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梨Pyrus是世界范围栽培的主要果树树种之一。2012年中国梨的栽种面积为108.55万hm2，梨产量达到了1 579万t[1]，为世界上梨产量最高、面积最大的国家。梨为落叶乔木，树体较大，而且结果周期较长，因此，梨的新品种选育不仅需要的时间长，而且土地及劳动力投入耗费大。目前，中国梨品种选育方式主要包括杂交育种、芽变选种、实生选种、辐射育种等[2]。以上梨品种培育方法中除了辐射育种，其他育种方式的效率都较低，难以满足育种和生产实践的需求。此外，由于梨自身产生突变的效率比较低，难以获得类似模式植物的突变体材料用于重要性状的内在机制研究，因此，开展梨突变体的创制具有重要的实践和科学意义，是十分重要的研究工作。甲基磺酸乙酯（EMS）是目前应用最为广泛，效果最佳的化学诱变剂之一，其诱变后代的突变频率高，EMS处理玉米Zea mays花粉，突变频率高达78%[3]，且多为显性突变[4]，易于突变体的筛选。EMS已成功应用于水稻Oryza sativa，油菜Brassica napus等10多种植物诱导突变体[5-15]，但在梨上的应用还未见报道。为了探索适宜梨的突变体诱导技术体系，本研究采用不同体积分数的EMS溶液处理杜梨Pyrus betulaefolia种子，通过对种子萌发、遗传位点变异率鉴定，以及幼苗生长发育状态等检测，筛选最适宜的EMS诱变处理体积分数，以期获得梨的突变体，为梨新品种的选育以及特异性状分子基础研究提供资源和种质材料。
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供试材料为杜梨种子，采集于南京农业大学国家梨工程研究中心江浦实验基地。EMS药剂由美国Sigma公司生产。
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使用砂藏法层积2 000粒杜梨种子，温度为4 ℃，湿度为60%，层积时间为40 d，在发现种子有80%左右尖端露白时即可使用EMS药剂进行处理。处理前先用蒸馏水将河沙洗净，再用蒸馏水浸泡24 h。
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将杜梨种子随机分成10组，200粒·组-1，放入锥形瓶中。使用0.1 mol· L-1，pH 7.0的磷酸缓冲液配置EMS溶液，各组EMS的体积分数依次为0（ck），0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，0.8%和0.9%。将配置好的EMS溶液分别加入各组，将锥形瓶口封住，摇匀，处理24 h后使用硫代硫酸钠清洗种子15 min，再用双蒸水清洗15 min，将种子晾干后，播种，种子出芽时统计出芽率。
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随机选取梨苗20株·组-1，于春季采集幼嫩叶片，液氮速冻后保存于-70 ℃。使用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取DNA[16]，在10.0 g·kg-1琼脂糖凝胶上进行电泳检测DNA质量，使用Nanodrop超微量分光光度计调整质量浓度至50 mg· L-1，DNA样品保存于-20 ℃。
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从通用的相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）引物中筛选出多态性较好，条带较为清晰的10对引物[16]，并对它们进行编号（表 1），检测EMS处理后杜梨幼苗的遗传变异频率，并进行重复验证。聚合酶链式反应（PCR）体系（25.0 μL）：10×PCR缓冲液（Mg2+）2.0 μL，2.5 mmol· L-1 dNTP 1.6 μL，各引物0.6 μL，50～100 ng DNA模板，Taq酶1.0×16.67 nkat（药剂购于TakaRa公司）。PCR扩增所用程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃，1 min，35 ℃，1 min，72 ℃，1 min，5个循环，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃ 1 min，34个循环后72 ℃延伸8 min，应用Sensoquest Labcycle PCR仪器进行扩增。
表 1 检测样品间遗传差异的SRAP标记及引物序列
Table 1. SRAP markers and primer sequence used for identification of genetic variation
正向引物 反向引物 em1: 5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′ me1: 5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′ em4: 5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′ me3: 5′-TGAGTCCAAACCGGAAT-3′ em5: 5′-GACTGCGTACGAATTAAC-3′ me5: 5′-TGAGTCCAAACCGGAAG-3′ em9: 5′-GACTGCGTACGAATTCGA-3′ me6: 5′-TGAGTCCAAACCGGTAA-3′ em10: 5′-GACTGCGTACGAATTCAG-3′ me8: 5′-TGAGTCCAAACCGGTGC-3′ em11: 5′-GACTGCGTACGAATTCCA-3′ em12: 5′-GACTGCGTACGAATTATT-3′ 说明:引物组合1: em1，me1；2: em4，me3；3: em4，me8；4: em10，me5；5: em5，me5；6: em9，me6；7: em11，me5；8: em12，me 3；9: em15，me1；10: em15，me6。 取PCR产物1.5 uL点样于质量浓度为0.8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，以恒定功率80 W，电泳2.5 h，染色液染色15 min，显色液显色15 min后拍照记录。观察电泳图谱，将各对引物变异位点处有条带的记为“0”，无条带的记为“1”，将数据录入Excel表格中，计算变异条带总数和变异平均值。
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幼苗定植田间后，定期管理幼苗，分别于2012年12月和2013年12月，测量所有梨苗的植株高度和节间长度，计算各组植株高度均值和平均节间长度，并进行差异显著性分析。
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统计各组EMS处理后杜梨幼苗发芽率，结果显示：不同体积分数EMS处理降低了梨苗的发芽率。各组中，发芽率最高的组为对照组，其发芽率为90.5%；发芽率最低的组为第10组（体积分数为0.9%EMS），发芽率仅为15.5%。从表 2中可以看出：在EMS体积分数为0.1%~0.6%时，随着体积分数升高，发芽率逐渐降低；而在EMS体积分数为0.7%和0.8%时，发芽率趋于平稳；半致死剂量出现在EMS体积分数为0.3%处理组样品，该组出芽率为47.0%；临界致死剂量出现在EMS体积分数为0.4%处理组样品，该组出芽率为38.0%。
表 2 EMS诱变后杜梨苗发芽率和变异频率
Table 2. Germination percentage of seeds and mutant rate of seedlings after EMS treatment
组号 EMS体积分数/% 发芽数量 发芽率/% 变异频率/% 1 0（对照） 181 90.5 11.0 2 0.1 128 64.0 34.0 3 0.2 117 58.5 32.0 4 0.3 94 47.0 33.7 5 0.4 76 38.0 37.3 6 0.5 66 33.0 31.3 7 0.6 41 20.5 33.7 8 0.7 42 21.0 32.7 9 0.8 41 20.5 29.3 10 0.9 31 15.5 35.3 -
利用筛选的10对SRAP标记通用引物对不同处理组的样本DNA进行鉴定，统计各组幼苗的变异频率。结果表明：10对引物总共检测到15个变异位点，平均每对1.5个，变异位点多出现在100~500 bp扩增大小区间。数据统计结果显示，EMS的体积分数为0.4%时，变异频率最高，为37.3%（表 2）。可见，EMS处理梨种子使其产生了可鉴定的序列位点突变。如图 1所示：为引物em10-me5检测对照组与0.4% EMS处理组随机选取的20株幼苗的遗传突变扩增图谱，可见0.4%EMS处理组在100~250 bp间产生了突变位点。通过引物扩增的重复试验，可以确定检测到的变异位点是稳定可靠的。
图 1 SRAP引物em10-me5检测对照组与0.4% EMS处理组部分个体的遗传突变扩增图谱
Figure 1. Amplification pattern of individuals in ck group and 0.4% EMS treatment detected by SRAP primers combination of em10-me5
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不同体积分数EMS处理后的幼苗定植田间后，定期管理幼苗，测量杜梨苗第1年和第2年停止生长时的植株高度和节间长度，并计算各组植株高度均值的差异显著性以及平均节间长度（表 3）。统计结果显示：杜梨苗第1年和第2年停止生长时，植物高度均值最高的组都为对照组，其高度分别为81.9 cm和175.5 cm；植物高度均值最低组则发生了变化，第1年停止生长时最低组为第4组，EMS体积分数为0.3%，其高度为44.5 cm，而第2年时，最低组为第8组，EMS体积分数为0.7%，其高度为92.0 cm；杜梨苗第1年和第2年停止生长时，各组株高均与对照组差异极显著（P＜0.01），可见EMS处理梨种子后都在一定程度上影响了梨苗的生长。平均节间长度数据的统计结果显示：杜梨连续2 a停止生长时，对照组的节间长度都是最长的，分别为1.97 cm和3.10 cm。第1年停止生长时最短组为第6组，EMS体积分数为0.5%，其长度为1.68 cm。第2年时，最短组为第5组，EMS体积分数为0.4%，其长度为2.56 cm；第1年停止生长时，EMS处理各组的梨苗节间长度差异不显著；第2年停止生长时，对照组与第2，4，5，7，8，9组差异极显著（P＜0.01）。
表 3 EMS诱变后杜梨苗连续2 a生长情况的表型统计
Table 3. Phenotypic evaluation of seedlings after EMS treatment in 2012-2013
组号 EMS体积分数/% 株高平均值/cm 平均节间长度/cm 2012 2013 2012 2013 1（对照组） 0 81.85±4.83 A 175.50±7.83 A 1.97±0.098 A 3.10±0.062 A 2 0.1 52.28±2.63 B 98.68±5.49 B 1.78±0.069 A 2.62±0.081 B 3 0.2 60.50±4.32 B 109.63±7.11 B 1.81±0.076 A 2.82±0.070 AB 4 0.3 44.53±2.79 B 93.89±5.65 B 1.71±0.056 A 2.59±0.066 B 5 0.4 53.68±3.34 B 111.50±5.55 B 1.74±0.058 A 2.56±0.059 B 6 0.5 55.54±4.73 B 119.14±8.21 B 1.68±0.048 A 2.69±0.011 AB 7 0.6 56.64±5.19 B 104.76±6.53 B 1.86±0.070 A 2.60±0.082 B 8 0.7 58.80±6.52 B 92.00±6.44 B 1.78±0.17 A 2.63±0.014 B 9 0.8 49.07±4.75 B 102.57±9.30 B 1.84±0.058 A 2.61±0.012 B 10 0.9 52.09±5.83 B 118.27±10.19 B 1.89±0.077 A 2.88±0.013 AB 说明：差异显著性水平，大写字母表示P＜0.01。 -
诱变育种中一般采用植株半致死剂量或临界剂量作为诱变的最佳体积分数[17]。杜梨苗的半致死剂量出现在第4组，EMS处理体积分数为0.3%；临界剂量出现在第5组，EMS体积分数为0.4%。经过SRAP分子标记检测，变异频率最高的组为第5组，EMS处理体积分数正好为临界剂量。在表型数据上，虽然第4组的梨苗高度低于第5组，但2组之间的差异并不显著；而在节间长度方面，2组的长度较为接近。因此，综合以上数据分析，确定EMS处理促进杜梨种子突变的最佳体积分数为0.4%。
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EMS是一种良好的化学诱变剂，Klmark于1953年最早报告了EMS对突变诱导的有效性。其后EMS被广泛应用于植物中，其产生的突变类型较多。例如抗逆类型突变，Zhou等[5]使用EMS诱变水稻，获得了抗盐性的突变植株；品质和产量类型突变，Fang等[8]使用EMS诱变花生Arachis hypogaea，获得高油酸突变体；形态特征类型的突变，这类突变是EMS诱变后突变最多的类型，而且大致上都是以矮化为主，EMS在许多植物[6-14]上都产生了不同程度的矮化突变体。本实验中，使用不同体积分数的EMS诱变杜梨种子后，不仅产生了可检测的遗传变异，各处理组在株高上显著低于对照组，形态上发生了变化，但要确定这些变异是否为可遗传的稳定变异，还有待于进一步试验研究。
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不同体积分数EMS诱变植物产生突变体效率不同。Fang等[8]使用10.0 g·kg-1的EMS处理原本油酸含量44.2%的花生品种，得到了油酸含量超过60%的突变体。而Zhou等[5]使用体积分数为0.5%的EMS处理水稻种子，获得了抗盐性较好的突变体。我们使用不同体积分数的EMS处理杜梨种子，结合分子和生理指标的鉴定，获得了促进杜梨突变的最适宜EMS体积分数为0.4%。由此可见，EMS处理在不同物种的最佳使用体积分数是有差异的，需要针对不同物种进行优化和筛选。
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EMS是一种烷化剂，能够诱发基因突变，多为点突变[4]，使用DNA分子标记的方法可以快速有效地鉴定出突变位点。胡建斌等[18]使用SRAP分子标记技术检测到了EMS诱变黄瓜Cucumis sativus的变异位点。殷冬梅等[19]使用随机扩增多态性DNA（RAPD）分子标记技术检测到了EMS诱变花生的突变位点。相比于其他分子标记，SRAP分子标记的特点：操作较为简单，只涉及到PCR扩增；引物片段较长，重复性较好；使用通用引物，正反向引物可以随机组合；检测结果中共显性标记占标记位点的比例较高[20-21]，在基因组中分布较为均匀，更适用于检测农艺性状的差异[22]。本试验中，使用的10对通用SRAP引物共检测到了15个突变位点，检测效率较高，可对筛选适宜的EMS体积分数提供可靠的数据支持。
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EMS在农作物与蔬菜花卉中的应用较广，已构建了很多突变体库。由于木本植物生长周期较长，获得稳定遗传的时间较长，所以在果树上的应用研究还比较少。本研究中，我们首次使用不同体积分数的EMS药剂诱变杜梨种子，通过分子和生理数据的鉴定与分析，得到了最佳的诱变处理体积分数，其种子繁殖当代植株在形态上表现出了一定的变异特征，相比于传统的杂交育种和自然突变体筛选，化学诱变的效率更高。本研究结果将为今后快速获得梨突变体提供可靠的理论基础和依据。
Identification and analysis of EMS-induced seed mutants in Pyrus betulifolia
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摘要: 为了获得杜梨Pyrus betulifolia突变体, 以杜梨种子为试材, 分别使用不同体积分数甲基磺酸乙酯(EMS)[0(ck), 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%]对层积后的种子进行诱变处理。然后, 统计了种子发芽率, 使用相关序列扩增多态性(SRAP)标记鉴定遗传变异位点, 测量幼苗田间株高和节间长度。试验结果表明:杜梨种子发芽的半致死剂量为0.3% EMS处理。结合SRAP标记鉴定和表型数据分析, 筛选出最适宜的EMS处理体积分数为0.4%, 变异率为37.3%;同时, 使用SPSS软件对表型数据分析显示, 处理组的杜梨苗株高极显著低于对照组(P=0.01)。研究结果为快速获得杜梨突变体提供了理论基础和依据。
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关键词:
- 园艺学 /
- 杜梨 /
- 甲基磺酸乙酯(EMS) /
- 种子 /
- 相关序列扩增多态性(SRAP)标记 /
- 突变
Abstract: To obtaining the mutants of Pyrus betulifolia, different concentrations (0, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%) of ethyl methane sulphonate (EMS) were used to induce seeds after stratification. Then, seed germination percentage was determined, sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers were used to identify mutant loci, and phenotypic measurements of plant height and internode length of the seedlings were made. Results showed that the half lethal dose of EMS concentration was 0.3%. Combined with SRAP markers detection and phenotypic data analysis, the optimum concentration of EMS treatment was 0.4%, and the mutation rate was 37.3%. Meanwhile, the phenotypic data analysis which used SPSS revealed that plant height with different EMS treatments was significantly lower (P=0.01) than the ck group. These results should provide a valuable theoretical basis for effectively obtaining pear mutants. -
林产品生长具有一定的地域特征。一些特定地区的林产品因具备某些优秀品质，更受消费者的青睐，然而普通消费者难以通过产品外观或其他物理特性区分特定产地和其他产地的产品。受经济利益的驱使，有些商家伪造产品产地或掺假蒙骗消费者，损害了消费者和原产地的利益，因此，需要一种分析技术能识别林产品的产地，鉴定产品的真伪。稳定同位素技术在溯源和掺假鉴别方面有着较好的优势，目前已应被用于农产品[1]和食品领域[2]。为推动这项技术在林产品领域中的应用，在广泛查阅国内外文献的基础上，对稳定同位素技术在林产品中的溯源和鉴别应用研究进行综述及展望。
1. 稳定同位素技术的基本原理
具有相同质子数，不同中子数的同一元素的不同核素互为同位素。其中不具有放射性的同位素称为稳定同位素，其来源有2种：一部分是由放射性同位素衰变之后的稳定产物，例如206Pb和87Sr等；另一部分是自然界本身存在的天然稳定同位素，例如12C和13C，18O和16O等。
利用稳定同位素可以鉴别不同种类的产品以及追溯产地来源的原理：①自然界中的植物因其固碳方式不同，可分为C3植物(如小麦Triticum aestivum，水稻Oryza sativa，大豆Glycine max，棉花Gossypium spp.等)，C4植物(如玉米Zea mays，甘蔗Saccharum officinarum，高粱Sorghum bicolor，苋菜Amaranthus tricolor等)和CAM植物(如仙人球Echinopsis tubiflora，芦荟Aloe vera，龙舌兰Agave americana以及景天Sedum erythrostictum等)，不同种类的植物碳同位素比值(δ13C)分布不同，其中C4植物为-14‰~-10‰，CAM植物为-30‰~-10‰，C3植物为-35‰~-22‰[3]。②同一种生物体因受气候、环境和生物代谢的影响，导致同位素在生物体内产生分馏，使得不同地区的生物体体内的碳、氢、氧、氮等同位素的丰度不同[4]。
由于稳定同位素在自然界中的含量很低，很难用绝对值来表达同位素的差异，同时人们更加关心的是同位素组成的微小变化，因此国际上常用同位素比值δ表示。公式为：
$ \delta = ({R_{样品}}/{R_{标准}} - 1) \times 1\;000{\rm{‰ }}。 $
(1) 式(1)中：R样品为所测样品中的重同位素与轻同位素丰度之比，即：13C/12C，D/H，18O/16O和15N/14N。R标准为国际标准样中，δ13C以维也纳-PeeDee箭石标准(V-PDB)为基准，δ18O和δD以平均海洋水(SMOW)为基准，δ15N以大气中的氮气(N2-atm)为基准。通过同位素质谱仪(IRMS)可以精确地测定同位素比值。
2. 稳定同位素技术在林产品溯源研究中的应用
某些林产品出自不同的产地会存在品质和性能上的差异。另外，随着人们生活水平的提高，道地性产品得到推崇，消费市场对某些产品的原产地有所要求。普通消费者很难通过外观判别特定产地和普通产地的商品，容易买到冒牌产地的产品[5]。建立林产品的溯源体系既能够保护原产地的利益，也能够确保产品质量，保护消费者的利益。目前，稳定同位素技术已用于经济林产品，如水果、林产饮料、木本油料等的产地溯源。
2.1 水果
猕猴桃有很强的地域特征，马奕颜等[6]采集了陕西省(周至县、眉县)，四川省和湖南省的中华猕猴桃Actinidia chinensis样品，检测其δ13C，δD和δ15N以及维生素C、维生素E和总糖。结果发现：单个元素的判别率较低，其中δD和δ15N对产地的判别略优于δ13C，而δ13C，δD和δ15N三者结合，对3个省总体的判别率也仅为57.8%，对周至县、眉县亚地区的判别率为80%。利用线性判别-主成分分析(LDA-PCA)，δ13C，δD和δ15N结合维生素C、维生素E和总糖含量，3个省的总体判别率提高至88.9%，对亚地区的判别率提升至93.3%。
LONGOBARDI等[7]采集了阿普利亚地区(40°47′N，17°06′E)和艾米利亚罗马涅(44°35′N，11°13′E)的樱桃Cerasus pseudocerasus样品，艾米利亚罗马涅地区的δ13C，δ18O和δD的平均值分别为-26.5‰，33.2‰和-38.5‰；阿普利亚地区的δ13C，δ18O和δD的平均值分别为-26.4‰，35.4‰和-30.7‰。从艾米利亚罗马涅到阿普利亚，δ13C，δ18O和δD都有不同程度的增加，由于北方(艾米利亚罗马涅)到南方(阿普利亚)气候、环境改变导致同位素分馏。利用δ13C，δ18O和δD三者的线性判别分析，对2个地区的判别率为94.9%；此外，通过电子鼻检测技术，采用3个不同的分析模型(VES1，VES2和VES3)，得到最高的判别率只有89.7%。这说明稳定同位素技术相比于其他检测手段在溯源领域确实有着较好的优势。
胡桂仙等[8]研究了浙江、福建、云南、贵州和江苏等地区杨梅Myrica rubra的稳定同位素和多元素的特征，采用LDA-PCA方法对不同地区的杨梅进行判别，其中浙江省杨梅的准确判别率为99.6%，福建省为90.3%，云南、贵州、江苏省样品归为一类，其准确判别率为98.4%。陈历水等[9]研究了黑加仑Ribes nigrum果实的碳氮同位素，发现两者联合对黑加仑产地溯源的准确率达86.9%。
2.2 木本油料
橄榄Canarium album油有着极佳的天然保健、美容功效以及理想的烹调用途，其物理特性和化学成分因不同的品种和地理环境而有所不同。CAMIN等[10]利用δ13C，δ18O，δD以及镁、钾、钙、钒、锰、锌、铅、锶、铯、镧、铈、钐、铕及铀这14种元素对橄榄油的产地进行线性判别，准确率达95.0%。PORTARENA等[11]测定了意大利沿海岸7个产地的38个初榨橄榄油样品，由于都是沿海地区，气候环境条件相似，7个产地δ13C和δ18O变化范围较小，分别为-30.2‰~-27.5‰和21.7‰~26.5‰，发现单独用δ13C和δ18O很难判别不同的产地，采用与拉曼光谱相结合，线性判别分析7个产地初榨橄榄油样品的准确判别率为82.0%，对于其中5个产地的判别率为100%。FRANCESCA等[12]连续追踪了3 a意大利9个产地初榨橄榄油的δ13C和δ18O值，由此建立的地理模型能够清晰地判别意大利北方、中南部的第勒尼安、中央亚得里亚海、西西里岛和撒丁岛初榨橄榄油。
2.3 其他林产品
MAGGI等[13]研究了来自希腊、伊朗、意大利、西班牙藏红花Crocus sativus香料中的16种特征参数(着色程度、藏红花苦甙、藏红花醛等)以及碳氢氮同位素比值，发现若只通过16种特征参数对4个产地的判别率为60.7%，而结合δ13C，δD和δ15N值，采用后交叉验证得到100%的判别率。
西洋参Panax quinquefolius是一种地域性的药材，制成的西洋参片同样具有地域特征。TIAN等[14]首先测定了中国山东、北京、吉林，加拿大，美国的西洋参δ13C，δD，δ18O和δ15N，分别为-28.52‰~22.19‰，-43.41‰~90.6‰，18.3‰~30.5‰以及-2.46‰~3.97‰。由于δD，δ18O和δ15N与地域的相关性较大，因此利用δD，δ18O和δ15N建立模型，对4个产地的判别率为88%。此外，西洋参制成药片前后δD，δ18O和δ15N没有变化，表明上述模型同样适用于判别西洋参药片的产地。利用该模型对药店购买的10盒西洋参药片进行产地判别，成功地区分了来自美国的7盒产品和来自中国北京的3盒产品。
李国琛[15]采集了辽宁、吉林、黑龙江、陕西、湖北、湖南和广西7个产地的五味子Schisandra chinensis样品，发现δ13C和δ15N是追溯五味子产地的良好指标，同时进一步发现五味子中的δ15N与相应地区土壤样品中的δ15N和氮含量呈正相关性。
在追溯产品的体系时，首先要保证收集样品的产地准确无误。通过测定样品的δ13C，δD，δ18O和δ15N，或者其中的几种同位素比值，采用线性判别方法对数据进行判别分析。如果采用单个同位素指标判别，则需达显著差异(P＜0.05)时才能判别。有时，还需结合其他的分析检测，将产品的同位素比值测定结果与其他有效成分(如维生素C，维生素E和总糖)的指标结合，同时用线性判别方法，以提高产地的判别率。
3. 稳定同位素技术在林产品鉴别研究中的应用
目前，市场销售产品的掺假有2种：一种是C4植物某些成分对C3植物产品的掺杂，如果汁中加入玉米糖浆、C4植物油对C3植物油的掺杂；另一种是外源的水分、乙醇等的掺杂，如苹果醋中加入人工合成的乙酸、天然来源的香精香料中添加工业用料、植物与动物源产品的掺杂等。这些掺杂行为会损害消费者的利益，甚至影响消费者健康，也使企业在不公平的竞争中受到侵害。为了稳定市场，避免消费者购买到假冒产品，打假鉴别势在必行[5]。稳定同位素技术适用于对林产品的鉴别掺假。目前大多集中在林产饮料、木本草本油料以及某些香精香料方面。
3.1 林产饮料
在林产饮料方面主要是一些水果汁的掺假鉴别。MAGDAS等[16]研究发现：往纯正果汁中加入不同比例的自来水，果汁中的δ18O和δD随着自来水比例的增加而减小，自来水体积分数从9%增加到41%，δ18O和δD分别从-5.5‰和-51.4‰减小到-7.5‰和-59.7‰。δ18O所占的比例与自来水添加的百分比很接近。在往苹果汁(C3)中添加蔗糖(C4)后，发现δ13C的变化与蔗糖的含量存在着线性变化。以此对8种市售水果汁检测，结果发现：其中4种的δ18O和δD异常高，分别大于-6.5‰和-50.0‰，认为这4种添加了自来水；而这4种中的3种，其δ13C也异常的高，大于-14.6‰，认为添加了蔗糖或者玉米糖浆。
GUYON等[17]采用高效液相质谱联用同位素比例质谱(HPLC-IRMS)，分离并检测了25个真实柑橘Citrus reticulata类果汁的有机酸、葡萄糖、果糖的δ13C。将葡萄糖的δ13C值分别与有机酸、果糖的δ13C值建立散点图，发现样品呈现一定的分布区间。对30个市售的果汁样品(6个浓缩果汁、24个“纯果汁”)检测发现某些市售果汁中的有机酸葡、萄糖、果糖δ13C远大于真实果汁的δ13C，认为添加了外源性C4类的有机酸、外源性糖；利用散点图模型验证发现：有10个市售“纯果汁”其有机酸的δ13C值超出了模型中的置信区间，说明“纯果汁”并不纯。
在国内，牛丽影等[18]利用稳定同位素技术对非浓缩果汁和浓缩果汁进行鉴别，发现非浓缩果汁中的δ18O和δD要高于浓缩果汁。李鑫等[19]采用液相色谱联用同位素比例质谱(LC-IRMS)研究发现橙汁中的多种糖组分(葡萄糖、果糖等)的δ13C能用于橙汁掺假鉴别。徐生坚等[20]发现：外源性糖浆的δ18O要比果汁中的δ18O低，且小于25.0‰，根据果汁的δ18O也能鉴别果汁掺假。除了普通的橙汁饮料掺假，水果醋类饮料也有掺假现象，此类饮料的掺假主要是添加了玉米来源的冰乙酸。钟其顶等[21]研究发现：苹果醋中乙酸的δ13C与玉米来源冰乙酸的掺入量具有线性正相关关系。利用该研究检测了20个市售苹果醋饮料的δ13C，发现其中6个δ13C明显高于正常范围，认为有玉米来源的冰乙酸添加。此外研究还扩展到石榴Punica granatum汁[22]、苹果Malus domestica汁[23]等。
3.2 木本油料
角鲨烯和角鲨烷是常用的保健品，能从橄榄油和深海鲨鱼中提炼而出。欧盟禁止从鲨鱼中提炼角鲨烯、角鲨烷，但是从鲨鱼中提炼产量高，成本低，导致很多不法厂家依然掺杂从鱼类中提炼的角鲨烯、角鲨烷。FEDERICA等[24]发现从橄榄油提炼出的角鲨烯、角鲨烷的δ13C平均值为-28.4‰±0.5‰，比从鲨鱼中提炼出的-20.5‰±0.7‰要低。角鲨烯、角鲨烷的δ13C与鲨鱼中提炼的角鲨烯、角鲨烷的掺入量呈线性正相关关系，且一旦掺入量体积分数高于10%就能鉴别。鉴于此，对4个标明橄榄油提炼市售样品检测，发现有1个样品添加了体积分数为70%的鲨鱼提炼出的角鲨烯或者角鲨烷，2个样品添加了体积分数为20%的鲨鱼提炼出的角鲨烯或者角鲨烷。郭莲仙等[25]研究发现：纯橄榄油的全油δ13C要小于掺假橄榄油，同时表明，植物油的脂肪酸组成联合植物全油、主要脂肪酸的δ13C值能综合判别植物油掺假。
3.3 香精香料
FEDERICA等[26]结合气相联用质谱(GC-MS)和气相联用火焰离子化检测(GC-FID)发现玫瑰Rosa rugosa精油的δ13C平均值为-27.5‰，典型的C3植物，而一般的掺假精油来源于C4植物，且5%~8%的掺入量难以通过玫瑰精油的中的δ13C平均值检测。FEDERICA发现玫瑰精油的成分乙酸香叶酯、香叶醇的δ13C值没有随C4精油的掺入量发生改变，可以用于玫瑰精油掺假鉴别。BONACCORSI[27]检测了莱姆Citrus aurantifolia精油中α-苹烯、苧烯、β-苹烯等多个组分的δ13C值，通过多组分的折线图比较了市售莱姆精油和真实莱姆精油各组分δ13C值的差异，发现市售精油中有5瓶掺假。
SCHMIDT等[28]采用稳定同位素技术检测香草醛的掺假，发现天然香草醛的δ13C值为-16.8‰~ -21.5‰，而人工合成的香草醛的δ13C值为-24.9‰~36.2‰，因此可以用碳同位素比值检测天然香草醛的掺假。GREULE等[29]测定香草醛分子以及香草醛甲氧基上的δ13C和δD，并将2组δ13C和δD用散点图分析，建立了判别香草醛掺假的区间。
利用稳定同位素技术鉴别时，往往选取产品中的某一种或者几种组分测定研究。此时，需要其他仪器的辅助，比如HPLC-IRMS和GC-IRMS等，将待测组分分离后检测。掺假鉴别一般研究的是δ13C同位素的比值，这主要是由于市面上的掺假大部分为C4成分对C3成分的掺假，此外也有与氢、氧、氮等同位素相结合分析。研究过程必须要有真实的样品，对其所测的数据与其他待检样品的数据比较，才能得出最终的结果。
3.4 在有机产品认证研究中的应用
有机产品是指不使用人工合成物质如化学农药、化肥、植物生长调节剂、饲料添加剂等通过有机生产体系生产出来的产品，它与绿色食品和无公害食品共同组成中国的安全食品。中国政府自2002年起在全国范围内全面推进“无公害食品行动计划”，旨在实现中国食用农林产品的无公害生产，保障消费安全。对有机产品，除了需要对产地进行认证外，还要求在产品的加工、包装、运输、储存、销售过程中不受到污染，同时需要有完善的质量控制、跟踪审查体系，以及可靠的产品认证方法。稳定同位素技术以δ15N为判定指标，进行植物性有机产品与普通产品的区别。因为植物性有机产品不允许使用氮肥，只能使用有机肥料，研究发现氮肥的δ15N值接近于0，而有机肥料的δ15N值较高，施用有机肥料的植物通过同位素分馏使得有机产品的δ15N高于普通产品[30-31]。
RAPISARDA等[32]分别检测了2种橙子Citrus的δ15N，发现有机橙子中果肉蛋白质和氨基酸的δ15N值都要高于普通橙子，利用这2个参数对有机橙子的鉴别率能达90.63%。CAMIN等[33]检测了橙子、草莓Fragaria × ananassa，柑橘的δ13C，δ2H，δ18O，δ15N和δ34S以及其他的物理化学参数(pH、葡萄糖、果糖等)，发现根据δ15N值、抗坏血酸和固体可溶物能够有效鉴别有机产品，但是δ15N容易受到水果种类、年份、种植地区的影响。冯海强等[34]发现与施尿素的茶树Camellia sinensis相比，施有机肥的茶树其茶叶的δ15N明显要高，因为有机肥为粪便，其本身的δ15N就高，表明根据δ15N判别有机茶叶具有可行性。
4. 稳定同位素技术的优、缺点
稳定同位素技术的优点有：①灵敏度高。用于检测的样品只需几毫克甚至零点几毫克，极大方便了低含量组分的检测。②实验过程简单快速。使用高自动化的同位素质谱仪，许多样品可以直接检测，避免了繁琐的提取和纯化工作。③适用范围广。在掺假鉴别过程中，普通方法难以检测结构相似的掺假物，而稳定同位素技术利用同位素的比值及分布能鉴别这一类物质；④安全环保。稳定同位素没有放射性，且实验过程中不会造成二次污染。这些优点使得稳定同位素技术的使用越来越广。
然而该技术还存在一些不足之处。首先，稳定同位素技术所需设备较为昂贵，普通实验室难以配备，使得样品的分析成本高。其次，该技术在鉴别、溯源时，如果不同的地区具有相似的环境，则同位素比值分布差异性有可能不显著，这将对产品的溯源造成一定的困难。因此，在使用稳定同位素技术时还需考虑多方面的因素。
5. 结语
稳定同位素技术在追溯林产品产地来源、鉴别掺假、有机产品认证等方面有着重要的作用。但是，目前，稳定同位素技术对林产品产地溯源及鉴别主要源于植物自身代谢导致的同位素分馏效应，由于中国幅员辽阔，气候、纬度等因素也对稳定同位素分馏有一定影响，因此植物生长机理与产地环境之间的关系需要深入研究，并将研究结果深入推广，使之能够用于更多林产品的溯源和鉴别问题。单一元素指标难以达到检测目的，可研究采用多元素，多种化合物检测，并利用LDA-PCA对测定结果进行分析，或联用其他的检测手段HPLC-IRMS和GC-IRMS等，进行有效成分的深入研究，及分子内的稳定同位素分布研究，从而建立更为可靠的林产品检测方法和溯源识别体系。
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图 1 SRAP引物em10-me5检测对照组与0.4% EMS处理组部分个体的遗传突变扩增图谱
Figure 1 Amplification pattern of individuals in ck group and 0.4% EMS treatment detected by SRAP primers combination of em10-me5
表 1 检测样品间遗传差异的SRAP标记及引物序列
Table 1. SRAP markers and primer sequence used for identification of genetic variation
正向引物 反向引物 em1: 5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′ me1: 5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′ em4: 5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′ me3: 5′-TGAGTCCAAACCGGAAT-3′ em5: 5′-GACTGCGTACGAATTAAC-3′ me5: 5′-TGAGTCCAAACCGGAAG-3′ em9: 5′-GACTGCGTACGAATTCGA-3′ me6: 5′-TGAGTCCAAACCGGTAA-3′ em10: 5′-GACTGCGTACGAATTCAG-3′ me8: 5′-TGAGTCCAAACCGGTGC-3′ em11: 5′-GACTGCGTACGAATTCCA-3′ em12: 5′-GACTGCGTACGAATTATT-3′ 说明:引物组合1: em1，me1；2: em4，me3；3: em4，me8；4: em10，me5；5: em5，me5；6: em9，me6；7: em11，me5；8: em12，me 3；9: em15，me1；10: em15，me6。 
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表 2 EMS诱变后杜梨苗发芽率和变异频率
Table 2. Germination percentage of seeds and mutant rate of seedlings after EMS treatment
组号 EMS体积分数/% 发芽数量 发芽率/% 变异频率/% 1 0（对照） 181 90.5 11.0 2 0.1 128 64.0 34.0 3 0.2 117 58.5 32.0 4 0.3 94 47.0 33.7 5 0.4 76 38.0 37.3 6 0.5 66 33.0 31.3 7 0.6 41 20.5 33.7 8 0.7 42 21.0 32.7 9 0.8 41 20.5 29.3 10 0.9 31 15.5 35.3
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表 3 EMS诱变后杜梨苗连续2 a生长情况的表型统计
Table 3. Phenotypic evaluation of seedlings after EMS treatment in 2012-2013
组号 EMS体积分数/% 株高平均值/cm 平均节间长度/cm 2012 2013 2012 2013 1（对照组） 0 81.85±4.83 A 175.50±7.83 A 1.97±0.098 A 3.10±0.062 A 2 0.1 52.28±2.63 B 98.68±5.49 B 1.78±0.069 A 2.62±0.081 B 3 0.2 60.50±4.32 B 109.63±7.11 B 1.81±0.076 A 2.82±0.070 AB 4 0.3 44.53±2.79 B 93.89±5.65 B 1.71±0.056 A 2.59±0.066 B 5 0.4 53.68±3.34 B 111.50±5.55 B 1.74±0.058 A 2.56±0.059 B 6 0.5 55.54±4.73 B 119.14±8.21 B 1.68±0.048 A 2.69±0.011 AB 7 0.6 56.64±5.19 B 104.76±6.53 B 1.86±0.070 A 2.60±0.082 B 8 0.7 58.80±6.52 B 92.00±6.44 B 1.78±0.17 A 2.63±0.014 B 9 0.8 49.07±4.75 B 102.57±9.30 B 1.84±0.058 A 2.61±0.012 B 10 0.9 52.09±5.83 B 118.27±10.19 B 1.89±0.077 A 2.88±0.013 AB 说明：差异显著性水平，大写字母表示P＜0.01。
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2014.06.010
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