异系数为0.59%；制剂A2中嘧菌酯的平均质量分数为10.13%，标准偏差为0.05%，变异系数为0.45%。表明平行分析结果之间数据非常接近，分析方法精密度高。
表 1 精密度试验结果
Table 1. Precision test results
试样 平行试样质量分数/% 标准偏差/% 变异系数/% 1 2 3 4 5 6 平均值 制剂A1 10.06 10.17 10.13 10.23 10.20 10.12 10.15 0.06 0.59 制剂A2 10.17 10.18 10.11 10.09 10.07 10.15 10.13 0.05 0.45 -
在空白溶液和已知质量浓度的嘧菌酯样品中分别添加不同质量浓度的嘧菌酯标准品，配成一定质量浓度的样品溶液，在上述色谱条件下进行分析，计算回收率。从表2可见：嘧菌酯的回收率为98.2%~100.4%，平均回收率为99.7%，表明该方法准确度较高。综上所述，该分析方法标准曲线线性相关性好，精密度及准确度较高，可应用于有效成分嘧菌酯质量分数的分析。
表 2 准确度试验结果
Table 2. Accuracy recovery test results
试样
编号本底值/
(mg·L−1)加入标样量/
(mg·L−1)理论值/
(mg·L−1)实测值/
(mg·L−1)回收率/
%1 0 10 10.00 9.82 98.2 2 0 20 20.00 19.94 99.7 3 0 40 40.00 39.66 99.1 4 28.16 10 38.16 38.24 100.2 5 28.16 20 48.16 48.28 100.3 6 28.16 40 68.16 68.42 100.4 -
从图5A可见：乙醇溶解嘧菌酯溶液的处理材中，嘧菌酯的抗流失性较好，各处理材中嘧菌酯的流失率相对较低，即防腐剂在处理材中的固着性能较好。具体地，在质量分数为0.05%和0.15%的药剂处理下，马尾松嘧菌酯的流失率分别为18.8%和14.7%，107杨嘧菌酯的流失率分别为17.4%和14.7%，杉木嘧菌酯的流失率分别为21.0%和20.1%。表明嘧菌酯在马尾松和107杨中的流失率水平相当，而杉木的高于马尾松和107杨。
图 5 质量分数为0.05%和0.15%的药剂下嘧菌酯3种制剂处理木材的流失率
Figure 5. Leaching rates of treated wood by 3 formulations of azoxystrobin with content of 0.05% and 0.15%
如图5B所示：嘧菌酯制剂A1的处理材中，嘧菌酯的流失率均小于20.0%，抗流失性能较优。马尾松和杉木处理材的流失率分别为8.4%~10.9%和8.2%~9.6%，两者均低于107杨处理材的流失率(11.9%~19.0%)。
如图5C所示：嘧菌酯制剂A2的处理材中，嘧菌酯的流失率均小于15%，抗流失性能较强。在质量分数为0.05%的药剂处理下，马尾松、杉木和107杨处理材的流失率分别为11.1%、12.9%和14.9%，3种处理材差异不大；在质量分数为0.15%的药剂处理下，马尾松、杉木和107杨3种处理材的流失率分别8.9%、8.7%和8.8%，3种处理材基本相同。
嘧菌酯3种制剂的处理表现出同样的流失规律，3种不同树种均为低质量分数制剂处理材的流失率大于高质量分数制剂处理材。2种不同质量分数制剂处理材的药剂流失量基本一致，而防腐液质量分数较高时处理材载药量较高，造成药剂流失量占载药量的比例更低。而木材种类对流失率的影响在每种制剂中的表现没有明确规律，只有在制剂A1的处理材中，107杨流失率明显高于马尾松和杉木，另外2种制剂处理材在不同树种之间的流失率差别较小。
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为了比较嘧菌酯制剂和乙醇溶液处理木材流失率的差异，以质量分数为0.05%和0.15%的制剂处理下流失率的平均值作为嘧菌酯在此树种上的流失率。如图6所示：乙醇溶解、制剂A1和制剂A2处理的107杨药剂流失率非常接近，但以制剂A2处理材稍低；对马尾松和杉木而言，乙醇溶解嘧菌酯处理材的药剂流失率高于制剂A1和制剂A2。表明将嘧菌酯制备成水基化制剂处理木材不会造成流失率的升高，可用于处理户外木材及其制品。
图 6 嘧菌酯处理木材的流失率
Figure 6. Leaching rates of azoxystrobin from treated wood
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有研究认为：有机防腐药剂处理木材的流失性能主要与其在水中的溶解度相关[21]，嘧菌酯在水中溶解度为6 mg·L−1(20 ℃)[22]，而醚菌酯在水中的溶解度仅为2 mg·L−1(20 ℃)，醚菌酯在水中极小的溶解度可能是各处理材中醚菌酯流失率均较小的原因。醚菌酯是甲氧基丙烯酸酯的另一代表化合物，其处理马尾松、107杨等木材的药剂流失率为3.1%~18.4%[23]，而本研究处理木材嘧菌酯的流失率为8.7%~21.0%，可见，醚菌酯抗流失性能优于嘧菌酯。三唑类化合物是已被广泛应用的有机木材防腐剂，关于其抗流失性能已有较多研究，其中戊唑醇和丙环唑制剂处理马尾松防腐材的流失率分别为28.0%~41.0%和18.0%~26.0%，环丙唑醇等其他三唑化合物流失率高达34.0%~43.0%[24]，嘧菌酯抗流失性能明显高于三唑类化合物，这可能与三唑化合物在水中的溶解度高达31~110 mg·L−1(20 ℃)有关[21]。此外，通过三唑化合物和铜复配制剂处理木材可增加三唑固着性能，或者三唑制剂中添加疏水剂处理木材可减少水中溶解防腐剂的量，这2种方法均可降低处理材中三唑化合物的流失率[24]。如果嘧菌酯等制剂处理材用于水流失严重的环境区域，亦可考虑进行上述处理进一步降低其流失率。
然而，木材防腐剂流失是一个非常复杂的过程，不仅受药剂溶解度的影响，还与药剂、助剂和木材之间的相互作用有关[25−26]。不同木材的构造与性质差异较大也会有一定影响，嘧菌酯在木材上表现出不同的流失性，具体原因需要深入研究。
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本研究通过高效液相色谱分析方法建立了检测嘧菌酯质量分数的方法，2个分析样品的变异系数为0.45%和0.59%，样品的回收率为98.2%~100.4%，具有较高的精密度及准确度，可用于嘧菌酯质量分数的准确分析。马尾松、杉木和107杨3种处理材的嘧菌酯流失率差异不大，且均表现为低质量分数制剂处理材的流失率大于高质量分数制剂处理材；同时，与乙醇溶解制剂相比，嘧菌酯制成的水基化制剂处理木材不会造成流失率升高，因此嘧菌酯制剂可用于户外处理木材及其制品。
Analytical method of azoxystrobin by HPLC and leaching performance of treated wood
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摘要:
目的 探究嘧菌酯(azoxystrobin)的高效液相色谱(HPLC)分析方法及抗流失性能，旨在确定嘧菌酯处理材的抗流失性能，为其户外使用提供研究基础。 方法 采用紫外检测器及C18反相色谱柱，通过优化检测波长、流动相组成及配比、柱温及流动相流速等色谱条件，确定分析嘧菌酯的色谱条件，采用外标法对嘧菌酯质量浓度进行检测，并进行标准曲线相关系数、精密度、准确度等分析；参照GB/T 29905—2013《木材防腐剂流失率试验方法》开展流失试验，并利用建立的分析方法测定各处理材流失液中嘧菌酯的质量浓度，以确定防腐材的抗流失性能。 结果 优化得到嘧菌酯分析的色谱条件：V(甲醇)∶V(水)=80∶20为流动相，流速为0.8 mL·min−1，检测波长为220 nm。嘧菌酯标准溶液在质量浓度为1~80 mg·L−1内，标准曲线相关系数为0.999 6，线性相关性强；2个分析样品的变异系数为0.45%和0.59%，样品的回收率为98.2%~100.4%。抗流失试验结果表明：处理材中嘧菌酯的抗流失性较好，马尾松Pinus massoniana、杉木Cunninghamia lanceolata和107杨Populus×euramericana处理材的流失率分别为8.4%~18.8%、8.2%~21.0%和8.8%~19.0%。3种处理材之间的嘧菌酯流失率差异不大，均表现为低质量分数制剂处理材的流失率大于高质量分数制剂处理材的规律；乙醇溶解嘧菌酯处理材的流失率稍高于2种水基化制剂处理材的流失率。 结论 采用HPLC测定嘧菌酯的质量浓度，标准曲线线性相关性强，精密度和准确度高，能准确分析嘧菌酯的质量浓度；嘧菌酯的2种水基化制剂的抗流失性能较好，可用于户外木材及其制品。图6表2参26 -
关键词:
- 木材保护 /
- 嘧菌酯 /
- 高效液相色谱(HPLC) /
- 防腐材 /
- 抗流失性
Abstract:Objective This study, with an exploration of the high performance liquid chromatography (HPLC) analysis method and leaching resistance of the azoxystrobin formulation, is aimed to provide a research basis for its outdoor utilization. Method On the one hand, UV detector and C18 reversed-phase chromatographic column were used for detection before an investigation was conducted of the chromatographic conditions, such as detection wavelength, flow phase composition and ratio, column temperature and flow phase flow rate with further discussion so as to optimize the chromatographic conditions suitable for the analysis of azoxystrobin. On the other hand, the mass concentration of azoxystrobin was detected by external standard method, and the standard curve correlation coefficients, precision and accuracy were evaluated after which the leaching procedure was adopted according to the Chinese standard GB/T 29905−2013 Laboratory Method of Determining the Leachability of Wood Preservatives, and leaching rate of azoxystrobin in treated wood were tested by the established analytical method. Result The optimized chromatographic conditions for analysis of azoxystrobin were as follows: flow phase methanol-water ratio of 80∶20, flow rate of 0.8 mL·min−1, and UV detection wavelength of 220 nm. There was a good linear relationship between azoxystrobin concentration and chromatographic peak area in the range of 1−80 mg·L−1 for azoxystrobin standard solution, with a determination coefficient of 0.999 6. The coefficient variation of samples were 0.45% and 0.59%, and the recovery rates of the samples were 98.2%−100.4%. The leaching rate of azoxystrobin from Pinus massoniana, Cunninghamia lanceolata and Populus×euramericana were 8.4%−18.8%, 8.2%−21.0% and 8.8%−19.0%, respectively, with little difference in leaching rates between the three treated woods. The leaching rate of azoxystrobin in the treated Pinus massoniana, C. lanceolata and Populus×euramericana were all below 21% and the leaching resistance were excellent. All of the three tree species exhibit a pattern where the leaching rate of low concentration treated woods is greater than that of high concentration treated woods whereas the leaching rate of the treated wood with ethanol-dissolved azoxystrobin was slightly higher than that of the water-based formulations. Conclusion The HPLC method for determining azoxystrobin mass concentration showed good linear correlation of the standard curve, high precision, and recovery rate, which can be used for analysis of azoxystrobin mass concentration. The leaching resistance of the two water-based formulations of azoxystrobin was good and can be used for outdoor treatment of wood and its products. [Ch, 6 fig. 2 tab. 26 ref.] -
生物质炭基肥是一种以生物质炭为基质，根据不同区域土地特点、不同作物生长特点以及科学施肥原理，添加有机质或无机质配制而成的生态环保型肥料。生物质炭具有微观孔隙结构、较大的比表面积和高吸附性等特点，这使得生物质炭基肥在优化土壤理化性质和调节土壤微生物群落及数量等方面效果显著[1]。研究表明：施用生物质炭基肥可以显著改善土壤的物理性状[2]，降低土壤容重[3]，增加田间持水量和透气性[4]，提高土壤pH和养分有效性[5]。在生产实践中，施用生物质炭基肥可实现化肥减施，提高当地烟农收益的目的[6−7]。根据不同用途，研究人员相继开发出多种生物质炭基肥类型，并已在北方壤土、砂土麦田和南方烟田进行应用[8]。
尽管生物质炭基肥在烤烟Nicotiana tabacum种植中已经得到一定的推广，但相关研究多集中在施用生物质炭基肥对烤烟地上部生长及养分积累方面[9−10]，而对烤烟根系发育及其与烤后烟化学品质关系的研究鲜有报道。重庆植烟区烟叶品质和地方性香韵特色突出，是中国烟叶的重要产区。近年来，随着有机肥的使用比例过少和土壤连作效应的增加，重庆植烟区土壤有效养分严重失衡，土壤酸化、黏化、贫瘠以及微生物群落结构恶化已经成为丞待解决的问题[11]。研究显示：重庆植烟土壤在2005年已经出现了严重的酸化现象[12]，有一半以上的土壤严重酸化，其中黔江县、丰都县的酸化土壤面积均达65%以上[13]，酸碱度适宜的土壤不到35%。因此，在生产中应采取增施生物质炭基肥、种植绿肥等措施加强对酸化土壤的治理，为优质烟叶的生产提供保障。本研究选用‘云烟116’N. tabacum ‘Yunyan 116’为材料，在重庆彭水县设置常规施肥、生物质炭基有机肥和生物质炭基复混肥大田试验，研究生物质炭基肥对烤烟根系发育、产量产值和化学品质的影响，以期为指导当地烤烟生产和提高烟农收益提供理论依据和技术支持。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
于2020年和2021年3—10月，在重庆市彭水县润溪镇重庆烟草科学研究所彭水试验站(29.14°N，107.96°E)开展研究。烟草种植制度为1年1熟，冬季休闲。该区属亚热带湿润季风气候，年均气温为17.5 ℃，年均降水量为1 241.0 mm。土壤类型为黄壤土，pH 5.4，有机质和有机碳质量分数分别为24.1和14.0 g·kg−1，碱解氮、速效磷、速效钾质量分数分别为88.8、12.8、147.8 mg·kg−1。
1.2 试验设计
大田试验选择肥力中等、地势平坦、无严重病害史的田块，采取完全随机设计，共设3个处理：①常规施肥(T1)。按照当地农户习惯，施农家肥2 250 kg·hm−2和烟草复合肥750 kg·hm−2；②生物质炭基有机肥(T2)。在T1处理基础上增施生物质炭基有机肥1 350 kg·hm−2；③生物质炭基复混肥(T3)。在农家肥2 250 kg·hm−2的基础上增施生物质炭基复混肥750 kg·hm−2。其中T1和T2处理中的烟草复合肥氮磷钾质量比为6∶12∶25，生物质炭基复混肥中的氮磷钾和生物质炭的质量比为8∶10∶20∶18，生物质炭基有机肥发酵原料含质量分数为85%的杏鲍菇渣和15%的生物质炭。各处理分别用尿素、过磷酸钙和硫酸钾补充配平，保证各处理氮磷钾肥用量相同。每个处理重复3次，共9个小区。生物质炭基有机肥和生物质炭基复混肥均由贵州金叶丰农业科技有限公司提供。供试品种为‘云烟116’，由重庆市烟草公司彭水县分公司提供。烟苗采用漂浮育苗，于5月上旬移栽，移栽密度为16 492 株·hm−2，移栽行距为120 cm，株距为50 cm，垄高为40 cm。其他田间管理按照规范化栽培技术进行。
1.3 样品采集与处理
1.3.1 根系样品采集与处理
分别在移栽后的30、60、90和120 d，选取每个处理具有代表性的烤烟3株，取烟株根系20 g在超低温冰箱−80 ℃内保存，用于测定生理指标，余下部分，在105 ℃下杀青15 min，65 ℃烘干至恒量后用粉碎机进行粉碎，过60目筛，装入封口袋保存，用于测定根系氮钾和烟碱质量分数。
1.3.2 烤后样品采集与处理
将移栽后120 d的烟叶从下部叶自下而上进行采收，采收后按照小区进行统一编杆烘烤。依据GB 2635—92对烘烤后的烟叶样品进行分级，每处理分别取上部叶、中部叶和下部叶烟叶各2.5 kg，置于65 ℃烘箱烘至恒量，粉碎过60目筛，用于测定烤后烟叶的化学成分。
1.4 测定项目及方法
1.4.1 根系生理活性指标
根系活力采用改良氯化三苯基四氮唑法测定[14]；根系氮质量分数采用凯氏定氮法测定，根系钾质量分数采用火焰光度计法测定，根系烟碱质量分数采用提取脱色法测定[15]。
1.4.2 经济性状指标
各处理小区烟叶单独采收编杆，单独计产量。待烟叶全部采收烘烤完毕后，依照GB 2635—1992对烤后烟叶进行分级，计算产值、产量与上等烟比例。
1.4.3 化学品质指标
分别测定分析各处理烤后烟叶的常规化学成分(质量分数)[16]。全氮采用凯氏定氮法测定；总糖和还原糖采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定；烟碱采用提取脱色法测定；氯离子采用浸提法(热蒸馏水法)测定；全钾采用火焰光度计法测定。
1.5 数据统计与分析
使用Excel整理数据，采用SPSS 22.0对烤烟的根系活力、根条数、根系氮、钾和烟碱质量分数以及烤后烟的经济性状和化学品质等进行多重比较和相关分析，其中多重比较采用Duncan的SSR检验法(显著性水平为0.05)，相关分析采用Pearson相关系数中的双尾检验，采用Origin 2021绘图。
2. 结果与分析
2.1 不同生物质炭基肥对烤烟根系性状的影响
2.1.1 不同生物质炭基肥对烤烟根系活力的影响
由图1可知：随着烟株移栽时间的延长，3个处理的根系活力均呈先上升后下降的抛物线式变化，以移栽后60 d时最高，移栽后120 d时最低。在移栽后30 d时，3个处理的烟株根系活力无显著差异。在移栽后60 d时，T2处理的根系活力较T1处理显著提高(P＜0.05)。在移栽后90 d时，T2与T3处理的根系活力无显著差异，但较T1处理分别显著提高了46.8%和34.4%(P＜0.05)。在移栽后120 d时，T2处理的根系活力与T3和T1处理差异显著(P＜0.05)。生物质炭基肥可以提高烟株根系活力，总体上以T2处理效果最好。
图 1 移栽后不同生物质炭基肥处理下烤烟根系活力的变化Figure 1 Change of root activities of flue-cured tobacco under different biochar-based fertilizers after transplantation2.1.2 不同生物质炭基肥对烤烟根条数的影响
如表1所示：烟株的侧根条数在移栽后的30 d时，3个处理间无显著性差异。在移栽后60 d时，T2和T3处理的侧根条数显著高于T1处理(P＜0.05)。在移栽后90 d时，3个处理侧根条数从大到小依次为T3、T2、T1，T3处理相比T1处理增加了17.5% (P＜0.05)。在移栽后120 d时，T2和T3处理比T1处理提高14.7%和26.4% (P＜0.05)。
表 1 移栽后不同生物质炭基肥处理下烤烟根条数的变化Table 1 Change of root number of flue-cured tobacco under different biochar-based fertilizers after transplantation移栽后时间/d 处理 侧根/条 不定根/条 30 T1 13.8±4.1 a 62.4±1.3 b T2 14.3±1.2 a 74.9±2.6 a T3 15.4±0.8 a 76.6±3.1 a 60 T1 17.5±1.4 b 89.2±1.5 c T2 22.7±2.9 a 117.2±1.9 b T3 24.7±1.6 a 136.6±2.0 a 90 T1 25.7±3.8 b 59.0±4.8 c T2 26.3±1.0 ab 68.6±0.5 b T3 30.2±2.4 a 75.0±3.3 a 120 T1 23.1±1.3 b 44.8±0.8 b T2 26.5±1.6 a 54.7±1.5 a T3 29.2±1.7 a 53.3±1.9 a 说明：不同字母表示同时间不同处理间差异显著(P＜0.05)。 移栽后30 d时，T2和T3处理烟株的不定根条数均高于T1处理，且与T1处理呈显著差异(P＜0.05)。移栽后60和90 d时，3个处理的不定根条数从大到小依次为T3、T2、T1，且3个处理间均存在显著差异(P＜0.05)。移栽后120 d时，以T2处理的不定根条数最多，其次为T3处理，最后为T1处理，且T2、T3与T1处理差异达显著水平(P＜0.05)。总体上，烟株的侧根条数和不定根条数以T3处理最多。
2.1.3 不同生物质炭基肥对烤烟根系钾、氮和烟碱质量分数的影响
由图2可以看出：3个处理根系钾质量分数随烟株的生长呈逐渐下降趋势。移栽后30和60 d时，T2和T3处理的烟株根系钾质量分数均高于T1处理，其中T3处理显著高于T1处理(P＜0.05)。移栽后90和120 d时，3个处理的烟株根系钾质量分数无显著差异。
图 2 不同生物质炭基肥对根系钾质量分数的影响Figure 2 Effects of different biochar-based fertilizers on potassium contents in roots从图3可见：在移栽后的30~90 d，T3和T1处理的烟株根系氮质量分数均高于T2处理。其中在移栽后30 d时，T3与T2处理烟株根系氮质量分数差异显著(P＜0.05)，在移栽后60 d时，3个处理之间的根系氮质量分数差异不显著。在移栽后90 d时，T1和T3处理根系氮质量分数均显著高于T2处理(P＜0.05)，而在移栽后120 d时，T2处理根系氮质量分数最高，且与T1处理差异显著(P＜0.05)。
图 3 不同生物质炭基肥对根系氮质量分数的影响Figure 3 Effects of different biochar-based fertilizers on nitrogen contents in roots图4表明：3个处理的烟碱质量分数均在移栽后90 d时达最高值。移栽后30 d时，3个处理的根系烟碱质量分数无显著差异。移栽后60 d时，以T3处理烟株根系的烟碱质量分数最高，且显著高于T1与T2处理(P＜0.05)。移栽后90 d时，仍以T3处理最高，且与T2处理间差异显著(P＜0.05)。移栽后120 d时，T1和T3处理降幅较大，以T2处理烟碱质量分数最高，且与T1处理间差异显著(P＜0.05)。
图 4 不同生物质炭基肥对根系烟碱质量分数的影响Figure 4 Effects of different biochar-based fertilizers on nicotine contents in roots2.2 不同生物质炭基肥对烤后烟产量和品质的影响
2.2.1 对烤后烟经济性状的影响
从表2可见：T2处理的烟叶产量最高，比T1处理高16.9% (P＜0.05)。T3与T1处理差异不显著，但比T1处理增加了11.4%。3个处理的产值与产量从大到小依次为T2、T3、T1。3个处理间的均价差异不显著(P＞0.05)，其中T2和T3处理的均价高于T1处理。各处理间的上中等烟比例差异显著(P＜0.05)，其中以T2处理最高，其次为T3处理，最后为T1处理。总体上，与T1处理相比，T2和T3处理的产量、产值、均价和中上等烟比例均呈增加趋势，整体以T2处理效果最佳，说明施用生物质炭基肥对烤后烟的产量产值及上中等烟比例均有明显的促进作用。
表 2 不同生物质炭基肥处理下烤后烟经济性状的比较Table 2 Comparison of economic traits of different biochar-based fertilizer treatments处理 产量/
(kg·hm−2)产值/
(万元·hm−2)均价/
(元·kg−1)上中等烟
比例/%T1 1 933 b 5.3 b 27.4 a 83.1 c T2 2 260 a 6.5 a 28.5 a 86.0 a T3 2 153 ab 6.0 ab 28.0 a 84.6 b 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。 2.2.2 对烤后烟化学品质的影响
烟叶内在化学成分及其协调性是衡量烤烟品质的重要指标[17]。由表3可知：T2处理烤后烟上部叶中的氯离子、还原糖、烟碱质量分数最高，且糖碱比高于其他2个处理。但T3处理的烤后烟叶的钾和总氮质量分数较为突出，在3个处理中钾氯比和氮碱比最高。T1处理的总糖质量分数占比最高，与T2、T3处理差异显著(P＜0.05)。T2处理烤后烟中部叶的氯离子、还原糖、总糖和烟碱质量分数仍然最高，其中，3个处理的上部叶和中部叶的氯离子质量分数均差异显著(P＜0.05)，且T2和T3处理的还原糖质量分数均差异显著(P＜0.05)。T3处理的钾和总氮质量分数最高，与T1处理差异显著(P＜0.05)，T3处理的钾氯比和氮碱比最高，与其他2个处理差异显著(P＜0.05)，糖碱比则以T1处理最高。烤后烟下部叶中3个处理的氯离子、烟碱和总氮质量分数及钾氯比差别不显著，但钾、还原糖和总糖质量分数均以T2处理最高，且与T1或T3处理差异显著(P＜0.05)，氮碱比则以T1处理最高。
表 3 烤后烟叶化学成分比较Table 3 Comparison of chemical composition of flue-cured tobacco等级 处理 氯/% 钾/% 钾氯比 还原糖/% 总糖/% 烟碱/% 糖碱比 总氮/% 氮碱比 上部叶 T1 0.24 c 1.51 b 6.43 b 19.82 ab 27.35 a 2.44 a 8.12 a 2.73 a 1.07 a T2 0.28 a 1.51 b 5.41 c 20.73 a 25.61 b 2.55 a 8.13 a 2.57 b 0.97 b T3 0.26 b 1.90 a 7.32 a 17.74 b 23.17 c 2.61 a 6.80 b 2.89 a 1.11 a 中部叶 T1 0.35 c 1.65 b 4.75 b 21.84 a 28.01 a 2.18 b 10.02 a 2.31 b 0.93 b T2 0.40 a 1.70 b 4.23 b 22.39 a 28.64 a 2.56 a 8.75 b 2.46 ab 0.96 b T3 0.37 b 2.09 a 5.63 a 20.58 b 27.66 a 2.17 b 9.48 ab 2.74 a 1.11 a 下部叶 T1 0.31 a 1.91 b 6.12 a 20.87 b 31.21 ab 1.86 a 11.22 b 2.15 a 0.92 a T2 0.33 a 2.53 a 7.57 a 24.66 a 32.43 a 1.89 a 13.05 a 2.02 a 0.87 b T3 0.34 a 2.18 b 6.53 a 21.39 b 28.89 b 1.93 a 11.08 b 2.10 a 0.87 b 说明：不同字母表示同等级不同处理间差异显著(P＜0.05)；氯、钾、还原糖、总糖、烟碱、总氮均为质量分数。 2.3 烤烟根系生长指标与烟叶化学品质指标的相关分析
相关分析(表4)可知：移栽后30 d时，根系钾与烟叶氯离子呈显著正相关(P＜0.05)；移栽后60 d时，烟叶钾与根系活力呈显著正相关(P＜0.05)，与氮碱比呈显著负相关(P＜0.05)，根系氮与烟叶总氮呈显著正相关(P＜0.05)，但与烟叶钾呈显著负相关(P＜0.05)；移栽后90 d时，根系烟碱与烟叶总氮呈显著负相关(P＜0.05)，与烟叶钾氯比呈显著正相关(P＜0.05)，而根系氮与烟叶还原糖呈显著负相关(P＜0.05)；移栽后120 d时，根系烟碱与烟叶钾呈显著正相关(P＜0.05)。根系钾与烟叶总糖呈显著正相关(P＜0.05)，根系氮与烟叶钾氯比呈极显著正相关(P＜0.01)。
表 4 烤烟根系性状与烟叶化学品质的相关分析Table 4 Correlation analysis of flue-cured tobacco root traits and chemical properties移栽后时间/d 根系性状 烟叶化学成分 还原糖 总糖 总氮 钾 烟碱 糖碱比 氮碱比 钾氯比 氯离子 30 根系活力 0.395 −0.410 −0.621 0.665 0.936 0.213 0.970 0.528 0.996 烟碱 −0.835 −0.970 0.663 −0.618 0.512 −0.924 0.068 −0.743 0.262 钾 0.252 −0.543 −0.496 0.545 0.978 0.064 −0.923 0.394 0.998* 氮 −0.899 −0.930 0.754 −0.714 0.397 0.966 0.196 −0.823 0.135 60 根系活力 0.919 0.332 −0.99 0.997* 0.434 0.828 −0.870 0.968 0.660 烟碱 −0.075 −0.785 −0.188 0.245 0.993 −0.263 −0.748 0.076 0.924 钾 0.573 −0.216 −0.767 0.803 0.844 0.407 −0.999* 0.690 0.957 氮 −0.955 −0.428 0.999* −0.999* 0.339 −0.882 0.814 −0.989 −0.579 90 根系活力 0.789 0.081 −0.922 0.943 0.649 0.658 −0.967 0.872 0.830 烟碱 0.976 0.499 −0.999* 0.995 0.262 0.917 −0.765 0.998* 0.512 钾 −0.858 −0.201 0.962 −0.976 −0.552 −0.745 0.929 −0.925 −0.756 氮 −0.999* −0.698 0.957 −0.939 −0.015 −0.987 0.582 −0.984 −0.284 120 根系活力 0.958 0.860 −0.849 0.817 −0.245 0.995 −0.350 0.903 0.024 烟碱 0.922 0.339 −0.991 0.997* 0.427 0.832 −0.866 0.970 0.655 钾 0.616 0.997* −0.389 0.335 −0.759 0.754 0.254 0.491 −0.556 氮 0.989 0.562 −0.993 0.984 0.189 0.944 −0.715 0.999** 0.446 说明：*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。 综合来看，根系性状与化学品质之间在移栽后存在不同的相关关系，且在移栽后60、90和120 d时更为突出，根系钾和氮与烤后烟的化学品质指标相关性均达到显著水平(P＜0.05)。在移栽后90和120 d时，根系烟碱与化学品质指标相关性同样也达到显著水平(P＜0.05)。
3. 讨论
根系不仅是作物吸收水分和养分的重要器官，也是激素、氨基酸和有机酸等生物大分子的合成器官，其形态建成和生理功能将直接影响作物地上部分的生长发育、产量和品质[18]。不仅如此，对于烤烟来说烟株根系还是次生代谢产物烟碱的重要合成器官，其生长发育状况对烤烟品质有直接影响。在烤烟的生产实践中，烟株的主根长度、须根条数、根总体积和根尖数等根系形态指标与烤烟农艺性状表现出显著正相关[19]。本研究表明：T2和T3处理烟株的根系活力相比常规施肥均有所提升，其中T2处理的根系活力最高，这与韩毅等[20]的研究结果一致；另外，也有研究表明：添加生物质炭可以有效提高烟株的根系活力[21]。这说明生物质炭和生物质炭基肥本身具有的多孔和大比表面积结构有利于土壤通气性的增加，这对烟株根系活力的提高起到重要的调控作用。与此同时，施用生物质炭基肥能够显著增加烟株的不定根条数与侧根条数，这表明生物质炭基肥能够对烟株根系发育提供良好的生态环境[22−23]。根系钾和总氮质量分数均随着烟株的生长而逐渐降低，生物质炭基肥处理相比T1处理的降幅较小，可能是生物质炭具有缓释氮肥的作用，从而保证了烤烟各生长期所需的氮肥量，但要注意与氮肥的配施比例[24]。根系烟碱质量分数则在移栽后90 d达到峰值，可能与打顶后烟株体内的激素平衡状态被破坏有关，这与范江等[25]的研究结果一致。烟株的根系生长受到刺激，其生物量显著高于未打顶的烟株，发达的根系可促进烟株对养分的吸收。根系是合成烟碱的主要部位，打顶后烟株合成烟碱的能力大幅提升，进而提高烟株的烟碱积累量[26]。除了能够改善土壤的通透性之外，生物质炭基肥还含有丰富的大量元素与微量元素，从而为烟株根系的生长发育、后期烤烟产量和品质提供了保障[27]。
生物质炭基肥对常见农作物的生长具有促进作用，可达到增产的目的[28]。本研究结果表明：施用生物质炭基肥显著增加了烤烟产量、产值、均价和上中等烟比例，其中以施用生物质炭基有机肥处理烟株的产量、产值最佳。王晓强等[29]研究表明：生物质炭基肥与氮肥配施可提高烟叶产量和中上等烟比例，从而提高烟叶的均价及产值。同时施用生物质炭基肥可减少氮素化肥的施用量，从而改善烟叶内在化学成分的协调性，增加中性致香物质[30]。从不同生物质炭基肥对烤后烟常规化学成分的影响来看，T2和T3处理对烤烟内在常规化学成分有显著的影响。其中T2处理能显著提高上中下部叶的还原糖质量分数及中下部叶的总糖质量分数，这与李青山等[31]的研究结果一致。上中部叶的氯质量分数高于其他处理，减低总氮和烟碱质量分数处于适中稳定的范围，从而提高糖碱比。糖碱比高，有助于提高烟叶的安全性，柔和烟气。中上部叶钾质量分数差异不明显，钾氯比变化不大；T3处理可提高上中部叶的钾质量分数、钾氯比、氮碱比和总氮质量分数，T3处理的全氮、烟碱质量分数较高，可能由于施用生物质炭基复混肥可减少土壤养分的淋溶损失有关。T3处理的氯离子质量分数高，可能与淋溶损失能力与生物质炭基复合肥的施用成正比有关。据烟叶采收后对中部烟叶化学成分的分析表明：T2和T3处理烟叶在各指标上都符合优质烟叶的标准，T1处理在优质烟叶协调性方面略差。这表明施用生物质炭基肥不但能够促进烤烟生长，而且能提高烟叶内在化学成分的协调性，改善烟叶品质。
4. 结论
施用生物质炭基肥能促进烤烟根系发育，有效提升烟株的根系活力，增加侧根和不定根条数，延缓根系钾、氮质量分数流失，提高烟株根系的烟碱积累量。同时，施用生物质炭基肥可增加烤烟的产量产值，提升烤后烟的化学品质。本研究的生物质炭基有机肥更有利于促进烤烟根系的生长发育，改善烤后烟叶化学成分质量分数，提高烤烟产量、产值、均价和中上等烟比例。
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图 5 质量分数为0.05%和0.15%的药剂下嘧菌酯3种制剂处理木材的流失率
Figure 5 Leaching rates of treated wood by 3 formulations of azoxystrobin with content of 0.05% and 0.15%
表 1 精密度试验结果
Table 1. Precision test results
试样 平行试样质量分数/% 标准偏差/% 变异系数/% 1 2 3 4 5 6 平均值 制剂A1 10.06 10.17 10.13 10.23 10.20 10.12 10.15 0.06 0.59 制剂A2 10.17 10.18 10.11 10.09 10.07 10.15 10.13 0.05 0.45 
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表 2 准确度试验结果
Table 2. Accuracy recovery test results
试样
编号本底值/
(mg·L−1)加入标样量/
(mg·L−1)理论值/
(mg·L−1)实测值/
(mg·L−1)回收率/
%1 0 10 10.00 9.82 98.2 2 0 20 20.00 19.94 99.7 3 0 40 40.00 39.66 99.1 4 28.16 10 38.16 38.24 100.2 5 28.16 20 48.16 48.28 100.3 6 28.16 40 68.16 68.42 100.4
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