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三叶青Tetrastigma hemsleyanum为葡萄科Vitaceae崖爬藤属Tetrastigma植物，学名为三叶崖爬藤，是中国特有药材，也是新“浙八味”之一[1]。三叶青全株均可药用，具有清热解毒、消肿止痛、祛风化痰等功效，常用于治疗发烧、小儿热惊厥、哮喘、肝炎、风湿等疾病[2]，还可用于饲料绿色添加剂，改善动物健康，预防疾病[3]，被称为“植物抗生素”[4]。研究表明：三叶青的主要化学成分为黄酮类物质，如二氢黄酮、黄酮和黄酮醇，包括柚皮素、芦丁、山奈酚、异槲皮素和原花青素等[5]。这些成分具有良好的药理活性，是三叶青药材品质的物质基础。
黄酮类成分作为药用植物的次生代谢产物，生物合成过程受到诸多转录因子的调控，如MYB、bHLH、WRKY等。有研究发现：参与调控黄酮生物合成途径的MYB转录因子多为R2R3-MYB的第4、5、6、7亚家族成员[6]。其中，第4亚家族的R2R3-MYB转录因子是公认的苯丙烷途径及木质素生物合成途径的转录抑制因子，如蓝莓Vaccinium corymbosum中的VcMYB4a作为R2R3-MYB第4亚家族的转录因子，抑制蓝莓木质素的生物合成，起到负调控作用[7]。第5亚家族或第6亚家族的R2R3-MYB基因成员作为MYB-bHLH-WDR (MBW)转录复合物的一个组成部分，参与花青素或原花青素的合成[8]，如胡萝卜Daucus carota中的DcMYB6可诱导花青素的生物合成[9]；拟南芥Arabidopsis thaliana中第5亚家族的AtMYB123/TT2可以与TT8和TTG1蛋白形成复合物，激活DFR、ANS和ANR基因表达，共同促进种皮中原花青素的合成[10]；葡萄Vitis vinifera中的转录因子VvMYBPA1、VvMYBPA2和VvMYB5a等均参与原花青素调控[11]。第7亚家族的R2R3-MYB因子则一般具有调控黄酮醇的功能[12]，如拟南芥中的AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111转录因子被归类为第7亚家族，通过调节AtFLS1基因表达冗余调节黄酮醇的生物合成[13]。
BAI等[14]研究发现：三叶青地上和地下部分的品质有所差异，特别是黄酮类成分含量有明显变化。但关于三叶青地上和地下部分黄酮类成分差异的形成机制却鲜有报道。因此，本研究通过对前期转录组分析发现的MYBPAR基因进行克隆，从ThMYBPAR的基因结构、蛋白定位、系统发育关系、表达量等方面，探究ThMYBPAR基因对三叶青块根和叶片中黄酮类成分的合成调控作用，以期为三叶青药材品质调控提供科学依据。
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在浙江省丽水市遂昌县种植基地，选取生长健壮、无病虫害、苗高大小近似的近3年生三叶青苗，种植于浙江省中药资源保护与创新重点实验室试验基地(30°15′30.39″N，119°43′26.92″E)。于2024年5月取三叶青块根及叶片放入密封袋，立即液氮冷冻并放置在超低温冰箱保存(−80 ℃)备用。
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总黄酮的测定选用芦丁作为标准品。分别称取三叶青块根及叶片样品各0.1 g，置于锥形瓶中，加入体积分数为70%的甲醇3.0 mL，在60 ℃水温超声30 min，离心10 min取上清，即为供试样品溶液。吸取三叶青块根及叶片供试样品溶液1.0 mL于10.0 mL量瓶中，用体积分数为70%的甲醇定容至刻度，分别吸取2.0 mL于10.0 mL试管中，加质量分数为5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，振荡摇匀，黑暗放置6 min，加质量分数为10%的硝酸铝0.3 mL，振荡摇匀，黑暗放置6 min，再加质量分数为4%的氢氧化钠4.0 mL，振荡摇匀，用体积分数为70%的甲醇定容至刻度，振荡摇匀，黑暗放置15 min后置比色皿中，测定波长510 nm处的吸光度。以体积分数为70%的甲醇溶液作为空白对照。
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提取方法同1.2.1。采用香草醛-盐酸法测定提取液中的原花青素含量。将4.0 g香兰素溶于100.0 mL甲醇中，得质量分数为4%的香草醛-甲醇溶液。取1.0 mL三叶青块根及叶片样品于试管中，加入质量分数为4%的香草醛-甲醇溶液，混合后再加入1.5 mL浓盐酸，立即摇匀。室温避光30 min，测定波长500 nm处的吸光度，以质量分数为4%的香草醛-甲醇溶液作为空白对照。
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称取3.785 g过硫酸钾于100 mL容量瓶中，加水超声溶解后定容，配制成140 mmol·L−1的过硫酸钾溶液；称取0.384 g ABTS于100 mL棕色容量瓶中，加水定容，配制成7 mmol·L−1的ABTS溶液。量取88 μL过硫酸钾与5 mL的ABTS混合，摇匀避光12 h。12 h后用无水乙醇稀释，使其在波长734 nm处的吸光度为0.7±0.2。在96孔板中加入100 μL反应液和100 μL三叶青块根及叶片样品，室温避光震荡反应6 min后，测量734 nm处的吸光度，以抗坏血酸作为阳性对照，将测量值代入，计算ABTS自由基清除率(A)：A＝(1−Ai/A0)×100%。其中：A0为混合液的吸光度，Ai为样品i的吸光度。
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取三叶青的块根、叶片，分别在液氮中研磨后，用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit提取总RNA，经凝胶电泳和超微量核酸分析仪检测，获得高质量的RNA，用于后续研究。
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使用PrimeScript™ Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA反转录成cDNA。根据转录组数据库中MYBPAR基因的CDS序列，设计基因克隆引物(表1)，根据PrimeSTAR® Max DNA Polymerase使用说明书对ThMYBPAR基因进行PCR扩增。经电泳检测后，目的片段被纯化回收，经载体连接及大肠埃希菌Escherichia coli DH5α转化测序后获得阳性单菌落，并在−80 ℃条件下保存。
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
引物名称 序列(5′→3′) ThMYBPAR-F ATGGGGAGAAGCCCTTGTTGT ThMYBPAR-R TTATTCTCCAAACCAGTCACCGC MDH-F TGTTGCTACGACTGATGT MDH-R CCTGAGACTTGTAGATGGAA qThMYBPAR-F GCTGGCCGGAGCAAGAACAA qThMYBPAR-R GTGGTGTTTCCGTCGGTCGT qThLAR-F CGACAGCCGACGCTGGTATT qThLAR-R TCAAGCGCAGGTTGCAGTGA ThMYBPAR-GFP-F gctcggtacccggggatccATGGGGAGAAGCCCTTGTTGT ThMYBPAR-GFP-R gcccttgctcaccatgtcgacTTATTCTCCAAACCAGTCACCGC -
根据植物表达载体pCAMBIA
1300 -GFP及ThMYBPAR基因序列，设计含有限制性酶切位点的引物(表1)，PCR扩增得到的产物经纯化回收后与GFP表达载体连接，转化农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pSoup)，注射接种本氏烟草Nicotiana benthamiana的幼嫩叶片，2 d后用激光共聚焦显微镜观察荧光信号。 -
使用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒对样品的RNA进行反转录，设计荧光定量PCR引物(表1)，后用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行荧光定量PCR试验。基因的相对表达量用2−ΔΔCt方法表示。
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采用Excel整理数据，通过SPSS进行Pearson相关性分析，显著性水平为0.05。每个实验重复3次。
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从图1A和图1B可见：三叶青块根及叶片中的总黄酮质量浓度分别为0.55和0.05 g·L−1，原花青素质量浓度分别为1.77和0.13 g·L−1，三叶青块根中总黄酮的质量浓度是叶片的11倍，块根中原花青素的质量浓度是叶片中的13倍。可以看出三叶青块根中的总黄酮和原花青素质量浓度均显著高于叶片(P＜0.05)。
图 1 三叶青块根及叶片中的总黄酮质量浓度、原花青素质量浓度和ABTS自由基清除率
Figure 1. Contents of total flavonoids and proanthocyanidins, ABTS free radical scavenging rate in root and leaf of T. hemsleyanum
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由图1C可以看出：三叶青块根及叶片对ABTS均具备清除能力，且块根的清除能力高于叶片，块根的ABTS自由基清除率高达90%。
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本研究发现了1个属于R2R3-MYB第5亚家族的MYB转录因子，命名为ThMYBPAR。ThMYBPAR基因的序列长度为888 bp，预测编码产生310个氨基酸组成的蛋白。将ThMYBPAR蛋白与美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中收录的VvMYBPAR、VvMYBPA1、VvMMYBPA2和AtTT2进行序列比对(图2)，结果发现ThMYBPAR具有典型的R2和R3 DNA结合功能结构域，说明ThMYBPAR为R2R3-MYB家族。且本研究进一步分析了ThMYBPAR与数据库中的VvMYBPAR、VvMYBPA1、VvMMYBPA2和AtTT2序列上的差异。从系统进化分析结果(图3)可以明显看出：ThMYBPAR可以与VvMYBPAR、CsMYB5e、CsMYB5b等R2R3-MYB第5亚家族的成员聚为一类，且ThMYBPAR与VvMYBPAR更相近。
图 2 ThMYBPAR蛋白序列比对
Figure 2. Sequence alignment of ThMYBPAR proteins
图 3 ThMYBPAR蛋白系统进化分析
Figure 3. Phylogenetic analysis of ThMYBPAR proteins
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蛋白质在细胞中的定位一定程度上能够反映其潜在的功能，为了探究ThMYBPAR编码蛋白在细胞中的定位，构建基因ThMYBPAR与GFP融合表达载体，与植物细胞核定位Marker在烟草叶片中共定位。如图4所示：ThMYBPAR蛋白的荧光信号仅出现在烟草的细胞核中，呈现出明显的绿色荧光信号，与植物细胞核定位Marker定位一致，说明ThMYBPAR属于核定位。
图 4 ThMYBPAR蛋白的亚细胞定位
Figure 4. Subcellular localization of ThMYBPAR
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对ThMYBPAR及ThLAR基因进行RT-qPCR验证(图5)显示：块根中ThMYBPAR及ThLAR表达量显著高于叶片(P＜0.05)。其中三叶青块根中ThLAR的表达量是叶片中的4倍，而块根中ThMYBPAR的表达量是叶片的20倍。
图 5 三叶青块根和叶片的基因相对表达量
Figure 5. Relative expression levels of genes in root and leaf
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由表2可知：三叶青中总黄酮与原花青素呈极显著正相关(P＜0.01)，与ThMYBPAR、ThLAR基因表达量也均呈极显著正相关(P＜0.01)；原花青素与ThMYBPAR、ThLAR基因表达量也呈极显著正相关(P＜0.01)。
表 2 三叶青活性成分与基因表达量之间的相关性
Table 2. Correlation between active ingredients and gene expression of T. hemsleyanum
活动成分 总黄酮 原花青素 ThMYBPAR ThLAR 总黄酮 1.000 原花青素 1.000** 1.000 ThMYBPAR 0.983** 0.983** 1.000 ThLAR 0.989** 0.989** 0.994** 1.000 说明：**表示极显著相关(P＜0.01)。 -
MYB转录因子是一类DNA结合蛋白，由高度保守的MYB结构域构成，每个结构域由一系列高度保守的氨基酸序列及间隔序列拼接而成。这些氨基酸可以使MYB蛋白折叠成螺旋—螺旋—转角—螺旋(HHTH)结构[15]。作为植物中最大的转录因子家族，MYB结构域由1~4个重复序列构成。根据MYB结构域的数量和位置，可以分为4类：1R(R1/2，R3-MYB)、2R(R2R3-MYB)、3R(R1R2R3-MYB)和4R(R1R2R2R1/2MYB)[16]。其中与类黄酮代谢相关的MYB通常为R2R3-MYB，并且在原花青素合成调控模式中起着重要作用[17]。本研究从三叶青中克隆得到1个MYBPAR基因，从基因编码的氨基酸序列结构上来看，ThMYBPAR的N端具有高度保守的R2R3结构域，并对其进行生物信息学分析，得出ThMYBPAR蛋白序列具有2个典型的MYB转录因子结构域，表明ThMYBPAR属于R2R3-MYB转录因子，且在三叶青块根中的表达量高于叶片。
系统进化树分析显示：ThMYBPAR、AtTT2、VvMYBPA1和VvMYBPA2等参与原花青素调控的转录因子共聚到SG5-MYB亚组，因此推测ThMYBPAR基因可能也参与原花青素的生物合成。花青素还原酶(ANR)及无色花青素还原酶(LAR)是原花青素单体生物合成过程中2个关键限速酶，对原花青素的生物合成及积累具有重要作用[18]。有研究发现：葡萄VvLAR基因还可通过时空特异性表达影响原花青素的种类和积累[19]；如VvMYBPAR通过激活原花青素(PA)特异性分支基因，以及与PA单体前体修饰和运输相关的候选基因的启动子，参与调控原花青素的合成途径[20]；VvMYBPA1、ANR和LAR基因的高表达促进了葡萄中原花青素的合成[21−22]。因此，推测三叶青块根中ThLAR与ThMYBPAR的高表达，可能促进三叶青中原花青素的合成，从而导致三叶青块根中的原花青素质量浓度显著高于叶片。
三叶青具有广阔的药用价值和经济价值，而原花青素作为植物重要的次生代谢产物之一，不仅是植物应对生物和非生物胁迫的一种重要防御手段，还能影响植物发育和品质。虽然原花青素生物合成途径在模式植物中已有研究，但在三叶青中的调控机制研究相对较少。基于以上研究结果，可以进一步探究三叶青中黄酮类物质的生物合成途径及其调控机制，为药用植物资源的利用和品质调控提供新的思路和方法。
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本研究从三叶青中克隆了1个ThMYBPAR基因，基因的序列长度为888 bp，编码310个氨基酸，ThMYBAPR属于R2R3-MYB转录因子家族，定位于细胞核，与葡萄、拟南芥等R2R3-MYB转录因子有较高的同源性。系统进化分析表明：ThMYBPAR转录因子与葡萄中的VvMYBPAR、拟南芥中的AtTT2等参与调控原花青素的转录因子聚为一类，且与原花青素调控相关的基因ThLAR在三叶青块根中显著上调，ThMYBPAR与ThLAR呈显著正相关。因此推测ThMYBPAR转录因子参与了三叶青中原花青素的合成，且主要通过ThLAR来调控。
Cloning and analysis of tissue-specific expression patterns of ThMYBPAR gene in Tetrastigma hemsleyanum
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摘要:
目的 黄酮类成分是三叶青Tetrastigma hemsleyanum药材品质的物质基础，探究ThMYBPAR基因对三叶青块根和叶片中黄酮类成分的合成调控作用，可为三叶青药材品质形成的分子机制提供理论依据。 方法 以近3年生的三叶青块根及叶片为材料，测定总黄酮和原花青素的质量浓度以及抗氧化能力，设计引物克隆ThMYBPAR基因，利用生物信息学分析ThMYBPAR蛋白的序列特征和系统进化关系，通过激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位，采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析ThMYBPAR基因在三叶青块根和叶片中的表达模式，并分析ThMYBPAR基因表达水平与黄酮类成分的相关性。 结果 三叶青块根中总黄酮及原花青素质量浓度分别是0.55和1.77 g·L−1，显著高于叶片(P＜0.05)，而且块根提取物的ABTS自由基清除率高达90%，说明三叶青块根和叶片间的药材品质存在差异。根据前期转录组数据克隆得到1个长度为888 bp的ThMYBPAR基因，可编码产生310个氨基酸组成的蛋白，与葡萄Vitis vinifera基因中的VvMYBPAR基因高度相似，具有典型的R2和R3 DNA结合功能结构域。系统进化分析结果表明：三叶青中的ThMYBPAR属于R2R3-MYB第5亚家族转录因子，且主要定位在细胞核中。RT-qPCR分析结果显示：ThMYBPAR基因主要在三叶青块根中表达，且表达量与总黄酮和原花青素质量浓度呈极显著正相关(P＜0.01)。 结论 ThMYBPAR基因参与调控三叶青中原花青素的合成机制，推测不同表达水平可能是影响三叶青块根和叶片品质的主要原因。图5表2参22 -
关键词:
- 三叶青 /
- 基因克隆 /
- ThMYBPAR基因 /
- 原花青素
Abstract:Objective Flavonoids are essential components that determine the quality of Tetrastigma hemsleyanum. This study aims to investigate the regulatory role of the ThMYBPAR gene in flavonoid biosynthesis in both the tuberous root and leaves of T. hemsleyanum, thereby providing a theoretical foundation for understanding the molecular mechanisms underlying quality formation in this plant species. Method The tuberous root and leaves of 3-year-old T. hemsleyanum plants were analyzed by determining their content of proanthocyanidins, total flavonoids, and antioxidant capacity. Primers were designed for the cloning of the ThMYBPAR gene. The sequence characteristics and evolutionary relationships of the ThMYBPAR protein were assessed through bioinformatics analysis. Additionally, the expression patterns of the ThMYBPAR gene in both tuberous root and leaves were examined using real time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR), alongside an investigation into the correlation between ThMYBPAR gene expression levels and flavonoid content. Result The content of total flavonoids and proanthocyanidins in the tuberous root were 0.55 and 1.77 g·L−1 respectively, which were significantly higher than those in the leaves (P＜0.05). Moreover, the ABTS free radical scavenging rate of the tuberous root extract reached 90%, indicating notable differences in the quality of herbal material between the tuberous root and leaf samples. Previous transcriptomic analyses had demonstrated that the ThMYBPAR gene, which consisted of 888 bp and encoded a protein comprising 310 amino acids, showed a significant degree of similarity to the VvMYBPAR gene found in grapevines (Vitis vinifera). The protein contained distinctive DNA-binding functional domains, R2 and R3, and was classified within the R2R3-MYB transcription factor subfamily 5, with a preferential localization in the nucleus. RT-qPCR analysis revealed that the expression of the ThMYBPAR gene was primarily detected in the tubers of T. hemsleyanum, exhibiting a positive correlation with the content of total flavonoids and proanthocyanidins (P＜ 0.01). Conclusion The ThMYBPAR gene plays a crucial role in the regulation of proanthocyanidin synthesis in T. hemsleyanum. The differential expression levels of ThMYBPAR in the tuberous root and leaves may account for the observed variations in quality between these two plant parts. [Ch, 5 fig. 2 tab. 22 ref.] -
Key words:
- Tetrastigma hemsleyanum /
- gene clone /
- ThMYBPAR gene /
- proanthocyanidins
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近年来，人类对土地和矿物资源的过度开发利用以及对农药和化肥的不合理使用，破坏了原生态土壤[1-2]，引起了土壤质量严重下降，甚至导致了土壤污染，其中重金属是土壤污染的主要来源之一[3]。农田中土壤重金属具有潜伏性强、难去除、毒害性高等特点，不仅可以通过积累影响土壤和农产品质量，阻碍植物生长，还可以通过食物链被人体吸收，威胁人体健康[1, 4]。果园土壤作为生产果品的载体，其中有毒有害重金属不仅会对树体生长和果实产量产生影响，而且会影响果品质量安全并带来生态风险。
麦尔哈巴·图尔贡等[5]研究发现：镉是吐鲁番盆地葡萄Vitis vinifera种植园土壤中污染水平及生态风险级别最高的重金属，而且受不合理施肥影响最大。王敏等[6]研究认为：早期铜矿开采以及长期过度施肥，特别是磷肥和有机肥的过度施用是香榧Torreya grandis‘Merrillii’多种重金属超标的重要原因。潜在生态风险评价表明：浙江省会稽山脉附近的香榧集中种植区土壤整体处于轻度危害状态，其中以镉的潜在风险最大[6]。ZINICOVSCAIA等[7]研究摩尔多瓦苹果Malus pumila种植园土壤中37种元素的富集情况，并通过计算富集因子、污染因子、地累积指数和污染负荷指数等评价重金属元素对土壤污染的生态风险，发现矿区土壤中的砷等处于严重超标状态，而且具有较高的潜在生态风险等级。DONG等[8]对白水县苹果种植园土壤中8种重金属元素进行测定，并采用单因素污染指数、内梅罗综合指数和潜在生态风险指数等方法评价土壤重金属存在的潜在风险，发现随着经营年限的增加，苹果园土壤中镍、铜、砷和汞的含量逐渐升高，表明人工干预促进了土壤重金属的积累，存在严重的生态风险性。YAN等[9]以重庆市黔江地区5个猕猴桃Actinidia chinensis品种为研究对象，测定了土壤和果实中8中重金属元素的含量，结果发现：猕猴桃种植园重金属从岩石向土壤，从土壤向果实迁移显著，其中锌和铬是果实中超标较严重的元素，存在中等潜在生态风险。由此可知：果园土壤重金属污染来源多样，危害极大，不仅是人类目前面临的重要环境问题之一，而且对食品安全具有极大威胁[10]。
柿Diospyros kaki适应性强，分布范围广，为中国重要的传统木本粮食树种，也是国家目前重点支持的特色经济林树种之一[11]。河南省柿栽培历史悠久，是中国柿主产区之一，柿产量长期位居中国前3位。位于太行山区的济源市、安阳市和三门峡市是河南省柿的主产区，占据该省总产量的72.0%，已成为当地农村经济发展和农民增收的支柱之一。但果农在生产中，为了追求产量，过度使用化肥和农药，引起土壤质量明显退化。另外，济源市、安阳市和三门峡市均为重要的矿产区，农业生产和矿产开采提高了土壤重金属污染风险，对柿产品带来潜在安全隐患和生态安全风险[12]。为探讨河南省柿主产区土壤重金属污染情况及生态风险，本研究调查了河南省柿主产区代表性果园土壤样品，测定其中砷、镉、铬、铜、铅和汞等6种重金属元素的质量分数；采用污染负荷指数、潜在生态风险指数和生态风险预警指数法，对柿园土壤重金属来源及潜在生态风险进行评估，以期为河南省柿主产区土壤环境安全评价和重金属污染防治提供科学依据，为其他柿产区土壤重金属研究提供参考。
1. 材料和方法
1.1 研究区域概况
研究区域属于豫西北的太行低山丘陵地区(33°31′~36°21′N，110°21′~114°59′E)，平均海拔为705.0 m。该区气候属暖温带季风性大陆气候，光热资源较丰富，年平均气温为14.1 ℃，年平均日照时数为2 370.0 h，年平均降水量为600 mm，年平均蒸发量为1700 mm，无霜期为200 d，年辐射总量为518 kJ·cm−2。山体以沉积岩为主，土壤以褐土为主，pH 7.0~8.5。
1.2 样品采集与检测
2020年11月柿果采收后，在济源、安阳和三门峡等3个河南省柿主产区，选取正常经营、果树病虫害较轻、果品质量上乘的果园90个(每个产区30个)。在每个果园中间位置设置1个25 m×25 m的样地，并在样地内按照“对角线五点采样法”采集200 g土样，采样深度为0~20 cm。将采集的样品装入清洁自封袋，记录采样点的立地条件、土壤情况、农户施药和施肥管理情况等[13]。
土样在室内常温下风干，拣出杂物，磨碎并充分混合，过100目尼龙筛后用于检测土壤样品中的砷、汞、镉、铬、铜与铅的质量分数及土壤pH[14]。测试过程中加入国家标准土壤参比物质(GSS-12)进行质量控制，各重金属的回收率均在国家标准参比物质的允许范围内[1]。各个参数以每个果园5个点的平均值代表该果园的表征值。
1.3 土壤重金属污染及生态风险评价方法
以河南省太行山果树种植园土壤重金属的背景值(重金属砷、汞、铅、镉、铬、铜的背景值分别为7.79、0.049、19.60、0.374、63.80、19.70 mg·kg−1，以下简称“背景值”)为评价依据[15]，采用单因子污染指数(contamination factor，CF)和污染负荷指数(pollution load index，IPL)对柿园土壤重金属进行污染评价[16]。以GB 15618—2018《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准(试行)》中的国家农用地土壤污染风险筛选值[重金属砷、汞、铅、镉、铬、铜污染风险筛选值(pH＞7.5)分别为25.00、3.400、170.00、0.600、250.00、100.00 mg·kg−1，简称“筛选值”]为评价依据[14]，采用综合潜在生态风险指数(potential ecological risk index，IR)评价土壤重金属污染的潜在生态风险，并采用生态风险预警指数(ecological risk warning index，IER)对土壤生态风险进行预警评估[1, 3, 13]，其中砷、汞、铅、镉、铬、铜的毒性系数分别为10.0、40.0、5.0、30.0、2.0和5.0，潜在生态风险指数分级标准[17]见表1。
表 1 土壤重金属污染评价指标及其分级标准Table 1 Evaluation indexes and grading standards of soil heavy metal pollutionCF IPL 污染等级 E IR 风险等级 IER 预警等级 (0, 1] (0, 1] 无 (0, 40] (0, 150] 轻微 (−∞, 0] 无需 (1, 2] (1, 2] 轻度 (40, 80] (150, 300] 中等 (0, 1] 预警 (2, 3] (2, 3] 中度 (80, 160] (300, 600] 较强 (1, 3] 轻度 (3, +∞) (3, +∞) 重度 (160, 320] (600, 1200] 很强 (3, 5] 中度 (320, +∞) (1200, +∞) 极强 (5, +∞) 重度 说明：CF为单因子污染指数；IPL为污染负荷指数；E为各重金属单项潜在生态风险指数；IR综合潜在生态风险指数；IER为生态风险 预警指数 1.4 数据处理
采用Excel 2019对数据进行初步整理和计算，采用SPSS 20.0进行数据统计分析和K-S正态分布检验，属于正态分布的数据用Pearson相关性分析，非正态分布的用Spearman进行相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 河南省柿主产区土壤重金属质量分数特征
由表2可知：砷和汞质量分数在安阳产区土壤中最高，分别为13.84和0.105 mg·kg−1，三门峡产区土壤中砷质量分数仅为2.34 mg·kg−1；铅和镉质量分数在济源产区土壤中最高，分别为54.80和0.492 mg·kg−1；铬和铜质量分数在三门峡产区土壤中最高，分别为53.10和38.01 mg·kg−1，分别是济源产区的1.36和1.30倍。这说明6种重金属在河南省3个柿主产区土壤中的积累特征不同。与背景值相比，砷仅在三门峡产区低于背景值，汞在3个主产区均高于背景值，且汞在整个主产区高达背景值的2.00倍；铅在三门峡和济源产区是背景值的2.00~3.00倍；镉仅在济源产区超过背景值，而铜在3个主产区均高于背景值，其中在三门峡产区最高，为背景值的2.00倍。6种重金属质量分数平均值在3个主产区均低于筛选值，但砷在安阳产区，铅和镉在济源和三门峡产区以及铬和铜在安阳和三门峡产区均存在某些柿园大于筛选值，处于污染状态，其中镉在济源产区甚至高达筛选值的3.07倍。这说明不同重金属在3个产区的积累程度不同。方差分析表明：砷、铅、镉和铬在3个主产区的F值分别为59.70、6.60、8.50、5.85，说明它们的积累程度均达极显著差异(P＜0.01)。
表 2 河南柿主产区土壤重金属质量分数统计Table 2 Statistics of the heavy metals in soils from the main D. kaki producing area in Henan Province产区 参数 质量分数/(mg·kg−1) 产区 参数 质量分数/(mg·kg−1) 砷 汞 铅 镉 铬 铜 砷 汞 铅 镉 铬 铜 安阳产区 均值 13.84 0.105 16.87 0.167 46.34 29.79 济源产区 均值 13.33 0.092 54.80 0.492 39.15 29.24 标准差 6.70 0.072 5.57 0.076 24.33 19.70 标准差 3.67 0.087 55.75 0.516 8.25 10.64 极小值 1.55 0.020 5.34 0.000 17.09 2.56 极小值 2.97 0.015 7.04 0.048 14.82 6.10 极大值 25.12 0.373 25.45 0.335 93.87 111.04 极大值 21.36 0.399 276.45 1.839 51.07 53.14 三门峡产区 均值 2.34 0.099 37.74 0.277 53.10 38.01 整个主产区 均值 9.84 0.099 36.47 0.312 46.20 32.35 标准差 2.30 0.097 42.18 0.131 9.38 19.72 标准差 7.01 0.085 42.97 0.336 16.63 17.50 极小值 1.22 0.032 9.64 0.081 35.29 18.71 极小值 1.22 0.015 5.34 0.000 14.82 2.56 极大值 14.12 0.543 204.00 0.847 87.12 128.90 极大值 25.12 0.543 276.45 1.839 93.87 128.90 2.2 河南省柿主产区土壤重金属质量分数的变异系数及频率分布
土壤重金属质量分数变异分为小(0~0.15)、中(0.16~0.35)和高(＞0.36)等3类[18-19]。由表3可知：6种重金属在河南省杮主产区的变异均达到高度等级，仅砷在济源、铅在安阳、铬在济源和三门峡产区为中等变异。这说明6种重金属元素在河南省柿主产区的空间变异程度较高，分布存在一定的随机性。依据Grubbs准则剔除90个果园土壤重金属数据异常值[3]，然后绘制河南省柿主产区土壤6种重金属质量分数的频次分布图(图1)。砷和铬的偏度和峰度均在[−1, 1]附近，且中位数都较接近均值(表3)，铬总体符合的近正态分布，砷存在一定的偏正态分布。汞、铅、镉和铜的中位值都小于均值，且偏度分别为2.72、3.32、2.60和2.95，说明样本的铅、镉质量分数左偏，为右尾分布，表明多数柿园土壤的铅、镉质量分数较低，也印证了河南省柿主产区重金属空间分布变异较大的特征。
图 1 河南省柿主产区土壤重金属质量分数分布频次Figure 1 Frequency distribution of the heavy metals in soils from the main producing area of D. kaki of Henan Province表 3 河南省柿主产区土壤重金属变异系数和分布频次Table 3 Coefficients of variation and frequency distribution of the heavy metals in soils from the main producing area of D. kaki of Henan Province参数 产区 砷 汞 铅 镉 铬 铜 变异系数 安阳产区 0.48 0.69 0.33 0.45 0.53 0.66 济源产区 0.28 0.94 1.02 1.05 0.21 0.36 三门峡产区 0.98 0.98 1.12 0.47 0.18 0.52 整个主产区 0.71 0.86 1.18 1.08 0.36 0.54 中位数 整个主产区 11.41 0.08 22.42 0.21 44.72 29.47 偏度 整个主产区 0.25 2.72 3.32 2.60 0.77 2.95 峰度 整个主产区 −0.98 9.79 12.94 6.74 1.23 13.60 2.3 河南省柿主产区土壤重金属来源分析
相关性分析法可以用来解析土壤中重金属来源[3]。对河南省柿主产区土壤重金属质量分数的Pearson相关分析(表4)表明：铅与汞、镉、铜，以及汞与镉表现为极显著相关(P＜0.01)。铜与砷、镉、铬，以及砷与铬达显著相关(P＜0.05)。推断铅和汞、镉、铜可能来自相同的途径，铜与砷、镉、铬的来源也有很大的相似性。整体而言，铅和铜可能是这6种重金属积累的主导元素，或是诱导其他元素在土壤中积累的主要元素，而6种元素间也呈现出相互伴随的复杂积累效应。
表 4 河南省柿主产区土壤重金属之间相关系数矩阵Table 4 Correlations matrix of the heavy metals in soils from the main producing area of D. kaki of Henan Province重金属 pH 砷 汞 铅 镉 铬 铜 pH 1.000 砷 0.177 1.000 汞 −0.119 0.105 1.000 铅 −0.116 0.123 0.410** 1.000 镉 −0.184 0.170 0.397** 0.784** 1.000 铬 −0.191 −0.237* 0.176 0.006 −0.042 1.000 铜 −0.085 −0.209* 0.085 0.299** 0.218* 0.264* 1.000 说明：* 表示显著相关(P＜0.05)，** 表示极显著相关(P＜0.05) 土壤重金属质量分数数据经KMO和巴特力(Bartlett)检验及因子分析和主成分分析表明：第1主成分可解释总方差的37.1%，主要包括铅、镉和汞，其中铅的载荷更是高达0.900；第2主成分可解释34.4%的总方差，其中铬和铜是主要变量，两者载荷分别为0.730和0.608 (表5)。主成分散点图表明(图2)：汞、铅和镉以及铬和铜分别具有高度相似的同源性。这与相关性分析的结果一致。
表 5 河南省柿主产区土壤重金属主成分分析Table 5 Principal component analysis of the heavy metals in soils from the main producing area of D. kaki of Henan Province项目 因子 砷 汞 铅 镉 铬 铜 方差贡献率/% 累计贡献率/% 因子载荷 第1主成分 0.173 0.648 0.900 0.880 0.124 0.418 37.1 37.1 第2主成分 −0.726 0.006 −0.078 −0.173 0.730 0.608 34.4 71.5 
图 2 河南省柿主产区土壤重金属主成分分析散点图Figure 2 Spatial scatter plot of principal component analysis for the heavy metals in soils from the main producing area of D. kaki of Henan Province2.4 河南省柿主产区土壤重金属污染分析
根据分级标准对河南省柿主产区土壤重金属进行污染评价。结果(表6)可知：3个产区土壤单因子污染指数(CF)最大的重金属分别为：安阳汞(2.13)、济源铅(2.80)和三门峡汞(2.02)。另外，安阳产区所有柿园均处于无镉污染状态，76.67%的柿园也处于无铬污染状态，而砷和汞的污染比例均高达83.33%，其中重度污染的比例达到13.33%。济源产区柿园砷、铅和汞的污染比例较高，其中铅的重度污染比例高达30%。三门峡产区大部分柿园表现为无污染或仅轻度污染，但也分别有16.67%、13.33%和6.67%的柿园处在汞、铅和铜的重度污染状态。从整个主产区来看，汞和铜是最主要的重金属污染元素，镉和铬最低。
表 6 不同区域单因子污染指数值及污染等级样点百分比Table 6 Percentages of sites at different pollution levels in the total sample sites各重金属污染指数 安阳产区 济源产区 平均值 标准差 无/% 轻度/% 中度/% 重度/% 平均值 标准差 无/% 轻度/% 中度/% 重度/% CF,砷 1.78 0.86 16.67 50.00 20.00 13.33 1.71 0.47 6.67 63.33 30.00 0 CF,汞 2.13 1.46 16.67 36.67 33.33 13.33 1.87 1.76 43.33 26.67 13.33 16.67 CF,铅 0.86 0.28 63.33 36.67 0 0 2.80 2.84 10.00 53.33 6.67 30.00 CF,镉 0.45 0.20 100 0 0 0 1.32 1.38 66.67 3.33 13.33 16.67 CF,铬 0.73 0.38 76.67 23.33 0 0 0.61 0.13 100 0 0 0 CF,铜 1.51 1.00 30.00 53.33 10.00 6.67 1.48 0.54 20.00 63.33 16.67 0 IPL 0.95 0.34 76.67 20.00 3.33 0 1.32 0.70 50.00 36.67 10.00 3.33 各重金属污染指数 三门峡产区 整个主产区 平均值 标准差 无/% 轻度/% 中度/% 重度/% 平均值 标准差 无/% 轻度/% 中度/% 重度/% CF,砷 0.30 0.29 96.67 3.33 0 0 1.26 0.90 40.00 38.89 16.67 4.44 CF,汞 2.02 1.97 26.67 46.67 10.00 16.67 2.01 1.73 28.88 36.67 18.89 15.56 CF,铅 1.93 2.15 30.00 53.33 3.33 13.33 1.86 2.19 34.45 47.78 3.33 14.44 CF,镉 0.74 0.35 96.67 3.33 0 0 0.83 0.90 87.78 2.22 4.44 5.56 CF,铬 0.83 0.15 96.67 3.33 0 0 0.72 0.26 91.11 8.89 0 0 CF,铜 1.93 1.00 3.33 73.33 16.67 6.67 1.64 0.89 17.78 63.34 14.44 4.44 IPL 0.96 0.35 50.00 50.00 0 0 1.08 0.52 58.89 35.56 4.44 1.11 土壤重金属污染负荷指数(IPL)表明(表6)：河南省柿主产区IPL为1.08，说明河南省柿主产区土壤整体处于重金属轻度污染状态，其中济源产区IPL值最大(1.32)，安阳和三门峡表现为无污染。从污染等级的比例来看，安阳产区无污染柿园最多，达到76.67%，济源产区土壤重金属污染程度最高。
2.5 河南省柿主产区土壤重金属污染的生态风险分析
以筛选值作参比标准，计算河南省柿主产区各柿园土壤重金属潜在生态风险指数(E)及综合潜在生态风险指数(IR) [3]。结果发现：在3个产区，汞的生态风险指数最高，达80.31，铬最低(仅1.45)，说明汞处于较强风险的等级。3个产区的IR最大值为济源产区的581.24，最小值为三门峡产区126.99。这说明：3个产区均为轻微生态风险等级，其中济源产区风险最高，三门峡产区最低，但各产区均出现了处于中等及较强生态风险等级的柿园(表7)。
表 7 不同区域潜在生态风险指数及污染等级样点百分比Table 7 Percentages of sites at different risk levels in the total sample sites各重金属
风险指数安阳产区 济源产区 平均值 标准差 轻微/% 中等/% 较强/% 很强/% 极强/% 平均值 标准差 轻微/% 中等/% 较强/% 很强/% 极强/% E砷 17.76 8.60 100 0 0 0 0 17.11 4.71 100 0 0 0 0 E汞 85.25 58.44 20.00 33.33 36.67 10.00 0 74.86 70.39 43.33 26.67 23.33 3.33 3.33 E铅 4.30 1.42 100 0 0 0 0 13.98 14.22 96.67 3.33 0 0 0 E镉 13.44 6.07 100 0 0 0 0 39.50 41.40 66.67 10 23.33 0 0 E铬 1.45 0.76 100 0 0 0 0 1.23 0.26 100 0 0 0 0 E铜 7.56 5.00 100 0 0 0 0 7.42 2.70 100 0 0 0 0 IR 129.77 63.51 73.33 23.33 3.33 0 0 154.10 121.43 66.67 23.33 10 0 0 各重金属
风险指数三门峡产区 整个主产区 平均值 标准差 轻微/% 中等/% 较强/% 很强/% 极强/% 平均值 标准差 轻微/% 中等/% 较强/% 很强/% 极强/% E砷 3.00 2.95 100 0 0 0 0 12.63 9.00 100 0 0 0 0 E汞 80.83 78.84 26.67 46.67 16.67 6.67 3.33 80.31 69.07 30.00 35.56 25.56 6.67 2.22 E铅 9.63 10.76 96.67 3.33 0 0 0 9.30 10.96 97.78 2.22 0 0 0 E镉 22.22 10.48 96.67 3.33 0 0 0 25.05 26.92 87.78 4.44 7.78 0 0 E铬 1.66 0.29 100 0 0 0 0 1.45 0.52 100 0 0 0 0 E铜 9.65 5.00 100 0 0 0 0 8.21 4.44 100 0 0 0 0 IR 126.99 85.31 76.67 20.00 3.33 0 0 136.95 92.95 72.22 22.22 5.56 0 0 2.6 河南省柿主产区土壤重金属生态风险预警分析
土壤生态风险预警分析是基于环境生态风险评估中而发展来的，它更侧重于对土壤系统、农林植物及其产品可能存在的生态风险研究，具有精准、定量和定性评价的优点[3]。以筛选值作参比标准，计算河南省柿主产区土壤重金属污染生态风险预警等级(IER)，结果如表8。整个主产区IER平均值为2.33，为轻度预警，其中济源产区IER最大(3.79)，为中度预警，三门峡和安阳产区均为轻度预警等级。6种重金属中，仅汞在安阳和三门峡产区以及铅在济源产区表现为轻度预警等级，且这2种重金属均存在处于重度预警的柿园，其中济源产区处于汞和铅重度预警的柿园高达20%。这也与各元素在整个主产区的CF、IPL、E以及IR等的格局基本一致。
表 8 不同区域生态风险预警指数及预警级别样点百分比Table 8 Percentages of sites at different warning levels in the total sample sites各重金属
预警指数安阳产区 济源产区 平均值 标准差 无需/% 预警/% 轻度/% 中度/% 重度/% 平均值 标准差 无需/% 预警/% 轻度/% 中度/% 重度/% IER,砷 0.78 0.86 16.67 50.00 33.33 0 0 0.71 0.47 6.67 63.33 30.00 0 0 IER,汞 1.13 1.46 16.67 36.67 36.67 6.67 3.33 0.87 1.76 43.33 26.67 23.33 0 6.67 IER,铅 −0.14 0.28 63.33 36.67 0 0 0 1.80 2.84 10.00 53.33 16.67 6.67 13.33 IER,镉 −0.55 0.20 100 0 0 0 0 0.32 1.38 66.67 3.33 26.67 3.33 0 IER,铬 −0.27 0.38 76.67 23.33 0 0 0 −0.39 0.13 100 0 0 0 0 IER,铜 0.51 1.00 30.00 53.33 13.33 3.33 0 0.48 0.54 20.00 63.33 16.67 0 0 IER 1.45 2.36 33.33 13.33 33.33 10.00 10.00 3.79 6.14 33.33 23.33 6.67 10.00 26.67 各重金属
预警指数三门峡产区 整个主产区 平均值 标准差 无需/% 预警/% 轻度/% 中度/% 重度/% 平均值 标准差 无需/% 预警/% 轻度/% 中度/% 重度/% IER,砷 −0.70 0.29 96.67 3.33 0 0 0 0.26 0.90 40.00 38.89 21.11 0 0 IER,汞 1.02 1.97 26.67 46.67 16.67 6.67 3.33 1.01 1.73 28.89 36.67 25.56 4.44 4.44 IER,铅 0.93 2.15 30.00 53.33 6.67 0 10 0.86 2.19 34.44 47.78 7.78 2.22 7.78 IER,镉 −0.26 0.35 96.67 0 3.33 0 0 −0.17 0.90 87.78 1.11 10.00 1.11 0 IER,铬 −0.17 0.15 96.67 3.33 0 0 0 −0.28 0.26 91.11 8.89 0 0 0 IER,铜 0.93 1.00 3.33 73.33 20.00 3.33 0 0.64 0.89 17.78 63.33 16.67 2.22 0 IER 1.75 3.98 43.33 23.33 13.33 6.67 13.33 2.33 4.51 36.67 20.00 17.78 8.89 16.67 3. 讨论
3.1 河南省柿主产区土壤重金属来源
土壤重金属来源主要有成土母质和人类活动[20]，其中人类活动引起的土壤污染主要包括工业废弃物、肥料和农药以及采用重金属超标的水灌溉农田等[21-22]。河南省柿整个主产区土壤中铅、铜、汞和砷质量分数约为背景值的1.26~2.01倍，铬和镉均低于背景值，说明铅、铜、汞和砷受人为因素影响更大，也有可能是土壤本身理化性质不同[20]。在一定区域内，相关性强的重金属可能具有相同来源途径[23-25]。从相关分析与主成分分析结果来看，铅、镉和汞之间分别呈现为极显著性相关，铬和铜呈现为显著性相关，说明铅、镉、汞三者以及铜与铬两者可能具有相同的来源，这与河南省典型工业区周边农田[13]、新疆地区辣椒Capsicum annuum种植基地[3]以及吉林省果树基地[21]等研究结果一致。
汞和铅是燃煤排放的标志物，空气中的汞和铅以大气沉降的方式进入土壤[13]。铅和铜是农药、化肥以及农家有机肥等的标志性元素之一[2]，也是电池等工业生产的废气原料[13]。河南省3个柿主产区土壤6种重金属质量分数及其主要特征差异较大，这说明各产区重金属来源存在较大差异，这种差异可能是人类活动的差异引起的[25]。砷受人类活动，特别是农药和水肥影响较大[7, 26]。安阳是河南省重工业基地之一，冶金建材、煤炭化工以及化肥农药生产等是安阳市的主产业，也是导致安阳产区土壤重金属砷和汞质量分数较高的主要原因。济源市有铅都之称，铅和铜分别是济源和三门峡的支柱产业，导致了济源产区土壤铅等重金属质量分数升高，而铅、锌、砷和镉等也是近10 a来国内金属冶炼引起的土壤污染的高浓度重金属[27]。安阳和济源农药和农家肥的施用量约为三门峡的1.8倍，灌溉水中砷和汞含量严重超标，当地政府把治理水中重金属砷作为重中之重的民生项目。安阳是全国重要的化肥生产基地，域内有多个国家重点化肥、化工生产企业，安阳产区的果园施肥以复合肥为主。济源产区的果园在生产中施用了较多的腐熟不彻底的牲畜粪便等农家肥，而且使用了含有较多无机砷的杀菌剂和除草剂。以上这些人类活动都对土壤中砷和铜等重金属的富集具有重要的促进作用[7, 25-26]，也与3个产区土壤重金属含量特征相一致。
3.2 河南省柿主产区土壤重金属污染及风险特征
虽然60%的柿园土壤处于铜、汞、铅和砷污染状态，但从土壤重金属污染负荷指数来看，河南省柿主产区目前处于轻度污染(1.0＜IPL＜2.0)状态，其中济源产区污染较为严重，砷是该产区重金属污染贡献最大的元素之一。这与砷是河南省典型工业城市土壤重金属污染最重要的元素的结论一致[13]。总体来看，6种重金属在各个产区的污染程度不同，但汞是安阳和三门峡产区重金属污染最主要的来源，铅是济源产区污染最严重的重金属元素。不同重金属元素在吐鲁番盆地葡萄园土壤[5]以及新疆焉耆盆地辣椒地土壤[3]的污染特征也不同，这可能是各产区土壤背景值及人类活动特征不同有关[6]。
汞是6种重金属中生态风险等级最高的元素，表现为较强的风险等级(E＞80)，70%的柿园处于汞污染的中等风险及以上等级，镉次之。但济源产区23.33%的柿园均处于镉较强污染风险等级之上，在3个主产区中最高。各元素对IR和IER的贡献率与各元素的污染程度并不完全一致，如镉污染程度相对较低，但济源产区重金属污染风险等级最高，这不仅与不同产区的人为干扰活动存在差异相关[28]，还可能与不同重金属元素毒性系数相差较大有关。一般来说，元素毒性系数越高，其潜在生态风险指数越大[17]；各元素的背景值及国家标准值也是重要影响因素[29]。另外，有些重金属虽然在土壤中的污染程度较高，但其容易伴随其他颗粒物迁移进入土壤中矿化埋藏[30]，使其对生物的毒性降低，从而降低了潜在生态风险[5, 28]。
4. 结论
河南省柿主产区土壤砷主要受农业生产活动的影响，汞、铅和铜则受工业活动影响较大。河南省整个柿主产区土壤重金属污染为轻微风险等级，生态风险预警属于轻度预警等级，但济源产区土壤重金属污染水平、潜在生态风险程度与生态风险预警等级均达到中等水平。汞是河南省柿主产区土壤污染程度最严重的重金属，也是生态风险等级和预警级别最高的重金属元素。
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图 1 三叶青块根及叶片中的总黄酮质量浓度、原花青素质量浓度和ABTS自由基清除率
Figure 1 Contents of total flavonoids and proanthocyanidins, ABTS free radical scavenging rate in root and leaf of T. hemsleyanum
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
引物名称 序列(5′→3′) ThMYBPAR-F ATGGGGAGAAGCCCTTGTTGT ThMYBPAR-R TTATTCTCCAAACCAGTCACCGC MDH-F TGTTGCTACGACTGATGT MDH-R CCTGAGACTTGTAGATGGAA qThMYBPAR-F GCTGGCCGGAGCAAGAACAA qThMYBPAR-R GTGGTGTTTCCGTCGGTCGT qThLAR-F CGACAGCCGACGCTGGTATT qThLAR-R TCAAGCGCAGGTTGCAGTGA ThMYBPAR-GFP-F gctcggtacccggggatccATGGGGAGAAGCCCTTGTTGT ThMYBPAR-GFP-R gcccttgctcaccatgtcgacTTATTCTCCAAACCAGTCACCGC 
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表 2 三叶青活性成分与基因表达量之间的相关性
Table 2. Correlation between active ingredients and gene expression of T. hemsleyanum
活动成分 总黄酮 原花青素 ThMYBPAR ThLAR 总黄酮 1.000 原花青素 1.000** 1.000 ThMYBPAR 0.983** 0.983** 1.000 ThLAR 0.989** 0.989** 0.994** 1.000 说明：**表示极显著相关(P＜0.01)。
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