梅花2个<i>PmWRKY</i>2基因克隆及在逆境胁迫下的表达模式

王楠楠; 董彬; 杨丽媛; 赵宏波

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.20200706

梅花2个PmWRKY2基因克隆及在逆境胁迫下的表达模式

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200706

王楠楠^{1, 2, 3,},
董彬^{1, 2, 3},
杨丽媛^{1, 2, 3},
赵宏波^{1, 2, 3, ,}

1.
浙江农林大学风景园林与建筑学院，浙江杭州 311300
2.
浙江农林大学浙江省园林植物种质创新与利用重点实验室，浙江杭州 311300
3.
浙江农林大学南方园林植物种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，浙江杭州 311300

基金项目: “十三五”国家重点研发计划资助项目(2019YFD1001505，2018YFD1000402)；浙江省农业新品种选育重点项目(2016C02056-12)

详细信息

作者简介: 王楠楠(ORCID: 0000-0002-2571-5980)，从事抗寒分子机制研究。E-mail: 1780192738@qq.com

通信作者: 赵宏波(ORCID: 0000-0003-4714-8240)，教授，博士，博士生导师，从事观赏植物遗传育种等研究。E-mail: zhaohb@zafu.edu.cn

中图分类号: S685.17

Cloning and expression analysis under adversity stress of 2 PmWRKY2 in Prunus mume

WANG Nannan^{1, 2, 3
,},
DONG Bin^{1, 2, 3},
YANG Liyuan^{1, 2, 3},
ZHAO Hongbo^{1, 2, 3
, ,}

1.
School of Landscape Architecture, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China
2.
Zhejiang Provincial Key Laboratory of Germplasm Innovation and Utilization for Garden Plants, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China
3.
Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Germplasm Innovation and Utilization for Southern Garden Plants, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China

摘要: 目的低温是影响梅花Prunus mume栽培应用的重要环境因素。WRKY基因是一类主要存在于植物中的转录因子，参与响应非生物胁迫等过程。了解梅花WRKY基因对非生物和脱落酸(ABA)胁迫的响应，对梅花定向育种具有重要的意义。方法以梅花‘骨红朱砂’Prunus mume ‘Guhong Zhusha’为材料，通过反转录PCR(RT-PCR)克隆获得了2个WRKY2转录因子，命名为PmWRKY2-1和PmWRKY2-2；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因在低温和干旱下的表达模式。结果 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的编码区长度分别为2 223和2 220 bp，分别编码740和739个氨基酸，包含2个WRKY结构域和C₂H₂型锌指结构；PmWRKY2-1与PmWRKY2-2亲缘关系较远，但两者与蔷薇科Rosaceae植物欧洲甜樱桃P. avium、桃P. persica、李P. dulcis的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示：在低温和干旱处理下，PmWRKY2-1与PmWRKY2-2都能被诱导；脱落酸(ABA)处理后，PmWRKY2-1与PmWRKY2-2的表达显著降低。结论 PmWRKY2-1与PmWRKY2-2可能参与调控梅花低温和干旱响应，并可能受到ABA的调控。图6表1参28
- 梅花 /
- WRKY转录因子 /
- 基因克隆 /
- 表达分析
Abstract: Objective Low temperature is a main environmental factor that influences the cultivation and application of Prunus mume whereas WRKY gene is a plant-specific transcription factor which participates in the response to abiotic stress process. This study, with an investigation of how WRKY gene responds to low temperature and drought stress, is aimed to provide guidance for the directional breeding of P. mume. Method With the P. mume ‘Guhong Zhusha’ cDNA template selected as the substance, two WRKY2 genes were cloned by means of RT-PCR, named as PmWRKY2-1and PmWRKY2-2 before their expression patterns were under low temperature and in the condition of drought employing real-time quantitative PCR (qRT-PCR). Result a) PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2, with respective coding area lengths of 2 223 and 2 220 bp, encode 740 and 739 amino acids respectively, both including 2 WRKY domains and a C₂H₂ zinc finger structure; b) though with a distant genetic relationshp with each other, both PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 had a close relationship with P. avium, P. persica and P. dulcis; c) according to the results of the real-time quantitative PCR (qRT-PCR), both PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 could be induced by low temperature and drought treatment And d) the expressions of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 were significantly reduced after abscisic acid (ABA) treatment. Conclusion PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 are likely to participate in the regulation of low temperature and drought response of P. mume, yet might be subject to the regulation by ABA. [Ch, 6 fig. 1 tab. 28 ref.]
- Prunus mume /
- WRKY transcription factor /
- gene cloning /
- expression analysis of genes

铁路、公路等基础设施建设会破坏和占压地表植被，形成大量的裸露坡面，遇到降雨极易发生水土流失，甚至出现滑坡、泥石流等次生地质灾害。裸露坡面常常具有坡度陡、坡体稳定性低、水分条件差和土壤瘠薄等特征，是不利于植被生长的困难立地。客土喷播绿化是裸露坡面恢复植被最快速最有效的方式之一，喷播后灌溉养护对植被生长至关重要^[1]。大量调查发现：客土喷播后普遍存在过度灌溉，产生坡面径流，造成水土流失和水资源浪费；同时喷播基质通气不畅也会影响植被生长。可见，确定适合植被生长且能保证灌溉时坡面不产流的客土喷播基质含水量已成为当前亟需解决的问题。目前，关于适宜含水量研究大多集中在林地土壤与林木之间，如夏江宝等^[2]对贝壳堤岛旱柳Salix matsudana光合效率的土壤水分临界效应及其阈值进行了分级研究，景雄等^[3]对毛竹Phyllostachys edulis实生苗土壤水分有效性及生产力进行了分级研究，张淑勇等^[4]对黄刺玫Rosa xanthina叶片光合生理参数的土壤水分阈值响应及其生产力进行了分级研究等，客土喷播基质适宜含水量与植被生长的关系研究则较少。以往的研究大都只关注了植物某一个生长阶段的土壤水分适宜含水量阈值^{[2, 5-6]}，缺乏对不同季节植被生长与基质水分关系的研究。鉴于此，本研究以北方地区常用的喷播修复植物黑麦草Lolium perenne作为研究对象，利用种植盆模拟客土喷播绿化，通过控制不同客土喷播基质水分梯度，分析夏、秋季黑麦草光合特性日变化对不同喷播基质水分的响应规律，以叶片净光合速率(P_n)和水分利用效率(E_WU)作为“产”“效”来评价黑麦草生产力和水分利用能力的依据，并进行季节间比较，建立夏、秋季黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级，以期为北京至张家口的公路、铁路等冬季奥林匹克运动会交通廊道以及自然条件相近地区的工程创面客土喷播恢复植被灌溉养护提供参考。

1. 研究区概况与方法

1.1 研究区概况

研究区河北省张家口市涿鹿县为北京冬季奥林匹克运动会延庆赛区和张家口崇礼赛区廊道沿线，高速公路G6和G7之间，地理坐标为40°26′20″N，115°17′03″E。涿鹿县属温带半干旱大陆性季风气候，年均气温为9.1 ℃，极端最高气温为39.2 ℃，极端最低气温为−23.9 ℃，年均降水量为367 mm，年均蒸发量为1 600 mm，无霜期为169 d，年平均积温为2 100~3 400 ℃，风向以西北为主，平均风速2~3 m·s⁻¹，土壤为沙壤质褐土。

1.2 试验材料

喷播基质材料为客土(取自河北省涿鹿县苗圃)、木纤维[长1~3 cm，中矿复地生态环境技术研究院(北京)有限公司]、保水剂(3005KCE，美国艾森公司)、黏合剂(A30，美国艾森公司)、稻壳和黑麦草种子(北京布莱特草业有限公司)。喷播基质层和种子层的材料配比见表1。黑麦草播种量为4 g·m⁻²。

表 1 基质层和种子层的材料配比

Table 1 Material ratio of matrix layer and seed layer

喷播层次	客土/ %	木纤维/%	稻壳/ %	复合肥/ (g·m⁻³)	保水剂/ (g·m⁻³)	黏合剂/ (g·m⁻³)
基质层(10 cm)	70	10	20	300	200	150
种子层(3 cm)	67	33
说明：客土、木纤维和稻壳为体积比

下载: 导出CSV

| 显示表格

1.3 试验设计

利用种植盆试验模拟客土喷播绿化，种植盆上口直径50 cm、盆底直径40 cm、高15 cm，底部打孔便于排水。使用恒睿牌HKP125型客土喷播机。2021年4月26日，根据表1的材料配比将基质层和种子层分上、下2层先后喷播到种植盆内，采用微喷灌雾化喷头对喷播基质灌溉养护，保持喷播基质充分湿润(每次灌溉以喷播基质表面不积水为准)，保证种子出苗有充足的水分。

2021年5月26日开始控制喷播基质含水量(为质量含水量，下同)，用环刀法测得喷播基质的田间持水量为30.36%，容重为1.12 g·cm⁻³。喷播基质含水量设置5个水分梯度，分别为30.36%、25.81%、21.25%、16.70%和12.14%，即喷播基质相对含水量(C_RW)为100%、85%、70%、55%和40%，每个水分梯度设置3个重复。每天16:00用TDR350土壤水分速测仪(美国Spectrum公司)测定C_RW(通过容重换算为质量含水量)，每盆测定重复3次取平均值，并根据公式计算耗水量：w_设−w_测=m_耗/m_干。其中：w_设为设计质量含水量(%)；w_测为实测质量含水量(%)，根据TDR350实测值和容重换算；m_耗为每盆黑麦草耗水量(g)；m_干为每盆喷播基质干质量(g)，可由基质体积和容重计算得出。使用微喷灌雾化喷头对喷播基质补充水分，为避免降水影响，试验在透明通风遮雨大棚内进行。

1.4 指标观测

于夏季(2021年8月5日，即控水2个月后)、秋季(2021年10月11日，即控水4个月后)选择连续3 d晴朗无云的天气，使用Li-6400XT便携式光合作用测定仪(标准叶室，Li-COR)测定黑麦草叶片P_n (μmol·m⁻²·s⁻¹)、蒸腾速率T_r (mmol·m⁻²·s⁻¹)、气孔导度G_s (mol·m⁻²·s⁻¹)、胞间二氧化碳(CO₂)摩尔浓度C_i (μmol·mol⁻¹)等生理参数以及大气CO₂摩尔浓度C_a (μmol·mol⁻¹)、光合有效辐射P_AR (μmol·m⁻²·s⁻¹)、气温T_a (℃)和相对湿度R_h (%)等环境因子，并根据公式E_WU=P_n/T_r计算水分利用效率、L_s=1−C_i/C_a计算气孔限制值。测定时间为8:00—16:00，隔2 h测1次，每个种植盆选取3株生长健康、长势一致的黑麦草，每株选取3片叶，每片叶记录3次读数，取平均值。

1.5 数据处理

运用Excel 2016整理光合参数与基质相对含水量数据；SPSS 22.0进行差异显著性检验LSD；Origin 2018进行作图和多项式拟合建立回归模型，使用F检验对回归模型进行显著性检验。

2. 结果与分析

2.1 夏秋两季主要环境因子的日变化

由图1可知：夏、秋季P_AR的日变化为单峰曲线，均为先升高后下降，峰值均出现在12:00，夏季峰值为(1 393.71±110.04) μmol·m⁻²·s⁻¹，秋季为(786.73±88.74) μmol·m⁻²·s⁻¹。夏季P_AR日均值(999.75±459.61) μmol·m⁻²·s⁻¹大于秋季(504.07±274.09) μmol·m⁻²·s⁻¹。夏、秋季C_a日变化为“V”型曲线，8:00—12:00下降，之后上升。秋季C_a日均值(421.15±17.65) μmol·mol⁻¹大于夏季(411.54 ±10.76) μmol·mol⁻¹，两者相差较小，仅为2.30%。

图 1 夏、秋季光合有效辐射(P_AR)和大气CO₂摩尔浓度(C_a)的日变化

Figure 1 Diurnal variation of photosynthetically active radiation (P_AR) and atmospheric CO₂ concentration (C_a) in summer and autumn

下载: 全尺寸图片幻灯片

由图2可知：夏、秋季T_a的日变化与P_AR相似，也为单峰曲线，在12:00达最大值。夏季T_a最大为(42.88±1.46) ℃，秋季为(28.41±1.06) ℃。夏季日均值(37.87±3.23) ℃大于秋季(26.21±2.03) ℃。夏、秋季R_h的日变化与T_a相反，12:00前下降，之后上升，夏、秋季R_h最低值分别为20.98%±1.65%和17.05%±1.47%。夏季R_h日均值(26.72%±5.56%)大于秋季(19.98%±2.70%)。

图 2 夏、秋季气温(T_a)和相对湿度(R_h)的日变化的日变化　　　　　

Figure 2 Diurnal variation of temperature (T_a) and relative humidity (R_h) in summer and autumn

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.2 不同喷播基质含水量下黑麦草光合特性的日变化

2.2.1 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片净光合速率(P_n)的日变化

夏、秋季黑麦草叶片P_n日变化对C_RW有明显的阈值响应(图3)。当C_RW为70%~85%时，P_n的变化呈双峰曲线，均出现光合“午休”现象，上午和下午各出现1个峰值，此水分范围内，P_n在全天各时段均最高。当C_RW增加至100%时，P_n呈单峰曲线，峰值出现在12:00。当C_RW降低到55%和40%时，P_n为单峰曲线，峰值均出现在8:00(但秋季C_RW为55%时P_n峰值出现在10:00)，P_n在全天各时段均处于较低水平，表明C_RW低于55%会严重抑制植物的光合作用。由表2可知：P_n日均值对C_RW也有明显的阈值响应。当C_RW为85%时，夏季P_n日均值最大，达(11.17±3.08) μmol·m⁻²·s⁻¹，与其他水分梯度有显著差异(P＜0.05)。秋季的P_n日均值在C_RW为70%时达最大，为(7.02±1.97) μmol·m⁻²·s⁻¹，与其他水分梯度也有显著差异(P＜0.05)。夏季P_n日均值均大于秋季，C_RW为55%~100%时两季差异达到显著(P＜0.05)。C_RW为40%时，两季P_n日均值均较低，可见当C_RW较低时植物光合作用将受到严重影响。综上所述，夏、秋两季维持黑麦草较高P_n的C_RW为70%~85%，高于或低于此范围，P_n明显受到抑制。

图 3 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草净光合速率(P_n)的日变化

Figure 3 Diurnal variation of net photosynthetic rate (P_n) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn

下载: 全尺寸图片幻灯片

表 2 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草光合生理参数的日均值变化

Table 2 Change of daily mean of photosynthetic physiological parameters of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn

C_RW/%	P_n/(μmol·m⁻²·s⁻¹)		T_r/(mmol·m⁻²·s⁻¹)		E_WU/(mol·mol⁻¹)
C_RW/%	夏季	秋季	夏季	秋季	夏季	秋季
100	6.79±2.01 Abc	4.30±0.95 Bb	5.59±1.17 Aab	2.75±0.16 Bab	1.32±0.20 Bbc	1.56±0.26 Acd
85	11.17±3.08 Aa	6.07±1.24 Ba	6.83±1.12 Aa	3.13±0.40 Ba	1.61±0.22 Ba	1.92±0.22 Ab
70	9.26±2.79 Aab	7.02±1.97 Ba	6.76±0.63 Aa	2.92±0.59 Ba	1.43±0.15 Bab	2.37±0.25 Aa
55	5.77±2.09 Ac	3.77±1.03 Bb	4.91±0.93 Ab	2.35±0.30 Bbc	1.20±0.12 Bbc	1.63±0.20 Ac
40	2.80±1.66 Ae	2.74±0.78 Ab	3.03±0.87 Ac	2.16±0.28 Ac	1.01±0.28 Ac	1.28±0.16 Ad
说明：同列不同小写字母、同行不同大写字母均表示差异显著(P＜0.05)

下载: 导出CSV

| 显示表格

2.2.2 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片蒸腾速率(T_r)的日变化

夏、秋季黑麦草叶片T_r日变化规律与P_n基本相似(图4)，当C_RW为70%~85%时，黑麦草T_r的日变化呈双峰曲线。当C_RW增加至100%时，T_r呈现单峰曲线，夏、秋季峰值均出现在14:00，但日均值却低于C_RW为70%~85%时。表明基质水分充足可有效延缓T_r“午休”，但会降低T_r。当C_RW≤55%时，T_r呈单峰曲线，峰值出现在8:00或10:00，全天各时段均处于较低的水平。结合表2可知：当C_RW≥55%时，夏季T_r日均值显著高于秋季(P＜0.05))，可见不同季节气候环境对植物T_r影响较大。当C_RW为40%时，T_r日均值显著低于其他水分梯度(P＜0.05)，表明水分胁迫严重限制T_r。综上所述，C_RW过高或过低均会降低黑麦草T_r，当C_RW为70%~85%时，黑麦草会保持较高的T_r，保障植物正常生理活动。

图 4 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草蒸腾速率(T_r)的日变化

Figure 4 Diurnal variation of transpiration rate (T_r) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.2.3 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片水分利用效率(E_WU)的日变化

E_WU日变化对基质含水量有明显的阈值响应(图5)。C_RW为70%~85%时，E_WU为双峰曲线(但秋季C_RW=85%时为单峰曲线)，全天各时段E_WU均高于其他水分梯度。当C_RW增加至100%时，E_WU表现为单峰曲线，峰值出现在12:00。C_RW为40%~55%时，E_WU峰值出现在8:00或10:00，之后不断降低。结合表2可知：当C_RW≥55%时，秋季E_WU日均值显著高于夏季(P＜0.05)，C_RW为40%时秋季E_WU日均值高于夏季，但不差异显著。C_RW为40%和100%时，E_WU日均值均显著低于其他水分梯度(P＜0.05)，表明C_RW过高或过低都会降低E_WU。综上所述，夏、秋季维持黑麦草同时具有较高P_n和E_WU的C_RW为70%~85%，在这个水分范围内，T_r也保持较高水平，有利于植物的光合作用。

图 5 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草水分利用效率(E_WU)的日变化

Figure 5 Diurnal variation of water use efficiency (E_WU) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.2.4 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片气孔导度(G_s)、胞间CO₂摩尔浓度(C_i)和气孔限制值(L_s)的日变化

夏、秋季黑麦草G_s对C_RW具有明显的阈值响应(图6)，当C_RW为70%~85%时，G_s呈现双峰曲线。当C_RW=100%时，G_s为单峰曲线，峰值出现在12:00。当C_RW为40%~55%时，全天G_s峰值出现在8:00，之后一直降低，维持在较低水平。C_i和L_s对C_RW的阈值响应表现不同的变化规律(图7和图8)，上午和下午表现也不同。C_RW为70%~100%时，P_n下降，G_s和C_i明显下降，L_s明显升高，表明P_n下降原因是气孔限制。C_RW=55%时，上午P_n下降，G_s和C_i明显下降，L_s升高，但下午P_n下降，G_s和L_s下降，C_i反而升高，可见限制黑麦草P_n的原因上午和下午不同，上午以气孔限制为主，气孔关闭导致CO₂供应不足，下午以非气孔限制为主，水分胁迫导致植物叶片光合结构受损，P_n下降。当C_RW=40%时，C_i从8:00开始上升且一直处于较高水平，而L_s全天都较低，表明水分胁迫严重损坏了植物叶片光合结构，降低了光合作用有关酶的活性，从而降低了P_n。由图9可知：夏、秋季不同C_RW范围内P_n和G_s的正比关系不同，当C_RW＞55%时，随着G_s增大，P_n线性增大，P_n和G_s为线性正比关系；当C_RW≤55%时，P_n和G_s为非线性关系。因此，当C_RW=55%时，黑麦草不仅发生了P_n限制机制的转变，其P_n和G_s之间的关系也发生转变。综上所述，在C_RW=55%时出现上午、下午C_i和L_s变化相反的情况，表明此基质含水量是黑麦草叶片P_n下降由气孔限制为主转变为非气孔限制为主的临界点。

图 6 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草气孔导度(G_s)的日变化

Figure 6 Diurnal variation of stomatal conductance (G_s) of L. perenne under different water content of spraying substrate in summer and autumn

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 7 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草胞间CO₂摩尔浓度(C_i)的日变化

Figure 7 Diurnal variation of intercellular CO₂ concentration (C_i) of L. perenne under different water content of spraying substrate in summer and autumn

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 8 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草气孔限制值(L_s)的日变化

Figure 8 Diurnal variation of stomatal limit value (L_s) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 9 夏、秋季黑麦草净光合速率(P_n)和气孔导度(G_s)的关系

Figure 9 Relationship between net photosynthetic rate (P_n) and stomatal conductance (G_s) of L. perenne in summer and autumn

下载: 全尺寸图片幻灯片

2.3 基于黑麦草光合特性的喷播基质含水量临界值分析

为进一步确定黑麦草喷播基质相对含水量(C_RW)分级临界值，对黑麦草P_n、T_r、E_WU和G_s的日均值与C_RW构建回归模型(表3)。由P_n与C_RW的回归模型知：夏、秋季P_n达最大值的C_RW分别为78.17%、76.02%，其对应的最大P_n分别为9.68和 6.33 μmol·m⁻²·s⁻¹。令P_n=0，求出夏、秋季水合补偿点的C_RW分别为35.02%、30.83%(C_RW大于100%的点均已舍去)。根据回归模型的积分式^[2]求出C_RW为40%~100%时黑麦草夏季P_n平均值为7.77 μmol·m⁻²·s⁻¹，对应的C_RW分别为58.98%和97.36%。同理可求出黑麦草秋季P_n平均值为5.29 μmol·m⁻²·s⁻¹，对应的C_RW分别为57.71%和94.33%。由此可以确定黑麦草夏、秋季P_n达到中等以上水平的C_RW分别为58.98%~97.36%、57.71%~94.33%。

表 3 夏、秋季黑麦草光合参数与喷播基质相对含水量的回归模型

Table 3 Regression model between photosynthetic parameters of L. perenne and relative water content of spraying substrate in summer and autumn

参数	季节	回归模型	决定系数	F	P
P_n	夏季	y=−22.092 7+0.813 0x−0.005 2x²	0.88	78.98	9.12×10⁻¹¹
P_n	秋季	y=−11.584 0+0.471 3x−0.003 1x²	0.81	45.60	1.49×10⁻⁸

T_r	夏季	y=−9.497 1+0.398 7x−0.002 5x²	0.94	595.83	0.000
T_r	秋季	y=−0.574 0+0.083 8x−0.000 5x²	0.83	39.08	5.74×10⁻⁸

E_WU	夏季	y=−0.844 9+0.061 0x−0.000 4x²	0.80	31.05	3.93×10⁻⁷
E_WU	秋季	y=−2.344 8+0.122 2x−0.000 83x²	0.76	35.29	1.37×10⁻⁷

G_s	夏季	y=−0.354 2+0.013 5x−0.000 086x²	0.78	39.97	4.73×10⁻⁸
G_s	秋季	y=−0.319 7+0.012 2x−0.000 077x²	0.83	53.94	3.30×10⁻⁹
说明：y表示各参数，x表示喷播基质相对含水量(C_RW)

下载: 导出CSV

| 显示表格

根据E_WU与C_RW的回归模型，求出夏、秋季E_WU达最大值的C_RW分别为76.25%、73.61%，对应的最大值分别为1.48和 2.15 μmol·mmol⁻¹。令E_WU＝0，求出夏、秋季的对应的C_RW分别为15.41%、22.68%(C_RW大于100%的点均已舍去)。根据回归模型的积分式求出C_RW为40%~100%时黑麦草夏季E_WU的平均值为1.35 μmol·mmol⁻¹，对应的C_RW分别为58.17%和94.33%。同理可求出黑麦草秋季E_WU的平均值为1.89 μmol·mmol⁻¹，对应的C_RW分别为55.81%和91.42%。由此确定黑麦草夏、秋季E_WU达到中等以上水平的C_RW分别为58.17%~94.33%、55.81%~91.42%。

2.4 基于光合特性的黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级

将P_n和E_WU取最大值点、平均值点、最低值点和P_n下降气孔限制转折点的喷播基质C_RW临界值，作为黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级临界点，建立喷播基质适宜含水量的阈值分级(表4)。此分级标准将P_n和E_WU作为“产”“效”来评价黑麦草生产力和水分利用能力的依据，建立了黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级。以P_n=0时的水合补偿点作为临界点，低于此临界点划为“无产无效水”范围。P_n下降原因由气孔限制为主转为非气孔限制为主对应的C_RW称为“P_n气孔限制转折点”。P_n和E_WU取最大值时的C_RW确定为“高产高效水”临界值点。依据P_n、E_WU与C_RW的回归模型积分式求解二者的平均值来确定P_n和E_WU达到中等以上水平的临界点，在此范围内称为“中产”“中效”，此范围外称为“低产”“低效”。为更清晰地展示5种阈值分级类型，借助坐标轴对其划分参数和数值进行展示(图10)。

表 4 基于光合特性的黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级

Table 4 Threshold gradient of suitable water content of L. perenne spraying substrate based on photosynthetic characteristics

季节	临界值指标	临界点对应的C_RW/%	基质适宜含水量阈值分级类型	基质适宜含水量阈值/%
夏季	P_n=0	35.02	无产无效水	＜35.02
	P_n(sl→nsl)	55.00	低产低效水	35.02~55.00，97.36~100.00
	P_n取平均值(P_n-ave)	58.98~97.36	中产中效水	78.17~97.36
	P_n取最大值(P_n-max)	78.17	中产高效水	55.00~76.25
	E_WU取最大值(E_WU-max)	76.25	高产高效水	76.25~78.17
	E_WU取平均值(E_WU-ave)	58.17~94.33

秋季	P_n=0	30.83	无产无效水	＜30.83
	P_n(sl→nsl)	55.00	低产低效水	30.83~55.00，94.33~100.00
	P_n取平均值(P_n-ave)	57.71~94.33	中产中效水	76.02~94.33
	P_n取最大值(P_n-max)	76.02	中产高效水	55.00~73.61
	E_WU取最大值(E_WU-max)	73.61	高产高效水	73.61~76.02
	E_WU取平均值(E_WU-ave)	55.81~91.42
说明：P_n=0为水合补偿点，P_n(sl→nsl)为P_n气孔限制转折点

下载: 导出CSV

| 显示表格

图 10 夏、秋季黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级坐标轴图示

Figure 10 Coordinate graphic figures of spraying substrate suitable water content threshold gradient of L. perenne in summer and autumn

下载: 全尺寸图片幻灯片

3. 讨论

夏、秋季黑麦草光合生理参数(P_n、T_r、E_WU、G_s、C_i和L_s)日变化对喷播基质含水量的阈值响应规律与黄刺玫^[5]、文冠果Xanthoceras sorbifolia^[6]、连翘Forsythia suspensa^[7]、山杏Prunus sibirica^[8]、羊草Leymus chinensis和紫花苜蓿Medicago sativa^[9]等对土壤水分阈值响应的规律一致，即C_RW过高或过低均会抑制植物光合作用。C_RW为70%~85%时，夏、秋季P_n、T_r日变化均呈现双峰曲线，在12:00表现出“光合午休”现象。主要原因是中午气温最高，高温影响植物光合酶的活性，降低P_n；空气相对湿度低，叶片表面饱和水汽压差增大，叶片气孔保卫细胞失水过多，导致部分气孔关闭，降低T_r和P_n^[10]。C_RW为100%时，夏、秋季P_n日变化均呈现单峰曲线，峰值出现在12:00，但P_n日均值并不高。表明水分充足可以延缓植物光合午休，但C_RW过高，喷播基质孔隙较小，不利于根系呼吸，影响根系吸收营养元素，造成光合叶绿素含量降低，从而降低P_n^[11]。C_RW为100%时，夏、秋季T_r日变化的峰值延迟到14:00。已有研究表明：当水分充足时光照强度是影响T_r的主要因子，光合辐射可以促进叶片气孔开放，从而增强T_r^[12-13]。C_RW为40%~55%时，夏、秋季P_n和T_r均处于较低水平，原因是严重水分胁迫下植物为减少体内水分散失增加了气孔阻力^[4]，导致P_n和T_r降低。研究表明：适度的干旱胁迫能有效提高植物的水分利用效率^[14-15]，与本研究观点一致，即C_RW为70%~85%时黑麦草E_WU达最大值，并非在C_RW最高的时候。秋季E_WU显著高于夏季，主要原因是秋季T_r的降低幅度比P_n的降低幅度要更大，这与许多学者^[16-18]的研究结果一致。

夏、秋季黑麦草G_s日变化与P_n的变化规律基本相似，但通过对P_n和G_s的关系拟合可知：P_n和G_s在C_RW≤55%时两者为非线性关系，C_RW＞55%时为线性正比关系，这与郎莹等^[19]的研究结果一致。轻度水分胁迫下，叶片气孔部分关闭，G_s下降，进入叶片CO₂减少，因此C_i降低，L_s升高，但是当C_RW为55%时，下午时段G_s下降，C_i升高，表明水分胁迫可能破坏了叶片的光合结构，导致叶片吸收CO₂、光合作用能力下降。这也进一步说明，在C_RW为55%时，黑麦草P_n下降原因已经由气孔限制为主转变为非气孔限制为主。已有研究表明：当植物光合作用受到非气孔限制时，水分胁迫可能开始损坏光合结构^[20-21]，叶绿体受损并且不可逆^[22]，当C_RW进一步降低，植物叶子变黄甚至脱落^[21]。因此，C_RW=55%被认为是黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级的临界点。

采用P_n和E_WU作为土壤水分的“产”“效”指标可评价土壤水分有效性和适宜含水量范围^{[2-3, 5, 7, 23]}，主要方法有3类：第1类为聚类分析法^{[4, 24]}，即通过试验获取多个水分梯度下的P_n和E_WU进行聚类分析，得到不同的水分分级临界点。由于获取的水分梯度随机性较大，该方法缺乏足够代表性。第2类为极限值法，即通过获取P_n和E_WU与C_RW的定量关系，找出P_n和E_WU的最低值、最大值点和气孔限制转折点，以此来划分水分分级临界点。但此法并未对中等水平的“产”“效”进行划分^[2，6]。第3类为回归方程拟合法，即通过建立植物P_n和E_WU与C_RW的回归模型，计算P_n的水合补偿点、P_n和E_WU最低值点、最大值点和平均值点对应的土壤水分，并以此作为土壤水分有效性阈值分级临界点。该方法对土壤水分分级比较完整^{[2-3, 21]}。本研究结合第2类和第3类方法，即采用回归方程拟合法计算临界值点再结合P_n气孔限制转折点来确定喷播基质适宜含水量阈值分级标准。在拟合时采用了P_n和E_WU的日平均值与C_RW，相比只测上午光合数据^{[2, 4, 6, 21]}的研究更具有代表性。本研究确定的“无产无效水”“低产低效水”“中产中效水”“中产高效水”和“高产高效水”5种喷播基质适宜含水量阈值分级类型，可以根据不同的工程绿化养护要求和黑麦草不同生长阶段对水分的需求来选择利用。例如，在裸露边坡等困难立地最突出的特征是干旱和缺水，坡面工程绿化以防治水土流失和提高水分利用效率为目标，而不是充分供水达到最高产量^[24-25]。因此既满足边坡植被修复要求，又不因灌溉量过大而造成坡面水土流失、影响植物生长和浪费水资源等问题，可以保持喷播基质含水量在“中产高效水”(55.00%≤C_RW≤76.25%和55.00%≤C_RW≤73.61%)的范围，以此为标准进行灌溉。

4. 结论

夏、秋季黑麦草净光合速率水合补偿点的喷播基质相对含水量分别为35.02%和30.83%，即实际质量含水量分别为10.63%和9.36%，喷播基质含水量低于此值光合作用无效。夏、秋季黑麦草净光合速率下降由气孔限制转变为非气孔限制的喷播基质相对含水量均为55%，即实际质量含水量为16.70%，喷播基质含水量低于此值将对黑麦草叶片光合结构造成不可逆性损坏，建议灌溉养护时保持基质含水量不能低于此水分范围。客土喷播绿化以快速恢复植被为目标时可以保持喷播基质含水量在“高产高效水”范围，以此为标准进行灌溉，夏、秋季分别为76.25%≤C_RW≤78.17%和73.61%≤C_RW≤76.02%，即实际质量含水量分别为23.15%~23.73%和22.35%~23.08%。客土喷播绿化以提高水分利用效率并恢复基本植被(即恢复到当地自然植被盖度为准)为目标时，可以保持喷播基质含水量在“中产高效水”范围，以此为标准进行灌溉，夏、秋季分别为55.00%≤C_RW≤76.25%和55.00%≤C_RW≤73.61%，即实际质量含水量分别为16.70%~23.15%和16.70%~22.35%。

图 1 2个PmWRKY2基因的扩增

Figure 1 PCR amplification of 2 PmWRKY2 genes in P. mume

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 2 梅花与其他物种WRKY氨基酸序列的比对

Figure 2 Amino acid sequence of WRKY between P. mume and other species

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 3 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的WRKY结构域

Figure 3 WRKY domain displays of PmWRKY2-1和PmWRKY2-2

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 4 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2蛋白质的二级结构

Figure 4 Secondary protein structure of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 5 梅花与其他物种WRKY氨基酸序列系统进化树分析

Figure 5 Phylogenetic tree analysis of the amino acid sequence of P. mume and other species

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 6 非生物和ABA处理下的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达

Figure 6 Expression levels of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 under abiotic stress and ABA

下载: 全尺寸图片幻灯片

表 1 基因克隆及表达所用引物序列

Table 1. Primers used in Gene clone and Quantitative real-time PCR

用途	引物名称	序列(5′→3′)
基因克隆	PmWRKY2-1F	ATGGCTGGCATCGATGA
	PmWRKY2-1R	CTACATCTGTGGTCCAAG
	PmWRKY2-2F	ATGGGATTTTTAAGAACC
	PmWRKY2-2R	CTAGTACGATTGATGACTGCTTC
实时荧光定量PCR	QPmWRKY2-1F	GTCCCCTTATCTGACAATACCTC
	QPmWRKY2-1R	AAAGCGAATGAAGTATTTATGTCCT
	QPmWRKY2-2F	TCCGTTGCTTCCTCCCAATGATGAC
	QPmWRKY2-2R	CAAAATCTATTGGTTGTTGCTCC
	QPmEF1αS	CGGATTCAATGTTAAGAATGTTGC
	QPmEF1αA	AGAACTGGAGCATATCCGTTACC

下载: 导出CSV

[1]	陈俊愉. 中国梅花[M]. 海口: 中国海南出版社, 1996.
[2]	陈俊愉. 中国梅花品种图志[M]. 北京: 中国林业出版社, 1989.
[3]	张启翔. 梅花及其杂交种根系抗寒性研究初报[J]. 北京林业大学学报, 1992, 14(增刊 4): 83 − 86. ZHANG Qixiang. A preliminary study on cold resistance of root system of Mei and its hybrid cultivars [J]. J Beijing For Univ, 1992, 14(suppl 4): 83 − 86.
[4]	包满珠, 陈俊愉. 中国梅的变异与分布研究[J]. 园艺学报, 1994, 21(1): 81 − 86. BAO Manzhu, CHEN Junyu. Studies on the variation and distribution of Prunus mume Sieb. et Zucc. [J]. Acta Hortic Sin, 1994, 21(1): 81 − 86.
[5]	包满珠. 我国川、滇、藏部分地区梅树种质资源及其开发利用[J]. 华中农业大学学报, 1993, 12(5): 498 − 501. BAO Manzhu. The germplasm resources and exploitation of Prunus mume in partial area of Sichuan, Yunnan and Tibet of China [J]. J Huazhong Agric Univ, 1993, 12(5): 498 − 501.
[6]	王白坡, 钱银才, 沈湘林, 等. 实生梅开花结果特性的研究[J]. 浙江林学院学报, 1992, 9(1): 6 − 13. WANG Baipo, QIAN Yincai, SHEN Xianglin, et al. Study on flowering and fruiting charaeters of seedling-mumeplant [J]. J Zhejiang For Coll, 1992, 9(1): 6 − 13.
[7]	EULGEM T, RUSHTON P J, ROBATZEK S, et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors [J]. Trends Plant Sci, 2000, 5(5): 199 − 206.
[8]	VIVES-PERIS V, MARMANEU D, GÓMEZ-CADENAS A, et al. Characterization of Citrus WRKY transcription factors and their responses to phytohormones and abiotic stresses [J]. Biol Plant, 2018, 62(1): 33 − 44.
[9]	PAN Linjie, JIANG Ling. Identification and expression of the WRKY transcription factors of Carica papaya in response to abiotic and biotic stresses [J]. Mol Boil Rep, 2014, 41: 1215 − 1225.
[10]	NIU Canfang, WEI Wei, ZHOU Qiqun, et al. Wheat WRKY genes TaWRKY2 and TaWRKY19 regulate abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants [J]. Plant Cell Environ, 2012, 35: 1156 − 1170.
[11]	YOKOTANI N, SATO Y, TANABE S, et al. WRKY76 is a rice transcriptional repressor playing opposite roles in blast disease resistance and cold stress tolerance [J]. J Exp Bot, 2013, 64(6): 5085 − 5097.
[12]	LIU Guoyin, LI Bing, LI Xiang, et al. MaWRKY80 positively regulates plant drought stress resistance through modulation of abscisic acid and redox metabolism [J]. Plant Physiol Biochem, 2020, 156: 155 − 166.
[13]	YAN H R, JIA H H, CHEN X B, et al. The cotton WRKY transcription factor GhWRKY17 functions in drought and salt stress in transgenic Nicotiana benthamiana through ABA signaling and the modulation of reactive oxygen species production [J]. Plant Cell Physiol, 2014, 55(12): 2060 − 2076.
[14]	ZHANG Qixiang, CHEN Wenbin, SUN Lidan, et al. The genome of Prunus mume [J]. Nat Commun, 2012, 3: 1318. doi: 10.1038/ncomms2290.
[15]	BAO Fei, DING Anqi, CHENG Tangren, et al. Genome-wide analysis of members of the WRKY gene family and their cold stress response in Prunus mume [J]. Genes, 2019, 10(11): 911. doi: 10.3390/genes10110911.
[16]	PENG Ting, GUO Cong, YANG Jie, et al. Overexpression of Mei (Prunus mume) CBF gene confers tolerance to freezing and oxidative stress in Arabidopsis [J]. Plant Cell Tissue Organ Cult, 2016, 126(3): 373 − 385.
[17]	李元元, 高志强, 曹清河. 甘薯SPF1转录因子的生物信息学分析[J]. 江苏农业学报, 2017, 33(4): 760 − 767. LI Yuanyuan, GAO Zhiqiang, CAO Qinghe. Bioinformatics analysis of SPF1 transcription factor of sweet potato [J]. Jiangsu Agric Sci, 2017, 33(4): 760 − 767.
[18]	CHEN Lin, YANG Yang, LIU Can, et al. Characterization of WRKY transcription factors in Solanum lycopersicum reveals collinearity and their expression patterns under cold treatment [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 464(6): 962 − 968.
[19]	WEI Kaifa, CHEN Juan, CHEN Yanfeng, et al. Molecular phylogenetic and expression analysis of the complete WRKY transcription factor family in maize [J]. DNA Res, 2012, 19: 153 − 164.
[20]	MENG Dong, LI Yuanyuan, BAI Yang, et al. Genome-wide identification and characterization of WRKY transcriptional factor family in apple and analysis of their responses to waterlogging and drought stress [J]. Plant Physiol Biochem, 2016, 103: 71 − 83.
[21]	ROSS C A, LIU Yue, SHEN Qingxi J. The WRKY gene family in rice (Oryza sativa) [J]. J Integr Plant Biol, 2007, 49(6): 827 − 836.
[22]	SUN Chuanxin, SARA P, OLSSON H, et al. A novel WRKY transcription factor, SUSIBA2, participates in sugar signaling in barley by binding to the sugar-responsive elements of the iso1 promoter [J]. Plant Cell, 2003, 15(9): 2076 − 2092.
[23]	罗昌国, 渠慎春, 张计育, 等. 湖北海棠MhWRKY40b 在几种胁迫下的表达分析[J]. 园艺学报, 2013, 40(1): 1 − 9. LUO Changguo, QU Shenchun, ZHANG Jiyu, et al. Expression analysis of Malus hupehensis (Pamp) Rehd. MhWRKY40b gene in response to several stresses [J]. Acta Hortic Sin, 2013, 40(1): 1 − 9.
[24]	ZHANG Ying, YU Hongjun, YANG Xueyong, et al. CsWRKY46, a WRKY transcription factor from cucumber, confers cold resistance in transgenic-plant by regulating a set of cold-stress responsive genes in an ABA-dependent manner [J]. Plant Physiol Biochem, 2016, 108: 478 − 487.
[25]	ZHU Hong, ZHOU Yuanyuan, ZHAI Hong, et al. A novel sweetpotato WRKY transcription factor, IbWRKY2, positively regulates drought and salt tolerance in transgenic Arabidopsis [J]. Biomolecules, 2020, 10: 506. doi: 10.3390/biom10040506.
[26]	王官凤, 吕兵兵, 王安虎, 等. 苦荞抗旱相关转录因子基因FtWRKY10的克隆及功能鉴定[J]. 农业生物技术学报, 2020, 28(4): 629 − 644. WANG Guanfeng, LÜ Bingbing, WANG Anhu, et al. Cloning and functional identification of drought resistance related transcription factor gene FtWRKY10 from tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum) [J]. J Agric Biotechnol, 2020, 28(4): 629 − 644.
[27]	ZHANG Youzhi, LI Yaping, HASSAN M J, et al. Indole-3-acetic acid improves drought tolerance of white clover via activating auxin, abscisic acid and jasmonic acid related genes and inhibiting senescence genes [J]. BMC Plant Biol, 2020, 20: 150. doi: 10.1186/s12870-020-02354-y.
[28]	JIANG Wenbo, YU Diqiu. Arabidopsis WRKY2 transcription factor mediates seed germination and postgermination arrest of development by abscisic acid [J]. BMC Plant Biol, 2009, 9: 96. doi: 10.1186/1471-2229-9-96.

[1]	王子玥, 杨锋, 王红燕, 邢巧月, 白岩. 三叶青ThMYBPAR基因的克隆及组织差异表达分析 . 浙江农林大学学报, 2025, 42(2): 273-280. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20240459
[2]	杨钰, 王艺光, 董彬, 肖政, 赵宏波. 不同梅花品种花香成分鉴定与分析 . 浙江农林大学学报, 2024, 41(2): 262-274. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230279
[3]	应宇鑫, 陈俊宇, 姚玲窕, 许张婷, 俞振明, 开国银. 掌叶覆盆子RcF3H基因克隆及表达分析 . 浙江农林大学学报, 2024, 41(6): 1180-1188. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20240326
[4]	尚林雪, 王群, 张国哲, 赵雨, 顾翠花. 紫薇LiCMB1基因的克隆及表达特性分析 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(2): 330-337. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220333
[5]	洪方蕾, 陆瑶, 俞世姣, 胡芷诺, 缪云锋, 钟诗蔚, 赵宏波. 桂花OfABFs基因克隆和表达分析 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(3): 481-491. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220264
[6]	孟超敏, 耿翡翡, 卿桂霞, 张富厚, 李雪林, 刘逢举. 陆地棉低磷胁迫应答基因GhGDPD1的克隆与表达分析 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(4): 723-730. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220624
[7]	卓娟, 侯丹, 林新春. 毛竹PhebHLH6基因克隆及表达分析 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(4): 731-737. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220553
[8]	兰智鑫, 侯丹, 吴蔼民, 林新春. 毛竹PeCIGRs基因的克隆及表达分析 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(5): 982-990. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220761
[9]	孟超敏, 耿翡翡, 卿桂霞, 周佳敏, 张富厚, 刘逢举. 陆地棉磷高效基因GhMGD3的克隆与表达分析 . 浙江农林大学学报, 2022, 39(6): 1203-1211. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220145
[10]	缪云锋, 周丹, 董彬, 赵宏波. 桂花OfNAC转录因子鉴定及在花开放阶段的表达分析 . 浙江农林大学学报, 2021, 38(3): 433-444. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200474
[11]	庞天虹, 钱婕妤, 付建新, 顾翠花, 张超. 桂花己糖激酶基因家族成员的序列及表达分析 . 浙江农林大学学报, 2021, 38(2): 225-234. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200370
[12]	蒋琦妮, 付建新, 张超, 董彬, 赵宏波. 桂花OfAP1基因的克隆及表达分析 . 浙江农林大学学报, 2019, 36(4): 664-669. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.04.005
[13]	武丹阳, 杨洋, 李慧玉. 3个白桦BpBEE基因的克隆与表达分析 . 浙江农林大学学报, 2017, 34(1): 137-144. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019
[14]	李冰冰, 刘国峰, 魏书, 黄龙全, 张剑韵. 烟草NtPLR1基因克隆与表达分析 . 浙江农林大学学报, 2017, 34(4): 581-588. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.04.003
[15]	屈亚平, 张智俊, 王超莉, 王蕾, 吴林军. 毛竹阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的基因克隆、原核表达及纯化 . 浙江农林大学学报, 2016, 33(6): 928-934. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.002
[16]	王超莉, 张智俊, 屈亚平, 王蕾. 毛竹丙酮酸磷酸双激酶调节蛋白基因克隆、原核表达及纯化 . 浙江农林大学学报, 2015, 32(5): 749-755. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2015.05.014
[17]	侯传明, 郑雅文, 王正加, 徐英武. 山核桃MADS-like基因的克隆与分析 . 浙江农林大学学报, 2015, 32(1): 33-39. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2015.01.005
[18]	庞景, 童再康, 黄华宏, 林二培, 刘琼瑶. 杉木纤维素合成酶基因CesA的克隆及表达分析 . 浙江农林大学学报, 2015, 32(1): 40-46. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2015.01.006
[19]	王国立, 安华明, 秦巧平, 李孟娇, 刘真真, 陈佳莹, 周倩, 张岚岚. 柑橘果实成熟特异基因CsPMEI/InvI的克隆与序列分析 . 浙江农林大学学报, 2013, 30(3): 336-342. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2013.03.005
[20]	黄程前, 宋丽青, 童再康, 程龙军. 光皮桦BlFTL基因的克隆和表达模式 . 浙江农林大学学报, 2013, 30(3): 343-349. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2013.03.006

链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200706

https://zlxb.zafu.edu.cn/article/zjnldxxb/2021/4/812

点击查看大图

图(6) / 表(1)

计量

文章访问数: 1040
HTML全文浏览量: 211
PDF下载量: 48
被引次数: 0

1. 研究区概况与方法
1.1 研究区概况
1.2 试验材料
1.3 试验设计
1.4 指标观测
1.5 数据处理
2. 结果与分析
2.1 夏秋两季主要环境因子的日变化
2.2 不同喷播基质含水量下黑麦草光合特性的日变化
2.3 基于黑麦草光合特性的喷播基质含水量临界值分析
2.4 基于光合特性的黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级
3. 讨论
4. 结论

全文HTML

梅花Prunus mume是中国十大传统名花，在中国有3 000多年栽培历史，江南地区花期为2月左右^[1]。梅花适应性较强，耐高温、较耐低温和干旱。在年均气温为16~23 ℃的地区生长最好，根系不耐−8 ℃以下的低温^[2-3]。梅花适栽范围介于自然分布区和历史分布区之间，北界为西藏经四川至甘肃天水，陕西宝鸡、西安，河南洛阳，最后到山东烟台，通过海岸线与自然分布区相接，以长江流域为集中赏梅地带^{[2, 4]}。在华北、东北和西北等北方地区不能露地越冬，在江南地区，春季的极端低温(低于−3 ℃)则会对花(蕾)造成伤害，极大地影响观赏价值。因此，抗寒育种一直是梅花育种的重要方向^[4-6]。WRKY转录因子是一类主要存在于植物中的锌指型转录因子，在植物响应生物胁迫与非生物胁迫的过程中起着重要作用。根据WRKY结构域数量和锌指结构特征，WRKY家族可分为3类：I类包含2个WRKY结构域和1个CX₄₋₅CX₂₂₋₂₃ HXH (C₂H₂)型锌指结构；Ⅱ类包含1个WRKY结构域和1个CX₄₋₅CX₂₂₋₂₃HXH (C₂H₂)型锌指结构；Ⅲ类包含1个WRKY结构域和1个CX₇CX₂₃HXC (C₂HC)型锌指结构^[7]。WRKY家族参与了广泛的生物过程，包括种子萌发、植物发育和植物激素信号传递等^[8]。研究表明：WRKYs最重要的功能之一是参与防御非生物胁迫^[9]，可显著提高小麦Triticicum aestivum^[10]、水稻Oryza sativa^[11]等的耐寒性和香蕉Musa acuminate^[12]、棉花Gossypium hirsutum^[13]等的抗旱性。近年来，随着梅花基因组正式公布^[14]，关于梅花抗寒和抗旱基因的挖掘和研究逐渐展开，这为深入研究梅花抗寒、抗旱等机制提供了重要的基础。梅花中共鉴定出58个WRKY成员，PmWRKYs在梅花的不同组织(根、茎、叶、花和果实)中有不同程度的表达，其中17个PmWRKYs可能是调控梅花抗寒性的潜在转录因子^[15]。本研究以梅花品种‘骨红朱砂’‘Guhong Zhusha’为材料，采用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得了2个PmWRKY2转录因子，通过生物信息学分析和同源基因序列比对，检测PmWRKY2基因在不同非生物胁迫下的表达模式，以期为后续开展WRKY转录因子在梅花抗寒和抗旱方面的作用机制研究奠定基础。

3. 讨论

植物在生长发育的过程中会受到多种因素的影响，而低温与干旱是常见的影响植物生长发育、果实品质以及地理分布的非生物胁迫因素，严重时可能会导致植物死亡。植物在长期适应进化的过程中逐渐形成了复杂而高效的应答机制，从分子、生理、细胞和生化等多方面做出适应性调整，以抵御和适应低温、干旱等胁迫。在植物响应低温、干旱胁迫过程中，普遍存在于植物中的WRKY转录因子发挥了重要作用^[17]，目前已在拟南芥^[7]、番茄Solanum lycopersicum^[18]、玉米Zea mays ^[19]、苹果Malus domestica^[20]、水稻^[21]等大多数物种中均有报道。

本研究克隆获得的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因都含有2个WRKY结构域，C端都为C₂H₂型锌指结构；但2个蛋白质序列的差异较大，相似性仅为45.87%；与一些蔷薇科植物的亲缘关系较近；PmWRKY2-1与拟南芥AtWRKY2的相似性为51.26%，PmWRKY2-2为32.07%。值得一提的是，PmWRKY2-2与麻风树(XP_021629940.1)、酸枣(XP_015875770.1)、蔓花生 (XP_015962000.1)等植物的SUSIBA2-Like氨基酸序列具有一定的相似性，有研究^[22]报道SUSIBA2属于WRKY转录因子超家族并参与碳水化合物合成代谢。

罗昌国等^[23]发现：低温处理下湖北海棠Malus hupehensis MhWRKY40b基因表达量呈现先上升后下降的趋势；低温处理下黄瓜Cucumis sativus CsWRKY46^[24]和水稻OsWRKY76^[11]也呈现先上升后下降的表达趋势，与本研究中梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因对低温的响应趋势一致。干旱处理下PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达量先显著上升后下降，最高表达量分别上调了约50倍和10倍。ZHU等^[25]发现：拟南芥中过表达甘薯Ipomoea batatas IbWRKY2和苦荞^[26]Fagopyrum tataricum FtWRKY10能提高转基因植株的抗旱性；ZHANG等^[27]发现：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid)处理白车轴草Trifolium repens，其WRKY2作为干旱响应基因可以提高白车轴草的耐旱性。JIANG等^[28]发现：ABI5、ABI3、ABA2和ABA3等ABA途径基因诱导拟南芥2个WRKY2的表达从而介导种子萌发和萌发后的发育停滞。本研究中，ABA处理下，梅花2个PmWRKY2基因的表达都被抑制，预测启动子序列中的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2分别含有1个和7个ABA响应元件ABRE，推测这2个基因可能通过ABA调控低温相关基因的表达进而调控梅花的耐寒性，但这些推论还需进一步验证。

参考文献 (28)

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

留言板

梅花2个PmWRKY2基因克隆及在逆境胁迫下的表达模式

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200706

作者简介: 王楠楠(ORCID: 0000-0002-2571-5980)，从事抗寒分子机制研究。E-mail: 1780192738@qq.com

通信作者: 赵宏波(ORCID: 0000-0003-4714-8240)，教授，博士，博士生导师，从事观赏植物遗传育种等研究。E-mail: zhaohb@zafu.edu.cn

Cloning and expression analysis under adversity stress of 2 PmWRKY2 in Prunus mume

1. 研究区概况与方法

1.1 研究区概况

1.2 试验材料

1.3 试验设计

1.4 指标观测

1.5 数据处理

2. 结果与分析

2.1 夏秋两季主要环境因子的日变化

2.2 不同喷播基质含水量下黑麦草光合特性的日变化

2.2.1 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片净光合速率(Pn)的日变化

2.2.2 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片蒸腾速率(Tr)的日变化

2.2.3 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片水分利用效率(EWU)的日变化

2.2.4 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片气孔导度(Gs)、胞间CO2摩尔浓度(Ci)和气孔限制值(Ls)的日变化

2.3 基于黑麦草光合特性的喷播基质含水量临界值分析

2.4 基于光合特性的黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级

3. 讨论

4. 结论

计量

出版历程

梅花2个PmWRKY2基因克隆及在逆境胁迫下的表达模式

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200706

1. 浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 杭州 311300 2. 浙江农林大学 浙江省园林植物种质创新与利用重点实验室，浙江 杭州 311300 3. 浙江农林大学 南方园林植物种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，浙江 杭州 311300

作者简介: 王楠楠(ORCID: 0000-0002-2571-5980)，从事抗寒分子机制研究。E-mail: 1780192738@qq.com

通信作者: 赵宏波(ORCID: 0000-0003-4714-8240)，教授，博士，博士生导师，从事观赏植物遗传育种等研究。E-mail: zhaohb@zafu.edu.cn

English Abstract

Cloning and expression analysis under adversity stress of 2 PmWRKY2 in Prunus mume

全文HTML

1.1. 植物材料与处理

1.2. 方法

1.2.1. RNA提取及cDNA合成

1.2.2. 基因的克隆

1.2.3. 序列的生物信息学分析

1.2.4. 基因表达分析

2.1. 梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因的克隆及生物信息学分析

2.2. 梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2蛋白的二级结构预测

2.3. 系统进化分析

2.4. PmWRKY2-1和PmWRKY2-2在非生物胁迫和脱落酸处理下的表达

目录

全文HTML

1.1. 植物材料与处理

1.2. 方法

1.2.1. RNA提取及cDNA合成

1.2.2. 基因的克隆

1.2.3. 序列的生物信息学分析

1.2.4. 基因表达分析

2.1. 梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因的克隆及生物信息学分析

2.2. 梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2蛋白的二级结构预测

2.3. 系统进化分析

2.4. PmWRKY2-1和PmWRKY2-2在非生物胁迫和脱落酸处理下的表达

2.2.1 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片净光合速率(P_n)的日变化

2.2.2 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片蒸腾速率(T_r)的日变化

2.2.3 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片水分利用效率(E_WU)的日变化

2.2.4 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片气孔导度(G_s)、胞间CO₂摩尔浓度(C_i)和气孔限制值(L_s)的日变化

1. 浙江农林大学风景园林与建筑学院，浙江杭州 311300

2. 浙江农林大学浙江省园林植物种质创新与利用重点实验室，浙江杭州 311300

3. 浙江农林大学南方园林植物种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，浙江杭州 311300

作者简介:
王楠楠(ORCID: 0000-0002-2571-5980)，从事抗寒分子机制研究。E-mail: 1780192738@qq.com