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植物常因具有独特的叶片斑纹而观赏价值倍增。引种于日本的矢竹Pseudosasa japonica是园林绿化中的重要材料[1]，变型有花叶矢竹P. japonica f. akebonosuji和曙筋矢竹P. japonica f. akebono。前者有3种叶色，白叶、白绿相间条纹叶和白色渐渐复绿的复绿叶[2]，后者叶色多为放射状暗条纹的淡绿叶。3种矢竹叶色丰富、秆型挺拔，是研究叶色变异的理想材料。不同叶色会影响植物光合能力，主要由叶片中色素种类和含量决定。王振兴等[3]对狗枣猕猴桃Actinidia kolomikta彩叶和绿叶研究发现，色素含量是影响叶色的重要因素；吴雪霞等[4]揭示了遮光使得光化学反应的能量在茄子Solanum melongena叶片所吸收的光能中占比逐渐增加，天线色素耗散的能量逐渐减少；银丝竹Bambusa multiplex ‘Silverstripe’不同叶色间的光合色素含量存在显著差异，随绿色叶片面积的下降而下降[5]。叶色是各种色素含量的综合表现，通常表现为绿色是因为叶绿素含量较高，而其他的色素含量比较低[6]。研究发现：随着色素累积水平的改变，植物叶色也发生相应变化[7]，这种叶色变异与色素类物质合成降解、叶绿体发育等因素密切相关。张向娜等[8]发现：叶色中叶绿素和类胡萝卜素对茶树Camellia sinensis光合作用、抗逆性、鲜叶适制性等有重要影响。在可见光波段，水稻Oryza sativa不同叶色的冠层光谱反射率随着植株生长而不断变化，叶绿素含量与一阶微分光谱的相关系数呈极显著正相关[9]。色素也反映了植物的光合能力和生理状态，光合色素在光能的吸收、传递和转换过程中起着关键的作用，能驱动光合作用把光能转变为化学能[10]，载体为光系统Ⅰ(PSⅠ)和光系统Ⅱ(PSⅡ)。有研究发现：光胁迫下的杂种杨无性系光化学能量储存分配到PSⅡ的份额要比分配到PSⅠ的多[11]。本研究以3种矢竹不同叶色叶片为对象，解析不同叶色叶片反射光谱特性、PSⅡ和PSⅠ特性之间的差异，探索不同叶色竹种光合能力差异，为进一步探究叶色变异机制奠定基础。
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于2019年6月下旬，在浙江省杭州市浙江农林大学翠竹园进行采样测定。测量和取样位点均为中部。取竹高、叶位及长势一致，生长健壮的当年成竹，枝位第2档第2片完全展开叶。取样叶包括矢竹的深绿色叶片(green leaf，GL)，花叶矢竹正在复绿叶片(alobino leaf，AL，相对矢竹复绿30%，SPAD值为12.5)，花叶矢竹条纹叶片(trip leaf，SL。包括白色部分albino sector in leaf with strips，SA；绿色部分green sector in leaf with strips，SG)，曙筋矢竹淡绿色叶片(virescent leaf，VL)。
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取植株新鲜成熟功能叶片，去叶脉后剪碎混合均匀，称0.5 g，用体积分数为80%的丙酮溶液25 mL提取叶片叶绿素，静置48 h，重复3次。具体操作方法和步骤参照参考文献[12]。用紫外-可见分光光度计(UV-255)对350~1 000 nm波长范围内的光吸收值进行全光谱扫描。根据ARNON法[13]修正公式计算叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)和类胡萝卜素(Car)质量分数。
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观测仪器为光谱分析仪(UniSpec-SC，美国)，波段为310~1 150 nm，采样间隔1 nm。每个处理选取10个样株，每个样株选取3片叶片，取平均值作为该样品的光谱反射率。测量过程中用白板对其进行校正。用Multispec 5.1读取反射光谱原始数据，对原始光谱数据进行微分变换一阶求导，增强叶片反射光谱特征，减少背景噪声的影响和提高生化参数的监测效果。Dλi=Rλi+1−Rλi−1/(λi+1−λi−1)，其中：Dλi为反射率光谱的一阶导数光谱；Rλi为波长λi处的光谱反射率值[14-15]。为了进一步研究不同叶色矢竹反射光谱与色素、光系统之间的关系，根据已有研究，选择与叶片色素关系密切的2个植被指数，即叶绿素归一化指数(ChlNDI)[16]和光化学植被指数(PRI)[17]。IChlND=(R750−R705)/(R750+R705)；IPR=(R531−R570)/(R531+R570)。其中：IChlND为叶绿素归一化指数，IPR为光化学植被指数，Rλ为波长λ处的光谱反射率。
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采用非调制式叶绿素荧光仪(Yaxin-1611)测定叶片快速叶绿素荧光动力学参数，方法参照STRASSER等[18]。测量前，叶片暗适应15 min，以二极管(465 nm，谱线半宽20 nm)为光源发出强度为3 000 μmol·m−2·s−1的饱和脉冲光照射叶片，以10 μs (2 ms之前)和1 ms (2 ms之后)的间隔记录荧光信号，并检测激发的叶绿素荧光。测定5 次·株−1，计算平均值及标准误。将得到的数据经Vt=(Ft−F0)/(FM−F0) 标准化之后得到快速叶绿素荧光诱导动力学曲线[19]，快速叶绿素荧光诱导动力学得到的参数反应了PSⅡ供体侧、受体侧、反应中心等光合机构的特性。
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以4种不同叶色矢竹叶片为材料，测量和取样位点均为中部。将叶片经过暗适应20 min后利用M-PEA植物效率仪(Hansatech，英国)测定820 nm的光吸收值，以820 nm相对吸收值(ΔI/I0)作为衡量PSⅠ最大氧化还原能力的指标[20]。计算公式参照SCHANSKER等[21]。4种矢竹不同叶色叶片重复测定5次，计算平均值及标准误。
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采用Excel 2019整理、计算数据，用SPSS 22.0和Duncan法进行方差分析和多重比较，用Origin 9.0、SigmaPlot及Photoshop CS5作图。
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对同一发展期的叶片调查发现：不同种矢竹叶片颜色差异较大(图1)。花叶矢竹的叶色会出现白叶(AL)和具绿色条纹的花叶(SL)，其中白叶能逐渐复绿，但是绿度小且泛黄；曙筋矢竹叶片(VL)为淡绿色；矢竹叶片(GL)呈深绿色。
图 1 不同叶色矢竹叶片
Figure 1. Leaf color observation
由表1可知：AL中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素质量分数最低，与其他叶片差异极显著(P＜0.05)。GL的叶绿素a 、叶绿素b 质量分数为最高，叶绿素a较VL高29.8%，较SL高8.8%；叶绿素b较VL高25.1%，较SL高7.6%；类胡萝卜素较VL高20.1%，较SL低11.4%；而SG与VL的差异不显著(P＞0.05)。AL的Chl a/b、Car/Chl均为最高，显著高于其他3种叶片；其中SA为叶片白色部分，未测出光合色素。
表 1 不同叶色矢竹光合色素差异
Table 1. Difference of photosynthetic pigment content in different colors’ leaves of P. japonica
材料 Chla/(mg·g−1) Chlb/(mg·g−1) Car/(mg·g−1) Chl a+b/(mg·g−1) Chl a/b Car/Chl AL 0.34±0.015 a 0.26±0.010 a 0.32±0.015 c 0.60±0.035 a 1.3±0.007 a 0.53±0.022 b SG 20.39±0.170 b 18.27±0.120 b 5.52±0.020 a 38.66±0.250 c 1.1±0.020 b 0.14±0.010 a VL 17.09±0.080 b 15.72±0.070 b 4.07±0.184 b 33.81±0.140 b 1.0±0.013 b 0.12±0.007 a GL 22.19±0.120 c 19.66±0.150 b 4.89±0.020 a 41.85±0.220 c 1.14±0.024 b 0.11±0.005 a 说明：同列内不同小写字母表示材料间差异显著(P＜0.05) -
除AL外，其他的反射光谱曲线均具有典型的绿色植被反射光谱特征，在500与670 nm左右的位置有2个低反射区。不同叶片反射光谱的反射率在蓝光区(430~470 nm)、绿光区(500~560 nm)不同，SA在绿光区明显高于SG、VL、GL，在556 nm 处达最高值，为0.385，比VL、SG和GL分别高8.0%、46.7%和51.2%；GL在近红外区(780~1 000 nm)最高，达0.600，其他叶片趋于一致(图2A)。由一阶导数(图2B)可以看出，除AL外，其他叶片在绿光区(550~560 nm)和红光区(650~760 nm)均出现最大峰值，黄光区(560~600 nm)出现最小峰值。
图 2 叶片反射光谱曲线(A)和一阶导数曲线(B)
Figure 2. Leaf reflectance curve (A) and first derivative curve (B)
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图3所示：不同叶色矢竹叶片的叶绿素归一化指数、光化学植被指数变化趋势一致，从大到小依次为GL、SG、VL、SA、AL。GL(0.420)与SG(0.350)叶绿素归一化指数无显著差异，但显著(P＜0.05)高于其他叶片，AL的2种植被指数值均为最低，分别为0.180和0.165。
图 3 植被指数
Figure 3. Spectral reflectance indices
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由图4可以看出：GL的Fv/Fm为0.80，SG和VL的Fv/Fm降低为0.72和0.75，说明它们反应中心的活性有所下降。而AL显著(P＜0.05)低于其他叶片，仅为0.32。GL的Fv/Fm显著(P＜0.05)高于AL和SG，VL的Fv/Fm占GL的94%。说明反应中心活性从大到小依次为GL、VL、SG、AL。叶片光化学性能指数PIABS可以更为准确地反映植物光合机构的状态[22]。其中：ψP0为暗适应后的最大光化学效率，ψ0为反应中心捕获的激子将电子传递到电子传递链中QA−下游电子受体的概率。SG与VL的PIABS差异不显著(P＞0.05)，但都与GL差异显著(P＜0.05)，分别为GL的46.2%与42.1%。AL的PIABS最低，为0.32。VL与GL的Fv/Fm无显著差异(P＞0.05)，PIABS存在显著差异(P＜0.05)，GL较VL高56.3%。
图 4 Fv/Fm和PIABS的比较
Figure 4. Concentration on the Fv/Fm and PIABS
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如图5A所示：AL的初始荧光(F0)最大，SG的F0最小，说明AL的反应中心发生可逆性失活，SG的反应中心活性或类囊体的完整性均大于其他叶片。2 ms时的荧光强度(FJ)和30 ms时的荧光强度(FI)、最大荧光产量(FP=Fm)均表现为AL大于其他叶片，SG均小于其他叶片。SA为花叶矢竹条纹叶(SL)中的白色部分，未检测出相关数据。GL和VL的荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)差异不大，在O、J、I点近乎相同，大于SG且小于AL。将OJIP曲线双重归一化后得到快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(图5B)，3个竹种的不同叶色叶片均存在O、J、I、P点，说明光合电子链仍然能够有效运转。J点和I点主要反映PSⅡ受体侧活性。VL的曲线与GL没有重合，在J点处明显分开。J点出现是由于电子传递时间差而还原态质体醌A(QA−)大量累积导致的荧光迅速上升，说明VL累积的QA−最多。I点与P点一致，从大到小依次为VL、AL和SG、GL，当达到P点时，说明PSⅡ完全关闭，荧光产量最高。
图 5 不同叶色叶片的OJIP荧光曲线(A)与相对可变荧光强度随时间的变化(B)
Figure 5. Changes of OJIP fluorescence curves (A) and relative variable fluorescence intensity (B) of different colors’ leaves
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由图6可以看出：各叶片在t时的820 nm相对吸收值(It)呈“V”型变化，且SG、VL、GL变化趋势相同。在16 ms时，各叶片的820 nm相对光吸收值达到最低点，1~16 ms，各叶片的820 nm相对吸收值均呈现下降趋势，且下降速度从大到小依次为SG、VL、GL、AL、SA。180 ms时，820 nm相对光吸收值达到最大值，从大到小依次为SG、VL、GL、SA、AL。16~180 ms，各叶片的820 nm相对吸收值整体呈现上升趋势。由图7可以看出：GL的ΔI/I0最大，且与其他叶片差异显著(P＜0.05)，SA的ΔI/I0最低，AL与SA的ΔI/I0差异不显著(P＞0.05)，与其他叶片差异显著(P＜0.05)。PSⅠ最大氧化还原能力从大到小依次为GL、VL、SG、AL、SA。花叶矢竹条纹叶白色部分(SA)复绿之后(AL)ΔI/I0上升，说明PSⅠ活性上升。
图 6 不同叶色叶片820 nm相对吸收值变化
Figure 6. Changes in relative absorption values of PSI 820 nm of different color leaves
图 7 不同叶色叶片PSⅠ最大氧化还原能力ΔI/I0的差异
Figure 7. PSI maximum ability of oxido-reduction △I/I0 of different color leaves
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如图8所示：在能量传递效率方面，捕获的光量子进入电子传递的效率(Ψ0)和吸收的光能进入电子传递的效率(φE0)的趋势一致，均从大到小依次为AL、SG、VL、SG，且AL与其他叶片差异显著(P＜0.05)。在单位反应中心的性能方面，不同叶片的反应中心吸收光能(ABS/RC)、PSⅡ的最大捕获量(TRO/RC)、用于电子传递的能量(ETO/RC)、单位反应中心的热耗散(DIO/RC)这4个代表单位反应中心的性能的参数趋势较为一致。ABS/RC从大到小依次为AL(8.13)、SG(2.97)、VL(2.38)、GL(1.96)。AL吸收的光能远远高于其他叶片，还原QA的能量及用于电子传递的能量最高。但是GL的单位面积反应中心(RC/CSO)的数量最多，SG的RC/CSO数量为最少。
图 8 快速荧光特征参数
Figure 8. Characteristics of fluorescence transient
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相关分析表明(表2)：矢竹类叶片的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b、类胡萝卜素质量分数与叶绿素归一化指数(ChlNDI)、光化学植被指数(PRI)都显著正相关(P＜0.05)。且叶绿素a、叶绿素b与ChlNDI、PRI呈极显著正相关(P＜0.01)。ChlNDI和吸收的光能进入电子传递的效率(φEo)呈极显著正相关(P＜0.01)，与Fv/Fm、PIABS显著正相关(P＜0.05)；但PRI与PIABS相关性不显著(P＞0.05)，PRI与Fv/Fm、φEo为显著(P＜0.05)相关。
表 2 叶片ChlNDI和PRI与色素质量分数、Fv/Fm、PIABS、φE0的相关性
Table 2. Correlation between reflectance spectrum parameters and pigment contents
光谱参数 Chla Chlb Chl a+b Car Fv/Fm PIABS φEo ChlNDI 0.966** 0.961** 0.924** 0.898* 0.883* 0.802* 0.937** PRI 0.969** 0.977** 0.931** 0.929** 0.759* 0.648 0.823* 说明：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01 -
不同叶色变异现象与光合色素含量的差异有关。在高等植物中, 决定叶片颜色的色素主要有叶绿素、类胡萝卜素和花青素等[23]。季鹏章等[24]研究发现：茶树紫色变异品种‘紫娟’Camellia sinensis var. assamica叶绿素含量随着叶片的成熟度增加呈上升趋势。WANG等[25]发现：黄色变异茶树‘中黄2号’C. sinensis‘Zhonghuang 2’的叶绿素和类胡萝卜素含量显著低于正常绿色品种‘龙井43’C. sinensis ‘Longjing 43’。本研究中，不同叶色矢竹叶片的光合色素质量分数存在差异，导致叶色变异。3种矢竹不同叶色叶片的光合色素质量分数均不同，矢竹叶片GL叶绿素和类胡萝卜素质量分数最高，叶绿素a质量分数显著高于其他叶片；AL的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素质量分数不到0.5 mg·g−1，显著低于其他叶片，所以叶色主要呈白色。
植物色素是植物体内主要吸收光能的物质，且植物叶片色素质量分数与光谱参数也有着紧密的联系[26]。叶绿素参与吸收和传递光能、光化学反应，在光合作用中起着非常重要的作用。且叶绿素a是构成反应中心的重要组分，叶绿素的质量分数会影响反应中心的数量[27-29]。反射光谱特征能反映光合能力。本研究中，色素质量分数的差异导致矢竹不同叶色叶片光谱曲线也存在较大差异。不同绿度叶片的反射光谱曲线整体变化趋势一致，且相同波长下反射率差异较大，而花叶矢竹白叶(AL)反射光谱无典型的绿色植被光谱曲线特征，表明白叶复绿过程中光能吸收存在异常。矢竹叶片的叶绿素及类胡萝卜素质量分数与叶绿素归一化指数(ChlNDI)、光化学植被指数(PRI)都存在显著相关性，说明光合色素质量分数会影响反应中心数量，进而影响叶绿素归一化指数和光化学反射指数特征参数。
不同叶色叶片PSⅠ、PSⅡ之间的活性存在差异且相互作用，叶绿素缺乏会影响PSⅡ活性反应中心和PSⅡ天线的合成[30]。当吸收、转化的光能在PSⅠ和PSⅡ间达到平衡时，植物的光化学效率和光化学活性才能达到最大；光合作用电子传递是由PSⅠ和PSⅡ协调作用共同完成的，PSⅠ或PSⅡ受到伤害，都会导致光合能力下降[31]。不同叶色矢竹叶片均具有叶绿素荧光曲线动力学活性。但PSⅡ反应中心开放降低程度差异显著(P＜0.05)，花叶矢竹的复绿叶和淡绿叶显著(P＜0.05)低于矢竹，且能量用于电子传递份额变小；ΔI/I0是作为衡量PSⅠ最大氧化还原能力的指标，ΔI/I0越高说明其最大氧化还原能力越强[20]。不同叶片间参数ΔI/I0的变化，表明了PSⅠ的氧化还原能力存在显著差异，PSⅠ 抑制会限制PSⅡ向受体侧的电子传递，导致PSⅡ的受体侧电子传递链受损，PSⅡ反应中心发生可逆性失活。叶绿素质量分数最低的AL叶片最大光化学效率Fv/Fm和叶片性能指数PIABS均为最低，PSⅡ反应中心活性最低，植物光合机构状态未恢复，充分表明PSⅡ活性最弱。这些结果表明：矢竹叶片随着相对叶绿素的减少会降低光能的吸收，而花叶矢竹白叶色素质量分数低可能与叶色变异有关。花叶矢竹条纹叶片反应中心较少，但仍具有较好的PSⅡ活性和叶绿素水平，这可能与叶色变异有密切关系。
综上所述，不同叶色矢竹叶片均具有典型的反射光谱特征，但是不同叶色叶片间光谱特征与光系统特性存在差异，这与叶绿素质量分数的变化有直接的关系。叶绿素减少会大大降低光能的吸收，而光抑制会限制PSⅡ向受体侧的电子传递，电子传递链受损，反应中心失活。花叶矢竹条纹叶片反应中心数量较少，但仍具有较好的PSⅡ活性和叶绿素水平，维持较好的光合能力。
Reflection spectrum and photochemical characteristics of different colors’ leaves in Pseudosasa japonica
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摘要:
目的 通过解析矢竹Pseudosasa japonica不同叶色叶片反射光谱特性、光系统Ⅱ(PSⅡ)和光系统Ⅰ(PSⅠ)特性之间的差异，探索不同叶色竹种光合能力差异，从生理角度分析矢竹叶色变异特性并为进一步探究叶色变异机制奠定基础。 方法 取生长健壮的矢竹叶片(GL)、花叶矢竹P. japonica f. akebonosuji复绿叶片(AL)、花叶矢竹条纹叶片[(SL)包括白色部分(SA)和绿色部分(SG)]、曙筋矢竹P. japonica f. akebono(VL)4种不同叶色叶片为材料，测定光合色素质量分数、叶绿素归一化指数(ChlNDI)、光化学植被指数(PRI)、快速荧光动力学参数及820 nm相对吸收值。 结果 叶片叶绿素质量分数从大到小依次为GL、SL、VL、AL；不同叶色矢竹叶片的叶绿素归一化指数、光化学植被指数变化趋势一致，从大到小依次均为GL、SG、VL、SA、AL；4个色叶的光系统Ⅰ最大氧化还原能力从大到小依次为GL、VL、SG、AL；花叶矢竹复绿叶、条纹绿叶和曙筋矢竹都具有叶绿素荧光曲线动力学活性，但光系统Ⅱ反应中心开放降低程度与矢竹差异显著(P＜0.05)，能量用于电子传递份额变小；缺乏叶绿素使得单位反应中心吸收的光能不断增加，可能是因为它需要更多的反应中心来应对其较低的转化效率，但最大光化学效率(Fv/Fm)和叶片性能指数(PIABS)都逐渐降低，可能是光系统Ⅱ反应中心发生可逆失活，能吸收光能但不能推动电子传递。 结论 叶色变异导致矢竹叶片光合色素质量分数存在差异，进而影响叶绿素归一化指数和光化学反射指数特征参数，叶绿素缺乏会影响光系统Ⅱ活性反应中心发生可逆性失活。花叶矢竹条纹叶片反应中心较少，但仍具有较好的光系统Ⅱ活性和叶绿素水平，维持较好的光合能力，这可能与其独特的花叶性状有关。图8表2参31 Abstract:Objective This study is aimed to explore the differences in photosynthetic capacity of different colors’leaves of Pseudosasa japonica, analyze the leaf color variation from a physiological point of view and lay the foundation for the further exploration of the mechanism of leaf color variation. Method With the strong bamboo leaves of Pseudosasa japonica(GL), regreened leaves of P. japonica f. akebonosuji(AL), striped leaves of P. japonica f. akebonosuj(SL), including the white part(SA) and the green part(SG), and the leaves of P. japonica f. akebono(VL) selected as the subjects, an investigation was conducted of the photosynthetic pigment content, ChlNDI, PRI, fast fluorescence kinetic parameters and 820 nm relative absorption. Result a) The relative content of chlorophyll in leaves was as follows: GL＞SL＞VL＞AL and the change trend of chlorophyll normalized difference index (ChlNDI) and photochemical reflectance index(PRI) in different leaves of Pseudosasa japonica is the same, which is GL＞SG＞VL＞SA＞AL; b) The maximum redox capacity of Photosystem Ⅰ(PSⅠ) of three bamboo species was GL＞VL＞SG＞AL; the regreened leaves and the striped green leaves of P. japonica f. akebonosuji and the P. japonica f. akebono demonstrate chlorophyll fluorescence curve kinetic activity, but the PhotosystemⅡ(PSⅡ) reaction center had a significantly lower degree of openness than that of the Pseudosasa japonica, and the share of energy used for electron transfer becomes smaller; c) The lack of chlorophyll makes the light energy absorbed by the unit reaction centers increase continuously, probably because it requires more reaction centers to cope with its lower conversion efficiency, however, the maximum photochemical efficiency (Fv/Fm) and the leaf performance index on absorption basis (PIABS) are gradually reduced, possibly due to the fact that the PSⅡ reaction center is reversibly deactivated, able to absorb light energy yet unable to promote electron transfer. Conclusion The variation of leaf color will lead to the difference of photosynthetic pigment content in different kinds of Pseudosasa japonica, and then affect the chlorophyll normalization index and photochemical reflectance index characteristic parameters. Chlorophyll deficiency will affect the active reaction center of PSⅡ, causing reversible inactivation. There are fewer reaction centers in the striped leaves of P. japonica f. akebonosuji, but it still demonstrates good PSⅡ activity, chlorophyll level, and maintains good photosynthetic capacity, usually subject to the uniqueness of flowers and features of leaves. [Ch, 8 fig. 2 tab. 31 ref.] -
Key words:
- Pseudosasa japonica /
- leaf color variation /
- reflectance spectrum /
- photoreaction system
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在自然界中，植物易受到各种病原物的侵害，植物与病原物协同进化，形成了一系列复杂的防御体系。组成型抗性和诱导型抗性是植物应对病原菌侵害和植食者取食的2种典型的防御机制，植物通过协调不同防御机制实现其最佳防御效果[1]。角质蜡质是植物表皮中由超长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物构成的一类次生代谢产物。角质蜡质组成的角质层是植物在长期的生态适应过程中，为抵御恶劣生态环境、生物/非生物胁迫而形成的重要保护屏障，广泛参与植物逆境抵御、病虫害防卫等诸多抗性生理过程，在抗病、抗虫、耐盐、抗旱等方面具有重要的生态学功能[2]。近年来，角质蜡质的研究受到各国研究者的持续关注，取得了诸多新进展[3-4]。本研究以植物组成型、诱导型抗性防御反应为主线，归纳总结目前有关角质蜡质代谢及其抗病作用机制的研究进展，以期为植物抗病机理的阐明及相关病害的防治提供研究思路。
1. 角质蜡质生物合成
1.1 角质层蜡质生物合成
角质层是植物地上部分一层重要的疏水性保护膜，对植物适应复杂多变的环境具有重要意义[5]。最新研究证实：植物根冠和胚胎中也存在角质层结构，其中根冠角质层在植物应对渗透胁迫和侧根形成中发挥了重要作用，而胚胎角质层则在成熟种子中起着扩散屏障以及调控种子萌发的作用[6-7]。角质层结构可分为三部分：第1部分是由嵌入细胞壁多糖的角质以及蜡质组成的角质层基层；第2部分是由角质和镶嵌在角质内部的蜡质共同组成的真角质层；第3部分是由蜡质膜/蜡质晶体沉积在植物表面形成的蜡质层[8]。
角质层由角质和蜡质组成，其中蜡质又分为表层蜡质和内部蜡质。角质层蜡质由超过20个碳原子的超长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物组成，包括醛、烷烃、支链烷烃、烯烃、伯醇、仲醇、不饱和脂肪醇、酮和蜡酯，以及萜类和甾醇类的环状化合物等[9]。利用正向和反向的遗传学手段对拟南芥Arabidopsis thaliana等模式植物开展研究，目前蜡质的生物合成途径已经基本弄清。对拟南芥中大量蜡质合成缺陷突变体ECERIFERUM(CER)的研究，已经分离鉴定出了一大批涉及蜡质生物合成的蜡质突变体基因(CER)。质体合成的C16、C18脂肪酸是蜡质合成的重要前体物，在长链脂酰辅酶A合成酶(LACS)的作用下以脂酰-COA的形式运输到内质网，通过内质网上的脂肪酸延长酶复合体以及BAHD酰基转移酶CER2及其同系物CER2-LIKE1/ CER26和CER2-LIKE2在内的一些辅助因子的协同作用进行碳链延伸[10]，生成C20以上的超长链脂酰-COA；随后通过烷烃合成途径形成醛、烷烃、次级醇和酮等蜡质组分，或通过内质网的醇合成途径形成初级醇和蜡酯等蜡质组分[11]。拟南芥烷烃合成酶CER1和WAX2/CER3基因突变体，其醛、烷烃、次级醇和酮的含量降低，这与烷烃合成通路的代谢产物一致；而CER1、WAX2/CER3和CYTB5共表达引起来自超长链脂酰-CoA的超长链烷烃的氧化还原依赖性合成，表明其可能编码烷烃合成途径中烷烃的合成[12]。作为拟南芥中编码醛脱羧酶的CER1基因家族成员之一的CER1-like1也通过与CER1相同的机制在烷烃的生物合成中起着至关重要的作用，但CER1-like1更偏向于催化短链烷烃的合成[13]。烷烃合成途径的最终反应被认为是由属于细胞色素P450家族的中链烷烃羟化酶1(MAH1/CYP96A15)催化烷烃氧化产生次级醇，并进一步催化次级醇氧化生成酮类[14]。研究表明：在醇合成途径中，编码脂酰辅酶A还原酶的CER4基因负责地上部分组织表皮细胞和根中初级醇的合成，而编码蜡酯合成酶基因的WSD1基因其拟南芥突变体表现出比野生型更低的蜡酯含量，表明WSD1可能负责蜡酯的合成[15-17]。
1.2 角质层角质生物合成
成熟角质层中还含有角质，角质是一种主要由ω端和中链羟基化的C16和C18的氧化脂肪酸以及甘油以酯键交联而成的聚合物[18]。角质单体的合成在内质网上进行，内质网对质体产生的C16和C18脂肪酸进一步修饰合成各种以单酰基甘油酯形式存在的角质单体。角质单体的合成涉及许多氧化反应，由细胞色素P450酶催化，其中末端碳链氧化反应涉及细胞色素P450末端羟化酶(CYP86A)家族成员，而中链氧化反应涉及细胞色素P450中链羟化酶(CYP77A)家族成员。拟南芥CYP86A2、CYP86A4、CYP86A7和CYP86A8突变体表现出角质层结构异常和角质组分改变，表明这几个基因与角质生物合成中ω链的羟基化密切相关[19]。ω-羟基脂肪酸则进一步经过脱氢反应生成脂肪醛，脂肪醛再经氧化反应最终生成二羧酸；虽然催化该过程的酶尚不清楚，但是由于CYP86A2和HTH(hothead)这2个基因的拟南芥突变体中缺少二羧酸，因此认为其可能涉及ω-OH脂肪酸氧化生成二羧酸的反应[20-21]。CYP77A6是目前唯一被鉴定为能够进行中链羟化的酶，CYP77A基因在花瓣中强烈表达，但在其拟南芥突变体的花瓣中却完全丢失了二羟基角质单体；其异源表达结果表明：该基因特异性催化ω-OH脂肪酸的中链羟基化，这也表明角质合成的中链羟基化反应发生在末端羟基化之后[22]。此外，CYP77A4异源表达催化环氧化羟基脂肪酸的合成，表明其可能参与环氧化脂肪酸的合成，但目前尚未完全证实。角质单体合成的最终反应由甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化完成，脂酰-COA在甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化下，酰基转移至甘油-3-磷酸生产单酰基甘油角质单体。拟南芥GPAT1-8基因被报道在细胞外脂质聚酯的合成中起着重要作用，其中GPAT4-8已经被证明有助于角质的合成，并且这几种酶相较于未被取代的脂肪酸表现出对末端羟基或羧基脂肪酸具有更强的催化效率，表明他们在氧化反应之后发挥作用[23]。
质膜ATP结合盒转运蛋白(ABCG)已经被证明可能与角质和蜡质向质外体的转运有关；而脂质转移蛋白(LTPs)被证明很可能有助于角质单体通过细胞壁向角质层的转运[24]。随着番茄Solanum lycopersicum中CD1/GDSL1这第1个角质合酶的发现，长久以来存疑的脂肪酶(GDSL)家族的酶在角质组装中的作用也得到了确证[25-27]，而拟南芥α/β水解酶蛋白基因BODYGUARD (BDG)的发现证明了植物中可能存在一些其他的角质合酶[28]。尽管目前的研究已经在角质蜡质的合成、运输、组装方面取得了一定的进展，但角质层的形成机制仍然未知。
2. 植物的抗病类型
2.1 组成型抗性
组成型抗性是植物的固有特性，是植物在遭受侵害前就己存在的抗性，包含植物固有的层和细胞壁的角质、蜡质、木质素等成分。其中，化学抗性主要包括酚类、皂苷、不饱和内酯及有机硫化合物等植保素(phytoalexins)[29]。组成型抗性是植物在长期的系统发育中产生和发展起来的[30]，由植物基因型决定，但其抗性强弱也会受到环境因素的影响。
2.2 诱导型抗性
诱导型抗性是指植物经病原物刺激后诱导产生的抗性成分或抗性反应，包括物理抗性和化学抗性2类。物理抗性包括细胞壁及角质层加固和修复、乳突的形成、木质化作用及侵填体的形成等[31]。化学抗性则包括过敏性反应的诱导、植保素的产生、水解酶的激活及病程相关蛋白的表达等。诱导型抗性类似于免疫反应，只有在遇到外界因子，如物理损伤、植食者取食和病原菌侵染时才得以表现[32]。因此，诱导型抗性具有“开-关效应”，也称作“兼性抗性”。物理抗性与化学抗性通常协同发挥作用，一些物理屏障和化学因子不仅属于组成型抗性，也会在诱导型抗性中起重要作用，典型的如角质蜡质。
诱导型抗性并非植物的原始性状，而是一种衍生性状。植物长期处于复杂的环境中，容易受到各种病原物的侵害，组成型抗性是一种被动的防御机制，并不能确保植物对病原物的完全防御。为了更好地抵御病原菌的入侵，植物进化出了一系列诱导防御反应，植物的这种抵抗外界病原物刺激所形成的防御反应又被称为植物的先天免疫。植物先天免疫由微生物、病原体和/或损伤相关的分子模式(分别为MAMP，PAMP和/或DAMP)识别相应的化学分子所触发[33]，这些化学分子在植物与微生物相互作用过程中释放，并被模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别。
植物的先天免疫包括两大类，病原物相关分子模式触发型免疫(PAMP-triggered immunity，PTI)和效应因子触发型免疫(effector-triggered immunity，ETI)[34]。植物-病原体互作中植物启动先天免疫的第1步是植物模式识别受体(PRRs)识别病原相关分子模式(PAMPs)的化学分子，引发病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)，激活植物体中促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，从而使植物产生早期应答反应[35]。然而，病原体为了抑制植物的诱导型防御反应便于自身的入侵反应，往往会产生大量抑制PTI激活的效应因子，而植物此时会启动先天免疫的第2步反应，通过特异性的抗性蛋白(R蛋白)识别效应因子，在侵染位点启动快速剧烈的防御反应，这种防御反应即为ETI[36]。ETI诱导的抗性通常表现为入侵位点的细胞凋亡，即过敏反应[37]。
MAMPs/PAMPs或DAMPs都可以诱导PTI[38]，并且相较于特异性的ETI具有更加广谱的抗性反应，如活性氧(ROS)积累，激活MAPK依赖性信号级联反应，植物抗毒素的生物合成，水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等防御相关激素以及相关抗性基因的诱导表达[33, 39]。植物的这2种免疫反应机制通过启动防御反应诱导植物产生局部和系统抗性，两者协同作用进而抵御病原菌的入侵[40]。植物在侵染位点启动超敏反应特异性抵御病原菌侵染的这种反应被称为植物的局部抗性，而与之相对的，植物活化抗性基因使植物在整株水平上产生抗性或者产生抵御病原菌再次入侵的抗性，这种非专化性的抗性则被称为系统抗性[41]。通常植物的系统抗性包括诱导系统抗性(ISR)和获得性系统抗性(SAR)，ISR主要由非致病菌诱导产生，而SAR则是由植物响应病原菌侵染产生的[42]。这2种系统抗性依赖于SA，JA和ET信号途径的协同效应。SA和JA作为植物中十分重要的2条信号途径，在抗病化学信号的转导中的作用尤为重要。现在也有越来越多的证据表明，角质和蜡质在植物的诱导防御反应中也扮演着重要的角色[43]。
3. 角质蜡质在植物-病原互作中的作用
3.1 角质蜡质的组成型抗性
角质蜡质组成的角质层作为植物地上部分共有的一层保护性屏障，在植物组成型抗性中扮演着重要角色。角质蜡质组成型抗性作用也可分为物理抗性和化学抗性2类[44]。角质层及其组分角质蜡质维持着植物正常生长必需的机械强度，与植物对真菌的物理抗性密切相关；许多真菌需要通过附着胞的物理穿刺刺破植物角质层进而侵染内部细胞[45]，因此，完整的具有一定机械强度的角质层会阻碍真菌对植物的侵染，如许多果腐病病原体只能通过角质层缺陷的方式侵染果实[46]。
植物角质蜡质组成对病原菌的物理抗性，不仅影响植物表皮机械强度，还会影响植物表面的疏水性(不渗透性)[44]。真菌孢子的萌发和细菌的繁殖需要高湿环境，疏水的角质层表面则不利于病原菌的停滞，能有效减少病原菌的侵染[47]。拟南芥和番茄角质蜡质合成缺陷的突变体具有强渗透性的角质层，表现出病原体感染的易感性。如拟南芥酰基载体蛋白4(ACP4)和GL1(GLABROUS 1)突变体的角质蜡质含量更低，增加了其表皮渗透性，叶片则表现出对2种病原体的高易感性[48-49]。研究表明：角质蜡质相关SHINE转录因子的突变导致角质层缺陷，进而导致了对灰霉病菌Botrytis cinerea易感性[50]。这些结果也进一步验证了角质蜡质代谢可通过调控角质层的渗透性进而影响植物的抗病性。
此外，角质蜡质组分也具有化学抗性功能。角质蜡质的某些组分可以抑制或者刺激孢子的萌发，如去蜡质处理的大麦Hordeum vulgare叶片有更多的附着胞生成，增加了其对锈菌的敏感性[51]；水稻Oryza sativa叶片角质组分十六烷二醇，可以诱导稻瘟菌Pyricularia oryzae的产生和附着胞的分化形成，并促进灰霉病真菌孢子的萌发和角质酶的表达[52-53]。此外，角质和蜡质的某些组分对某些病原体还具有直接的抑制作用，如C16和C18羟基脂肪酸对丁香假单胞菌Pseudomonas syringae有直接的抑制作用[54]，这些角质蜡质成分对病原菌的抑制作用构成了角质蜡质组成型抗性中的化学抗性。
综上所述，角质蜡质一方面能够通过影响角质层的物理性质(机械强度和疏水性)，实现对病原菌的物理屏蔽作用；另一方面也能通过羟基脂肪酸等抑菌成分直接调控病原菌的增殖分化来实现其化学防御功能。
3.2 角质蜡质的诱导型抗性
传统观点认为，角质层及其角质蜡质组分主要通过组成型抗性发挥其保护性屏障功能。现在更多研究证实：角质蜡质在植物的诱导防御反应中也发挥着重要作用[55]。与组成型抗性类似，角质蜡质的诱导型抗性也可分为物理抗性和化学抗性2类。在病原菌侵染植物的过程中，角质蜡质组分均会对病原菌的刺激作出响应。角质蜡质诱导型物理抗性功能的发挥，一般是响应病原菌的刺激，上调角质蜡质的合成，增强角质层的保护性屏障作用。如受到炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides感染的番茄果实，其角质蜡质的生物合成会显著上调[56]。柑橘Citrus sinensis花瓣感染炭疽病后，其表皮细胞脂质合成上调，角质蜡质相关代谢物沉积，并引起角质层结构的改变进而增强其物理抗性[57]。此外，大麦感染由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum引起的赤霉病后，抗性品种小穗会上调角质层的生物合成进而增强其对病原菌的物理抗性[58]。上述这些都表明角质蜡质在植物的诱导防御反应中发挥了重要的物理屏障作用。
角质蜡质也可作为诱导型抗性成分在病原菌侵染过程中发挥化学抗性功能。病原体侵染植物后，植物产生的降解产物和释放的内生肽可作为植物损伤相关分子模式的诱导子(DAMPs)被植物模式识别受体(PRRs)所识别，继而启动下游的免疫反应(PTI)[33]。目前的研究表明：角质层被真菌角质酶降解的产物也可作为DAMPs被损伤相关模式的受体所识别[17, 59]。由此认为角质蜡质可以通过作为诱导子激活下游的诱导防御反应进而实现其化学抗性的功能(图1)。这一观点也得到了许多外施角质单体研究结果的支持，如外施无抑菌活性的角质单体增加了大麦对白粉病菌Erysiphe graminis f.sp. hordei的抗性[60]；组织培养的马铃薯Solanum tuberosum细胞外施角质单体后乙烯的合成积累和相关防御基因的表达均上调[61]；外源施加角质单体增加了番茄病程相关基因的表达水平[62]；水稻叶片外源施加角质单体16-羟基棕榈酸，脂质转运蛋白基因OsLTP5和病程相关基因PR-10的表达也上调[63]。这些都在一定程度上表明角质蜡质可能是通过调控下游抗性基因的表达进而实现其化学抗性(图1)。
进一步的研究表明：除了作为诱导子调控下游抗性相关基因，某些角质蜡质组分也可以作为活性氧的诱导子诱导活性氧的积累。如黄瓜Cucumis sativus下胚轴外施角质蜡质组分的研究表明：某些角质蜡质成分具有良好的活性氧诱导活性[64-65]，而活性氧介导了植物包括超敏反应在内的一系列防御反应。基于这些研究，目前也有一些观点认为：角质蜡质可能通过作为活性氧的诱导子来激活下游的诱导防御反应进而实现其抗性功能[43,66]。除此之外，角质蜡质被认为可能作为信号分子影响植物的系统获得性抗性(SAR)[67]。基于上述研究，可得出角质蜡质作为诱导子激活下游的诱导防御反应时，可能主要是通过调控病原物相关分子模式触发型免疫(PTI)中的包括活性氧爆发，抗病基因表达，系统获得性抗性在内的一系列的抗性反应进而实现其抗性功能(图1)。
大量研究证实：激素信号在植物-病原体互作中发挥了重要作用[68]；激素作为重要的抗病信号可能涉及了植物角质蜡质介导的抗性反应。某些激素被证明可以调控角质蜡质的合成和相关抗性，如JA处理豌豆Vicia sativa幼苗，诱导其角质单体羟基脂肪酸的合成[69]，而羟基脂肪酸作为植物的内源信号分子发挥了重要的抗性作用，这表明JA可以调控角质的生物合成进而介导其抗病性。JA和角质蜡质同属于脂肪酸代谢通路，具有共同的合成前体，因此，也有观点认为JA不仅能够直接调控角质蜡质的生物合成介导其抗病性，还和角质蜡质存在着代谢流的重定向；基于角质蜡质生物合成缺陷突变体的研究也在一定程度上支持了这一观点。如拟南芥突变体RST1角质蜡质生物合成缺陷，JA及其相关抗病基因PDF1.2上调表达，表现出对白粉病的抗性[70]；柑橘自发突变体蜡质合成缺陷，JA和相关抗病基因PDF1.2上调表达，增加了对病原菌的抗性[71]。这些结果均表明：JA和角质蜡质之间可以通过代谢流的重定向进而调控植物的抗病性(图1)。
4. 结论与展望
角质层作为植物抵御病原菌侵染的第1道防线，在植物-病原互作中具有重要作用。角质蜡质是角质层主要成分，一方面可以作为组成型抗性成分发挥物理抗性(物理屏障)和化学抗性(抑菌)作用；另一方面，也可作为诱导型抗性成分发挥作用，诱导产生的角质蜡质组分可作为信号分子或者诱导子激活下游的抗性反应进而发挥其化学抗性功能。目前，角质蜡质介导的诱导抗性研究受到广泛关注，但其作用机理尚未完全阐明；哪些角质蜡质组分参与了植物的诱导型防御反应，其作为诱导子激活下游抗性反应的具体机制如何？激素信号介导的角质蜡质抗性机制如何？诸多问题均有待深入探讨，角质蜡质抗性机理的阐释为作物抗性育种提供了新的思路。此外，虽然已有相关研究表明角质蜡质具有抑菌活性和植物免疫反应诱导子的作用，但目前尚无角质蜡质类生物农药(植物免疫诱导剂)的报道。因此，角质蜡质作为生物农药(植物免疫诱导剂)具有广阔的开发前景，同时角质蜡质类生物农药(植物免疫诱导剂)的开发也将为病害防控提供新的思路。
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图 2 叶片反射光谱曲线(A)和一阶导数曲线(B)
Figure 2 Leaf reflectance curve (A) and first derivative curve (B)
图 5 不同叶色叶片的OJIP荧光曲线(A)与相对可变荧光强度随时间的变化(B)
Figure 5 Changes of OJIP fluorescence curves (A) and relative variable fluorescence intensity (B) of different colors’ leaves
图 6 不同叶色叶片820 nm相对吸收值变化
Figure 6 Changes in relative absorption values of PSI 820 nm of different color leaves
图 7 不同叶色叶片PSⅠ最大氧化还原能力ΔI/I0的差异
不同字母表示不同叶色矢竹叶片差异显著(P＜0.05)
Figure 7 PSI maximum ability of oxido-reduction △I/I0 of different color leaves
表 1 不同叶色矢竹光合色素差异
Table 1. Difference of photosynthetic pigment content in different colors’ leaves of P. japonica
材料 Chla/(mg·g−1) Chlb/(mg·g−1) Car/(mg·g−1) Chl a+b/(mg·g−1) Chl a/b Car/Chl AL 0.34±0.015 a 0.26±0.010 a 0.32±0.015 c 0.60±0.035 a 1.3±0.007 a 0.53±0.022 b SG 20.39±0.170 b 18.27±0.120 b 5.52±0.020 a 38.66±0.250 c 1.1±0.020 b 0.14±0.010 a VL 17.09±0.080 b 15.72±0.070 b 4.07±0.184 b 33.81±0.140 b 1.0±0.013 b 0.12±0.007 a GL 22.19±0.120 c 19.66±0.150 b 4.89±0.020 a 41.85±0.220 c 1.14±0.024 b 0.11±0.005 a 说明：同列内不同小写字母表示材料间差异显著(P＜0.05) 
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表 2 叶片ChlNDI和PRI与色素质量分数、Fv/Fm、PIABS、φE0的相关性
Table 2. Correlation between reflectance spectrum parameters and pigment contents
光谱参数 Chla Chlb Chl a+b Car Fv/Fm PIABS φEo ChlNDI 0.966** 0.961** 0.924** 0.898* 0.883* 0.802* 0.937** PRI 0.969** 0.977** 0.931** 0.929** 0.759* 0.648 0.823* 说明：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
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