下载:
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类黄酮物质参与植物多种生理活动，不仅能为植物生长发育提供帮助，同时还在植物抵抗逆境胁迫方面发挥作用[1]。黄烷酮3-羟化酶(F3H)作为类黄酮代谢途径上游的关键酶之一，负责催化形成二氢黄酮醇，之后经过花青素和黄酮醇合成途径形成各种类黄酮衍生物[2]。F3H在基因及蛋白结构上高度保守，其底物特异性较强，需要在2-氧化戊二酸盐、分子氧、亚铁离子(Fe2+)和抗坏血酸盐的辅助下发挥作用，所以在分类上也被归为2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(2-ODD)家族[3−4]。目前，在草莓Fragaria vesca、红花Carthamus tinctorius、拟南芥Arabidopsis thaliana、茶Camellia sinensis、黄花红砂Reaumuria trigyna、独行菜Lepidium apetalum和铁皮石斛Dendrobium officinale等植物中相继报道了关于类黄酮合成关键酶基因F3H的调控研究[5−11]。在功能上，F3H基因对植物的颜色着色有重要作用。苹果 Malus domestica MdLUX和MdPCL-like通过其启动子区域DNA低甲基化以及激活MdF3H，促进果皮中的花青素合成[12]。在草莓中，RNAi介导的F3H基因沉默导致花青素及黄酮醇显著降低，产生无色的草莓果实[5]。此外，F3H基因表达受到多种植物激素的正调控，其转录水平的增加也能提高植物对非生物和生物胁迫的耐受能力[13]。番茄 Solanum lycopersicum SlF3HL能在低温胁迫中刺激转基因烟草 Nicotiana tabacum合成类黄酮物质，使烟草耐冷性提高[14]。CtF3H在不同表型和化学型的红花中作用不同，在茉莉酸甲酯(MeJA)刺激下，CtF3H在花橙黄色型红花中高表达，并与醌式查尔酮和黄酮醇的积累有关，但在花白色型红花中低表达且不影响黄酮醇的积累[6]。
掌叶覆盆子Rubus chingii是中国特色的药食同源植物，也是浙江省新“浙八味”之一，具有补肝益肾、固精缩尿等功效[15]。相关研究表明掌叶覆盆子富含20多种黄酮类活性成分，具有抗菌抗炎等多种药理活性[16−17]。然而掌叶覆盆子类黄酮生物合成及转录调控机制尚不清晰。本研究克隆得到1个掌叶覆盆子类黄酮生物合成途径关键酶基因RcF3H的全长序列，并对其进行生物信息学分析，同时利用转录组和实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析RcF3H基因在不同组织、果实发育期以及MeJA刺激下的表达特征，为后期解析RcF3H对掌叶覆盆子类黄酮代谢的调控机制提供参考。
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掌叶覆盆子植物材料来自杭州市富阳环山掌叶覆盆子种植基地(29.93°N，119.95°E)。4个发育阶段(青果、青转黄果、黄果、红果)的掌叶覆盆子果实于2022年4—5月陆续采收。
激素MeJA处理：于2022年4月，选择生长状态良好的1年生掌叶覆盆子植株，使用100 μmol·L−1的MeJA溶液喷施叶片的正、反两面做胁迫处理(MJ)，以清水为对照组(ck)。每2 d喷施1次，处理7 d后，采集每组植株从上往下的第2张叶片作为样本。各3个重复，液氮速冻处理后放于−80 ℃低温冰箱保存。
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使用FastPure® Universal Plant Total RNA Isolation Kit提取试剂盒(RC411)，提取掌叶覆盆子植物样本总RNA。使用分光光度计(NanoDrop 2000)检测提取掌叶覆盆子总RNA浓度。使用Evo M-MLV反转录试剂盒Ⅱ(AG11711)反转录合成掌叶覆盆子cDNA。总RNA和cDNA分别放入−80和−20 ℃低温冰箱保存备用。
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根据掌叶覆盆子基因组文件[18]得到RcF3H基因的参考序列。使用Primer Premier 6.0设计RcF3H基因的扩增引物(表1)。引物合成由浙江尚亚生物技术有限公司完成。PCR扩增体系：ddH2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL (10 μmol·L−1)，掌叶覆盆子cDNA模板1 μL，12.5 μL PrimeSTAR Max premix(R045A)。PCR扩增程序：94 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 70 s，35个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃ 保温。反应结束后将PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测并使用产物纯化试剂盒(DC301)回收。最后将RcF3H基因片段连接到pMD19-T载体上(D102A)，热激法转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态，挑取阳性单克隆进行菌液PCR鉴定，由浙江尚亚生物技术有限公司测序分析。
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequence for this study
引物名称 引物序列(5′→3′) 引物用途 β-actin-F ATCCACGAGACTACATACAACTCC 内参基因 β-actin-R CTGTCTGCAATACCAGGGAAC RcF3H-F ATGGCTCCTACACCTACTAC 序列扩增 RcF3H-R AGCAAAAATACCATCCACTT RcF3H-qPCR-F CAAAGTGGCCTACAACCAATTC 荧光定量 RcF3H-qPCR-R CCTCGACAATCTTCTTGCAAATC -
使用Gene Structure Display Server网站分析RcF3H基因结构，并使用IBS 2.0作图。使用Expasy ProtParam tool网站预测掌叶覆盆子RcF3H蛋白的分子量、等电点等基本理化性质；通过Plant-mPLoc网站预测RcF3H蛋白的亚细胞定位情况。使用Expasy Protscale网站分析掌叶覆盆子RcF3H蛋白亲疏水性；使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)中的CD-Search分析RcF3H蛋白的保守结构域。
使用SOPMA网站预测RcF3H蛋白的二级结构，利用Swiss-Model网站预测RcF3H蛋白的三维结构。从NCBI数据库的Protein Blast中下载与RcF3H有较高同源性的蔷薇科Rosaceae植物的F3H蛋白序列，使用DNAMAN软件进行多序列比对；使用MEGA 7软件将拟南芥、水稻Oryza sativa等单、双子叶其他科属植物的F3H蛋白序列采用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树(bootstrap值设置为1 000，其余参数默认)，并利用ChiPlot作图。使用PlantCARE网站获得RcF3H基因前2 000 bp的启动子序列，检索得到顺式作用元件[19−20]。
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参考掌叶覆盆子的组织转录组数据[18]，分析不同组织下RcF3H基因相对表达量，并使用TBtools 软件绘制热图。
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以反转录合成的掌叶覆盆子cDNA为材料，使用Primer Premier 6.0设计RcF3H基因的RT-qPCR引物(表1)。引物由浙江尚亚生物技术有限公司合成。RT-qPCR反应方法参照文献[21]，使用iTaq™ universal SYBR® Green supermix (1725121)以及荧光定量PCR仪(ABI 7500)完成。RT-qPCR反应体系：iTaq™ universal SYBR® Green supermix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL (10 mmol·L−1)，cDNA模板1 μL (50 mg·L−1)，ddH2O 3 μL。RT-qPCR反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s ，40个循环。结果以掌叶覆盆子β-actin为内参基因，采用2–∆∆Ct法[22]计算RcF3H基因相对表达量。
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数据使用Excel 2021进行统计分析。使用SPSS 26进行单向方差分析以及t检验，使用GraphPad Prism 8作图。
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以反转录合成的掌叶覆盆子cDNA为模板，成功扩增得到目的基因片段(图1A)。对基因片段进行切胶回收，连接转化至DH5α感受态，12 h后对阳性单克隆菌液进行PCR验证并测序分析。结果显示：目的片段长度为1 098 bp，将其命名为RcF3H。RcF3H基因定位于第1条染色体内，由1个外显子构成，共编码了365个氨基酸(图2)。
图 1 掌叶覆盆子RcF3H基因克隆(A)、基因结构与染色体定位(B)
Figure 1. Gene cloning (A) and gene structure and chromosome localization (B) of RcF3H genes in R. chingii
图 2 掌叶覆盆子RcF3H核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
Figure 2. Nucleotide sequence and its encoded amino acid sequence of RcF3H genes in R. chingii
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RcF3H蛋白分子式为C1831H2900N498O553S13，相对分子量为65.16 kDa；理论等电点为5.64；脂肪系数为83.32；不稳定系数为38.22，属于稳定蛋白。亚细胞定位预测表明：该蛋白定位在细胞质上。
蛋白亲疏水性分析表明：RcF3H蛋白属于亲水性蛋白；蛋白平均亲水指数为−0.448，大部分区域表现出亲水性，最大疏水分值(−2.756)位于肽链第145位氨基酸，最大亲水分值(2.022)位于肽链第44位氨基酸(图3)。
图 3 掌叶覆盆子RcF3H蛋白的亲/疏水性预测
Figure 3. Hydrophilic/hydrophobic prediction of RcF3H genes in R. chingii
蛋白结构域分析发现：RcF3H蛋白属于2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族，拥有2OG-FeⅡ_0xy区域以及PLN02515和Pcb C等2个保守结构域(图4)。
图 4 掌叶覆盆子RcF3H蛋白保守结构域预测
Figure 4. Protein conserved domain of RcF3H protein in R. chingii
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RcF3H蛋白的二级结构预测发现：该蛋白存在α-螺旋、β-折叠、直链延伸和无规则卷曲4种结构，其中以α-螺旋和无规则卷曲占比最大，分别占37.53%和38.63%，而直链延伸和β-折叠分别占18.36%和5.48% (图5)。此外，以石榴Punica granatum蛋白(编号：A0A218XVH5.1)为模板，对RcF3H蛋白的三级结构进行建模。建模的三级结构覆盖率为92.31%，序列一致性为85.75%。该结果与二级结构预测结果一致。
图 5 掌叶覆盆子RcF3H蛋白二级结构(A)与三级结构(B)预测
Figure 5. Protein secondary structure (A) and tertiary structure (B) of RcF3H protein in R. chingii
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多序列比对分析发现：蔷薇科F3H蛋白序列具有很高的相似度，其中RcF3H与插田泡Rubus coreanus、草莓和玫瑰Rosa rugosa的相似性超过95%，与樱桃李Prunus cerasifera、欧洲甜樱桃Prunus avium和西洋梨Pyrus communis相似性接近90% (图6)。系统进化树分析发现：RcF3H与蔷薇科插田泡蛋白(编号：ABW74548.1)的亲缘关系最密切。同科属的F3H蛋白在系统进化上处于同一分支。与单子叶植物相比，掌叶覆盆子RcF3H与双子叶植物关系更密切，属于同一亚组(图7)。以上结果说明掌叶覆盆子RcF3H蛋白在生物进化过程中较为保守。
图 6 掌叶覆盆子RcF3H蛋白序列与其他植物F3H蛋白的同源性比对
Figure 6. Homology comparison of RcF3H protein in R. chingii protein sequences with other plant F3H proteins
图 7 掌叶覆盆子RcF3H与其他植物F3H蛋白的系统进化树
Figure 7. Phylogenetic tree of RcF3H protein in R. chingii with other plant F3H proteins
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RcF3H基因启动子中具有大量相对保守的CAAT-box和TATA-box。根据顺式作用元件功能的不同，可以将其分为植物生长发育、激素响应以及胁迫响应3个类别(表2)。RcF3H基因启动子顺式作用元件有2个植物生长发育的顺式调控元件；在激素响应中茉莉酸响应元件数量最多，赤霉素和生长素次之。此外，RcF3H基因在胁迫响应上包含有多数响应光照元件以及少量应对厌氧、缺氧、防御和应激、低温以及干旱的顺式作用元件。以上结果表明：RcF3H基因在辅助掌叶覆盆子响应激素和应对胁迫上发挥了重要作用，且可能受外界刺激后调控合成类黄酮物质。
表 2 掌叶覆盆子RcF3H基因启动子顺式作用元件分析
Table 2. Analysis of cis-regulatory elements of RcF3H promoter in R. chingii
类别 元件名称 数量 功能 植物生长发育 Circadian 1 参与昼夜节律控制的顺式调控元件 O2-site 2 玉米蛋白代谢调控的顺式调控元件 激素响应 AuxRE 1 生长素反应元件的一部分 CGTCA-motif 1 参与茉莉酸反应性的顺式作用元件 TGACG-motif 1 参与茉莉酸反应性的顺式作用元件 MYC 6 激素响应元件 P-box 1 赤霉素响应元件 Myb 1 MYB识别位点 MYB 1 MYB识别位点 MYB-like sequence 1 MYB识别位点 胁迫响应 ARE 3 对厌氧诱导必要的顺式调节元件 GC-motif 2 参与缺氧特异性诱导性的增强子元件 LTR 1 参与低温反应的顺式元件 MBS 1 MYB结合位点参与干旱诱导 STRE 1 胁迫响应元件 as-1 1 胁迫响应元件 TC-rich repeats 1 参与防御和应激反应的顺式作用元件 Box 4 2 参与光反应的保守DNA模块 GATA-motif 1 光响应元件的一部分 GT1-motif 3 光响应元件 Sp1 1 光响应元件 W box 1 诱导子响应元件 -
由图8A可知：RcF3H基因在掌叶覆盆子的根、茎、叶和果实中表达；其中青果中的相对表达量最高，分别是根的1.18倍，茎的5.05倍，叶片的46.00倍。表明RcF3H可能与掌叶覆盆子果实的生长发育有关。进一步分析在果实发育成熟过程中RcF3H基因的相对表达量。由图8B可知：RcF3H基因表达在青果期表达量最高，并在发育成熟过程表达量逐渐下降，该趋势与类黄酮质量分数变化一致[23]。启动子顺式作用元件分析发现：掌叶覆盆子RcF3H基因前2 000 bp启动子上存在响应MeJA的顺式作用元件(表2)。结合RT-qPCR技术发现：掌叶覆盆子RcF3H基因经过MeJA诱导处理后基因表达明显上升(图8C)。
图 8 掌叶覆盆子RcF3H不同组织(A)、不同果实发育阶段(B)及MeJA诱导处理(C)的表达分析
Figure 8. Expression analysis of RcF3H in different tissues (A), different fruit development stages (B) and MeJA induction treatment (C) in R. chingii
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本研究从掌叶覆盆子cDNA中克隆得到了完整的RcF3H基因序列，该基因由1条外显子构成，全长1 098 bp，编码了365个氨基酸。蛋白序列比对后发现：掌叶覆盆子RcF3H蛋白与蔷薇科插田泡等6种植物F3H的同源关系较近。蛋白质是细胞的功能分子，基因功能的主要执行者。掌叶覆盆子RcF3H拥有 2OG-Fe(Ⅱ)-Oxy结构以及2个典型的PLN02515和Pcb C保守结构域，亚细胞定位预测该蛋白位于细胞质中。一些蛋白质需要转移至特定的位置后才能发挥作用，信号肽能引导新合成的蛋白质向分泌通路转移[24]。RcF3H蛋白为稳定的亲水性蛋白，蛋白二级和三级结构分析发现：RcF3H主要以α-螺旋和无规则卷曲缠绕形成。系统进化树分析发现：RcF3H蛋白与单子叶植物亲缘关系较远，与双子叶植物亲缘关系较近且处于同一亚组，说明在进化过程中RcF3H基因较保守。
转录调控对基因表达起着很大的作用，主要通过基因的启动子及其相关的顺式作用元件控制[25]。对RcF3H启动子分析发现：其拥有茉莉酸、赤霉素和生长素等响应元件。RcF3H基因在MeJA处理7 d后表达量上调了1.68倍。在拟南芥中，茉莉酸和脱落酸能够调控类黄酮生物合成中AtF3H的表达[26]。MeJA处理绿熟期的樱桃番茄S. lycopersicum ‘Xin Taiyang’果实后，促进了类黄酮的积累，其类黄酮代谢途径中PAL1、C4H以及F3H等基因表达水平上调[27]。掌叶覆盆子RcF3H启动子还存在逆境胁迫响应有关的作用元件。黄花红砂在受到UV-B和干旱胁迫后，其RsF3H酶活性增加，类黄酮生物合成产物积累增多[28]。说明RcF3H基因可能在激素和逆境胁迫上发挥作用，调节类黄酮物质的合成来提高对环境适应性。
进一步探究掌叶覆盆子RcF3H表达与类黄酮的关系。RcF3H在掌叶覆盆子的根、茎、叶和果实中表达且具有组织特异性。RcF3H在青果中表达量最高，并在果实成熟过程中表达量逐渐下降，推测RcF3H可能与果实发育有关。随着掌叶覆盆子果实发育成熟，椴树苷和山奈酚-3-O-芸香糖苷等各种黄酮化合物会逐渐减少[23]，这与RcF3H表达变化趋势一致，推测RcF3H可能促进类黄酮的积累。一些研究报道了MeJA能促进类黄酮的生物合成[26−27]。掌叶覆盆子RcF3H能响应外源MeJA的刺激，其表达量相较于对照组上升了1.68倍，而MeJA促进掌叶覆盆子类黄酮代谢未见报道。综上所述，掌叶覆盆子RcF3H在多个组织器官中发挥生物学功能，并能影响类黄酮的积累。此外，具体的生物学功能验证以及调控机制解析也有待进一步研究。
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本研究在掌叶覆盆子中鉴定克隆了2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族基因RcF3H，该基因蛋白定位于细胞质，与双子叶植物同源性较高。该基因启动子上存在大量与激素和逆境响应相关的元件。RcF3H在多个器官中均有表达且具有组织特异性，并随果实成熟表达量逐渐下降。外源MeJA的刺激处理可提高RcF3H基因的表达。本研究初步解析了RcF3H在掌叶覆盆子类黄酮物质积累中的作用，为进一步研究其分子机制提供参考。
Cloning and expression analysis of RcF3H in Rubus chingii
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摘要:
目的 黄烷酮3-羟化酶(F3H)是植物类黄酮合成的关键酶。研究掌叶覆盆子Rubus chingii RcF3H基因与类黄酮代谢的关系并分析其生物学功能，可为进一步探究RcF3H在掌叶覆盆子类黄酮物质积累过程中的作用机制提供参考。 方法 在掌叶覆盆子中克隆RcF3H基因，并进行生物信息学分析，包括理化性质、同源性比对、系统进化树和启动子顺式作用元件等。检测RcF3H基因在不同组织器官、果实生长时期以及在外源茉莉酸甲酯(MeJA)诱导下的表达水平。 结果 2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(2-ODD)家族基因RcF3H位于第一条染色体，片段长度为1 098 bp，由1个外显子构成，共编码了365个氨基酸。RcF3H属于亲水性稳定蛋白，亚细胞预测定位在细胞质上。RcF3H蛋白的二、三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成，与插田泡Rubus coreanus及拟南芥 Arabidopsis thaliana等双子叶植物的亲缘关系最近。RcF3H基因启动子区域含有多个顺式作用元件，功能集中于响应激素和应对胁迫等方面。RcF3H基因在掌叶覆盆子果实中表达量较高，有明显的组织特异性。RcF3H基因表达变化与类黄酮物质在掌叶覆盆子果实中积累规律一致，并在100 μmol·L−1 MeJA处理下表达量上升。 结论 RcF3H 响应外源MeJA刺激，并可能作为掌叶覆盆子类黄酮生物合成的正向调节因子，影响类黄酮的积累。图8表2参28 Abstract:Objective Flavanone 3-hydroxylase (F3H) is a key enzyme in the synthesis of plant flavonoids. This study aims to investigate the relationship between RcF3H gene and flavonoid metabolism in Rubus chingii and analyze its biological function, so as to provide reference for further exploring the mechanism of RcF3H in the process of flavonoid accumulation in R. chingii. Method RcF3H gene was cloned from R. chingii, and bioinformatics analysis was performed, including physicochemical properties, homology comparison, phylogenetic tree and promoter cis-acting elements. At the same time, this study detected the expression level of RcF3H gene in different tissues, fruit growth period and exogenous methyl jasmonate (MeJA) induction. Result RcF3H gene, belonging to the 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase superfamily, was located on the first chromosome, and its fragment length was 1098 bp. RcF3H gene consisted of 1 exon and encoded 365 amino acids. RcF3H belonged to the hydrophilic stable protein. Subcellular localization predicted that the protein was located in the cytoplasm. The secondary and tertiary structure of RcF3H was mainly composed of α-helix and irregular curl, which had the closest genetic relationship with dicotyledons such as Rubus coreanus and Arabidopsis thaliana. Analysis of promoter cis-acting elements showed that the promoter region of RcF3H gene contained multiple cis-acting elements, and its function mainly focused on responding to hormones and stress. RcF3H gene was highly expressed in fruits, and had obvious tissue specificity. In addition, the expression of RcF3H gene in different ripening stages of fruits was consistent with the accumulation of flavonoids, and the expression increased under the treatment of 100 μmol·L−1 MeJA. These results suggested that RcF3H gene is the key enzyme to promoting flavonoid synthesis.Conclusion RcF3H gene responds to MeJA stimulation and may act as a positive regulator of flavonoid biosynthesis in R. chingii, affecting flavonoid accumulation. [Ch, 8 fig. 2 tab. 28 ref.] -
Key words:
- Rubus chingii /
- flavanone 3-hydroxylase /
- gene cloning /
- expression analysis /
- flavonoids
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除黑龙江、吉林、内蒙古和新疆4省(区)外，中国其余省(区、市)都有竹类生长和分布。据第8次(2009−2013年)森林资源清查，中国竹林面积达601 万hm2，占中国森林面积的3%，占世界竹林面积约20%[1]。在廊道旁、公园、古寺庙、风景区等地方种植竹子以增加景观优质性，是园林配置的一部分。竹林分布广，面积大，因此需要考虑竹林保护与防火等问题。有些竹种具有一定的防火能力，被作为防火植物使用，如毛竹Phyllostachys edulis、雷竹Ph. praecox等[2-3]。对于竹子的燃烧性能方面国内外研究较少，但是在森林可燃物的燃烧性和抗火性方面，国内外都进行了大量研究[4-9]。李树华等[10]认为：在火灾危险带种植刚竹Ph. sulphurea等植物可以减缓火势蔓延。钟安建等[11]对南昌城区15种园林树种的抗火性进行研究，认为珊瑚树Viburnum odoratissimum抗火性能最强，桂花Osmanthus fragrans抗火性能最差。金钱荣等[12]将木荷Schima superba选为防火功能较强的行道绿化树种。李世友等[13]对20种园林绿化植物的鲜枝叶进行燃烧试验及燃烧性排序。何忠华等[14]对12种园林树种的抗火性进行了综合评价，认为乐昌含笑Michelia chapensis抗火性最强。森林植物叶燃烧性研究方法可以为竹叶研究提供借鉴。张雨瑶等[15]对11种园林木本植物的新叶片和2种对比植物老活叶片进行了垂直燃烧实验，认为鹅掌楸Liriodendron chinense等燃烧性较强。氧指数试验法主要用于测定聚合材料的阻燃性能，如对于各种纺织品[16]、玻璃纤维增强塑料[17]、聚氯乙烯(PVC)管[18]、橡胶[19]等阻燃性能的测定，在森林可燃物研究方面的应用较少。本研究对17种园林竹鲜叶进行燃烧性比较，旨在分析园林竹鲜叶的易燃性差异，为竹林保护与防火提供依据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
以17种园林竹为研究对象(括号中数字为样品代号)，车筒竹Bambusa sinospinosa (1)、慈竹Neosinocalamus affinis (2)、灰金竹Phyllostachys nigra var. henonis (3)、灰香竹Chimonocalamus pallens (4)、料慈竹B. distegia (5)、龙竹Dendrocalamus giganteus (6)、绵竹B. intermedia (7)、青皮竹B. textilis (8)、沙罗单竹Schizostachyum funghomii (9)、秀叶箭竹Fargesia yuanjiangensis (10)、小佛肚竹B. ventricosa (11)、孝顺竹B. multiplex (12)、野龙竹D. semiscandens (13)、椅子竹D. bambusoides (14)、油竹B. surrecta (15)、云南甜龙竹D. hamiltonii (16)、紫竹Ph. nigra (17)。以5种常见易燃园林绿化用木本植物的老叶作对比，即阴香Cinnamomum burmanni (18)、桂花Osmanthus fragrans (19)、滇润楠Machilus yunnanensis (20)、蓝桉Eucalyptus globulus (21)、云南樟C. glanduliferum (22)。所有植物均栽植于西南林业大学校园内。由于新叶含水率呈动态变化，而老叶含水率相对稳定且易燃，故选老叶为实验样品。取叶时，选多株、不同枝条上外形和大小相似、质量相近的多片竹叶，于防火期采集健康的完整分枝，立刻带回实验室。
1.2 实验方法
采集同枝条上的老叶，分为2组，分别进行燃烧实验和含水率测定。燃烧实验前测定鲜叶质量、叶脉长度并在白纸上勾绘出鲜叶外形，实验在高浓度医用氧条件下进行，点火气体为丙烷气。将竹叶叶尖朝上、叶柄朝下放入试件夹中，点火器火焰长度为10~15 mm，从上朝下点火，用秒表记录竹叶燃烧时间。每种鲜叶重复6次实验。含水率(H)测定采用105 ℃烘干恒量法，取相对含水率。实验采用JF-3型氧指数测定仪进行。
1.3 数据获取及计算方法
叶片单位面积质量(W)、绝对线速率(V1)、绝对面积损失速率(V2)、绝对质量损失速率(V3)、相对线速率(V4)、相对面积损失速率(V5)和相对质量损失速率(V6)参照李世友等[6]、张雨瑶等[15]、郑永波等[20]和苏文静等[21]方法进行。
1.4 数据处理
运用SPSS 18.0软件，以平均V1、V2、V3、V4、V5、V6等6个指标进行因子分析，得到22种植物鲜叶的燃烧性能得分并排序。根据燃烧性能得分，应用聚类分析法划分等级。采用因子分析法对数据进行标准化处理，通过KMO值和Bartlett球体检验提取公因子，利用旋转法使因子变量更具有可解释性，计算因子变量得分。
2. 结果与分析
2.1 含水率、单位面积质量及燃烧速率
由表1可知：22种植物鲜叶的含水率和单位面积质量均差别较大，5种木本植物鲜叶单位面积质量均大于竹叶。单位面积质量最小、含水率较小的秀叶箭竹，燃烧速率最大。单位面积质量最大、含水率较大的云南樟，燃烧速率最小。含水率最大、单位面积质量较小的椅子竹，燃烧速率较小。含水率最小、单位面积质量中等的车筒竹，燃烧速率接近最大值。由此可见：鲜叶燃烧速率与单位面积质量、平均含水率有关。
表 1 22种植物鲜叶的含水率、单位面积质量及燃烧速率Table 1 Moisture content, mass per unit area and burning rate of fresh leaves of 22 plants speices代号 H/% W/(g·m−2) 绝对燃烧速率 相对燃烧速率 V1/(cm·s−1) V2/(cm2·s−1) V3/(g·s−1) V4/(%·s−1) V5/(%·s−1) V6/(%·s−1) 1 40.51 146 1.079 0.863 0.012 8.667 8.667 8.667 2 56.99 56 1.349 2.087 0.012 8.566 8.566 8.566 3 51.86 104 0.552 0.541 0.005 6.882 6.882 6.882 4 55.12 104 0.697 0.402 0.004 6.954 6.954 6.954 5 43.84 116 0.642 1.283 0.014 3.140 3.140 3.140 6 58.91 96 0.421 1.320 0.012 2.140 2.140 2.140 7 53.07 92 0.425 0.644 0.006 3.450 3.450 3.450 8 56.73 58 0.981 1.316 0.008 6.820 6.820 6.820 9 42.93 66 1.245 1.486 0.010 7.600 7.600 7.600 10 44.08 53 1.194 1.058 0.006 9.450 9.450 9.450 11 44.27 87 1.171 1.885 0.016 7.583 7.583 7.583 12 46.07 70 0.849 1.040 0.007 7.040 7.040 7.040 13 56.83 70 0.858 2.177 0.016 4.200 4.200 4.200 14 58.97 72 0.520 0.737 0.005 4.700 4.700 4.700 15 55.34 102 0.216 0.345 0.004 1.500 1.500 1.500 16 58.79 84 0.546 1.579 0.013 2.660 2.660 2.660 17 43.15 94 0.521 0.604 0.006 5.140 5.140 5.140 18 52.36 190 0.330 0.977 0.018 2.967 2.967 2.967 19 47.55 322 0.316 0.747 0.037 4.200 3.020 4.400 20 49.12 230 0.173 0.486 0.011 1.767 1.767 1.767 21 46.93 483 0.146 0.228 0.011 0.883 0.883 0.883 22 52.21 185 0.118 0.544 0.010 0.983 1.000 0.983 2.2 数据的标准化处理
由于所获得数据数值不同，单位不同，无法进行比较和计算，因此需要进行无量纲化处理。使用SPSS软件对数据进行标准化处理，结果如表2所示。
表 2 22种植物鲜叶燃烧性评价指标无量纲化后得分Table 2 Fresh leaf combustibility of 22 plants species evaluation index dimensionless points代号 V1 V2 V3 V4 V5 V6 1 1.108 53 −0.270 53 0.134 17 1.396 29 1.403 15 1.393 99 2 1.809 85 1.895 67 0.134 17 1.359 08 1.366 27 1.356 76 3 −0.260 34 −0.840 40 −0.849 73 0.738 69 0.751 40 0.735 89 4 0.116 30 −1.086 40 −0.990 29 0.765 21 0.777 69 0.762 44 5 −0.026 57 0.472 77 0.415 28 −0.639 89 −0.614 88 −0.643 72 6 −0.600 61 0.538 25 0.134 17 −1.008 29 −0.980 00 −1.012 41 7 −0.590 22 −0.658 11 −0.709 17 −0.525 68 −0.501 69 −0.529 43 8 0.853 98 0.531 17 −0.428 06 0.715 85 0.728 77 0.713 03 9 1.539 71 0.832 03 −0.146 95 1.003 20 1.013 56 1.000 61 10 1.407 24 0.074 57 −0.709 17 1.684 76 1.689 04 1.682 67 11 1.347 50 1.538 17 0.696 40 0.996 94 1.007 35 0.994 34 12 0.511 11 0.042 72 −0.568 62 0.796 90 0.809 09 0.794 14 13 0.534 49 2.054 95 0.696 40 −0.249 38 −0.227 85 −0.252 92 14 −0.343 46 −0.493 52 −0.849 73 −0.065 17 −0.045 29 −0.068 58 15 −1.133 09 −1.187 28 −0.990 29 −1.244 07 −1.213 68 −1.248 36 16 −0.275 92 0.996 62 0.274 72 −0.816 72 −0.790 14 −0.820 69 17 −0.340 86 −0.728 90 −0.709 17 0.096 92 0.115 36 0.093 65 18 −0.836 98 −0.068 78 0.977 51 −0.703 62 −0.678 05 −0.707 50 19 −0.873 34 −0.475 83 3.648 09 −0.249 38 −0.658 70 −0.179 18 20 −1.244 78 −0.937 74 −0.006 39 −1.145 71 −1.116 19 −1.149 92 21 −1.314 91 −1.394 34 −0.006 39 −1.471 38 −1.438 96 −1.475 84 22 −1.387 64 −0.835 09 −0.146 95 −1.434 54 −1.396 24 −1.438 97 2.3 KMO值和Bartlett球体检验
因子分析法并不能适用于任何情况，只有当样品数量大于评价指标数量时，才能得出KMO值和Bartlett球体检验结果，判断原始数据是否能够进行因子分析。对标准化后的数据进行KMO值和Bartlett球体检验，结果KMO值为0.625＞0.500，Bartlett检验接近0，说明指标具有相关性，适合做因子分析。
2.4 公因子提取
由表3可知：特征值大于1的公因子有2个，累积方差贡献率达到了89.623%，因此可用来描述22种园林植物鲜叶的燃烧性。
表 3 解释的总方差表Table 3 Interpretation of the total variance table成分 初始特征值 提取载荷平方和 旋转载荷平方和 总计 方差百分比/% 累积/% 总计 方差百分比/% 累积/% 总计 方差百分比/% 累积/% 1 4.114 68.567 68.567 4.114 68.567 68.567 4.084 68.070 68.070 2 1.263 21.056 89.623 1.263 21.056 89.623 1.293 21.553 89.623 3 0.591 9.843 99.466 4 0.031 0.515 99.981 5 0.001 0.019 100.000 6 1.887×10−8 3.145×10−7 100.000 2.5 因子旋转
采用最大方差法(varimax)进行因子旋转，目的是使公因子的相对负荷的方差之和最大，且保持原公共因子的正交性和公共方差总和不变。使每个因子的最大载荷变量数量最小，以简化对因子的解释。利用SPSS软件进行旋转，得到表4因子载荷矩阵。主成分1在绝对线速率(V1)、相对线速率(V4)、相对面积损失速率(V5)、相对质量损失速率(V6)上的载荷系数较大，体现了燃烧性能(f1)。主成分2在绝对面积损失速率(V2)、绝对质量损失速率(V3)的载荷系数较大，体现了燃烧性能(f2)。
表 4 旋转后因子载荷矩阵Table 4 Rotated factor load matrix评价指标 主成分 评价指标 主成分 1 2 1 2 V1 0.949 0.227 V4 0.981 −0.014 V2 0.480 0.718 V5 0.990 −0.600 V3 −0.224 0.850 V6 0.979 −0.007 2.6 计算因子得分
运用SPSS软件得出因子得分系数矩阵(表5)，因子得分模型可表示为：
表 5 因子得分系数矩阵Table 5 Component score coefficient matrix评价指标 主成分 评价指标 主成分 1 2 1 2 V1 0.224 0.125 V4 0.245 −0.066 V2 0.079 0.538 V5 0.250 −0.102 V3 −0.103 0.680 V6 0.244 −0.060 f1=0.224x1+0.079x2−0.103x3+0.245x4+0.250x5+0.244x6；
f2=0.125x1+0.538x2+0.680x3−0.066x4−0.102x5−0.060x6。
其中：xi为V1~V6的数值标准化后的数据，将表2的相关变量相应的代入上式中即得到22种植物鲜叶燃烧性公因子得分。再以各公因子的方差百分比作为权数计算22种植物鲜叶燃烧性综合评价得分。计算公式为：
F= λ1f1+ λ2f2=0.685 67f1+0.210 56f2。
其中：F为22种植物鲜叶的燃烧性能得分，λi为第i个公因子的方差百分比。得分大于0，说明该植物鲜叶的燃烧性能大于22种植物鲜叶燃烧性能的平均水平，反之则比较差；得分越高代表燃烧性能越好。
各植物鲜叶燃烧性能的最后得分及排名如表6所示。由表6可知：5种木本植物得分均小于0，且有2种燃烧性能得分排名最后，说明5种木本植物鲜叶的燃烧性能均低于平均水平。22种植物鲜叶的燃烧性能从大到小的顺序依次为慈竹、小佛肚竹、秀叶箭竹、沙罗单竹、车筒竹、青皮竹、孝顺竹、野龙竹、灰香竹、灰金竹、桂花、料慈竹、紫竹、椅子竹、云南甜龙竹、阴香、龙竹、绵竹、滇润楠、油竹、云南樟、蓝桉。其中，慈竹得分最高，说明最易燃，油竹得分最低，说明最难燃，但较云南樟、蓝桉易燃。具体来看，油竹的含水率较大、单位面积质量较大，在17种竹类中得分最低。秀叶箭竹含水率较小、单位面积质量最小，得分排在前列。蓝桉含水率较大、单位面积质量最大，得分排在最后。进一步说明了鲜叶的燃烧速率与单位面积质量、平均含水率有关。
表 6 22种植物鲜叶的燃烧性能得分及排序Table 6 Combustibility property score and rank of fresh leaves of 22 plants species代号 f1 f2 F 排序 代号 f1 f2 F 排序 1 1.245 11 −0.234 50 0.804 5 12 0.767 30 −0.482 73 0.424 7 2 1.546 36 1.026 31 1.276 1 13 0.031 05 1.700 27 0.379 8 3 0.510 85 −1.232 08 0.091 10 14 −0.072 37 −0.873 29 −0.233 14 4 0.609 57 −1.418 80 0.119 9 15 −1.157 88 −1.172 78 −1.041 20 5 −0.478 60 0.676 99 −0.186 12 16 −0.608 56 0.871 97 −0.234 15 6 −0.844 15 0.532 83 −0.467 17 17 0.014 46 −0.940 74 −0.188 13 7 −0.494 31 −0.792 39 −0.506 18 18 −0.807 66 0.681 30 −0.410 16 8 0.808 52 −0.063 17 0.541 6 19 −0.878 34 2.210 90 −0.137 11 9 1.168 40 0.310 35 0.866 4 20 −1.192 01 −0.405 70 −0.903 19 10 1.638 70 −0.650 80 0.987 3 21 −1.483 82 −0.585 92 −1.141 22 11 1.089 91 1.240 98 1.009 2 22 −1.412 53 −0.399 00 −1.053 21 2.7 聚类分析
应用SPSS软件对17种竹叶的燃烧性能得分进行聚类分析，由图1所示：17种园林竹鲜叶的燃烧性划为易燃和较易燃2个等级。其中，慈竹、小佛肚竹、秀叶箭竹、沙罗单竹、车筒竹、青皮竹、孝顺竹、野龙竹、灰香竹、灰金竹等易燃；料慈竹、紫竹、椅子竹、云南甜龙竹、龙竹、绵竹、油竹等较易燃。
3. 结论与讨论
对17种园林竹和5种易燃木本植物鲜叶燃烧性6个指标的因子分析可知：各植物得分差距较大，最高分与最低分之间相差2.417，说明22种植物鲜叶的燃烧性差距较大。与5种园林木本植物相比，竹叶均为易燃叶。料慈竹、椅子竹、云南甜龙竹、龙竹、紫竹、绵竹和油竹的鲜叶燃烧性能相对较低，尤其是油竹，比桂花、阴香和滇润楠还难燃。绝对线速率(V1)、相对线速率(V4)、相对面积损失速率(V5)和相对质量损失速率(V6)对其燃烧性影响较大。基于17种竹的燃烧性能得分，SPSS聚类分析将其划为易燃和较易燃2个等级，其中易燃竹种10种，较易燃竹种7种。
鲜叶的燃烧性受自身理化性质和生态学、生物学特性等多因素的综合影响。昆明地区旱季降雨稀少，园林竹浇水较为频繁，浇水周期、浇水量和浇水次数对竹叶的含水率造成一定影响。施肥也会影响竹子生理性能。研究表明施氮肥会提高大豆Glycine max的脂肪含量[22-23]；不同磷含量培养液处理下植株幼苗的株高、茎叶生物量和总生物量差异极其显著[24]；不同磷源处理下云南松Pinus yunnanensis幼苗体内磷含量明显不同[25]。施肥对植物化学成份的影响一定程度上也影响其燃烧性。本研究中的竹叶样品采自竹下较低部位；竹子受自身生长因素及光照等外部因素影响，不同空间部位的竹叶生长发育不均衡，也会导致竹叶不同的理化性质和生态学特性。以后的研究中，要尽量减少人工经营措施对实验取样的干扰，并且考虑不同空间部位对竹叶的作用，使样品更具有代表性。本研究根据竹叶的燃烧速率来分析燃烧性，而没有分析理化性质、生态学特性等对燃烧性的影响。因此，以上鲜叶的燃烧性排序及分类是在特定条件下得出的，能否适用于其他条件还需要进一步验证。
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图 1 掌叶覆盆子RcF3H基因克隆(A)、基因结构与染色体定位(B)
Figure 1 Gene cloning (A) and gene structure and chromosome localization (B) of RcF3H genes in R. chingii
图 2 掌叶覆盆子RcF3H核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
Figure 2 Nucleotide sequence and its encoded amino acid sequence of RcF3H genes in R. chingii
图 3 掌叶覆盆子RcF3H蛋白的亲/疏水性预测
Figure 3 Hydrophilic/hydrophobic prediction of RcF3H genes in R. chingii
图 4 掌叶覆盆子RcF3H蛋白保守结构域预测
Figure 4 Protein conserved domain of RcF3H protein in R. chingii
图 5 掌叶覆盆子RcF3H蛋白二级结构(A)与三级结构(B)预测
Figure 5 Protein secondary structure (A) and tertiary structure (B) of RcF3H protein in R. chingii
图 6 掌叶覆盆子RcF3H蛋白序列与其他植物F3H蛋白的同源性比对
Figure 6 Homology comparison of RcF3H protein in R. chingii protein sequences with other plant F3H proteins
图 7 掌叶覆盆子RcF3H与其他植物F3H蛋白的系统进化树
Figure 7 Phylogenetic tree of RcF3H protein in R. chingii with other plant F3H proteins
图 8 掌叶覆盆子RcF3H不同组织(A)、不同果实发育阶段(B)及MeJA诱导处理(C)的表达分析
Figure 8 Expression analysis of RcF3H in different tissues (A), different fruit development stages (B) and MeJA induction treatment (C) in R. chingii
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequence for this study
引物名称 引物序列(5′→3′) 引物用途 β-actin-F ATCCACGAGACTACATACAACTCC 内参基因 β-actin-R CTGTCTGCAATACCAGGGAAC RcF3H-F ATGGCTCCTACACCTACTAC 序列扩增 RcF3H-R AGCAAAAATACCATCCACTT RcF3H-qPCR-F CAAAGTGGCCTACAACCAATTC 荧光定量 RcF3H-qPCR-R CCTCGACAATCTTCTTGCAAATC 
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表 2 掌叶覆盆子RcF3H基因启动子顺式作用元件分析
Table 2. Analysis of cis-regulatory elements of RcF3H promoter in R. chingii
类别 元件名称 数量 功能 植物生长发育 Circadian 1 参与昼夜节律控制的顺式调控元件 O2-site 2 玉米蛋白代谢调控的顺式调控元件 激素响应 AuxRE 1 生长素反应元件的一部分 CGTCA-motif 1 参与茉莉酸反应性的顺式作用元件 TGACG-motif 1 参与茉莉酸反应性的顺式作用元件 MYC 6 激素响应元件 P-box 1 赤霉素响应元件 Myb 1 MYB识别位点 MYB 1 MYB识别位点 MYB-like sequence 1 MYB识别位点 胁迫响应 ARE 3 对厌氧诱导必要的顺式调节元件 GC-motif 2 参与缺氧特异性诱导性的增强子元件 LTR 1 参与低温反应的顺式元件 MBS 1 MYB结合位点参与干旱诱导 STRE 1 胁迫响应元件 as-1 1 胁迫响应元件 TC-rich repeats 1 参与防御和应激反应的顺式作用元件 Box 4 2 参与光反应的保守DNA模块 GATA-motif 1 光响应元件的一部分 GT1-motif 3 光响应元件 Sp1 1 光响应元件 W box 1 诱导子响应元件
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