下载:
-
三叶青Tetrastigma hemsleyanum为葡萄科Vitaceae崖爬藤属Tetrastigma的药用植物，主要以地下块根入药。在临床中，三叶青内服可治疗咽喉炎、肝炎、肺炎、小儿高热惊厥及病毒性脑膜炎等炎症，外用可治毒蛇咬伤、跌打损伤、痈疽等疾病，被誉为“植物抗生素”，是中国独有的珍贵药材，主要分布于浙江、湖南、广东、广西、四川等地[1]。由于三叶青具有良好的抗肿瘤功效且无毒副作用[2]，导致三叶青需求量大量增加，人工栽培面积不断扩大。人工种植三叶青多采取遮光大棚雾喷管理，藤叶生长茂盛，但块根品质却远不如生长环境苛刻的野生三叶青[3-5]。逆境胁迫虽抑制植物的生长发育，特别是营养生长，但同时也会促进或者抑制植物中黄酮等一些次生代谢产物的累积[6-9]。三叶青喜阴湿环境，野生三叶青多生长于山坡或山沟、溪谷两旁的针阔混交林或杂木林林下背阴处[10-11]，可见水分条件对三叶青的生长影响较大。目前，温度[12-13]、光照[14-15]、土壤肥料[16-17]等环境因子对三叶青生长的影响已有研究，但关于水分胁迫对三叶青特别是三叶青黄酮含量的影响还未见报道。因此，本研究分析了水分胁迫对三叶青生长、黄酮含量及其合成途径中关键酶的影响，为人工种植高品质三叶青提供理论依据。
-
三叶青由浙江五养堂药业有限公司遂昌县金竹药王谷三叶青基地提供。为了保持试验材料的一致性，以专用袋标准化繁育的2年生三叶青植株作为供试材料。
-
实验地位于浙江农林大学东湖校区(30°15′28″N，119°43′35″E)，该区全年降水量1 628.6 mm，全年平均气温16.4 ℃，年日照时数1 847.3 h，无霜期237.0 d。取长势良好的2年生的三叶青植株，种植在上口径20 cm、下口径15 cm、高20 cm的塑料花盆中，栽培基质为过筛土∶营养基质=2∶1(质量比)，每盆1株，缓苗5周，缓苗期间定时定量浇水。5周后，选取长势基本一致的2年生植株57株，随机分为3组，每组19盆，设置3个处理组，分别为干旱、水涝和对照。干旱组在试验期间一直不浇水，水涝组保证地下部分在试验期间一直处于淹水状态，对照组在试验期间正常浇水。
-
干旱组在胁迫处理的第1、8、16、24、32、40天，于相同叶位随机取样3盆(预试验发现三叶青在不浇水40 d左右出现死亡现象)，水涝组在胁迫处理的第1、4、8、12、16、20天，于相同叶位随机取样3盆(预试验发现三叶青在水淹20 d左右出现死亡现象)，对照组在胁迫处理的第1、4、8、12、16、20、24、32、40天，于相同叶位处随机取样3盆。每个试验组设置3个重复，所有样品取样后立即用清水洗净擦干后再立即用液氮预冷，于−80 ℃冰箱保存待测。
电镜样品取样，在胁迫处理最后1 d，取植株的中部成熟叶片，中间靠近大叶脉处部位切成长0.1 cm、宽0.2 cm左右的小片(避开大叶脉)后迅速放入体积分数为2.5%的戊二醛溶液中，抽真空至材料沉入固定液底部，4 ℃固定过夜，每个试验组重复3次。
-
随机取实验三叶青进行叶片表型拍摄，再取块根，洗净后擦干进行块根表型拍摄。
-
倒掉固定液，用0.1 mol·L−1 pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min；用质量分数为1%的锇酸固定样品1~2 h后漂洗3次。然后用不同体积分数的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%和95%)对样品进行脱水处理，每种体积分数处理15 min，再用纯乙醇处理20 min，最后用纯丙酮处理20 min。接着用Spurr包埋剂与丙酮的混合液(V/V=1/1)处理样品1 h；再用Spurr包埋剂与丙酮的混合液(V/V=3/1)处理样品3 h；最后用纯包埋剂处理样品过夜。将经过渗透处理的样品包埋起来，70 ℃加热过夜，即得到包埋好的样品；样品在LEICA EM UC7型超薄切片机中切片，获得70~90 nm的切片；切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液(体积分数)各染色5~10 min。最后在Hitachi H-7650型透射电镜中观察叶肉细胞中的叶绿体。
-
黄酮质量分数的测定方法参照文献[18-19]。以芦丁不同质量分数(mg)为纵坐标(y)，以波长500 nm下的吸光度D(500)为横坐标(x)绘制标准曲线，得到回归方程y=0.245 9x+0.001 6(R2=0.999 9)。测定样品在500 nm波长下的吸光度D(500)，计算三叶青总黄酮质量分数，每个样品3个重复。
-
酶液制备及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定参照徐琳煜[20]的方法，以每克鲜质量叶片每分钟波长290 nm下的吸光度D(290)变化0.01为1个酶活力单位(16.67 nkat·g−1·min−1)。查尔酮合成酶(CHS)活性测定参照试剂盒法(上海晶抗生物工程)：以标准物的浓度(×16.67 nkat·L−1)为纵坐标(y)，波长450 nm下的吸光度D(450)为横坐标(x)，得到标准曲线直线回归方程y=92.238x+1.193 8(R2=0.999)，然后根据样品的D(450)计算样品相应的浓度。查尔酮异构酶(CHI)活性测定参照试剂盒法(上海晶抗生物工程)：以标准物的浓度(×16.67 nkat·L−1)为纵坐标(y)，波长450 nm下的吸光度D(450)为横坐标(x)，得到标准曲线直线回归方程y=1 165.3x+50.552(R2=0.999)，然后根据样品的D(450)计算出样品相应的浓度。
-
用Excel进行数据处理与制图；运用单因素方差分析和最小显著极差法LSR进行方差分析和多重比较(α=0.05)；采用Pearson’s进行相关性分析。
-
水分胁迫严重影响三叶青的营养生长。从叶片表型来看，未遭受水分胁迫的三叶青(对照)叶片饱满，色泽鲜艳，叶脉清晰；干旱胁迫40 d后，三叶青叶片失水，萎蔫，逐渐发黄枯萎；水涝胁迫20 d后，三叶青叶片失绿变黄(图1)。从块根的表观形态上来看，对照组的块根饱满，形状完好，而干旱组的块根失水皱缩，表皮布满沟壑，水涝组的块根绵软，表皮极易脱落，块根几乎腐烂(图2)。
图 1 水分胁迫对三叶青叶片的影响
Figure 1. Effects of water stress on leaves of T. hemsleyanum
图 2 水分胁迫对三叶青块根的影响
Figure 2. Effects of water stress on roots of T. hemsleyanum
-
叶绿体结构的完整性及其内部结构的有序性对光合作用的光能吸收和传递有着重要作用。与对照相比，水涝和干旱处理下叶绿体数目明显减少(图3A1，图3B1，图3C1)。水分胁迫下，三叶青叶片中的叶绿体在细胞内的排列方式发生变化，与对照的紧贴细胞壁并且整齐分布相比，水涝和干旱处理后，叶肉细胞中的叶绿体与细胞壁分离，挤向液泡，在细胞中呈现拥挤混乱的现象，叶绿体向细胞中间靠拢，完全随机分布在细胞中(图3A1，图3B1，图3C1)。水涝和干旱处理后，叶肉细胞叶绿体膨胀，失去原本形态，叶绿体中淀粉粒数量增多，可能是代谢不正常导致淀粉粒无法运出造成的(图3A2，图3B2，图3B3)。与对照相比，水涝和干旱处理后，叶绿体基质颜色变浅，叶绿体膨大，质体小球颜色变浅，数量增多，体积变大(图3A3，图3B3，图3C3)。对照基粒片层结构整齐，紧密排列，而干旱和水涝处理后，基粒片层失去整齐紧密结构，与细胞质之间不再有完整界限，结构被破坏(图3A4，图3B4，图3C4)。
图 3 水分胁迫对三叶青叶片叶绿体超微结构的影响
Figure 3. Effects of water stress on chloroplast ultrastructurey of leaves in T. hemsleyanum
-
水分胁迫影响三叶青块根的黄酮质量分数。水涝胁迫8 d后，总黄酮质量分数显著高于对照(P＜0.05)，在胁迫12 d时达到最大值。干旱胁迫16 d后，总黄酮质量分数显著高于对照(P＜0.05)，在胁迫16 d时达到峰值(图4)。对照总黄酮质量分数保持在比较稳定的范围内，而水涝和干旱处理后，总黄酮质量分数呈先低后高再回落的变化趋势。
图 4 水分胁迫下三叶青块根黄酮质量分数的变化
Figure 4. Change of content of flavonoid in T. hemsleyanum under water stress
-
水分胁迫对三叶青块根黄酮合成关键酶活性的影响较大。水涝胁迫4 d后，PAL活性显著提高(P＜0.05)，并且在胁迫4 d时达到峰值，之后下降且在胁迫16 d时显著低于对照(P＜0.05)。干旱胁迫16 d后，PAL活性显著高于对照(P＜0.05)，并且在胁迫16 d时达到峰值，之后下降且在胁迫32 d时显著低于对照(P＜0.05)。即PAL活性呈先上升后下降的趋势，胁迫处理前期大于对照，胁迫后期则低于对照(图5)。
图 5 水分胁迫下三叶青块根PAL活性的变化
Figure 5. Change of activities of PAL in T. hemsleyanum under water stress
水分胁迫影响三叶青CHS活性。水涝胁迫4 d后，CHS活性显著高于对照(P＜0.05)，且在胁迫处理的12 d达到最大值，之后回落到与对照近似水平。干旱胁迫16 d后，干旱处理的CHS活性显著增强(P＜0.05)，并且在胁迫16 d达到峰值，之后下降至与对照近似水平。整个研究过程中，水涝和干旱处理的CHS活性呈先上升后下降的趋势，且酶活性大于对照组，对照组基本不变(图6)。
图 6 水分胁迫下三叶青块根CHS活性的变化
Figure 6. Change of activities of CHS in T. hemsleyanum under water stress
与对照相比，水涝胁迫12 d后，CHI活性显著增强(P＜0.05)，并且在胁迫处理的12 d达到峰值，之后开始下降。干旱胁迫下，CHI活性在8~16 d迅速增加，且在胁迫16 d显著高于对照(P＜0.05)，之后开始下降(图7)。总体来说，水涝和干旱的CHS活性呈先上升后下降的趋势，且酶活性大于对照组，而对照组的CHI活性一直比较稳定。此外，相比于CHS活性，CHI对胁迫的响应略有延缓，说明CHI可能在CHS之后起作用。
图 7 水分胁迫下三叶青块根CHI活性的变化
Figure 7. Change of activities of CHI in T. hemsleyanum under water stress
-
从表1可以看出：干旱和水涝胁迫下，三叶青黄酮质量分数、PAL、CHS、CHI活性之间均表现为正相关关系，个别呈显著相关(P＜0.05)，表明黄酮质量分数受酶活性的调控。胁迫处理组的PAL与CHS、CHI之间呈正相关，但相关不显著(P＞0.05)；CHS和CHI之间呈极显著相关(P＜0.01)，表明CHS和CHI共同促进黄酮质量分数增加。
表 1 水分胁迫下黄酮质量分数、PAL、CHS、CHI之间的相关性分析
Table 1. Correlation analysis between flavonoid content, PAL, CHS and CHI under water stress
处理 黄酮 PAL CHS CHI 水涝 黄酮 1 PAL 0.143 1 CHS 0.830* 0.614 1 CHI 0.854* 0.413 0.950** 1 干旱 黄酮 1 PAL 0.256 1 CHS 0.846* 0.699 1 CHI 0.895* 0.625 0.980** 1 对照 黄酮 1 PAL 0.565 1 CHS −0.014 0.464 1 CHI 0.336 0.553 0.920** 1 说明：*表示显著相关(P＜0.05)；**表示极显著相关(P＜ 0.01) -
水分影响三叶青的光合作用，而叶绿体作为光合作用的反应场所，其结构的完整性是影响光合作用正常运行的关键。本研究在三叶青叶绿体超微结构中发现：胁迫使三叶青叶绿体数量减少且不断向细胞中央靠拢，可能是三叶青叶片发黄的原因。王顺才等[21]在研究干旱胁迫对3种苹果属Malus植物的叶绿体超微结构的影响时也证实了这一点。本研究发现：干旱和水涝下，叶绿体形态结构发生改变，叶绿体膨大变圆，淀粉粒大量积累无法运出，质体小球的数量增多、体积变大、颜色变浅。杨凤军等[22]研究了干旱胁迫对番茄Lycopersicon esculentum叶面叶绿体超微结构后表明：逆境导致质体小球数量增加；因为质体小球是类囊体降解脂类聚集的结果，其数量的变化可作为叶细胞受损的标志[23]。本研究还观察到水涝和干旱的三叶青叶绿体基粒片层失去整齐紧密排列结构，变得松散模糊，没有界限，这与李冬林等[24]的研究结果一致；表明水涝和干旱使三叶青叶片叶绿体膜结构严重受损，失去生理活性，从而影响三叶青的光合作用和营养生长。
次生代谢过程是连接生态环境与药效成分含量的中间环节，产生的次生代谢产物在植物自我保护、生理调节等生命活动方面起着重要作用[25]，并且是药用植物的主要药效成分。环境影响次生代谢产物的形成和积累[26]。目前，关于非生物因子影响药用植物次生代谢产物的研究已有很多，ZHU等[27]研究认为：柴胡Bupleurum chinense在水分胁迫下通过增加次生代谢产物的含量来提高抗氧化能力，进而抵制因水分胁迫产生的自由基；有研究发现：低温培养的黄豆Glycine max，其大豆黄素和染料木苷的代谢水平显著增高[28]；LI等[29]在研究拟南芥Arabidopsis thaliana应对盐胁迫的响应时发现：黄酮类化合物含量上升。三叶青作为中药材，其药用活性成分主要有黄酮类化合物、酚酸类化合物、萜类化合物等次生代谢产物，本研究发现：水分胁迫促进了三叶青黄酮的积累，导致总黄酮质量分数高于对照，说明水涝和干旱使三叶青黄酮代谢增强，增加了三叶青块根单位干质量的黄酮质量分数。小麦Triticum aestivum、丹参Salvia miltiorrhiza等在水分胁迫下同样出现了黄酮类化合物质量分数上升的情况[30-31]。
PAL是连接初级代谢和苯丙烷类代谢途径中的关键酶和限速酶，可催化苯丙氨酸生成香豆酸、肉桂酸等中间产物，并且可以进一步转化为绿原酸、香豆素，也能够形成酯，再经历多条途径，进一步转化为木质素、类黄酮等物质。研究发现：药用植物在遭遇逆境胁迫时，PAL活性提高，当胁迫过严重时，PAL活性变弱[32]，本研究也验证了这一点。胁迫前期，PAL活性增强，催化苯丙氨酸代谢，促进黄酮代谢的进行；随着胁迫时间加长，PAL活性降低。CHS和CHI分别是黄酮类化合物合成途径中的第1个和第2个关键酶，胁迫会上调CHS、CHI活性[33]。本研究中，CHS和CHI活性在PAL之后增强，而黄酮质量分数也在这时达到峰值，这与酶作用途径中的顺序一致；而在胁迫后期，PAL、CHS、CHI活性不断下降，三叶青黄酮质量分数也有所回落，这可能是由于胁迫使三叶青生长受到威胁，严重抑制各种生命活动，各种酶的活性也不断下降。
郭肖等[34]对水芹Oenanthe javanica黄酮质量分数和PAL活性的相关性分析发现：黄酮含量与PAL活性的变化趋势一致。本研究发现：三叶青块根中PAL、CHS、CHI活性与黄酮质量分数呈正相关，且部分指标显著相关(P＜0.05)，表明三叶青黄酮质量分数与关键酶活性相关，关键酶活性增强可能是引起三叶青黄酮高积累的关键因素。许多研究也证明了这一点，如LI等[35]研究发现：转基因烟草Nicotiana tabacum的总黄酮质量分数与CHI活性呈正相关；在温度与水分胁迫下，参与银杏Ginkgo biloba黄酮类代谢的PAL、CHS基因表达量的变化趋势与类黄酮质量分数变化趋势基本一致[36]。
水分胁迫影响三叶青的生长，表现为叶片块根受损、叶绿体超微结构损伤、黄酮质量分数以及黄酮合成途径相关酶活性变化等。三叶青通过产生一系列应激反应以应对水分胁迫，适度的水分胁迫可通过增强黄酮合成途径中的关键酶活性以增强抗逆性，同时增加黄酮的产量，提高三叶青的药材品质。
Effects of water stress on chloroplast ultrastructure and key enzymes of flavonoid synthesis in Tetrastigma hemsleyanum
-
摘要:
目的 探究水分胁迫对三叶青Tetrastigma hemsleyanum叶绿体超微结构及黄酮合成关键酶活性的影响，有利于提升三叶青的品质。 方法 以2年生三叶青实生苗为材料，通过控水盆栽试验(设置水涝、干旱和对照)，分析水分胁迫对三叶青叶绿体超微结构、块根总黄酮质量分数以及黄酮合成途径中的3个关键酶[苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)]活性的影响。 结果 干旱和水涝均引起三叶青叶片叶绿体数量减少，叶绿体质体小球的数量增多、体积变大、颜色变浅，叶绿体基粒片层结构不再整齐紧密；干旱时，三叶青总黄酮质量分数在胁迫12 d达到峰值，水涝时则在胁迫16 d达到峰值，而PAL、CHS和CHI等3个关键酶则在黄酮质量分数达到峰值前期或者是同期表现出较高的活性；随着胁迫时间的延长，黄酮质量分数和关键酶活性都有不同程度的下降，黄酮质量分数与PAL、CHS、CHI活性均显著相关(P＜0.05)。 结论 适度的水分胁迫可提高三叶青块根中黄酮类化合物的质量分数以及相关酶的活性。图7表1参36 Abstract:Objective This study aims to investigate the effects of water stress on the ultrastructure of chloroplast and the activity and content of key enzymes in the flavonoid synthesis pathway of Tetrastigma hemsleyanum, so as to improve the quality of T. hemsleyanum. Method With two-year-old seedlings of T. hemsleyanum as materials, and through water control pot experiments (setting waterlogging, drought, and the control), the effects of water stress on chloroplast ultrastructure, root flavonoid content and the activities of three key enzymes [phenylalanine ammonia lyase(PAL), chalcone synthase(CHS) and chalcone isomerase(CHI)] in flavonoid synthesis pathway were analyzed. Result Drought and waterlogging both caused the decrease of chloroplast number in the leaves, and they moved toward the center of the cell instead of clinging to the cell wall. Besides, the number of plastid globules in the chloroplast increased and the volume became larger, the color became lighter, and the lamella structure of chloroplast was no longer neat and compact. The total flavonoid content of T. hemsleyanum reached the peak on the 12th day under drought stress, and reached the peak on the 16th day under waterlogging stress. Analysis of key enzyme activities in the biosynthetic pathway of flavonoids showed that the activities of PAL, CHS and CHI increased successively in the early stage of the maximum flavonoid content or during the same period, but with the extension of stress time, the total flavonoid content and key enzyme activities decreased in varying degrees. There was a significant correlation between the content of flavonoids and the activities of PAL, CHS, and CHI (P＜0.05). Conclusion Moderate water stress can increase the content of flavonoids in the roots of T. hemsleyanum and enhance the activity of related enzymes. [Ch, 7 fig. 1 tab. 36 ref.] -
Key words:
- water stress /
- Tetrastigma hemsleyanum /
- ultrastructure /
- flavonoid /
- key enzyme
-
九龙山榧Torreya jiulongshanensis为红豆杉科Taxaceae榧属Torreya高大乔木，雌雄异株，仅分布于浙江中部和西南部，模式产地为遂昌九龙山，被列为浙江省极小种群保护植物，最近一次被评估为极危(CR)植物[1]。2021年颁布的《国家重点保护野生植物名录》中，其被列为国家Ⅱ级保护植物(
http://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2021-09/09/content_5636409.htm )。目前，九龙山榧的种群数量极少，仅17株，其中模式产地仅1雌2雄共3株，每年结籽量很少，无幼树和幼苗，更新困难，而且生境破坏严重，人为干扰程度大[2-4]。九龙山榧作为榧属的古老孑遗植物，对研究古植物学和古地理学具有重要意义，其对于改良香榧T. grandis ‘Merrillii’品质也可能具有很大的潜在价值[5]。植物的有性生殖发育异常是濒危的主要原因之一，珍稀濒危植物或多或少存在生殖障碍[6-7]。研究发现：云南红豆杉Taxus yunnanensis不仅生殖周期长，且在1个雌配子体上有多个颈卵器，但最终只有1个或者少数几个颈卵器能得到精子，传粉效率低及雌雄性生殖系统发育不同步是造成其濒危的主要原因[8]；香果树Emmenopterys henryi在胚发育过程中存在明显胚后熟现象，致使种子萌发率低，更新困难[9]；羊角槭Acer yangjuechi在雌配子体发育过程中存在严重的生殖障碍，出现胚珠败育、胚囊退化及珠心组织细胞死亡等现象，是其濒危的重要原因[10]；崖柏Thuja sutchuenensis从大、小孢子叶球形成至种子成熟的整个发育过程中均存在败育，而胚珠败育及雌配子体游离核时期至幼胚发育期间的败育是其生殖障碍的主要原因[11]。
自20世纪初以来，国内外学者先后对榧属几种植物生殖生物学开展了研究[12-14]。然而，关于九龙山榧生殖生物学的研究至今未见报道。本研究采用石蜡切片法，对九龙山榧大、小孢子的发生和雌、雄配子体的发育过程进行研究，并与红豆杉科其他植物加以比较，旨在从生殖生物学角度探讨九龙山榧的种子发育及结籽率低下是否与其大、小孢子的发生和雌、雄配子的发育异常有关，以期为九龙山榧保育措施的制定提供生殖生物学依据。
1. 材料和方法
1.1 试验材料
九龙山榧取自模式产地：丽水市遂昌县王村口镇西坑下村(28°20′01″N，118°55′22″E，海拔501 m)。以林缘仅有的1雌株和与雌株相近的1雄株为样株。
1.2 试验方法
2018年6月底至2019年4月初，在小孢子叶球(雄球花)的芽分化到散粉期间，对其外部形态发育过程进行观测、拍照，并记录发育的各个时间段和重要时间节点。2018年6月28日至2019年2月13日，隔3 d采1次；2019年2月中旬至2019年4月初散粉，每天采样。每次取样5个。
2018年11月12日至2019年11月30日，在大孢子叶球(雌球花)的芽分化到种子发育期间，对其外部形态发育过程进行观测、拍照，记录各个发育时间段和重要时间节点。2018年11月12日至2019年4月4日，隔6 d采1次；2019年4月5—30日，每天取样。每次取样5个。
2019年4月5—6日的散粉期间，用毛笔对吐露传粉滴的胚珠进行人工授粉，授粉2 h后进行观察，对仍有传粉滴吐露的胚珠进行补粉，直到该大孢子叶球不再吐露传粉滴。2019年5月1日至2019年11月30日，隔6 d对大孢子叶球进行采样。每次采集3~5个。
采集的大、小孢子叶球浸泡固定于FAA溶液(体积分数为38%甲醛溶液∶冰醋酸∶体积分数为70%乙醇溶液=1∶1∶18，体积比)中，置于4 ℃冰箱中冷藏保存。采用常规石蜡切片法进行制片，切片厚度为5~7 μm[15]，用改良爱氏苏木精染色[16]，中性树胶封片，在Motic BA410E显微镜下观察并拍照。
2. 结果与分析
2.1 大小孢子叶球的生长发育
2.1.1 小孢子叶球的生长发育
2018年6月29日，九龙山榧雄株的多数枝条叶腋处已经可见新生的混合芽，长为2.78~3.96 mm[(2.40±0.11) mm]，宽为1.18~1.58 mm[(1.38±0.14) mm]，混合芽着生于当年生枝条上，偶见于2年生枝条(图1A)。2018年9月22日，幼嫩的小孢子叶球体积明显变大，长为2.24~2.55 mm[(2.40±0.11) mm]，宽为1.18~1.58 mm[(1.36±0.16) mm]，外裹鳞片叶，深绿色，顶端扁而宽；营养芽的体积变化不大，顶端与茎端相似，保持较尖的圆锥形(图1B)。此时，从外观上很容易将小孢子叶球与营养芽区分出来。2018年10月12日，小孢子叶球呈圆锥形(图1C)，外裹绿色鳞片叶，基部着生4枚苞片，2轮鳞片。小孢子叶球单生，长为2.78~3.96 mm[(3.37±0.47) mm]，宽为1.01~1.91 mm[(1.62±0.38) mm]，有一短轴，轴上螺旋状紧密排列着30~40枚小孢子叶，小孢子叶背面常着生4个(稀为3或5个)小孢子囊。2019年2月26日，小孢子叶球中下部变圆，呈浅绿色，芽鳞逐渐张开，露出小孢子囊(图1D)。2019年3月25日，小孢子叶球叶轴伸长，小孢子囊突破苞片、鳞片，逐渐伸到芽鳞外(图1E)，紧密的小孢子叶变得松散，小孢子囊完全暴露在空气中，开裂后花粉散出，此时小孢子叶球成熟(图1F)。成熟的小孢子叶球呈长圆柱形，饱满，小孢子叶逐渐变成黄绿色。
图 1 大、小孢子叶球(雌、雄球花)的发育Figure 1 Development of microstrobilus and macrostrobilus (male and female strobili)2019年4月4日，小孢子囊开始散粉，散粉时间持续4 d，时间较快。散粉前小孢子囊开裂，花粉散出，颜色呈黄色。同一小孢子叶球中，叶轴基部的小孢子囊散粉通常比叶轴上部的早开裂(图1G)。散粉后，小孢子叶球迅速干缩(图1H)。
2.1.2 大孢子叶球的生长发育
2018年11月12日，1年生枝条顶端存在普通芽和生殖芽，外观难以区分(图1I)。此时，生殖芽内部的苞叶叶腋出现珠被原基的隆起(图2A)。此后珠被不断生长，2019年3月25日，珠被生长至珠心上方，包被珠心(图2B)。此时，大孢子叶球2个，成对生于叶腋，外观呈圆锥形，长为0.38~0.49 mm[(0.47±0.12) mm]，宽为0.26~0.29 mm[(0.28±0.09) mm]，两侧微微隆起，外裹绿色鳞片状叶，着生于1年生雌株枝条顶端。每一大孢子叶球的短轴上紧密排列着4枚两两交互对生的苞片和最基部1枚侧生的苞片，具1个直立胚珠。2019年3月28日，在小孢子叶球即将散粉前，大孢子叶球逐渐从外包苞片和鳞片中突破，伸到芽鳞外，胚珠开始暴露在空气中，为接收花粉做准备(图1J)。2019年4月6日，假种皮开始露出(图2C)。此时，大孢子叶球呈圆球形，长为1.48~2.12 mm[(1.86±0.24) mm]，宽为1.07~1.47 mm[(1.37±0.28) mm]。2019年4月4—7日为散粉期，胚珠的珠孔端吐露出传粉滴，授粉后传粉滴消失(图1K)。2019年4月23日，假种皮的长度逐渐生长至珠被1/2处，可见明显的珠孔和珠心上部的溶解腔(图2D)。2019年4月30日，胚珠个体逐渐变大，外层的珠被和假种皮逐渐伸长，但还未完全包裹住胚珠的珠孔(图1L)。2019年6月8—29日，成对的大孢子叶球仅1个发育，发育的假种皮长度逐渐超过珠被，突破鳞片，包裹住胚珠(图1M和图1N)，先端较尖。2019年8月29日，胚珠长度增大，深绿色，胚珠着生的枝条顶端出现新生的小孢子叶球(图1O)。2019年9月22日，大孢子叶球呈卵球形，长为6.18~7.28 mm[(6.85±0.42) mm]，宽为3.15~3.50 mm[(3.32±0.11) mm]，胚珠底部变黄，假种皮先端变红(图1P)。
图 2 大孢子发生和雌配子体发育(含受精作用)Figure 2 Megasporogenesis and female gametophyte development (including fertilization)2.2 小孢子发生与雄配子体发育
2018年8月20日，小孢子叶原基表皮下方的孢原细胞已经分化形成次生造孢细胞。次生造孢细胞紧密相连，呈多边形(图3A)。2018年11月12日，外层的次生壁细胞开始分裂、分化，小孢子囊由外而内最终形成矩形的表皮层，呈椭圆形的小孢子囊内壁，呈不规则散状排列的2层中层细胞，以及最内呈长条形的绒毡层(图3B)。小孢子囊发育类型为基本型。2018年11月15日，造孢细胞分化形成小孢子母细胞，最初的小孢子母细胞由于体积较大、排列紧密，呈多边形，胞质浓厚，细胞核大(图3C)。2019年1月3日，在小孢子母细胞不断形成时期，最外层的表皮细胞经垂周分裂后，垂周壁加厚，径向壁延长，细胞内液泡化，细胞核和核仁逐渐消失，木质化加强，以适应内部小孢子母细胞数目的增加；内壁细胞径向延长，并纤维化加厚；中层细胞被挤压，切向壁延长呈扁平状紧贴内壁；绒毡层细胞在小孢子母细胞时期最初呈长条形单核延长，发育后期细胞个体逐渐变大，细胞质变浓，并以单核或双核形式存在(图3D)。2019年2月2日，排列紧密的小孢子母细胞逐渐从胼胝质中解离，变成游离的小孢子母细胞，形状从多边形变为圆形(图3E)。
图 3 小孢子发生和雄配子体发育(含精子形成)Figure 3 Microsporogenesis and male gametophyte development (including spermatogenesis)2019年2月26日至3月6日为小孢子母细胞减数分裂期。小孢子母细胞经过第1次减数分裂，形成2个子核(图3F)，2个子核之间不形成细胞壁直接进入减数分裂Ⅱ期，再次分裂之后形成四面体形、左右对称形2种类型的四分体(图3G)。小孢子囊壁和中层细胞开始解体，绒毡层细胞多为双核，由绒毡层出现的位置判断绒毡层细胞为周原质团细胞，绒毡层类型为变形绒毡层。小孢子囊内约7%绒毡层出现异常膨大，堆叠在一起(图3H)。2019年3月12日，四分体中的4个小孢子之间开始形成各自的细胞壁(图3I)。2019年3月16日，四分体开始解体，胼胝质壁消失，小孢子的细胞壁逐渐加厚，形成游离小孢子细胞(图3J)，绒毡层部分细胞进入药室内部(图3K)。2019年3月19日为小孢子细胞单核靠边期，表皮细胞木质化加强，内壁继续解体，中层细胞仅留下残迹，绒毡层仍以双核或单核形式存在(图3L)。一些小孢子囊内游离小孢子内液泡化导致细胞变形，约占11%(图3M)。
2019年3月31日，单核靠边的小孢子细胞壁开始逐渐增厚，细胞核经过有丝分裂形成2个核，细胞质也在2个核之间形成细胞板将2个核隔开，其中大的核为管核，小的核为生殖核。此时，成熟花粉粒形成(图3N)。成熟花粉粒的直径为30 μm，双核，表面褶皱成不规则状，无气囊。花粉成熟期时，小孢子囊内壁与中层细胞仅剩残迹，绒毡层消失，表皮细胞完全木质化并且带状加厚(图3O)。2019年4月4—7日，开始散粉时，小孢子囊囊基部囊壁没有加厚的开裂口破裂，从开裂口散出(图3P)。2019年5月30日，在胚珠上方花粉粒萌发成花粉管，伸入珠心组织1/3处，花粉管中可清晰看到管细胞、生殖细胞和不育细胞，生殖细胞比不育细胞稍大(图3Q)。2019年6月24日，花粉管入侵至珠心1/2处，生殖核明显增大，管核与不育核明显变小，且即将消失(图3R)。2019年7月27日，花粉管抵达雌配子体壁，此时管核和不育核已消失，位于花粉管先端的精原细胞已分裂成2个形状相似、大小相同的精细胞。精细胞核大、细胞质浓，形状为椭圆形或圆形(图3S)。2019年11月29日，花粉管伸长至颈卵器上方，精细胞明显增大，细胞质浓厚(图3T)。九龙山榧小孢子及雄配子体发育进程见表1。
表 1 九龙山榧的有性生殖过程Table 1 Process of sexual reproduction in T. jiulongshanensis发育时期(年-月-日) 小孢子和雄配子体发育 大孢子和雌配子体发育 2018-08-20 次生造孢细胞 2018-11-15 小孢子母细胞形成 2019-02-26—2019-03-06 小孢子母细胞减数分裂期 2019-03-12—2019-03-16 四分体时期 2019-03-16 小孢子从四分体中相互分离 2019-03-19 单核靠边期 2019-04-06 散粉与传粉 造孢组织 2019-04-23 减数分裂Ⅱ后期 2019-05-18 功能大孢子 2019-05-30 管细胞、生殖细胞和不育细胞 2019-06-06 游离核时期 2019-06-24 管核与不育核即将消失 2019-07-27 精原细胞分裂形成两个大小相同的精细胞 2019-08-11 细胞化阶段 2019-09-22 颈卵器母细胞 2019-09-22—2019-11-29 颈卵器阶段 2019-11-29 受精 2.3 大孢子发生与雌配子体发育
2019年4月6日，在散粉期，珠心下方与珠被齐平的水平线上出现一团核大、质浓、呈多边形的造孢细胞(图2E)。①大孢子发生时期：2019年4月23日，造孢细胞分化，在近中央位置形成大孢子母细胞，并进行减数分裂Ⅰ，形成大孢子二分体，二分体再进行减数分裂Ⅱ(图2F)，最终形成纵向直列的4个大孢子。2019年5月18日，合点端的大孢子不断发育，最终形成功能性大孢子，近珠孔的3个大孢子逐渐退化(图2G)。②游离核时期：2019年6月6日，合点端的功能大孢子继续进行多次有丝分裂，形成多核的雌配子体，但不形成细胞壁，细胞核呈游离状态，分布在雌配子体的细胞质中(图2H)。游离核之间由染色质丝相连。③细胞化时期：2019年8月11日，当游离核分裂8次，形成256个游离核后，在连接游离核间原生质丝的基础上，开始向心式形成细胞壁，最后整个雌配子体完全细胞化(图2I)。④颈卵器时期：当雌配子体不断发育到一定程度，近珠孔端的一些细胞开始逐渐膨大，形成颈卵器母细胞。2019年9月22日，颈卵器母细胞进行平周和垂周分裂，最终形成4个较小的颈细胞和1个较大的中央细胞(图2J)。刚形成的颈细胞呈圆形，细胞核明显，个体较周围细胞小，中央细胞呈圆形，细胞核较大，周围细胞质浓。中央细胞进行1次不均等分裂，形成卵核和腹沟核，腹沟核很快消失。由于此过程发生较快，因此未捕捉到正在退化的腹沟核。2019年9月30日，初形成的卵核位于颈卵器的近珠孔端，周围有少量细胞质包围，卵核下方有1个大液泡(图2K)。2019年10月13日，卵核开始下沉，往颈卵器的中央开始移动，同时蛋白泡出现(图2L)。2019年11月12日，受精前，成熟的颈卵器中蛋白泡消失，细胞质变浓，卵细胞发育成熟且位于中央，等待受精(图2M)。九龙山榧的颈卵器为椭圆形，多数位于雌配子体的近珠孔端，同一胚珠中有2个颈卵器。颈卵器的周围通常紧密排列着1层套细胞，套细胞的细胞核大、体积较小(图2L~M)。本研究观察到九龙山榧每个胚珠中只产生1个雌配子体，含2个单生型颈卵器，与香榧相同。九龙山榧的大孢子及雌配子体发育进程见表1。
2.4 精卵受精
九龙山榧的受精作用发生于2019年11月29日，从传粉到受精约7个月，在花粉管中产生2个大小相似的精细胞(图3T)，受精前其中一个精细胞进入颈卵器中与卵细胞结合，另一个则停留在花粉管中(图2N)。在精细胞接触卵细胞前，精细胞边缘整齐，细胞核明显，两者接触时，精细胞边缘开始变得模糊，细胞质因变得蓬松而染色较浅(图2O)。在精细胞和卵细胞逐渐融合的过程中，精细胞核区逐渐消失，细胞质相融(图2P)。
3. 讨论
裸子植物小孢子母细胞发育节律主要分为4种类型[17-20]：①小孢子母细胞的减数分裂过程起始于初冬，进入休眠期停止减数分裂，在翌年春季解除休眠后完成后续发育，如侧柏Platycladus orientalis。②翌年春天形成造孢细胞，再分化成小孢子母细胞，小孢子母细胞不经过休眠直接开始进行减数分裂，如穗花杉Amentotaxus argotaenia。③小孢子母细胞于当年年底前已经分化形成，经过翌年春季才开始后续的减数分裂过程，如欧洲赤松Pinus sylvestris。④小孢子母细胞进行减数分裂并形成游离小孢子再越冬，翌年春季继续发育为成熟花粉，红豆杉属Taxus加拿大红豆杉T. canadenesis、短叶红豆杉T. brevifolia、南方红豆杉T. wallichiana var. mairei和云南红豆杉T. yunnanensis等属此类型。九龙山榧与香榧小孢子母细胞的发育方式相同[21]，这种发育方式避免了其减数分裂过程受到寒冷冬季低温影响，降低了减数分裂发生异常的风险。九龙山榧在减数分裂时期部分小孢子囊的绒毡层发生异常增生和膨大现象。陈祖铿等[22]对穗花杉研究发现：绒毡层细胞发生异常膨大在裸子植物发育中为异常现象，其结果会导致小孢子母细胞受到挤压，在减数分裂过程中发生异常，最终引起花粉败育。这也曾在太白红杉Larix chinensis [23]的小孢子发育过程中有过报道。九龙山榧花粉囊中的绒毡层从小孢子母细胞时期一直持续存在到单核靠边期，直到形成成熟花粉粒才完全降解。绒毡层的延迟降解可能会争夺游离小孢子细胞发育所需的营养物质和空间。单核靠边期时，少部分小孢子囊中出现小孢子细胞内液泡化现象，导致一些细胞形状变化、破裂。但由于花粉粒能在雌花胚珠的珠心上方萌发出花粉管，且雄配子体的发育基本正常，说明花粉粒具备正常的生理活性和后期生殖功能，这与本研究对其花粉活力测定的结果一致。由此可见，小孢子的发生和雄配子体的发育均正常。
裸子植物的花粉萌发普遍迟缓且花粉管的生长非常缓慢[24]。穗花杉于5月底开始散粉，7月中下旬形成精子，历时约2个月[25]；短叶红豆杉于4月底萌发花粉管，6月初形成精子，历时1个多月[26]；南方红豆杉2月中下旬散粉，4月中旬体细胞迅速分裂形成2个精子，历时约2个月[20]；香榧于4月下旬散粉，7月中下旬花粉管中体细胞核分裂出2个大小相等的精核，过程近3个月[27]。九龙山榧4月初散粉，4月底花粉才开始萌发出花粉管，7月底雌配子体上方产生2个精原细胞。因此，九龙山榧从传粉到形成精子，整个过程历时近4个月，发育周期均较红豆杉科其他种更长。这可能是雄配子体在花粉管中发育缓慢以等待颈卵器中的卵细胞发育成熟以完成受精[20]。受精延迟现象在裸子植物中普遍存在。白豆杉Pseudotaxus chienii于4月17日传粉，5月下旬陆续发生受精作用，两者相隔1个多月[28]；穗花杉于5月25日至6月15日传粉，7月20—29日受精，两者相隔约2个月[22]；云南红豆杉的受精作用发生于3月底至4月初，传粉与受精相隔约4个月[8]；香榧于4月下旬授粉，9月上旬发生受精作用，从传粉到受精间隔4~5个月[27]。在本研究中，九龙山榧于4月初开始传粉，11月下旬发生受精作用，从传粉到受精需要约7个月，晚于红豆杉科已经报道的大多数植物。
植物有性生殖过程的任何一个环节出现障碍，都会造成生殖失败，种子减少，更新困难从而致濒[29]。九龙山榧小孢子叶球8月中旬开始发生，至2019年7月底才形成精子，历时11个月余；大孢子叶球11月中上旬开始发生，至2019年11月底才进行受精作用，过程历时12个月余，雌雄生殖系统发育的周期均较红豆杉科以往报道的其他种更长。生殖过程历时久、环节多，增加花粉败育、胚珠死亡的概率[8]，且从传粉到受精时间跨度大，加之个体数量极少，仅1雌株2雄株，胚珠发育严重滞后于小孢子叶球的散粉期，可能导致受精率降低甚至受精作用受阻。此外，陈佳妮等[30]发现：香榧结籽高于榧树，在于前者成熟叶片的氮含量和光合能力显著高于后者。九龙山榧为喜光的阳生树种[31]，其结籽率低的原因可能还与雌株树体老化、光合生理特性、外界营养不足等有关。
可见，九龙山榧冗长的生殖周期、复杂的生殖过程和雌性生殖系统发育明显滞后于雄性生殖系统，加之人为干扰强、树体老化、营养不足、个体数量少等均可能造成其结籽率底、自然更新困难，进而致濒。从实际出发，对九龙山榧的保育可以借鉴香榧的培育技术：①由于九龙山榧雌雄异株，小种群中的花粉密度很难达到较高的水平，胚珠传粉滴的吐露容易受不良天气的影响，因此在散粉期收集足够的花粉，将花粉合理优化保存，分期在晴天进行人工授粉以提高授粉率[32]；②加强雌株的科学管理，平衡施肥，追施磷、钾复合肥[33]，浅根多次施肥，繁殖期叶面施淡肥[34]，从而促进胚的发育和提高坐果率。
4. 致谢
材料采集过程中得到浙江遂昌王村口镇西坑下村严东根先生的无私帮助。在此深表谢意！
-
图 3 水分胁迫对三叶青叶片叶绿体超微结构的影响
Figure 3 Effects of water stress on chloroplast ultrastructurey of leaves in T. hemsleyanum
图 4 水分胁迫下三叶青块根黄酮质量分数的变化
Figure 4 Change of content of flavonoid in T. hemsleyanum under water stress
图 5 水分胁迫下三叶青块根PAL活性的变化
Figure 5 Change of activities of PAL in T. hemsleyanum under water stress
图 6 水分胁迫下三叶青块根CHS活性的变化
Figure 6 Change of activities of CHS in T. hemsleyanum under water stress
图 7 水分胁迫下三叶青块根CHI活性的变化
Figure 7 Change of activities of CHI in T. hemsleyanum under water stress
表 1 水分胁迫下黄酮质量分数、PAL、CHS、CHI之间的相关性分析
Table 1. Correlation analysis between flavonoid content, PAL, CHS and CHI under water stress
处理 黄酮 PAL CHS CHI 水涝 黄酮 1 PAL 0.143 1 CHS 0.830* 0.614 1 CHI 0.854* 0.413 0.950** 1 干旱 黄酮 1 PAL 0.256 1 CHS 0.846* 0.699 1 CHI 0.895* 0.625 0.980** 1 对照 黄酮 1 PAL 0.565 1 CHS −0.014 0.464 1 CHI 0.336 0.553 0.920** 1 说明：*表示显著相关(P＜0.05)；**表示极显著相关(P＜ 0.01) 
下载: 导出CSV
-
[1] 邱模昌, 周争道, 杨章坚. 三叶青总黄酮通过MAPK途径诱导乳腺癌细胞凋亡[J]. 中国临床药理学杂志, 2019, 35(23): 3059 − 3063. QIU Mochang, ZHOU Zhengdao, YANG Zhangjian. Total flavonoids from Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg induce apoptosis of breast cancer cells through MAPK pathway [J]. Chin J Clin Pharmacol, 2019, 35(23): 3059 − 3063. [2] 卢爱芳, 祁明君, 李宗亮, 等. 三叶青愈伤组织培养及其总黄酮含量的研究[J]. 中药材, 2010, 33(7): 1042 − 1045. LU Aifang, QI Mingjun, LI Zongliang, et al. Callus cultivation and determination of flavonoids from Tetrastigma hemsleyanum [J]. Chin Med Mater, 2010, 33(7): 1042 − 1045. [3] 马方芳, 张善华, 甘林叶, 等. 遂昌县三叶青产业发展现状与发展对策[J]. 浙江农业科学, 2020, 61(2): 296 − 298. MA Fangfang, ZHANG Shanhua, GAN Linye, et al. Status and countermeasures of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg industry development in Suichang [J]. Zhejiang Agric Sci, 2020, 61(2): 296 − 298. [4] 蹇京蓉. 中药三叶青资源状况及其对策研究[J]. 中国药物经济学, 2012(2): 228 − 230. JIAN Jingrong. Research on the resource status and countermeasures of the traditional chinese medicine Sanyeqing [J]. Chin Pharm Econ, 2012(2): 228 − 230. [5] 倪川, 袁雪艳, 丁卉, 等. 不同栽培模式三叶青叶绿素荧光特征[J]. 江苏农业科学, 2019, 47(14): 161 − 164. NI Chuan, YUAN Xueyan, DING Hui, et al. Effect of different cultivation modes on chlorophyll fluorescence characteristics of Tetrastigma hemsleyanum [J]. Jiangsu Agric Sci, 2019, 47(14): 161 − 164. [6] 张润华, 赵昕刚, 马尔妮. 栓皮槠软木微观构造和化学成分的研究[J]. 林产工业, 2019, 46(1): 48 − 52. ZHANG Runhua, ZHAO Xingang, MA Erni. Study on microstructure and chemical composition of cork from Quercus suber [J]. China For Prod Ind, 2019, 46(1): 48 − 52. [7] 蔡娜, 淡荣, 陈鹏. 水分胁迫对苦荞幼苗黄酮类物质含量的影响[J]. 西北农业学报, 2008, 17(4): 91 − 93. CAI Na, DAN Rong, CHEN Peng. Effects of water stress on flavonoids content of tartary buckwheat seedlings[J]. Acta Agric Boreali-Occident Sin, 2008, 17(4): 91 − 93. [8] 李丹丹, 梁宗锁, 杨宗岐, 等. 外源-5氨基乙酰丙酸对干旱胁迫下紫花苜蓿生理特性及次生代谢物含量的影响[J]. 西北植物学报, 2019, 39(10): 1827 − 1834. LI Dandan, LIANG Zongsuo, YANG Zongqi, et al. Effect of exogenous 5-aminolevulinic acid on physiological characteristics and secondary metabolite contents of Alfalfa seedling under drought stress [J]. Acta Bot Boreali-Occident Sin, 2019, 39(10): 1827 − 1834. [9] 刘晓玲. 不同色系大叶榉类黄酮物质变化规律及对干旱胁迫的响应[D]. 长沙: 中南林业科技大学, 2019. LIU Xiaoling. Changes of Flavonoids in Zelkova schneiana of Different Autumn Leaf Colors and Their Response to Drought Stress[D]. Changsha: Central South University of Forestry and Technology, 2019. [10] 徐庆华, 杨进良, 黄练忠, 等. 次生常绿阔叶林群落冠结构对林下植被的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(6): 1151 − 1157. XU Qinghua, YANG Jinliang, HUANG Lianzhong, et al. Influence of canopy strcture on understory vegetation of secondary evergreen broadleaf forest communities [J]. J Zhejiang A&F Univ, 2019, 36(6): 1151 − 1157. [11] 孙健, 沈晓霞, 陈加红, 等. 药用植物三叶青种质多样性与栽培管理的研究进展[J]. 科技通报, 2018, 34(1): 13 − 17. SUN Jian, SHEN Xiaoxia, CHEN Jiahong, et al. Research progress on the germplasm diversity and cultivation management of the medicinal plant Trifolium repens [J]. Bull Sci Technol, 2018, 34(1): 13 − 17. [12] 钱丽华, 阮松林, 戴丹丽, 等. 温度对三叶青组培苗SOD、MDA等指标的影响[J]. 浙江农业科学, 2010, 51(5): 972 − 974. QIAN Lihua, RUAN Songlin, DAI Danli, et al. The influence of temperature on the SOD, MDA and other indicators of Tetrastigma hemsleyanum tissue culture seedlings [J]. Zhejiang Agric Sci, 2010, 51(5): 972 − 974. [13] 钱丽华, 毛碧增. 光温条件对三叶青愈伤生长及黄酮积累的影响[J]. 浙江农业科学, 2013, 54(9): 1098 − 1100. QIAN Lihua, MAO Bizeng. The effect of light and temperature conditions on the callus growth and flavonoid accumulation of Tetrastigma hemsleyanum [J]. Zhejiang Agric Sci, 2013, 54(9): 1098 − 1100. [14] 徐琳煜, 刘守赞, 白岩, 等. 不同光强处理对三叶青光合特性的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(3): 467 − 475. XU Linyu, LIU Shouzan, BAI Yan, et al. Effects of light intensity treatments on photosynthetic characteristics in Tetrastigma hemsleyanum [J]. J Zhejiang A&F Univ, 2018, 35(3): 467 − 475. [15] 胡晓甜, 刘守赞, 白岩, 等. 遮阴对浙江三叶青生理生化及总黄酮的影响[J]. 广西植物, 2019, 39(7): 925 − 932. HU Xiaotian, LIU Shouzan, BAI Yan, et al. Effects of different shading treatments on physiology, biochemistry and total flavonoids of Tetrastigma hemsleyanum in Zhejiang Province [J]. Guihaia, 2019, 39(7): 925 − 932. [16] 吴志庄, 高贵宾, 欧建德, 等. 生物炭肥对毛竹林下三叶青叶绿素含量、光合与荧光特性的影响[J]. 西北林学院学报, 2017, 32(5): 59 − 63. WU Zhizhuang, GAO Guibin, OU Jiande, et al. Effects of the application of biochar-based fertilizer on chlorophyll contents and photosynthesis & fluorescence characteristics of Tetrastigma hemsleyanum under moso bamboo forest [J]. J Northwest For Univ, 2017, 32(5): 59 − 63. [17] 周武, 张善华. 不同有机肥对药用植物三叶青化感物质的影响[J]. 丽水学院学报, 2017, 39(2): 66 − 71. ZHOU Wu, ZHANG Shanhua. The effect of different organic fertilizers on the secretion of allelochemicals of medicinal plant Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg [J]. J Lishui Univ, 2017, 39(2): 66 − 71. [18] 郑军献, 胡轶娟, 梁卫青, 等. 紫外可见分光光度法测定三叶青中总黄酮的含量[J]. 中国中医药科技, 2009, 16(5): 386 − 387. ZHENG Junxian, HU Yijuan, LIANG Weiqing, et al. Determination of total flavonoids in Sanyeqing by ultraviolet-visible spectrophotometry [J]. China Tradit Chin Med Sci Technol, 2009, 16(5): 386 − 387. [19] 熊科辉, 吴学谦, 许海顺, 等. 不同干燥方法对三叶青活性成分含量的影响[J]. 中国药业, 2015(8): 48 − 50. XIONG Kehui, WU Xueqian, XU Haishun, et al. Influence of different drying methods on contents of active ingredients in Tetrastigma Hemsleyanum [J]. China Pharm, 2015(8): 48 − 50. [20] 徐琳煜. 光质对三叶青生长及黄酮类化合物合成的影响研究[D]. 杭州: 浙江农林大学, 2018. XU Linyu. Effect of Light Quality on the Growth and Synthesis of Flavonoids Synthesis of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg[D]. Hangzhou: Zhejiang A&F University, 2018. [21] 王顺才, 邹养军, 马锋旺. 干旱胁迫对3种苹果属植物叶片解剖结构、微形态特征及叶绿体超微结构的影响[J]. 干旱地区农业研究, 2014, 32(3): 15 − 23. WANG Shuncai, ZOU Yangjun, MA Fengwang. Influence of drought stress on leaf anatomical structure and micro-morphology traits and chloroplast ultrastructure of three Malus species [J]. Agric Res Arid Areas, 2014, 32(3): 15 − 23. [22] 杨凤军, 李天来, 臧忠婧, 等. 等渗NaCl、干旱胁迫对番茄幼苗光合特性及叶绿体超微结构的影响[J]. 应用生态学报, 2017, 28(8): 2588 − 2596. YANG Fengjun, LI Tianlai, ZANG Zhongjing, et al. Effects of isotonic NaCl and drought stress on photosynthetic characteristics and chloroplast ultrastructure of tomato seedlings [J]. Chin J Appl Ecol, 2017, 28(8): 2588 − 2596. [23] 朱素英. 不同条件下三七叶绿体超微结构的比较[J]. 西南农业学报, 2014, 27(6): 2554 − 2558. ZHU Suying. Comparative study on chloroplast ultrastructure of Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen under different conditions [J]. Southwest China J Agric Sci, 2014, 27(6): 2554 − 2558. [24] 李冬林, 金雅琴, 崔梦凡, 等. 夏季遮光对连香树幼苗形态、光合作用及叶肉细胞超微结构的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2020, 37(3): 103 − 112. LI Donglin, JIN Yaqin, CUI Mengfan, et al. Growth, photosynthesis and ultrastructure of mesophyll cells for Cercidiphyllum japonicum seedlings with shading in summer [J]. J Zhejiang A&F Univ, 2020, 37(3): 103 − 112. [25] 鲁守平, 隋新霞, 孙群, 等. 药用植物次生代谢的生物学作用及生态环境因子的影响[J]. 天然产物研究与开发, 2006, 18(6): 1027 − 1032. LU Shouping, SUI Xinxia, SUN Qun, et al. Biological functions of secondary metabolism of medicinal plants and influences of ecological environment [J]. Nat Prod Res Dev, 2006, 18(6): 1027 − 1032. [26] 孟书亦. SA和MeJA对黄芩愈伤组织黄酮类化合物含量及其合成酶的影响[D]. 长春: 吉林农业大学, 2017. MENG Shuyi. The Effect of SA and MeJA on the Content of Flavonoids and Synthase in the Callus of Scutellaria baicalensis Georgi[D]. Changchun: Jilin Agricultural University, 2017. [27] ZHU Zaibiao, LIANG Zongsuo, HAN Ruilian. Saikosaponin accumulation and antioxidative protection in drought-stressed Bupleurum chinense DC. plants [J]. Environ Exp Bot, 2009, 66(2): 326 − 333. [28] JANAS K M, CVIKROVÁ M, PAŁAGIEWICZ A, et al. Constitutive elevated accumulation of phenylpropanoids in soybean roots at low temperature [J]. Plant Sci, 2002, 163(2): 369 − 373. [29] LI Baozhu, FAN Ruonan, GUO Siyi, et al. The Arabidopsis MYB transcription factor, MYB111 modulates salt responses by regulating flavonoid biosynthesis[J]. Environ Exp Bot, 2019, 166(10): 103807. doi: 10.1016/j.envexpbot.2019.103807. [30] ALI Q, ALI S, LQBAL N, et al. Alpha-tocopherol fertigation confers growth physio-biochemical and qualitative yield enhancement in field grown water deficit wheat (Triticum aestivum L.)[J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 12924. doi: 10.1038/s41598-019-49481-7. [31] BAYAT H, MOGHADAM A N. Drought effects on growth, water status, proline content and antioxidant system in three Salvia nemorosa L. cultivars [J]. Acta Physiol Plant, 2019, 41(9): 149 − 156. [32] ZHOU Y J, CHE Q M, XU S X, et al. Metabolites of baicalein in human urine [J]. Die Pharm, 2000, 55(8): 626 − 627. [33] YUN Y B, JUNG H G, RAHIM M A, et al. Molecular analysis of genes related to phenylpropanoid and ascorbate biosynthesis in salt and UV-B treated pak choi grown under LEDs [J]. Botany, 2019, 97(9): 513 − 519. [34] 郭肖, 孔德章, 曹玉洪, 等. 不同产地水芹黄酮含量及PAL酶活性的差异研究[J]. 长江蔬菜, 2014(2): 32 − 34. GUO Xiao, KONG Dezhang, CAO Yuhong, et al. Difference about flavonoid content and PAL activity of water dropwort from different areas [J]. Yangtze River Veg, 2014(2): 32 − 34. [35] LI F, JIN Z, QU W, et al. Cloning of a cDNA encoding the Saussurea medusa chalcone isomerase and its expression in transgenic tobacco [J]. Plant Physiol Biochem, 2006, 44(7/9): 455 − 461. [36] 汪贵斌, 郭旭琴, 常丽, 等. 温度和土壤水分对银杏叶黄酮类化合物积累的影响[J]. 应用生态学报, 2013, 24(11): 3077 − 3083. WANG Guibin, GUO Xuqin, CHANG Li, et al. Effects of air temperature and soil moisture on flavonoids accumulation in Ginkgo biloba leaves [J]. Chin J Appl Ecol, 2013, 24(11): 3077 − 3083. 期刊类型引用(1)
1. 马长乐，杨建欣，桂晴，龚买玉，周龙飞，刘佳. 榧树属植物资源研究进展. 经济林研究. 2024(04): 1-13 . 
百度学术其他类型引用(1)
-
-
链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200358
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 1119
- HTML全文浏览量: 309
- PDF下载量: 39
- 被引次数: 2
