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梅花Prunus mume是中国十大传统名花，在中国有3 000多年栽培历史，江南地区花期为2月左右[1]。梅花适应性较强，耐高温、较耐低温和干旱。在年均气温为16~23 ℃的地区生长最好，根系不耐−8 ℃以下的低温[2-3]。梅花适栽范围介于自然分布区和历史分布区之间，北界为西藏经四川至甘肃天水，陕西宝鸡、西安，河南洛阳，最后到山东烟台，通过海岸线与自然分布区相接，以长江流域为集中赏梅地带[2, 4]。在华北、东北和西北等北方地区不能露地越冬，在江南地区，春季的极端低温(低于−3 ℃)则会对花(蕾)造成伤害，极大地影响观赏价值。因此，抗寒育种一直是梅花育种的重要方向[4-6]。WRKY转录因子是一类主要存在于植物中的锌指型转录因子，在植物响应生物胁迫与非生物胁迫的过程中起着重要作用。根据WRKY结构域数量和锌指结构特征，WRKY家族可分为3类：I类包含2个WRKY结构域和1个CX4−5CX22−23 HXH (C2H2)型锌指结构；Ⅱ类包含1个WRKY结构域和1个CX4−5CX22−23HXH (C2H2)型锌指结构；Ⅲ类包含1个WRKY结构域和1个CX7CX23HXC (C2HC)型锌指结构[7]。WRKY家族参与了广泛的生物过程，包括种子萌发、植物发育和植物激素信号传递等[8]。研究表明：WRKYs最重要的功能之一是参与防御非生物胁迫[9]，可显著提高小麦Triticicum aestivum[10]、水稻Oryza sativa[11]等的耐寒性和香蕉Musa acuminate[12]、棉花Gossypium hirsutum[13]等的抗旱性。近年来，随着梅花基因组正式公布[14]，关于梅花抗寒和抗旱基因的挖掘和研究逐渐展开，这为深入研究梅花抗寒、抗旱等机制提供了重要的基础。梅花中共鉴定出58个WRKY成员，PmWRKYs在梅花的不同组织(根、茎、叶、花和果实)中有不同程度的表达，其中17个PmWRKYs可能是调控梅花抗寒性的潜在转录因子[15]。本研究以梅花品种‘骨红朱砂’‘Guhong Zhusha’为材料，采用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得了2个PmWRKY2转录因子，通过生物信息学分析和同源基因序列比对，检测PmWRKY2基因在不同非生物胁迫下的表达模式，以期为后续开展WRKY转录因子在梅花抗寒和抗旱方面的作用机制研究奠定基础。
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梅花‘骨红朱砂’来自浙江农林大学梅花种质资源圃。采集生长势一致，无病虫害的1年生枝条，插于加入清水的培养瓶中，参照PENG等方法[16]处理，湿度为50%，光周期为16 h/8 h。低温(2 ℃)处理组取样时间为0(ck)、1、2、4、6、12、24、48、72 h。采用200 mmol·L−1的甘露醇溶液模拟干旱处理，取样时间为0(ck)、3、6、12、24、36、48 h。采用100 μmol·L−1脱落酸(ABA)处理，取样时间为0(ck)、3、6、12、24、36、48 h。所有新鲜样品采集后立即用液氮速冻，保存于−80 ℃，3次生物学重复。
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RNA的提取采用购自天津诺禾致源公司的UltraClean Polysaccharide and Phenol Plant RNA Purification Kit，方法参照试剂盒的提取说明书。cDNA的合成根据TAKARA PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)说明书在冰上进行。
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通过梅花基因组和表达谱数据获得PmWRKY2-1和PmWRKY2-2序列，利用Prime 5.0设计特异性引物(表1)，以‘骨红朱砂’叶片cDNA为模板，利用r-Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经切胶回收试剂盒回收后连接到pMD18-T载体(Takara公司，大连)中，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞后挑取阳性克隆，经PCR验证后送往杭州有康科技有限公司测序。
表 1 基因克隆及表达所用引物序列
Table 1. Primers used in Gene clone and Quantitative real-time PCR
用途 引物名称 序列(5′→3′) 基因克隆 PmWRKY2-1F ATGGCTGGCATCGATGA PmWRKY2-1R CTACATCTGTGGTCCAAG PmWRKY2-2F ATGGGATTTTTAAGAACC PmWRKY2-2R CTAGTACGATTGATGACTGCTTC 实时荧光定量PCR QPmWRKY2-1F GTCCCCTTATCTGACAATACCTC QPmWRKY2-1R AAAGCGAATGAAGTATTTATGTCCT QPmWRKY2-2F TCCGTTGCTTCCTCCCAATGATGAC QPmWRKY2-2R CAAAATCTATTGGTTGTTGCTCC QPmEF1αS CGGATTCAATGTTAAGAATGTTGC QPmEF1αA AGAACTGGAGCATATCCGTTACC -
采用在线软件BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 进行基因序列比对分析，用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在线分析开放阅读框，运用ProtParam 在线软件(http://web.expasy.org/protparam/)预测编码蛋白质的分子量、理论等电点；利用 SOPMA 在线工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)分析PmWRKY2蛋白质的二级结构组成；利用WOLFPSORT在线软件(https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl)预测基因的亚细胞定位；利用 DNAMAN 9.0软件对梅花PmWRKY2蛋白质与其他物种WRKY蛋白质进行比对分析；使用ClutsalX-v1.83程序进行多序列比对，然后将比对结果输入到MEGA 6.0软件中，利用邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树，Bootstrap值取1 000次。
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以不同处理的叶片为模板，反转录为cDNA，并进行实时荧光定量PCR。利用Prime 5.0设计PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的特异性引物，以梅花PmEF1α为内参基因。反应体系为SYBR Premix Ex Taq 酶(Takara，大连)10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物(10 μm·L−1)各0.8 μL，双蒸水 6.4 μL，每个样品设置3次重复。反应程序为两步法：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃复性30 s，共40个循环；然后以95 ℃持续5 s，60 ℃持续1 min，95 ℃持续15 s作为溶解曲线分析程序，最后根据
$ {2^{ - \Delta \Delta {C_{\rm{t}}}}} $ 法计算目的基因的相对表达量。 -
利用特异性引物进行PCR扩增，经过连接、转化、测序后获得编码序列(CDS)。测序结果显示：PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的CDS长度分别为2 223和2 220 bp(图1)，编码的氨基酸数目分别为740和739个，蛋白质分子量分别为79.94和80.98 kD，理论等电点分别为5.65和5.82。不稳定系数分别为53.93和53.82，脂肪指数分别为54.18和59.53，预测它们为不稳定蛋白质。总平均亲水系数(GRAVY)分别为−0.774和−0.743，属于亲水性蛋白质。亚细胞定位预测结果显示：PmWRKY2-1和PmWRKY2-2均位于细胞核。
图 1 2个PmWRKY2基因的扩增
Figure 1. PCR amplification of 2 PmWRKY2 genes in P. mume
氨基酸序列比对结果显示(图2)：梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的同源性仅为45.87%，与拟南芥Arabidopsis thaliana的AtWRKY2相似性分别为51.26%和32.07%；其中PmWRKY2-1与欧洲甜樱桃P. avium(XP_021826759.1)、桃P. persica(XP_007206427.1)的WRKY2同源性分别为98.65%，98.78%；PmWRKY2-2与甜李P. dulcis(XP_034218428.1)、桃(XP_007207009.2)的WRKY2同源性分别为98.51%，98.11%，与月季Rosa chinensis(XP_024188041.1)WRKY2同源性为77.97%。进一步分析发现：梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2氨基酸序列与其他植物氨基酸序列一样，均包含2个WRKY结构域和1个CX4−5CX22−23 HXH(C2H2)型锌指结构，属于Group Ⅰ (图3)。
图 2 梅花与其他物种WRKY氨基酸序列的比对
Figure 2. Amino acid sequence of WRKY between P. mume and other species
图 3 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的WRKY结构域
Figure 3. WRKY domain displays of PmWRKY2-1和PmWRKY2-2
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蛋白质二级结构预测结果显示(图4)：PmWRKY2-1蛋白质的二级结构中包含75.68%的无规则卷曲、10.81%的α螺旋、10.41%的扩展长链和3.11%的β转角结构；PmWRKY2-2蛋白质的二级结构中包含74.02%的无规则卷曲、13.80%的α螺旋、8.80%的扩展长链和3.38%的β转角结构。
图 4 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2蛋白质的二级结构
Figure 4. Secondary protein structure of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2
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利用MEGA 6.0软件构建梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2氨基酸序列的系统进化树(图5)。结果显示：梅花PmWRKY2-1与PmWRKY2-2的相似性较低，但与一些蔷薇科Rosaceae植物的亲缘关系都较近；其中PmWRKY2-1与桃(XP_007206427.1)、欧洲甜樱桃(XP_021826759.1)的WRKY亲缘关系较近，PmWRKY2-2与甜李(XP_034218428.1)、桃(XP_007207009.2)的WRKY氨基酸聚为一类，与麻疯树Jatropha curcas (XP_021629940.1)、酸枣Ziziphus jujube(XP_015875770.1)、蔓花生Arachis duranensis(XP_015962000.1)等SUSIBA2-Like(sugar signaling in barley)基因的氨基酸序列也有一定的相似性。
图 5 梅花与其他物种WRKY氨基酸序列系统进化树分析
Figure 5. Phylogenetic tree analysis of the amino acid sequence of P. mume and other species
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低温和干旱(甘露醇)处理后，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2表达均发生显著变化(图6)。在低温处理下，PmWRKY2-1在2 和12 h时表达量最高，分别是对照的5.0和4.4倍，之后呈现下降的趋势；PmWRKY2-2的表达量呈现先上升后下降的趋势，在6 h时达到最大值，是对照的2.4倍。在干旱处理下，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达模式均为先上升后下降的趋势，PmWRKY2-1的表达量在12 h达到最大且为对照的53.9倍，之后便呈现下降的趋势；PmWRKY2-2的表达量在6 h处达到最大，为对照的9.7倍，之后呈现下降趋势。在脱落酸(ABA)处理下，处理48 h前，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2均显著下调(P＜0.05)，说明其表达可被ABA抑制。
图 6 非生物和ABA处理下的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达
Figure 6. Expression levels of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 under abiotic stress and ABA
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植物在生长发育的过程中会受到多种因素的影响，而低温与干旱是常见的影响植物生长发育、果实品质以及地理分布的非生物胁迫因素，严重时可能会导致植物死亡。植物在长期适应进化的过程中逐渐形成了复杂而高效的应答机制，从分子、生理、细胞和生化等多方面做出适应性调整，以抵御和适应低温、干旱等胁迫。在植物响应低温、干旱胁迫过程中，普遍存在于植物中的WRKY转录因子发挥了重要作用[17]，目前已在拟南芥[7]、番茄Solanum lycopersicum[18]、玉米Zea mays [19]、苹果Malus domestica[20]、水稻[21]等大多数物种中均有报道。
本研究克隆获得的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因都含有2个WRKY结构域，C端都为C2H2型锌指结构；但2个蛋白质序列的差异较大，相似性仅为45.87%；与一些蔷薇科植物的亲缘关系较近；PmWRKY2-1与拟南芥AtWRKY2的相似性为51.26%，PmWRKY2-2为32.07%。值得一提的是，PmWRKY2-2与麻风树(XP_021629940.1)、酸枣(XP_015875770.1)、蔓花生 (XP_015962000.1)等植物的SUSIBA2-Like氨基酸序列具有一定的相似性，有研究[22]报道SUSIBA2属于WRKY转录因子超家族并参与碳水化合物合成代谢。
罗昌国等[23]发现：低温处理下湖北海棠Malus hupehensis MhWRKY40b基因表达量呈现先上升后下降的趋势；低温处理下黄瓜Cucumis sativus CsWRKY46[24]和水稻OsWRKY76[11]也呈现先上升后下降的表达趋势，与本研究中梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因对低温的响应趋势一致。干旱处理下PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达量先显著上升后下降，最高表达量分别上调了约50倍和10倍。ZHU等[25]发现：拟南芥中过表达甘薯Ipomoea batatas IbWRKY2和苦荞[26]Fagopyrum tataricum FtWRKY10能提高转基因植株的抗旱性；ZHANG等[27]发现：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid)处理白车轴草Trifolium repens，其WRKY2作为干旱响应基因可以提高白车轴草的耐旱性。JIANG等[28]发现：ABI5、ABI3、ABA2和ABA3等ABA途径基因诱导拟南芥2个WRKY2的表达从而介导种子萌发和萌发后的发育停滞。本研究中，ABA处理下，梅花2个PmWRKY2基因的表达都被抑制，预测启动子序列中的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2分别含有1个和7个ABA响应元件ABRE，推测这2个基因可能通过ABA调控低温相关基因的表达进而调控梅花的耐寒性，但这些推论还需进一步验证。
Cloning and expression analysis under adversity stress of 2 PmWRKY2 in Prunus mume
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摘要:
目的 低温是影响梅花Prunus mume栽培应用的重要环境因素。WRKY基因是一类主要存在于植物中的转录因子，参与响应非生物胁迫等过程。了解梅花WRKY基因对非生物和脱落酸(ABA)胁迫的响应，对梅花定向育种具有重要的意义。 方法 以梅花‘骨红朱砂’Prunus mume ‘Guhong Zhusha’为材料，通过反转录PCR(RT-PCR)克隆获得了2个WRKY2转录因子，命名为PmWRKY2-1和PmWRKY2-2；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因在低温和干旱下的表达模式。 结果 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的编码区长度分别为2 223和2 220 bp，分别编码740和739个氨基酸，包含2个WRKY结构域和C2H2型锌指结构；PmWRKY2-1与PmWRKY2-2亲缘关系较远，但两者与蔷薇科Rosaceae植物欧洲甜樱桃P. avium、桃P. persica、李P. dulcis的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示：在低温和干旱处理下，PmWRKY2-1与PmWRKY2-2都能被诱导；脱落酸(ABA)处理后，PmWRKY2-1与PmWRKY2-2的表达显著降低。 结论 PmWRKY2-1与PmWRKY2-2可能参与调控梅花低温和干旱响应，并可能受到ABA的调控。图6表1参28 Abstract:Objective Low temperature is a main environmental factor that influences the cultivation and application of Prunus mume whereas WRKY gene is a plant-specific transcription factor which participates in the response to abiotic stress process. This study, with an investigation of how WRKY gene responds to low temperature and drought stress, is aimed to provide guidance for the directional breeding of P. mume. Method With the P. mume ‘Guhong Zhusha’ cDNA template selected as the substance, two WRKY2 genes were cloned by means of RT-PCR, named as PmWRKY2-1and PmWRKY2-2 before their expression patterns were under low temperature and in the condition of drought employing real-time quantitative PCR (qRT-PCR). Result a) PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2, with respective coding area lengths of 2 223 and 2 220 bp, encode 740 and 739 amino acids respectively, both including 2 WRKY domains and a C2H2 zinc finger structure; b) though with a distant genetic relationshp with each other, both PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 had a close relationship with P. avium, P. persica and P. dulcis; c) according to the results of the real-time quantitative PCR (qRT-PCR), both PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 could be induced by low temperature and drought treatment And d) the expressions of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 were significantly reduced after abscisic acid (ABA) treatment. Conclusion PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 are likely to participate in the regulation of low temperature and drought response of P. mume, yet might be subject to the regulation by ABA. [Ch, 6 fig. 1 tab. 28 ref.] -
Key words:
- Prunus mume /
- WRKY transcription factor /
- gene cloning /
- expression analysis of genes
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茄子Solanum melongena是茄科Solanaceae茄属Solanum的 1年生草本植物，以浆果为产品器官，作为重要的蔬菜，在中国南北方被广泛栽培[1]。茄子果实营养丰富，富含多酚、花色苷和芦丁等营养物质，具有较高的食用价值与医疗保健功效[2−7]。茄子种质资源十分丰富，中国目前已建立了较成熟的国家茄子种质资源数据库管理系统和地方茄子种质资源数据库[8]。王佳慧[9]基于表型性状对142份茄子进行遗传多样性分析，发现不同茄子种质资源农艺性状存在较大差异，并从中筛选出了品质佳、抗寒性强的优良种质。张念等[10]采用形态标记对76 份茄子种质资源进行遗传多样性分析，发现种质资源间形态性状差异明显，基于Pearson系数聚类将其分为3类7组。陈雪平[11]利用形态标记对133份茄子种质及其近缘种进行分析，发现茄子形态遗传变异丰富，可作为植物学分类的重要依据。齐东霞等[12]利用表型性状对105份中俄茄子种质材料进行分析，发现材料间表现出不同程度多样性，表型聚类发现类群划分与地理来源没有直接关系，但与茄子果实性状存在一定相关性。
主成分分析法是通过降维方法将数量多且相关的变量重新组合，形成个数少、彼此独立并能尽量反映原变量相关信息的综合变量，简化了多个指标，为资源的评价和选择提供科学依据[13]。目前，主成分分析法被广泛应用于水稻Oryza sativa、玉米Zea mays、油茶Camellia oleifera、小麦Triticum aestivum、南瓜Cucurbita moschata等多种作物[14−18]，而中国在茄子农艺性状和品质评价方法及评价指标方面的研究较少，影响了茄子资源利用、新品种选育及市场竞争力的提升。
本研究以10份茄子种质资源为材料，通过测定并分析不同茄子品种农艺性状及果实品质等，采用主成分分析法对12个指标进行综合分析，构建科学的评价体系，以期为优质茄子资源或品种的快速筛选及新品种选育提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验在杭州市临安区清凉峰茄子基地进行。供试茄子品种有‘紫龙5号’‘紫龙7号’‘亮紫7号’‘浙茄10号’‘杭茄716’‘杭茄718’‘Z1’‘Z2’‘Z3’‘杭茄2020’等10个品种。日常栽培管理采用相同标准进行，2024年6月底采收每个品种盛果期果实，并立即运至浙江农林大学园艺学院实验室测定相关指标。
1.2 农艺性状和品质指标测定
每个品种材料随机选取10株，测定株高、株幅、茎粗等农艺性状。果实长度、横径、单果质量、果实颜色、果实硬度等指标测定均有10个生物学重复。采用色差仪(CR-10)测定茄子的果皮颜色[19]，获得L、a、b值。L代表亮度，a代表红绿度，即颜色的红绿差异，b代表蓝黄度，即颜色的蓝黄差异。采用蒽酮比色法[20−21]测定可溶性糖质量分数。采用G-250考马斯亮蓝法[22]测定可溶性蛋白质量分数。采用茚三酮比色法[23]测定游离氨基酸质量分数。采用福林酚法[24]测定总酚质量分数。采用物性测试仪(TA-XT plus)对茄子果实进行穿刺分析。试验中采用的探头为圆柱形P/2E探头，直径为2 mm，测试参数如下：测前速度为1 mm·s−1，测试速度为1 mm·s−1，测后上行速度为1 mm·s−1。
1.3 主成分分析
将茄子农艺性状和品质指标作为变量，导入SPSS 19.0进行标准化处理。利用软件中的因子分析对茄子性状进行主成分提取及相关性分析。采用方差贡献率作为主成分提取标准，计算主成分贡献率，根据特征向量，计算各主成分得分表达式，综合评价时对各指标进行无量纲化。
1.4 数据统计分析
茄子农艺性状测定重复10次，品质指标测定重复5次，采用Excel和SPSS 19.0对数据进行分析处理。文中数据均为平均值±标准差。
2. 结果与分析
2.1 农艺性状比较
由表1可知：10个品种茄子的植株高度为91.00~114.00 cm，其中‘Z2’最高，其次是‘亮紫7号’，‘杭茄718’最矮。各品种间株幅差异较大，株幅最大的是‘紫龙7号’，为100.00 cm，其次是‘紫龙5号’‘浙茄10号’‘杭茄718’，这3个品种间无显著差异。‘亮紫7号’的株幅最小，只有‘紫龙7号’的62.67%。10个品种茄子的植株茎粗为1.74~2.42 cm，其中‘杭茄716’最粗，显著高于其他品种(P＜0.05)，茎粗最小的是‘Z3’。
表 1 不同茄子品种的农艺性状比较Table 1 Agronomic characteristics comparison of 10 eggplant cultivars品种 株高/cm 株幅/cm 茎粗/cm 品种 株高/cm 株幅/cm 茎粗/cm ‘紫龙5号’ 101.33±2.73 c 97.00±5.48 b 2.04±0.18 bcd ‘杭茄718’ 91.00±1.90 e 96.00±3.41 b 2.17±0.13 b ‘紫龙7号’ 95.17±1.83 d 100.00±3.35 a 1.92±0.17 cde ‘Z1’ 98.67±4.55 cd 82.17±3.49 c 1.86±0.14 de ‘亮紫7号’ 112.33±4.63 a 62.67±3.33 f 2.13±0.25 bc ‘Z2’ 114.00±7.97 a 73.50±3.02 e 2.00±0.13 bcd ‘浙茄10号’ 107.33±3.72 b 97.00±1.90 b 1.97±0.21 bcd ‘Z3’ 100.67±9.20 c 77.00±3.46 d 1.74±0.14 e ‘杭茄716’ 102.33±2.25 c 83.67±4.97 c 2.42±0.37 a ‘杭茄2020’ 96.00±4.20 d 76.67±4.27 d 2.15±0.24 b 说明：同列不同小写字母表示同一指标不同品种间差异显著(P＜0.05)。 2.2 果实性状比较
10个茄子品种均为紫色品种。由表2可知：‘杭茄718’的L最高，说明其果实表面光泽度最好，‘Z3’的L最低。10个茄子品种的a为9.20~14.33。‘Z1’果皮的a最大，色泽最深，达14.33， ‘杭茄718’次之，‘Z3’的a最小，只有‘Z1’的64.20%。b均为负数，说明所有果实都没有偏黄的。
表 2 不同茄子品种果实性状比较Table 2 Comparison of fruit traits of 10 eggplant cultivars品种 皮色 长度/cm 横径/cm 单果质量/g L a b ‘紫龙5号 −0.45±0.10 bc 10.20±1.48 ef −4.55±0.87 a 33.87±1.48 de 2.48±0.10 c 101.82±7.96 bcd ‘紫龙7号’ −0.35±0.13 b 13.25±0.50 bc −7.28±0.26 e 29.47±0.40 h 2.35±0.16 d 98.08±5.84 d ‘亮紫7号’ −0.40±0.12 bc 11.45±1.04 d −5.78±0.78 c 35.10±2.47 c 2.43±0.10 c 113.55±10.42 a ‘浙茄10号’ 0.03±0.03 a 12.60±0.14 c −6.78±0.62 d 33.42±1.29 ef 2.30±0.15 d 103.99±5.10 bcd ‘杭茄716’ −0.40±0.08 bc 12.68±0.92 c −6.70±0.93 d 32.37±1.84 g 2.75±0.14 a 109.08±8.49 abc ‘杭茄718’ 0.08±0.05 a 13.55±0.25 ab −7.03±0.46 de 34.67±2.25 cd 2.48±0.10 c 109.98±16.86 ab ‘Z1’ 0.05±0.06 a 14.33±1.10 a −7.45±0.49 e 37.87±1.54 a 2.62±0.18 b 106.51±7.58 abcd ‘Z2’ −0.48±0.17 c 9.73±0.59 fg −5.53±0.94 bc 34.57±1.33 cd 2.70±0.09 a 105.65±4.20 abcd ‘Z3’ −0.63±0.10 d 9.20±0.84 g −4.48±0.46 a 36.47±1.12 b 2.70±0.18 a 105.90±2.29 abcd ‘杭茄2020’ −0.38±0.05 bc 10.90±0.60 de −5.15±0.44 b 32.80±2.60 fg 2.45±0.10 c 100.61±7.16 cd 说明：同列不同小写字母表示同一指标不同品种间差异显著(P＜0.05)。 各茄子品种的果实长度为29.47~37.87 cm，其中‘Z1’果实最长，显著高于其他品种(P＜0.05)。果实最短的品种是‘紫龙7号’，显著低于其他品种(P＜0.05)。果实横径最大的3个品种是‘杭茄716’‘Z2’‘Z3’，显著高于其他品种(P＜0.05)。果实最细的品种为‘浙茄10号’，仅为2.30 cm。不同品种茄子的单果质量存在一定差异，其中‘亮紫7号’单果质量最大，‘紫龙5号’单果质量最小。
2.3 果实质地特性比较
茄子果皮和果肉的穿刺试验发现(图1A)：各品种间果皮硬度存在差异，‘杭茄716’果皮硬度最大，显著高于其他品种(P＜0.05)，‘杭茄2020’次之，‘Z3’果皮硬度最小，仅为‘杭茄716’果皮硬度的55.05%；‘紫龙5号’‘紫龙7号’‘亮紫7号’‘杭茄718’的果皮硬度相近，无显著差异。各茄子品种果肉硬度的变化规律跟果皮硬度一致(图1B)。‘杭茄716’果肉硬度最大，‘杭茄2020’次之，‘Z3’果肉硬度最小，仅为‘杭茄716’果肉硬度的53.97%；‘紫龙5号’‘紫龙7号’‘亮紫7号’‘杭茄718’的果肉硬度相近，无显著差异。‘浙茄10号’‘Z1’‘Z2’果肉硬度差异不大。不同茄子品种间果皮韧性差异较大(图1C)。‘亮紫7号’果皮韧性最大，‘杭茄718’和‘浙茄10号’果皮韧性最小。‘紫龙5号’‘Z1’‘Z2’的果皮韧性差异不大。‘杭茄716’和‘杭茄2020’的果皮韧性最小，且两者之间无显著差异。
图 1 10个茄子品种果皮硬度、果肉硬度和果皮韧性比较Figure 1 Comparison of peel hardness, pulp hardness and pericarp toughness of 10 eggplant cultivars2.4 果实品质指标比较
由表3可知：茄子果实可溶性糖质量分数最高的品种为‘Z2’，达38.04 mg·g−1，其次是‘浙茄10号’，为35.35 mg·g−1，‘杭茄718’可溶性糖质量分数最低，只有25.01 mg·g−1，显著低于其他品种(P＜0.05)。茄子果实可溶性蛋白质量分数较高的3个品种为‘Z1’‘Z2’‘Z3’，显著高于另外7个品种(P＜0.05)。‘亮紫7号’和‘紫龙5号’果实游离氨基酸质量分数最高，达1.7 mg·g−1，‘杭茄2020’游离氨基酸质量分数最低，仅为0.73 mg·g−1，显著低于其他品种(P＜0.05)。‘紫龙7号’‘亮紫7号’‘杭茄718’‘杭茄2020’的总酚质量分数最高，显著高于其他品种(P＜0.05)，‘Z1’总酚质量分数最低，只有2.21 mg·g−1。
表 3 10个茄子品种果实品质指标比较Table 3 Comparison of fruit quality of 10 eggplant cultivars品种 可溶性糖/(mg·g−1) 可溶性蛋白/(mg·g−1) 游离氨基酸/(mg·g−1) 总酚/(mg·g−1) ‘紫龙5号’ 30.04±2.59 cd 3.53±0.65 b 1.69±0.06 a 4.08±0.67 bc ‘紫龙7号’ 34.53±2.91 abc 3.79±0.69 b 1.42±0.13 b 5.26±0.74 a ‘亮紫7号’ 32.62±1.04 bcd 3.54±0.42 b 1.76±0.26 a 5.19±0.88 a ‘浙茄10号’ 35.35±2.69 ab 3.66±0.27 b 1.09±0.15 c 3.60±0.91 bc ‘杭茄716’ 33.88±2.65 abc 3.14±0.55 b 1.17±0.12 bc 2.94±0.38 cd ‘杭茄718’ 25.01±1.03 e 3.90±0.65 b 1.36±0.13 bc 4.78±0.68 a ‘Z1’ 35.19±2.67 ab 5.03±0.38 a 1.12±0.19 c 2.21±0.72 d ‘Z2’ 38.04±2.73 a 4.68±0.25 a 1.19±0.23 bc 3.24±0.58 cd ‘Z3’ 32.14±3.45 bcd 4.79±0.20 a 1.27±0.23 bc 4.44±0.62 ab ‘杭茄2020’ 28.09±3.40 de 3.64±0.26 b 0.73±0.13 d 4.78±0.68 a 说明：同列不同小写字母表示同一指标不同品种间差异显著(P＜0.05)。 2.5 农艺和品质性状的主成分分析
对10个茄子品种的16个性状指标进行主成分分析，得到了特征值大于l的5个主成分，反映了总信息量的87.126% (表4)。第1主成分的方差贡献率为28.125%，其中可溶性蛋白、长度、株高、果皮韧性、可溶性糖、横径等具有较大的载荷值，综合反映了茄子产量、果实、品质等各方面的性状，因此，第1主成分能作为选择综合性状较好的优质茄子种质资源的有效指标。第2主成分的方差贡献率为21.098%，果肉硬度、果皮硬度、茎粗、株高等具有较大的载荷值，主要反映了茄子植株的生长性状。第3主成分的方差贡献率为16.474%，特征向量值较大的是单果质量、横径、色差a、茎粗等，主要反映了茄子的商品性状。第4主成分的方差贡献率为11.444%，特征向量值较大的是游离氨基酸、单果质量和果皮韧性。第5主成分特征向量值中较大的是长度和单果质量，其他指标的载荷值不突出，但增加了整个模型的信息表达量，更能全面反映茄子的综合性状。
表 4 茄子性状评价因子的特征值和累计方差贡献率Table 4 Characteristic value and cumulative variance contribution rate of eggplant evaluation factors主成分 特征值 方差贡献率/% 累计方差贡献率/% 1 4.500 28.125 28.125 2 3.376 21.098 49.224 3 2.636 16.474 65.697 4 1.831 11.444 77.141 5 1.598 9.985 87.126 为了消除不同单位及数据量纲的影响，对各性状指标的原始数据进行了无量纲化处理。根据表5构建了主成分(F1~F5)与茄子各生物学性状(X1~X16)间的线性关系式：
表 5 主成分在各性状指标上的因子载荷矩阵Table 5 Rotated component matrix of the principal component analysis性状 主成分 性状 主成分 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 茎粗(X1) −0.663 0.560 0.407 0.132 0.052 b (X9) 0.431 0.589 −0.525 −0.210 0.253 株高(X2) 0.573 0.402 0.180 0.254 −0.470 果皮硬度(X10) −0.755 0.579 0.237 −0.123 −0.025 株幅(X3) −0.546 −0.573 −0.284 −0.096 −0.155 果皮韧性(X11) 0.509 0.311 0.144 0.422 −0.267 长度(X4) 0.698 −0.168 0.377 0.083 0.529 果肉硬度(X12) −0.660 0.603 0.363 −0.208 −0.022 横径(X5) 0.402 0.376 0.513 −0.443 0.210 可溶性糖(X13) 0.475 −0.050 0.300 −0.115 −0.797 单果质量(X6) 0.191 0.261 0.585 0.539 0.404 可溶性蛋白(X14) 0.766 −0.457 0.125 −0.274 0.162 L (X7) −0.328 −0.758 0.398 0.241 0.132 游离氨基酸(X15) 0.163 0.172 −0.246 0.787 −0.056 a (X8) −0.531 −0.587 0.492 0.257 −0.078 总酚(X16) −0.261 0.178 −0.748 0.366 0.198 $$ \begin{split} {F} _{ {1}}=& {-0.312} {X} _{ {1}} {+0.270} {X} _{ {2}} {-0.258} {X} _{ {3}} {+0.329} {X} _{ {4}} {+0.190} {X} _{ {5}} {+0.090} {X} _{ {6}} {-0.155} {X} _{ {7}} {-0.250} {X} _{ {8}} {+0.203} {X} _{ {9}} {-0.356} {X} _{ {10}} {+0.240} {X} _{ {11}}-\\ &{0.311} {X} _{ {12}} {+0.224} {X} _{ {13}} {+0.361} {X} _{ {14}} {+0.077} {X} _{ {15}} {-0.123} {X} _{ {16}} {；}\\ {F} _{ {2}}= &{0.306} {X} _{ {1}} {+0.220} {X} _{ {2}} {-0.313} {X} _{ {3}} {-0.092} {X} _{ {4}} {+0.205} {X} _{ {5}} {+0.143} {X} _{ {6}} {-0.414} {X} _{ {7}} {-0.321} {X} _{ {8}} {+0.322} {X} _{ {9}} {+0.316} {X} _{ {10}} {-0.170} {X} _{ {11}} +\\ &{0.329} {X} _{ {12}} {-0.027} {X} _{ {13}} {-0.250} {X} _{ {14}} {+0.094} {X} _{ {15}} {+0.097} {X} _{ {16}} {；}\\ {F} _{ {3}}=& {0.251} {X} _{ {1}} {+0.111} {X} _{ {2}} {-0.175} {X} _{ {3}} {+0.233} {X} _{ {4}} {+0.317} {X} _{ {5}} {+0.361} {X} _{ {6}} {+0.246} {X} _{ {7}} {+0.304} {X} _{ {8}} {-0.324} {X} _{ {9}} {+0.146} {X} _{ {10}} {+0.089} {X} _{ {11}}+\\ &{0.224} {X} _{ {12}} {+0.185} {X} _{ {13}} {+0.077} {X} _{ {14}} {-0.152} {X} _{ {15}} {-0.462} {X} _{ {16}} {；}\\ {F} _{ {4}}= &{0.098} {X} _{ {1}} {+0.188} {X} _{ {2}} {-0.071} {X} _{ {3}} {+0.061} {X} _{ {4}} {-0.328} {X} _{ {5}} {+0.399} {X} _{ {6}} {+0.179} {X} _{ {7}} {+0.190} {X} _{ {8}} {-0.156} {X} _{ {9}} {-0.091} {X} _{ {10}} {+0.313} {X} _{ {11}}-\\ &{0.154} {X} _{ {12}} {-0.085} {X} _{ {13}} {-0.203} {X} _{ {14}} {+0.583} {X} _{ {15}} {+0.271} {X} _{ {16}} {；}\\ {F} _{ {5}}= &{0.078} {X} _{ {1}} {+0.149} {X} _{ {2}} {-0.056} {X} _{ {3}} {+0.049} {X} _{ {4}} {-0.260} {X} _{ {5}} {+0.317} {X} _{ {6}} {+0.142} {X} _{ {7}} {+0.151} {X} _{ {8}} {-0.123} {X} _{ {9}} {-0.072} {X} _{ {10}} {+0.248} {X} _{ {11}}-\\ &{0.122} {X} _{ {12}} {-0.068} {X} _{ {13}} {-0.161} {X} _{ {14}} {+0.463} {X} _{ {15}} {+0.215} {X} _{ {16}} {。} \end{split} $$ 在主成分分析基础上，以5个主成分和每个主成分对应特征值占提取主成分总特征值之和的比例作为权重，计算主成分综合模型(F)：F=0.28F1+0.21F2+0.16F3+0.11F4+0.10F5，根据综合模型计算不同茄子品种的综合性状得分(表6)。结果表明，‘亮紫7号’的综合性状最好，其次是‘Z1’，‘紫龙7号’的综合性状最差。
表 6 不同茄子品种性状预测评价结果Table 6 Characteristics prediction results of different eggplant varieties品种 F1 F2 F3 F4 F5 F 排名 ‘紫龙5号’ 0.08 0.66 −1.81 0.44 0.35 −0.05 6 ‘紫龙7号’ −1.87 −1.36 −1.88 0.18 0.14 −1.08 10 ‘亮紫7号’ 1.19 1.54 0.20 3.08 2.45 1.27 1 ‘浙茄10号’ −0.62 −1.72 −0.16 0.08 0.06 −0.55 7 ‘杭茄716’ −2.58 2.68 2.64 −0.87 −0.69 0.10 5 ‘杭茄718’ −2.19 −1.22 0.24 0.99 0.78 −0.64 8 ‘Z1’ 2.98 0.63 0.59 −0.75 −0.59 0.92 2 ‘Z2’ 2.96 0.47 −1.44 −1.29 −1.02 0.45 3 ‘Z3’ −1.72 1.38 −0.94 −1.69 −1.34 −0.66 9 ‘杭茄2020’ 1.76 −3.06 2.57 −0.17 −0.13 0.23 4 3. 讨论
中国茄子种质资源一般采用形态学的方法进行分类。近年来，分子标记在茄子种质资源分类上开始广泛应用。易金鑫[25]根据茄子形态学分类指标，将亚洲部分茄子种质资源分为野生茄、半栽培茄、栽培短茄(圆茄、卵茄)和栽培长茄。连勇等[26]根据各地区主要种植茄子果形、果色的差异，将国家蔬菜种质资源中期库保存的茄子及其近缘野生种资源分为7 个地方品种类型分布区，即圆果形茄子区(北京、河北、山东等)、紫色卵圆(高圆)形茄子区(新疆、宁夏、甘肃等)、黑紫色长棒形茄子区(黑龙江、辽宁、吉林等)、紫色棒形及卵圆形茄子区(云南、重庆、四川等)、紫红色长果形茄子区(广东、广西、海南等)、紫红色长棒形及卵圆形茄子区(安微、湖南、江西等)和紫红色长条形茄子区(浙江、上海、福建等)。本研究采用的10个茄子品种都是紫红色长条形茄子。对茄子农艺性状、果实性状及品质特性等进行测定，发现不同品种的株高、株幅、茎粗等农艺性状差异显著，果实长度、质地、果皮颜色等也存在较大差异，可溶性糖、可溶性蛋白、游离氨基酸等品质指标差异显著。这与前人研究结果一致[9−11]。房超等[27]采用简单重复序列(SSR)标记对83份茄子种质资源进行多样性和聚类分析，发现茄子栽培种和其近缘野生种存在明显差异，并将供试材料分为4大类群。赵德新[28]对55份茄子种质材料进行形态标记和简单重复序列区间扩增(ISSR) 标记聚类分析，发现果形是茄子分类比较稳定的划分标准。本研究采用主成分分析也发现，第1主成分中果实长度和横径均具有较大的载荷值，说明果形可以作为选择综合性状较好的优质茄子种质资源的重要指标。
果实质地特性可以反映产品的耐贮性。本研究发现‘杭茄716’的果实硬度和果皮硬度均显著高于其他品种，说明该品种的耐贮性比较好。主成分分析法能简化测定指标，提取主要因子，借助计算机软件对其进行综合分析与排序。李伟等[29]利用主成分分析法评价不同地区35个品种杨梅Myrica rubra的综合品质，筛选出了品质较佳的杨梅品种。滕芝妍等[18]对南瓜进行主成分分析，揭示了不同品种南瓜果实品质的差异。本研究对10个茄子品种进行主成分分析，得到5个主成分，影响力较大的是株高、果实长度、果皮韧性、可溶性糖质量分数等，综合反映了植株生长、果实性状、果实品质等方面性状，较客观地揭示了茄子种质资源特征。不过，茄子生长发育受到生长环境和气候条件的影响，下一步可以基于主成分分析法针对不同季节、不同区域和不同栽培条件下的茄子品种进行综合评价。
4. 结论
本研究测定了10个茄子品种的植株生长、果实商品性状及品质性状等16个相关指标，比较茄子品种间的差异，并在此基础上采用主成分分析法对不同茄子品种进行综合评价，确立了茄子评价综合得分模型。10个品种中，‘亮紫7号’的综合性状最好，其次是‘Z1’，而‘紫龙7号’的综合性状最差。该模型能够全面反映不同茄子品种的综合性状差异，可为茄子种质资源筛选和新品种选育提供理论依据和技术支撑。
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图 2 梅花与其他物种WRKY氨基酸序列的比对
Figure 2 Amino acid sequence of WRKY between P. mume and other species
图 4 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2蛋白质的二级结构
Figure 4 Secondary protein structure of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2
图 5 梅花与其他物种WRKY氨基酸序列系统进化树分析
Figure 5 Phylogenetic tree analysis of the amino acid sequence of P. mume and other species
图 6 非生物和ABA处理下的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达
Figure 6 Expression levels of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 under abiotic stress and ABA
表 1 基因克隆及表达所用引物序列
Table 1. Primers used in Gene clone and Quantitative real-time PCR
用途 引物名称 序列(5′→3′) 基因克隆 PmWRKY2-1F ATGGCTGGCATCGATGA PmWRKY2-1R CTACATCTGTGGTCCAAG PmWRKY2-2F ATGGGATTTTTAAGAACC PmWRKY2-2R CTAGTACGATTGATGACTGCTTC 实时荧光定量PCR QPmWRKY2-1F GTCCCCTTATCTGACAATACCTC QPmWRKY2-1R AAAGCGAATGAAGTATTTATGTCCT QPmWRKY2-2F TCCGTTGCTTCCTCCCAATGATGAC QPmWRKY2-2R CAAAATCTATTGGTTGTTGCTCC QPmEF1αS CGGATTCAATGTTAAGAATGTTGC QPmEF1αA AGAACTGGAGCATATCCGTTACC 
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