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松材线虫Bursaphelenchus xylophilus是公认的检疫性有害生物，破坏性地危害欧亚地区的松林资源[1]。松材线虫的生活史分为2个阶段：繁殖阶段和扩散阶段[2]。在温度适宜的夏季和秋季，松材线虫进入繁殖阶段，在树体内经过卵、繁殖型幼虫(J1~J4)，再发育为成虫。在不良环境条件下，松材线虫进入扩散阶段，即滞育型周期，繁殖型J2会转型发育为扩散型J3幼虫和扩散型J4幼虫，在此过程中体内脂滴数量增加，并发生脂滴融合现象，形成超大脂滴或者块状脂肪[3]。扩散型J4幼虫口针退化不取食，依靠消耗体内超大脂滴作为能量侵染新的寄主植物。因此，脂滴对于松材线虫的生存和传播都具有重要作用。中性脂肪(甘油三酯和胆固醇)在线虫中主要以脂滴的形式存在，是松材线虫体内脂肪的主要储存形式[4-6]。松材线虫的肠道是脂类物质沉积的主要场所。由于线虫虫体是透明的，可在显微镜下清楚地看到从头部到尾部的整个肠道，是研究脂肪沉积的一种理想模型[7]。模式线虫秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans可采用染料苏丹黑B、尼罗红和油红O等方法检测脂肪储存和代谢，不同染色方法下脂肪含量的表征呈现一定程度的差异。利用脂溶性的染料苏丹黑B来着色脂滴，脂滴在肠和皮下组织中可见。荧光染料尼罗红和油红O可将脂滴染成红色[8]。目前在松材线虫中尚无相关脂滴染色研究报道，因此，本研究使用不同的染料标记松材线虫体内的脂滴分布，通过使用ImageJ软件测量线虫脂滴的平均像素强度，来表征脂肪含量，确定适合松材线虫脂滴染色的方法[9]。
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松材线虫NXY61虫株为中国林业科学院森林保护研究所从浙江省宁波市罹病马尾松Pinus massoniana中分离获得。使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养的灰葡萄孢Botrytis cinerea来培养繁殖型松材线虫[2]。混合龄期的繁殖型线虫置于PDA培养基上生长3 d，在加入灭菌双蒸水(ddH2O)的贝尔曼漏斗中将线虫从培养基上洗下来，3 000 r·min−1离心3 min，清除上清液。扩散型3龄幼虫从当年采集的疫木中分离，扩散型4龄幼虫从媒介昆虫松墨天牛Monochamus alternatus体内分离。
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将松材线虫用M9缓冲液(3.00 g KH2PO4, 6.00 g Na2HPO4, 5.00 g NaCl, 1 mL 1 mol·L−1 MgSO4，加入蒸馏水定容至1 L)洗涤离心3次(3 000 r·min−1，1 min)；将线虫置于含体积分数为1%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)的M9缓冲液中，4 ℃过夜；−80 ℃冰箱冻融3次；将M9洗涤固定的线虫经梯度体积分数乙醇(25%，50%和70%)分级脱水，每级5 min；随后，在溶于体积分数为70%乙醇的苏丹黑B溶液中进行染色[10]。显微镜观察和拍摄染色后的线虫，并对皮下和肠道内染色的脂滴像素统计。
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将线虫用体积分数为1%多聚甲醛溶液固定，使线虫细胞和亚细胞结构保持稳定状态[9]。线虫和多聚甲醛溶液混合，并于室温摇动2~3 h后，静置使线虫沉降；在−80 ℃冰箱冻融3次，固定后的线虫逐级脱水；在M9缓冲液的线虫沉淀中加入1 mL尼罗红(1 mg·L−1)，在避光的环境下混匀并染色25~30 min，染色期间轻轻翻转离心管，使得虫体均匀接触染料；用1×PBS(8.00 g NaCl，0.20 g KCl，1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，溶于800 mL蒸馏水，用HCl调节溶液pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L)清洗1次，去除线虫表面的染料，然后使线虫自然沉降。最后用显微镜观察拍照。
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用M9缓冲液将松材线虫洗至离心管中，在体积分数为1%多聚甲醛室温或4 ℃固定15~30 min；然后置于−80 ℃冰箱中冷冻15 min，在43 ℃水浴中迅速解冻；低速离心1 min，弃上清；用1×PBS冲洗3次，弃去PBS；用体积分数为1%Triton X-100、异丙醇油红O溶液浸泡30 min；用1×PBS冲洗3次。用异丙醇置于载玻片上，显微镜下观察拍照[11]。
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使用改良的后置油红O染色方案[12]。将油红O溶于异丙醇，制成质量浓度为5.00 g·L−1原液。采用混合法制备油红O工作液(60%的原液和40%的水)。油红O工作液静置后用0.22 mm自旋过滤器过滤。将线虫用体积分数为1%多聚甲醛/PBS在室温下固定摇动30 min；然后立即将样品在冰箱中冷冻干燥15 min，并在自来水中溶解，共3次；低速离心1 min，弃上清；用1×PBS洗涤样品3次，用体积分数为60%异丙醇脱水2 min；用1 mL油红O工作液摇动1 h进行染色。染色后的样品用1×PBS洗涤3次，再水合1×PBS，并安装在琼脂填充的载玻片上，显微镜观察拍照。
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用徕卡荧光正置显微镜(DM4B)使用40×物镜观察固定的尼罗红、油红O和苏丹黑B染色的线虫，用CCD相机(DFC7000T)拍摄16位图像，并用ImageJ(V2.1.4.7)进行图像处理分析。
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将固定后的虫体置于显微镜下观察，与未染色线虫相比，苏丹黑B染色线虫的肠道普遍被染成蓝色(图1)。在实验过程中，用苏丹黑B原溶液染色线虫如图1A~B，显微镜下观察到的脂滴边界不清晰，整条成虫呈现深蓝色；将苏丹黑B稀释60%，染色观察如图1C~D，幼虫和成虫脂滴边界尚清楚，但仍会影响观察松材线虫的脂滴动态变化。
图 1 苏丹黑B、尼罗河红染色线虫中相同脂滴
Figure 1. Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets
尼罗红与苏丹黑B共同标记了肠道周围的脂滴。尼罗红染色线虫在显微镜下观察到部分脂滴呈浅红色(图1E~H)。将配置的母液染料稀释500倍，染色时间30 min，显微成像效果不佳(图1E~F)，大部分虫体脂滴染色不均，其中成虫的色泽较浅。当提高工作液浓度，仅将母液稀释了100倍，为5 mg·L−1, 并将染色时间增加为1 h (图1G~J)，可以分辨分布在成虫肠道周围的圆形大脂滴，而幼虫的脂滴边界相对比较模糊，不便于测量松材线虫脂滴的大小和脂肪存储量。
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在用油红O与后置油红O染色线虫时，培养的同步发育繁殖型线虫和野外采集的扩散型线虫都呈现明显的红色脂滴(图2)。油红O染色如图2A~D，可以观察到，当虫体内出现较多脂滴时，单个脂滴未能良好分离，会影响测量松材线虫脂肪储存量化及繁殖型与扩散型松材线虫的脂滴大小的变化。用后置油红O方法染色线虫结果如图2E~J，在显微镜下观察到脂滴边界清晰，其中J2和J3幼虫大部分较小的脂滴分布在肠道和表皮，并能观察到从幼虫J4到成虫出现小脂滴聚集成大脂滴的现象。扩散型J3较大的脂肪块与扩散型J4脂质小滴之间的脂滴大小变化十分明显。
图 2 油红O、后置油红O染色线虫中相同脂滴
Figure 2. Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus
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通过光学显微镜捕获的苏丹黑B、尼罗红、油红O染色松材线虫脂滴图片，用ImageJ进行图像处理，计算线虫脂滴图片的平均像素强度。图3结果显示：苏丹黑B和后置油红O染色松材线虫脂滴的平均像素强度明显高于尼罗红和油红O染色，其中苏丹黑B染色后整条虫呈现蓝色，所以脂滴平均像素强度最高，而尼罗红的最低，因为颜色较浅。这就说明脂滴平均像素强度偏高或偏低都会影响表征脂肪。经ImageJ图像处理比较分析，后置油红O染色脂滴经计算转换与原始图像的一致，具有单个脂滴的良好分离(图4)。
图 3 使用苏丹黑B、尼罗红、油红O和后置油红O染色的松材线虫脂滴平均像素的ImageJ图像分析结果
Figure 3. ImageJ image analysis results of average pixels of B. xylophilus lipid droplets stained with Sudan black B, Nile red, oil red O, and post-fix oil red O
图 4 后置油红O染色的松材线虫脂滴的图像处理
Figure 4. Image processing of post-fix oil red O stained adipocytes in B. xylophilus
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如表1所示：综合考虑染色方法的简易性、染色时间的长短[11]、染色的观察效果，后置油红O染色方法在4种染色方法中的染色时间相对较短，脂滴呈现的效果比较清晰，能实现脂滴的单个分离，方法步骤比较简单，认为后置油红O染色方法是松材线虫脂滴的最佳染色方法。
表 1 不同染料标记和方法的比较
Table 1. Comparison of different dyestuff markers and methods
染料 储备溶液 脱水步骤 染色时间/min 输出颜色 实现单个脂滴分离 油红O 5 g·L−1异丙醇 30 红色 否 苏丹黑B 体积分数为70%乙醇 乙醇系列 360 深蓝色 否 尼罗红 丙酮 乙醇系列 30 浅红色 否 后置油红O 5 g·L−1异丙醇 体积分数为60%异丙醇 60 红色 是 -
本研究通过使用染料标记的不同测定法来探索松材线虫的最佳脂滴染色方法。在染色前，需要先对虫体进行有效固定，多聚甲醛可很好地保存生物体组织的细微结构特征。固定以后，组织中的各种物质会沉淀和凝固，产生不同的折射率，促使产生光学差异，方便染色后观察。
油红O、苏丹黑B、尼罗红染色一般都能观察到线虫体内脂肪储存，但在本研究中呈现不同显色效果。苏丹黑B作为一种经典的染料，在固定过程中经乙醇的洗涤，无法标记线虫中脂肪储存[9]。本研究也发现：苏丹黑B染色松材线虫脂滴观察效果不佳，染色时间也比较长。尼罗红是一种由尼古蓝衍生的脂类染料，在疏水环境时发荧光，既可染色脂滴，又可检查完整活体动物的脂肪含量[13-15]，经常被作为秀丽隐杆线虫的脂肪酸代谢研究的染料标记。最近研究还发现，鲜活的线虫经尼罗红染色没有显示染色模式的差异[12]。当线虫被喂食尼罗红时，染料会在与溶酶体有关的细胞器中积聚[16]，固定尼罗红比喂食尼罗红更能显示脂肪储存情况。本研究初期观察到的脂滴色泽非常浅，甚至整条线虫未被染色，呈透明状态，经过多步实验探索，线虫中脂滴有部分染色，但仍有染色不完整的脂滴。而且由于尼罗红是亲水性染料，可能会染色脂褐素，导致固定染色不能将中性脂肪存储区与脂褐素区分开，影响结果[17]。油红O是一种油溶性偶氮染料，溶于乙醇和丙酮，在脂肪内能高度溶解，从而染色，颜色比较鲜红，染色效果相对于前面2种染料要好。后置油红O染色用体积分数为1%多聚甲醛的固定液在分子杂交炉中室温条件摇动30 min，通过摇动，使线虫充分接触固定液。将样品放在−80 ℃冰箱中冻融3次，并在自来水中溶解，相比于油红O染色(在43 ℃水浴中迅速解冻)，可增加线虫的缓冲性。在后置油红O染色过程中，异丙醇脱水使线虫显微成像时观察到的组织结构更清晰，用自旋过滤器过滤油红O工作液，可以减少沉淀杂质的产生。用琼脂填充幻灯片成像，可以防止线虫干死，也可以更好地固定已染色的线虫。经过多次实验探究，油红O染色之后，观察到的大小脂滴聚集，脂滴边界未能体现，红色会成片区域出现，当测量脂滴大小变化、脂滴数量时，会加大实验数据误差；后置油红O染色方法经过改良，线虫在室温下用体积分数为1%多聚甲醛摇动，并经多次冻融以后用体积分数为60%的异丙醇脱水，染色效果比较理想，可直接观察脂滴大小变化。综上所述，后置油红O染色方法是最佳松材线虫脂滴染色方法。
Comparison of four lipid droplets staining methods in Bursaphelenchus xylophilus
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摘要:
目的 从4种脂滴染色方法中筛选最适合松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的脂滴染色方法。 方法 采用苏丹黑B染色、尼罗红染色、油红O染色和后置油红O染色等4种染色方法来固定和表征松材线虫体内脂滴的分布，对染色后的线虫进行显微观察和拍摄，并用ImageJ软件对皮下和肠道内染色的脂滴像素进行统计。 结果 4种脂滴染色方法对松材线虫的脂滴都有一定的染色效果。显微拍照后观察脂滴与ImageJ软件图像处理后像素强度比较结果显示：苏丹黑B染色脂滴像素为200.00×1017 m2，尼罗红染色脂滴像素41.64×1012 m2，油红O染色脂滴像素52.12×1017 m2，后置油红O染色脂滴像素83.85×1017 m2。苏丹黑B染色脂滴平均像素强度最高，尼罗红染色脂滴平均像素强度最低，而后置油红O法染色脂滴经计算转换产生了与原始图像一致的表征，实现单个脂滴的良好分离。 结论 综合染色方法的简易、染色时间的长短和染色后的效果，改良后的后置油红O法是最佳的松材线虫脂滴染色方法，能清晰显示脂滴大小及分布。图4表1参17 Abstract:Objective With a comparison of the four commonly used methods for staining Caenorhabditis elegans lipid droplets, this study is aimed to figure out the most suitable dyeing method for Bursaphelenchus xylophilus lipid droplets. Method Four were used to fix and characterize After the distribution of lipid droplets in B. xylophilus was defined with its features revealed employ four dyeing methods including Sudan black B staining, Nile red staining, oil red O staining, and post-fix oil red O staining, the stained nematodes were observed and photographed microscopically, and then ImageJ software was used to count the subcutaneous and intestinal lipid droplet pixels. Result 1) The four dyeing methods have a certain dyeing effect on the lipid droplets of B. xylophilus. 2) Upon the observation of the lipid droplets after microphotographing and the comparison of the pixel intensity after image processing by ImageJ software, the stained lipid droplets pixels with Sudan black B, Nile red, oil red O and post-fix oil red O are 200×1017 m2, 41.64×1012 m2, 52.12×1017 m2, and 83.85×1017 m2 respectively. 3) Lipid droplets stained by Sudan black have the highest average pixel intensity, and lipid droplets stained by Nile red have the lowest average pixel intensity, whereas the lipid droplets stained by post-fix oil red O, after calculation and conversion, produced a consistent characterization with the original image, with a favorable separation of individual lipid droplet. Conclusion In conclusion, in light of the simplicity of the dyeing method, the length of dyeing time and the effect of dyeing, the improved post-fix oil red O method is the optimal method for dyeing lipid droplets in B. xylophilus, with the size and distribution of lipid droplets clearly shown. [Ch, 4 fig. 1 tab. 17 ref.] -
Key words:
- Bursaphelenchus xylophilus /
- lipid droplets staining /
- Nile red /
- oil red O /
- Sudan black /
- post-fix oil red O
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金线莲Anoectochilus roxburghii为兰科Orchidaceae开唇兰属Anoectochilus多年生草本植物，别名金线草、金线兰等，主要分布在中国福建、浙江、云南和台湾等地区。金线莲因含有黄酮类、多糖类、生物碱类等成分[1]，其药用价值日益被重视。由于金线莲对生长环境要求严格，且野生资源被过度采摘，导致金线莲已濒临灭绝[2]，因此有必要开展金线莲资源的保护。种质资源收集和遗传多样性评估是金线莲资源保护的基础研究工作。分子标记可以在DNA水平上揭示植物的遗传变异，是一种稳定可靠的遗传分析方法[3]。简单重复序列间扩增多态性(inter-simple sequence repeat，ISSR)和序列相关扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)主要针对非特异性序列进行扩增，对于基因组序列信息匮乏的物种较为有效[4]。目前，分别利用ISSR、SRAP等单一分子标记对金线莲遗传多样性的评价[5-11]已取得了一定的进展，但单一的分子标记技术经常受到扩增区域限制、引物扩增能力差异、模糊显性标记主观计入等因素影响，不能完全评价生物遗传多样性[12-13]，而综合运用多种分子标记，能最大程度优化聚类分析结果[14-15]。目前，结合ISSR与SRAP分子标记技术已经应用于薄荷Mentha haplocalyx[12]、烟草 Nicotiana tabacum[16-17]、韭菜Allium tuberosum [18]、栀子Gardenia jasminoides [19]等研究。本研究采用ISSR与SRAP相结合的方法对浙江与福建等地引种、杂交与野生的金线莲样品进行研究，揭示金线莲个体间与种源间的遗传分化，为金线莲资源的保护和利用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
48份金线莲新鲜叶片样品详见表1。
表 1 金线莲供试样品信息Table 1 Tested samples of A. roxburghii编号 样品 来源地 编号 样品 来源地 编号 样品 来源地 1 健君1号 浙江温州 17 尖叶自交辐射选育种 福建福州 33 福建网纹种 福建厦门 2 健君2号 浙江温州 18 红霞变异种 福建厦门 34 福建无网纹种 福建厦门 3 金康1号 浙江金华 19 小叶金线莲 福建福州 35 大福星 福建厦门 4 大圆叶 福建厦门 20 温州文成野生种 浙江温州 36 大圆宝 福建厦门 5 健君1号原种 浙江温州 21 尖叶金线莲 福建泉州 37 红霞 福建厦门 6 戴云山野生种 福建泉州 22 大叶金线莲 福建三明 38 健君1号 浙江温州 7 福建永春黄带种 福建泉州 23 云南金线莲 云南昆明 39 尖叶金线莲 福建三明 8 台湾金线莲 台湾高雄 24 野生无纹 福建厦门 40 庆元无网纹 浙江庆元 9 台湾金线莲 台湾高雄 25 尖叶红杆种 福建福州 41 福建金草繁育种 福建厦门 10 无纹(G) 福建三明 26 尖叶变异筛选种 福建福州 42 小圆叶 福建三明 11 福建金线莲 福建福州 27 尖叶变异筛选种 福建福州 43 银圆宝 台湾高雄 12 大叶(H) 福建三明 28 大叶金线莲 福建三明 44 尖叶自交选育种 福建福州 13 野生种子繁育种 福建三明 29 野生种子繁育种 福建三明 45 尖叶杂交种 福建福州 14 林下尖叶(台州) 浙江台州 30 福建本地银线莲 福建厦门 46 大叶红霞 福建三明 15 林下沙畈本地无纹 浙江金华 31 福建小圆叶 福建厦门 47 尖叶变异筛选种 福建福州 16 野生金线莲 江西萍乡 32 金华本地种 浙江金华 48 无纹金线莲 福建三明 1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取与检测
参照DNA提取试剂盒说明书提取金线莲的DNA，得到的DNA用50 μL双蒸水(ddH2O)溶解。以ddH2O为对照，使用超微量分光光度计检测DNA溶解液的浓度以及纯度。
1.2.2 金线莲ISSR引物筛选及检测
采用哥伦比亚大学公布的第9套100个ISSR通用引物序列，由北京擎科生物科技有限公司合成。使用3个已提取的DNA对100个ISSR引物进行筛选，反应体系总体积为20 μL，其中2×Taq Plus MasterMix 10 μL、ddH2O 8 μL、ISSR引物 1 μL、DNA溶解液1 μL，PCR扩增程序为98 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s，退火(不同引物退火温度不同) 15 s，72 ℃延伸15 s，循环35次；最后72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，挑选出多态性好、扩增条带清晰的引物对48个DNA样品进行扩增。
1.2.3 金线莲SRAP引物筛选及检测
参照FERRIOL等[20]的设计原理建立SRAP标记分析体系，由北京擎科生物科技有限公司合成，包含14条上游引物(Me1~Me14)和17条下游引物(Em1~Em17)，上下游引物可随机组成238对SRAP引物组合。使用2个已提取的DNA对238对SRAP引物组合进行筛选，PCR体系及扩增程序同上。将挑选出的多态性好、扩增条带清晰的引物对48个DNA样品进行扩增。
1.2.4 数据统计及分析
对PCR扩增产物电泳胶图进行人工读带，对扩增条带按有(1)或无(0)进行统计，形成“0, 1”数据矩阵，分别得到ISSR、SRAP及两者综合的数据。利用Excel统计每个(对)引物的总扩增条带数、多态性条带数和多态位点百分率(PPB)。使用POPGENE 32.0软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s多态性信息指数(I)、居群总基因多样性(Ht)、居群内基因多样性(Hs)、基因分化系数(Gst=1−Hs/Ht)和基因流(Nm)等遗传多样性相关参数，并计算不同种源间的遗传距离和遗传一致度，使用OmicStudio工具对遗传距离进行主坐标分析(PCoA)，使用NTSYS-PC 2.1软件对所采集的金线莲样品进行聚类分析并绘制非加权组平均法(UPGMA)树状图。
2. 结果与分析
2.1 引物筛选及扩增多态性
2.1.1 ISSR引物的筛选及其扩增多态性
经过2次筛选，共获得11条条带较为清楚的引物(表2)。11条引物共扩增出86条条带，其中多态性条带有84条，PPB平均值为97.67%，平均扩增条带数是7.82个，平均多态性条带数为7.64个。扩增条带数最多的引物是UBC880 (13条)，其次是UBC861 (12条)，扩增条带最少的是UBC810 (4条)。PPB为83.33%~100%，其中，UBC807、UBC810、UBC826、UBC834、UBC841、UBC842、UBC865、UBC68和UBC861的PPB为100%，均表现出极高的多态性，占总引物的81.82%；UBC856的PPB最低，为83.33%。
表 2 ISSR引物信息及扩增结果Table 2 ISSR primer information and amplification results编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数多态性
条带数PPB/% 1 UBC807 (AG)8T 6 6 100 2 UBC810 (GA)8T 4 4 100 3 UBC826 (AC)8C 6 6 100 4 UBC834 (AG)8YT 8 8 100 5 UBC841 (GA)8YC 10 10 100 6 UBC842 (GA)8YG 8 8 100 7 UBC856 (AC)8YA 6 5 83.33 8 UBC865 (CCG)6 6 6 100 9 UBC868 (GAA)6 7 7 100 10 UBC880 (GGAGA)3 13 12 92.30 11 UBC861 (ACC)6 12 12 100 平均 7.82 7.64 97.67 合计 86 84 说明：Y=(C, T)；PPB为多态位点百分率 2.1.2 SRAP引物的筛选及其扩增多态性
经过2次筛选，共获得11对条带较为清楚的引物组合(表3)。11对引物共扩增出88条条带，其中多态性条带有86条，PPB平均值为97.73%，平均扩增条带数是8个，平均多态性条带数为7.82个。扩增条带数最多的引物组合是Me11-Em4 (12条)；其次是组合Me4-Em13、Me2-Em14和Me13-Em10，扩增出9条条带；扩增条带最少的是Me13-Em16组合，只扩增出6条条带。PPB为88.89%~100%，其中，Me11-Em4、Me8-Em7、Me13-Em7、Me13-Em16、Me4-Em14、Me5-Em11、Me13-Em10、Me14-Em14和Me3-Em2组合的PPB为100%，均表现出极高的多态性，占总引物的81.82%；Me4-Em13和Me2-Em14组合的PPB最低，为88.89%。
表 3 SRAP引物信息及扩增结果Table 3 SRAP primer information and amplification results编号 SRAP引物 正向引物
(5′→3′)反向引物
(5′→3′)扩增条
带数多态性
条带数PPB/% 1 Me11-Em4 BACG DTGA 12 12 100 2 Me8-Em7 BTGC DCAA 7 7 100 3 Me13-Em7 BAAC DCAA 8 8 100 4 Me4-Em13 BACC DCTA 9 8 88.89 5 Me13-Em16 BAAC DGAT 6 6 100 6 Me2-Em14 BAGC DCTC 9 8 88.89 7 Me4-Em14 BACC DCTC 7 7 100 8 Me5-Em11 BAAG DCAC 7 7 100 9 Me13-Em10 BAAC DCAG 9 9 100 10 Me14-Em14 BTCC DCTC 7 7 100 11 Me3-Em2 BAAT DTGC 7 7 100 平均 8 7.82 97.73 合计 88 86 说明：B=TGAGTCCAAACCGG；D=GACTGCGTACGAATT；PPB为多态位点百分率 2.2 遗传距离和遗传一致度分析
ISSR研究中遗传一致度为0.4767~0.9070，遗传距离为0.0976~0.7408。其中，遗传一致度最高的1号与2号、3号与17号、14号与17号，均为0.9070，它们的遗传距离最小，均为0.0976，说明其亲缘关系较近；遗传一致度最低的是7号与22号，为0.4767，其遗传距离最大，为0.7408，说明其亲缘关系较远。在SRAP研究中遗传一致度为0.4659~0.9545，遗传距离为0.0465~0.7638。其中，遗传距离最小的是36号与37号，遗传距离最大的是10号与39号。综合ISSR和SRAP的数据后，遗传一致度为0.5115~0.8793，遗传距离为0.1286~0.6704。其中，遗传距离最小的是34号与37号，遗传距离最大的是10号与39号。
将48份样品按照产地来源分为5个群体(浙江、福建、台湾、江西和云南)，利用POPGENE 32软件对其遗传距离和遗传一致度进行计算，结果如表4所示。使用OmicStudio工具将ISSR+SRAP的标记结果进行PCoA分析，结果如图1所示：由于来自台湾(3个)、江西(1个)和云南(1个)的样品数目较少，故不作分析。结合表4与图1可知：浙江省与福建省金线莲种质混杂。
表 4 金线莲群体间的遗传一致度与遗传距离Table 4 Genetic agreement and genetic distance among A. roxburghii populations分子标记 产地 浙江 福建 台湾 江西 云南 ISSR 浙江 0.9577 0.8842 0.8416 0.7285 福建 0.0433 0.8916 0.7792 0.7336 台湾 0.1231 0.1148 0.7310 0.6552 江西 0.1724 0.2495 0.3133 0.5814 云南 0.3168 0.3098 0.4228 0.5423 SRAP 浙江 0.9853 0.9480 0.7960 0.8351 福建 0.0148 0.9531 0.7880 0.8233 台湾 0.0534 0.0480 0.7796 0.7978 江西 0.2282 0.2383 0.2490 0.6250 云南 0.1802 0.1945 0.2259 0.4700 ISSR+SRAP 浙江 0.9712 0.9160 0.8187 0.7818 福建 0.0292 0.9229 0.7835 0.7798 台湾 0.0878 0.0802 0.7555 0.7270 江西 0.2000 0.2439 0.2804 0.6034 云南 0.2462 0.2487 0.3188 0.5051 说明：对角线下方为Nei’s遗传距离，对角线上方为Nei’s遗传一致度 2.3 遗传多样性分析
分析浙江与福建种源的样品，结果如表5所示：ISSR分析显示，43个种源在物种水平上，Na为1.9651，Ne为1.4403，H为0.2727，I为0.4247，PPB为96.51%；在群体水平上，Na为1.7093~1.9302，Ne为1.3409~1.4325，H为0.2075~0.2668，I为0.3207~0.4147，PPB为70.93%~93.02%，相对于物种水平而言，群体间的遗传多样性水平较低。SRAP结果与ISSR结果相似。结合ISSR与SRAP的数据分析：43个种源在物种水平上，Na为1.9713，Ne为1.3797，H为0.2429，I为0.3873，PPB为97.13%；在群体水平上，Na为1.7816~1.9425，平均值为1.8621；Ne为1.3578~1.3607，平均值为1.3593；H为0.2239~0.2288，平均值为0.2264；I为0.3488~0.3664，平均值为0.3576；PPB为78.16%~94.25%，平均值为86.21%，也是群体间的遗传多样性水平更低。其中，从ISSR、SRAP及综合研究结果来看，Na、Ne、H、I及PPB中基本上是福建省大于浙江省，说明福建省的金线莲种群遗传多样性更高。
表 5 金线莲遗传多样性参数Table 5 Genetic diversity parameters of A. roxburghii分子标记 产地 等位基
因数 (Na)有效等位
基因数 (Ne)Nei’s基因多样
性指数 (H)Shannon’s多态性
信息指数 (I)多态位点百
分率 (PPB)/%ISSR 浙江 1.709 3 1.340 9 0.207 5 0.320 7 70.93 福建 1.930 2 1.432 5 0.266 8 0.414 7 93.02 群体水平 1.819 8 1.386 7 0.237 2 0.367 7 81.98 物种水平 1.965 1 1.440 3 0.272 7 0.424 7 96.51 SRAP 浙江 1.852 3 1.380 0 0.239 9 0.376 3 85.23 福建 1.954 5 1.284 8 0.191 6 0.319 1 95.45 群体水平 1.903 4 1.332 4 0.215 8 0.347 7 90.34 物种水平 1.977 3 1.320 6 0.213 8 0.350 8 97.73 ISSR+SRAP 浙江 1.781 6 1.360 7 0.223 9 0.348 8 78.16 福建 1.942 5 1.357 8 0.228 8 0.366 4 94.25 群体水平 1.862 1 1.359 3 0.226 4 0.357 6 86.21 物种水平 1.971 3 1.379 7 0.242 9 0.387 3 97.13 2.4 UPGMA聚类分析
2.4.1 基于ISSR标记的聚类
由图2可见：48份金线莲样品的遗传相似性系数为0.62~0.91，变幅为0.29。在遗传相似系数为0.67处，48份金线莲样品被划分为3类：在Ⅰ类中地理位置相同的主要有浙江温州的1、2、5、38号以及福建福州的17、25、26、27、44、45号，两地间亲缘关系相对较近；而Ⅱ类与Ⅲ类中样品的来源组成均较为分散，无明显特征。
2.4.2 基于SRAP标记的聚类
图3显示：48份金线莲样品的遗传相似性系数为0.62~0.95，变幅为0.33。在遗传相似系数为0.65处，48份金线莲样品被划分为2类，Ⅰ类中1、5、38号均来自浙江温州，且品种相似，故聚为一类；而在Ⅱ类中，各个品种难以明显划分出小类，这也是各地种质较为混乱所带来的结果。与ISSR标记相比，SRAP标记更难划分类别。
2.4.3 基于ISSR+SRAP标记聚类
图4显示：48份金线莲样品的遗传相似性系数为0.64~0.88，变幅为0.24。在遗传相似系数为0.68处，48份金线莲样品被划分为4类，Ⅰ类中地理位置相同的主要有浙江温州的1、2、5、38号以及台湾高雄的8、9号，两地间可能品种相互引种；Ⅱ类中主要为来自福建福州的样品，包括17、25、26、27、44、45号；Ⅲ类中地理位置相同的主要有福建厦门的4、18、24、31、33、34、36、37号以及福建三明的12、13、22、28、29、48号，两地间品种互引的可能性较大。2种分子标记结合的方法更易体现样品间亲缘关系、划分类别，更清楚地体现地理位置对亲缘关系的影响。
3. 讨论与结论
本研究利用ISSR与SRAP对48份不同来源金线莲样品进行遗传特性分析，共筛选获得11条ISSR引物，扩增86条条带，其中多态性条带84条，PPB为97.67%；筛选出的11对SRAP引物共扩增出了88条条带，多态性条带86条，PPB为97.73%。说明供试金线莲样本具有丰富的遗传多样性，且相较于王剑锴等[10]筛选出的用于检测金线莲资源遗传特性的RAPD分子标记，ISSR与SRAP的标记多态性明显增多，进一步验证了ISSR与SRAP在金线莲种源多态性检测方面的高效率。
基于ISSR与SRAP分子标记对金线莲样品的遗传距离与遗传一致度分析发现：遗传距离最小的是34号(福建厦门福建无网纹种)与37号(福建厦门红霞)，其亲缘关系较近；遗传距离最大的是10号(福建三明的无纹G)与39号(福建三明的尖叶)，其亲缘关系较远。从遗传多样性分析结果来看，来自福建的金线莲遗传多样性更高，同时结合金线莲群体间的遗传一致度与遗传距离结果以及PCoA分析，可以看出各地间金线莲种质资源十分混杂，其中包含了大量的野生种、半野生种和人工驯化的栽培种及杂交种，这种复杂性导致不同种源间的差异性明显，金线莲种质的遗传多样性增加。浙江省市场内流通的栽培种多为省外引入种[21-22]，各种质遗传交流频繁，这有利于培育出较优的金线莲品种。
本研究单独使用ISSR或SRAP的UPGMA聚类结果中，均出现各地间种源相互混杂的状况，并未严格按照地理距离的差异进行归类，而2种分子标记结合的聚类结果中，金线莲种质资源的聚类与不同地理位置分布的情况有比较高的一致度，表现出了一定地域性分布规律，说明2种分子标记方法结合相较于单一的分子标记方法能更准确地体现不同地区金线莲的差异性。由于2种分子标记所检测的基因座位以及所用的引物等因素存在差异，故两者得到的遗传距离不同，其聚类图也存在差异[23]，且每种分子标记方法均有其优势与不足，结合多种标记技术则能更全面、准确地揭示种质遗传特性。因此，本研究结合ISSR与SRAP能更准确地揭示金线莲资源的遗传多样性和亲缘关系，为金线莲良种培育以及野生金线莲资源保护等方面提供了帮助。此外物种的遗传特性容易受到生态环境、繁殖方式以及各种人为活动的影响，野生金线莲经过长期的自然选择，其遗传背景较为复杂；人工栽培种种源多来自于野生金线莲，品种混杂。同时金线莲在野外萌发所需的自然条件苛刻，加之生境的易碎性对其生存产生很大压力[24]，因此金线莲的遗传多样性受到生态环境极大的影响，所以有必要保护当地的生态环境以维护金线莲物种多样性。
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图 1 苏丹黑B、尼罗河红染色线虫中相同脂滴
Figure 1 Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets
图 2 油红O、后置油红O染色线虫中相同脂滴
Figure 2 Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus
图 3 使用苏丹黑B、尼罗红、油红O和后置油红O染色的松材线虫脂滴平均像素的ImageJ图像分析结果
Figure 3 ImageJ image analysis results of average pixels of B. xylophilus lipid droplets stained with Sudan black B, Nile red, oil red O, and post-fix oil red O
图 4 后置油红O染色的松材线虫脂滴的图像处理
Figure 4 Image processing of post-fix oil red O stained adipocytes in B. xylophilus
表 1 不同染料标记和方法的比较
Table 1. Comparison of different dyestuff markers and methods
染料 储备溶液 脱水步骤 染色时间/min 输出颜色 实现单个脂滴分离 油红O 5 g·L−1异丙醇 30 红色 否 苏丹黑B 体积分数为70%乙醇 乙醇系列 360 深蓝色 否 尼罗红 丙酮 乙醇系列 30 浅红色 否 后置油红O 5 g·L−1异丙醇 体积分数为60%异丙醇 60 红色 是 
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200674
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