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枇杷黄毛虫Melanographia flexilineata，又名枇杷瘤蛾，属鳞翅目Lepidoptera灯蛾科Arctiidae[1]，是中国南方枇杷Eriobotrya japonica上最主要的害虫。除危害枇杷外，枇杷黄毛虫还危害梨Pyrus spp.，李Prunus spp.，合欢Albizzia julibrissin，紫薇Lagerstroemia india等果树和绿化树。浙江省杭州市余杭区塘栖镇从唐代起就以盛产枇杷而著称于世[2]。近年来，鲜果枇杷价格快速上升，对品质的要求日益提高，枇杷产业迅速发展。枇杷黄毛虫在浙江余抗塘栖1 a发生4代，幼虫危害枇杷嫩芽和嫩叶，发生多时也危害老叶、嫩茎表皮和花果，严重时全树叶片被吃尽，削弱树势[3-4]，影响产量。国内对枇杷黄毛虫的寄主分布、形态、生物学特征等有一定的报道[5-9]，但开展系统监测调查、对其种群动态的研究及应用统计学方法建立预测模型等方面鲜有报道。本研究采用测报灯诱集与田间调查相结合的方法，通过对塘栖枇杷黄毛虫成虫灯下逐日系统监测结合田间定期系统调查，选择不同时期虫口基数、气象资料（气温、相对湿度、降水量）作为预测因子，使用逐步回归法开展其发生期和发生量的预测预报模型研究，对保障枇杷产量和品质，促进枇杷产业发展具有重要意义。
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自动虫情测报灯由河南省佳多科工贸有限公司生产，灯下接诱导漏斗和接虫袋。
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试验地设在余杭区塘栖枇杷研究所试验基地，枇杷品种为‘红娘子’‘Hongniangzi’和‘白沙’‘Baisha’，试验时期为2008-2013年。枇杷黄毛虫成虫采用频振式测报灯进行逐日诱集，每年开灯时间为4月1日至9月30日，历时约183 d，幼虫隔3 d左右田间调查1次，选取样树5株进行调查，树冠按东南西北划分4个方位，各个方位分上层、中层、下层等3层，将样树划分为12个资源单位，选取新梢枝条1枝·资源单位-1，记载各枝条上的幼虫数量。统计、记录每天诱捕的黄毛虫成虫数量及每周田间查见的黄毛虫幼虫，进行系统监测。
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利用2008-2013年枇杷黄毛虫在余杭区塘栖镇监测的系统历史资料，将前5 a的诱虫数据、田间系统调查数据和气象资料用来建模，应用SPSS 17.0软件，采取逐步回归分析方法[10]，建立发生期和发生量的预测预报模型，最后1 a的资料用来检验。原始调查数据不作任何转换，所用气象资料由杭州市气象局提供。
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将2014年的实况资料，应用唐启义等[11]提出的病虫测报应验程度判定模式进行验证，从而判断组建模型的可行性。发生期预报应验程度判定模式：
$${{T}_{s}}={{100}_{e}}^{\frac{-\pi }{\ln t}{{\left( \frac{{{a}_{1}}-{{a}_{2}}}{\delta } \right)}^{2}}}。$$ 发生量预报应验程度判定模式：
$${{D}_{s}}=100e\frac{-2a\pi }{\left( a+{{a}_{1}} \right)\ln t}\bullet \left( \frac{{{a}_{1}}-{{a}_{2}}}{\delta } \right)。$$ 其中：Ts和Ds分别为发生期和发生量判定模式的分值，Ts和Ds<40表明预报不准确，40≤Ts和Ds< 60表明预报比较准确，Ts和Ds≥60表明预报准确；a为预报对象常年平均值，a1为实测值，a2为预测值；δ为预报对象常年标准差，t 为自预报发出至实际发生时的期距（d）。
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2008-2013年枇杷黄毛虫灯下成虫诱集量监测结果（图 1）显示：2008年以来，枇杷黄毛虫种群动态特征和数量结构发生了一定的变化：一是越冬代成虫始见期年度间差异较大，其中2008年、2009年和2013年成虫始见期较早，均为4月中旬，以2013年最早（4月14日），2010-2012年相对较迟。二是主害代灯下成虫峰期时间、蛾量年度间有差异，总体均以第3代峰期诱蛾量最高，其次为第2代；峰期持续时间、蛾量受当年气候等条件的影响呈相应的变化，2008年和2009年于7月中旬出现全年诱蛾最高峰，2010-2013年诱蛾最高峰出现在7月下旬；主害期危害程度年度间差异大，2011年7月下旬诱蛾量596头·灯-1·旬-1，与历年同期比第3代成虫峰期蛾量明显偏高，占全年诱集总量的55.18%，2013年7月高峰期蛾量为87头·灯-1·旬-1，明显低于历年同期，分析其原因可能与当年夏季出现罕见高温干旱天气，不利于枇杷黄毛虫生长发育有关。有研究表明：气候较为暖湿的条件下成虫产卵量多、幼虫发生量大[6]，低于20 ℃和高于32 ℃的温度条件下对枇杷黄毛虫世代存活率不利[12]，7月和8月干旱对黄毛虫的发生有抑制作用[6]，也印证了这个可能性；第4代成虫诱集量普遍下降较快，可能与第3代幼虫发生期正值高温天气、成虫在高温下产卵少、卵孵化率下降使幼虫虫量不高有关。
图 1 2008-2013年枇杷黄毛虫灯下成虫种群数量特征
Figure 1. Quantitative characteristics of adult Melanographia flexilineata during 2008-2013
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2008-2013年田间幼虫系统调查（图 2）结果表明：年度间枇杷黄毛虫均以第2代幼虫危害最重，发生期为6月中下旬至7月上旬，高峰期主要出现在6月下旬，少数年份持续至7月上旬危害重，第2代幼虫期正值枇杷成熟阶段，除叶、芽外，果实也受害，对枇杷生产影响最大，2008-2013年高峰期平均虫量140.0~188.9头·株-1·旬-1，占全年总量的32.57%~47.23%。第1代幼虫发生期为5月上旬至6月上旬，高峰期主要出现在5月中旬，少数年份推迟至5月下旬，峰期平均虫量30.6~95.0头·株-1·旬-1，以2008年最高，2013年虫量最低。第3代幼虫发生于7月下旬至8月中旬，此时正值1 a中气温最高、雨水相对较少的季节，特别是2013年为持续高温干旱的年份，成虫产卵少，卵存活率低，发生期总虫量及高峰期虫量均下降，年度间发生量差别较大，2008年高峰期虫量49.0头·株-1·旬-1，高于其他年份，而2013年由于持续高温干旱，虫量明显低于其他年份。第4代幼虫田间查见幼虫较少，与前几代次比虫量下降较快，9月中旬后，幼虫陆续化蛹越冬。
图 2 2008-2013年枇杷黄毛虫幼虫种群数量特征
Figure 2. Quantitative characteristics of larvae Melanographia flexilineata during 2008-2013
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枇杷黄毛虫主要以幼虫啃食幼芽、叶片、嫩茎表皮和果实等，对产量和品质影响大。为开展枇杷黄毛虫的适期防治，加强危害风险监测，以第1代至第3代幼虫发生高峰期（y1,y2,y3）和高峰期发生量（y4,y5,y6）为预报对象，初选前期灯下诱蛾量、田间幼虫密度等虫情基数因子及上年12月至当年1月、4月至9月每旬平均气温、平均相对湿度、降水量等相关性较大的气象因子共56个指标作为预报因子，采用逐步回归分析，建立预测预报模型。结果表明：枇杷黄毛虫幼虫发生高峰期、高峰期虫量与前期虫口基数、气象因子密切相关，各有15个因子入选预测模型（表 1和表 2）。发生期预测模型表明：前期田间幼虫虫口密度、降水量对发生高峰期影响最大，各有5个因子入选预测模型，前期灯下诱蛾量、平均相对湿度、气温等也有一定的影响。发生量预测模型表明：枇杷黄毛虫第1代至第3代幼虫旬高峰期虫量与前期田间幼虫密度、灯下诱蛾量呈显著正相关，气象因子中平均相对湿度和降水量分别有5个和4个因子入选预测模型，气温因子中5月下旬、6月上旬、7月上旬平均气温也作为预测因子入选发生量预测模型。
表 1 枇杷黄毛虫发生期预测因子历史数据
Table 1. Predictive factors for occurrence period of Melanographia flexilineata
年 份 x2 x5 x9 x10 x12 x20 x21 x22 x28 x31 x38 x40 x43 x46 x53 2008 15 77 91.7 15.8 27.5 28 8 3 9.4 66.6 157 22 508 84.7 60.2 2009 20 61.3 36.3 19.2 50.7 9 11 48 31.4 35.8 148 14 380 74.2 0 2010 2 69.5 37.1 12.7 70.6 61 40 9 24.9 24.7 43 15 5 84.2 173.9 2011 5 60.6 68 16.9 16.3 36 25 8 33.8 29.4 165.9 14 289 75 42 2012 19 64.8 148.5 17.8 30.1 25.5 10 9 36 105.3 188.9 9 210 83.3 37.8 2013 3 69.3 23 18.6 12 24.5 8.1 6 53.9 9.9 106.5 5 29 79.7 0 x2，x43分别为4月下旬、7月中旬诱蛾量（头·灯-1·旬-1）；x20，x21，x22，x38，x40分别为5月下旬、6月上旬、6月中旬、6月下旬、7月下旬幼虫量（头·株-1·旬-1）；x5，x46分别为上年12月、当年6月下旬相对湿度（%）；x10为4月中旬气温（℃）；x9，x12，x28，x31，x53分别为1月、4月中旬、5月中旬、5月下旬、7月中旬降水量（mm）。 表 2 枇杷黄毛虫发生量预测因子历史数据
Table 2. Predictive factors for occurrence quantity of Melanographia flexilineata
年 份 x5 x9 x11 x14 x17 x20 x27 x29 x31 x32 x40 x42 x48 x50 x53 2008 77 91.7 78.7 57.1 64.6 28 54.4 25.3 66.6 24.2 22 0 30.8 26.9 60.2 2009 61.3 36.3 75.8 53.2 49.8 9 60.6 22.6 35.8 24.8 14 328 29.1 58.1 0 2010 69.5 37.1 80.3 60.4 61.3 61 76 22.3 24.7 21.8 15 0 28.9 38.4 173.9 2011 60.6 68 60.1 57.9 63.7 36 52.5 20.8 29.4 24.2 14 0 30.8 2.4 42 2012 64.8 148.5 72.7 66.4 66.3 25.5 70.6 21.1 105.3 24.1 9 0 31.7 15.1 37.8 2013 69.3 23 49 63.7 70.4 24.5 70.1 25.4 9.9 22.9 5 0 31.6 1.5 0 x5，x11，x14，x17，x27分别为上年12月、当年4月中旬、4月下旬、5月上旬、5月中旬相对湿度（%）；x9，x31，x50，x53分别为1月、5月下旬、7月上旬、7月中旬降水量（mm）；x29，x32，x48分别为5月下旬、6月上旬、7月上旬气温（℃）；x20，x40分别为5月下旬、7月下旬幼虫量（头·株-1·旬－1）；x42为7月上旬诱蛾量（头·灯-1·旬－1）。 表 3 枇杷黄毛虫发生期、发生量预测模型
Table 3. Forecasting model for occurrence quantity and period of Melanographia flexilineata
模型编号 预测模型 R2 1 y1=19.146+0.007x2-0.067 x5 -0.034 x9-0.486 x10+0.028 x12 1.000** 2 y2=-90.562+0.190 x5+0.142 x9+1.119 x11-0.044 x14+0.749 x17 1.000** 3 y3=3.005+0.245 x20+0.005 x21+0.085 x22-0.086 x28+0.010 x31 1.000** 4 y4=389.386+0.238 x20-1.230 x27-7.494 x29 +0.539 x31-0.763 x32 1.000** 5 y5= 34.876-0.139 x38-0.028 x40-0.004 x43-0.048 x46-0.043 x53 1.000** 6 y6=-492.071+2.252 x40+0.010 x42+15.380 x48-0.525 x50+0.061 x53 1.000** y1为第1代幼虫发生高峰期（5月15日为1）；y2为第2代幼虫发生高峰期（6月21日为1）；y3为第3代幼虫发生高峰期（8月1日为1）；y4为第1代幼虫高峰期发生量（头）；y5为第2代幼虫高峰期发生量（头）；y6为第3代幼虫高峰期发生量（头）。 -
将2013年的虫情、气象数据，应用1.4节的应验程度判定模式，分别对枇杷黄毛虫第1代至第3代幼虫的发生高峰期、高峰期发生量预测结果进行检验（表 4和表 5）。结果表明：用逐步回归法拟合的枇杷黄毛虫幼虫发生期、发生量模型，评分分值高，均大于99分，在准确的范围内。根据模拟结果，第1代、第2代和第3代枇杷黄毛虫幼虫发生高峰期模型拟合值分别为5月19日、6月25日、8月16日，实际分别为5月19日、6月25日、8月16日；第1代、第2代和第3代幼虫高峰期发生量模型拟合值分别为30.62，106.28和5.83头·株-1·旬-1，实际分别为31，107和6头·株-1·旬-1。模型拟合值接近实测值，拟合结果准确。
表 4 枇杷黄毛虫发生期预测模型验证
Table 4. Verification of forecastin model for occurrence period of Melanographia flexilineata
预测对象 a1 a2 t δ Ts 结论 第1代幼虫 5 5.04 10 2.11 99.95 准确 第2代幼虫 5 5.02 5 3.77 99.99 准确 第3代幼虫 16 15.99 15 5.81 100 准确 表 5 枇杷黄毛虫发生量预测模型验证
Table 5. Verification of forecastin model for occurrence quantity of Melanographia flexilineata
预测对象 a a1 a2 t δ Ts 结论 第1代幼虫 53.75 31 30.62 10 15.03 100 准确 第2代幼虫 152.55 107 106.28 5 26.27 99.98 准确 第3代幼虫 22.67 6 5.83 15 13.22 99.97 准确 -
本研究对枇杷黄毛虫进行了灯下诱蛾及田间幼虫系统调查。结果表明：枇杷黄毛虫在浙江余杭塘栖田间虫量与越冬期温湿度条件、主害代前期虫口基数及气候条件等密切相关，灯下诱蛾年度间总虫量2008年和2011年最高，2013年明显低于历年同期，与当年夏季持续高温干旱、不利于枇杷黄毛虫生长发育有关。田间幼虫量也呈现出相似的趋性，以2011年最高，2013年最低。关于枇杷黄毛虫在中国南方枇杷产区的每年发生代数、种群动态等，国内相关文献主要为福建[3, 5]、浙江[6-7, 12]等地的调查研究，在福建福州1 a发生5代[5]，上海地区1 a发生3代[13]。本研究表明枇杷黄毛虫在余杭塘栖1 a发生4代，与前人报道一致[6-7]，越冬代成虫始见期2008-2013年在4月中旬至下旬（4月14日至4月29日），2008年、2009年、2013年较早，2010-2012年相对较迟，与王恩等[6]的研究结果较一致（4月20日），比何富泉等[7]报道的（5月上旬）约早15~20 d。塘栖枇杷黄毛虫田间幼虫量年度间均以第2代危害最重，发生高峰期主要出现在6月下旬，少数年份推迟至7月上旬，主害代灯下成虫峰期时间、蛾量年度间有差异，总体均以第3代峰期诱蛾量最高，其次为第2代，第4代灯下成虫与田间幼虫量均下降较快，9月中旬后，幼虫陆续在树皮裂缝中、分枝处或树干基部和附近灌木上吐丝、结茧、化蛹越冬。
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本研究对枇杷黄毛虫发生的相关因素进行了调查和统计分析，筛选出发生期和发生量各15个因子，建立了种群动态预测模型，为预测各代次枇杷黄毛虫的发生高峰、开展适期防治提供了依据。枇杷黄毛虫发生高峰期受前期田间幼虫虫口密度、降水量影响最大；田间幼虫高峰期发生量与前期虫口基数呈极显著正相关，是枇杷黄毛虫发生的最重要因素，平均相对湿度、降水量、气温等气象因子也有一定的相关性，春夏气候较为暖湿的年份，成虫产卵量多，第1代和第2代幼虫田间发生量大，气温过高则卵孵化率、幼虫存活率下降[12]，特别是2013年夏季高温干旱对黄毛虫的发生有抑制作用，而比较暖湿的季节有利于黄毛虫发生。本研究引入了多年来枇杷黄毛虫发生期每旬平均气温、相对湿度、降水量等气象因子及前期虫口基数进行建模，应用唐启义等[11]提出的应验程度判定模式进行拟合率检验，评分分值均在90以上，模型拟合值与实测值接近，拟合结果准确，对今后枇杷黄毛虫的适时、准确预报具有一定的实用价值，可供杭州地区及气象等环境条件总体较为相似的地区应用。
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建立枇杷黄毛虫种群动态模型的目的是为了预测预报更为适时准确、更有效地为生产服务，以减少因该虫危害造成的损失。枇杷黄毛虫年度间发生期和发生量受当年气候条件等因素影响，在每年发生盛期内又呈季节性消长，采用多年数据建立种群动态模型可实行较准确的预测。本模型主要依据2008年以来的数据资料，为更充分地显现其年度间的周期性规律，增强预报结果的准确性，笔者将逐年追加监测资料，使样本总数增多，校正模型，使预测精度不断提高，更好地服务于生产实际。
Quantitative population characteristics and a prediction model for Melanographia flexilineata from Tangqi, Zhejiang
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摘要: 采用灯下诱蛾和田间幼虫系统调查相结合的方法,研究枇杷黄毛虫Melanographia flexilineata种群数量特征和消长动态,并建立其发生趋势预测模型。结果表明:2008-2013年灯下诱蛾越冬代成虫始见期在4月中旬至下旬(4月14日至29日),其中2010-2012年相对较迟,峰期持续时间、蛾量受当年气候等条件的影响呈相应的变化,2008年和2011年为最高峰期虫量,2013年明显低于历年同期;田间幼虫发生量也呈现出相似的趋势,年度间均以第2代幼虫危害最重,峰期主要出现在6月下旬,少数年份推迟至7月上旬,第4代灯下成虫与田间幼虫量均下降较快。在此基础上,以枇杷黄毛虫的田间系统监测资料及气温、相对湿度、降水量等气象因素作为预测因子,采用逐步回归分析法,筛选出了具有显著回归影响的24个因子进入回归模型,建立了第1代至第3代枇杷黄毛虫发生期和发生量预测模型,其中影响枇杷黄毛虫种群数量消长的关键因子为种群基数和降水量、气温和相对湿度。经检验,各代次发生期、发生量预测模型均达到99分以上的历史符合率和预测准确度,模型拟合值与实测值相符,能准确地预测出其发生量和发生高峰期。Abstract: To improve the forecasting and sustained prevention level of Melanographia flexilineata, population dynamics and quantitative characteristics were observed, then a forecast model was established by method of lamplight moth-trapping and a systematic larvae investigation from 2008-2013. Then, based on monitoring data including insect population and weather factors, such as temperature, humidity, and precipitation, a mathematical prediction model for quantity of occurrence and period of the 1st to 3rd generation of M. flexilineata was established using stepwise regression. Results by lamplight moth-trapping showed that the start for overwintering adult trappings was from middle to late April (from April 14th to 29th), but it was relatively late from 2010-2012 in contrast to other years. The peak period and quantity were affected by environmental factors such as climate, which led to peak quantities in 2008 and 2011 but a low ebb in 2013. Population dynamics of the larvae were similar trends with the 2nd generation causing the extremely serious harm; larval peak period occurred in late June but seldom in early July. The fourth-generation quantity of moth and larvae decreased rapidly. Based on the monitoring data collected from 2008 to 2013 including insect quantity and weather factors, the prediction mathematical models of occurrence quantity and period for the pest were established using the method of stepwise regression. Twenty-four factors which had a significant effect (P<0.05 or 0.01) on the regression forecasting model were screened out. Among them, population cardinal number, precipitation, humidity, and temperature were the key factors influencing pest population dynamics. Predicted values agreed well with measured values by inspection and application with the scores which could reflect the historical coincident rate and prediction accuracy of these models being over 99. Thus, this model could accurately predict the quantity and period of occurrence for M. flexilineata. The established prediction technique in this paper was signality to the accurate prediction and scientific prevention of M. flexilineata, which provided scientific basis for supervisors in production.
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抗生素因其广谱的抗菌特性和促进生长作用广泛应用于医疗卫生、畜牧及水产养殖等领域[1]。然而，进入机体的抗生素仅有小部分发挥作用，剩下约30%~90%会随着代谢排出体外[2-4]，并且以原药的形式输入周边环境[5]。一些化学性质稳定的抗生素会在环境中长期残留，不仅对周边植物[6]、鱼类[7]造成不利影响，其产生的选择压力还能够诱导耐药菌群的出现和抗性基因的传播[8]。鉴于其巨大的风险和威胁，抗生素以及抗性基因已经被世界卫生组织列为21世纪最重要的污染源之一。残留抗生素的去除和抗生素污染环境的修复成为保障生态安全和生命健康的重要举措。残留抗生素的去除主要有理化处理和生物降解2种途径，其中生物降解因为价格低廉、操作简便且不会造成二次污染而备受青睐[9]。当前关于利用微生物进行抗生素生物降解的研究日益增多，并已积累不少优良的菌种资源[10-11]。但抗生素被降解并不能确保转化产物的安全性，一些原药被代谢后可能会产生毒性更高的中间产物[12]。因此对降解菌株代谢产物的生物毒性评估和生态安全性评价是菌株能够实际应用的必要保证。土霉素(oxytetracycline，OTC)是当今应用范围最广、用量最多的抗生素之一[13]，由于性状稳定已在陆地、水体等多种环境中被高频次检出[14-15]。本研究前期分离获得1株OTC高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05，该菌株环境适应性好，能在液体体系、粪肥和土壤中发挥积极的降解作用[16]。本研究以该菌株为实验对象，利用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-Q-TOF-MS)初步解析菌株作用下OTC的降解产物，并以对OTC敏感的大肠埃希菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和水生生物斜生栅藻Scenedesmus obliquus作为指示生物，评估OTC降解产物的生物毒性，以期为菌株的安全使用提供初步理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验菌株和藻种
OTC高效降解菌A. nicotianae ZAF-05于2019年分离自制药厂活性污泥。OTC敏感菌革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌No 1.821、革兰氏阴性菌大肠埃希菌No 1.12882均来自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，OTC敏感斜生栅藻购自上海光宇生物技术有限公司。
1.2 培养基和试剂
OTC购于Solarbio公司，纯度＞99%。LB培养基用于细菌的培养，主要配方为胰蛋白胨10 g·L−1；酵母提取物5 g·L−1；氯化钠5 g·L−1，pH 7.2。BG11合成培养基用于供试斜生栅藻的培养，购自上海光宇生物技术有限公司并按说明书指导方法使用。质谱所用甲醇和乙腈等相关试剂均购自Merck公司(Kenilworth, 美国)。
1.3 方法
1.3.1 OTC降解产物分析
制备不同密度降解菌菌悬液，绘制细胞数量与悬液600 nm波长下吸光度[D(600)]的标准曲线，根据标准曲线得到合适密度的细菌悬液。在OTC终质量浓度为100 mg·L−1的LB培养基中接入终密度为1.5×105 CFU·mL−1的降解菌。培养2 d后，取样菌悬液经过滤除菌、过柱萃取后利用HPLC-Q-TOF-MS技术检测OTC降解产物。质谱数据由Agilent 6545 Q-TOF质谱仪获得，使用电喷雾电离源，以正离子和负离子模式工作。具体工作条件：离子化压力3 500 V，裂解电压75 V，碰撞能30 eV，质荷比50~1 200。筛选获得可能的转化产物以TPs表示。以添加OTC但不接种降解菌的处理为阳性对照，以不添加OTC但接种降解菌的处理为阴性对照，所有处理均设置3个平行。
1.3.2 OTC降解产物的生物毒性分析
降解产物毒性测定设置4个处理。对照A(ckA)：添加300 mg·L−1 OTC的LB液体培养基。T1处理：添加300 mg·L−1 OTC的LB培养基，接种降解菌；培养4 d后20 000 r·min−1高速离心2 min，取过滤除菌后的上清备用。T2处理：添加300 mg·L−1OTC的LB液体培养基，自然降解4 d。对照B(ckB)：LB液体培养基。①OTC降解产物对细菌的生物毒性。取2组各4支试管，按1∶1(v/v)加入LB培养液和上述4个处理样品，定容至体积5 mL。分别依次接入1.5×105 CFU·mL−1的枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌新鲜菌悬液，菌液密度确定方法同1.3.1。37 ℃下震荡培养，每隔24 h取样测定菌液吸光度[D(600)]，用以表征细菌数量。②OTC降解产物对供试藻的生物毒性。取1组4个三角瓶，依次加入16 mL BG11培养基和2 mL上述4个处理样品，混匀后接种终密度为1.2×103个·mL−1新鲜藻种。于25 ℃、12 h (光照) /12 h (黑暗)光周期条件下静置培养，每天定时摇晃4~5次，每隔24 h取样测定吸光度[D(680)]。培养4 d后取样藻液，参考武鹏鹏等[17]的方法测定藻液叶绿素质量浓度，参考邹宁等[18]的方法观察藻细胞结构。
1.3.3 数据分析
各处理均3个平行，所得数据利用SPSS 16.0进行方差分析，在0.01水平下确认差异显著性。
2. 结果与分析
2.1 OTC降解产物分析
OTC降解产物的生物毒性既取决于残留的OTC，也取决于降解过程中产生的中间代谢产物。培养2 d后，对各处理悬液产物进行HPLC-Q-TOF-MS分析发现：降解菌组和阳性对照中均检出了TP447和TP461，阴性对照中则未检出；推测TP447和TP461可能为OTC降解相关中间产物。图1 A和图1 B可见：在7.279 min时TP447出现了明显的特征峰，其图谱特征以及出峰时间与QI等[19]发现的脱甲基OTC一致；由图1 C和图1 D可见：TP447在正、负离子作用下均出现了脱甲基OTC特有的离子碎片图谱，推测TP447可能是OTC水解产物——脱甲基OTC。TP461在4~7 min区段内出现了多个特征峰(图2 A)，参考文献[20]可知：OTC出峰时间在5.434 min时，差向异构OTC(epioxytetracycline，EOTC)出峰时间在4.893 min时，同分异构OTC(isomeric oxytetracyline，ISO-OTC)出峰时间在6.550 min时；此3个化合物出峰时间、质荷比和分子离子峰图谱与TP461相同，推测TP461可能为OTC(图2 B)、EOTC (图2 C)和ISO-OTC (图2 D)的混合物。由表1可知：降解菌培养体系中OTC、EOTC和脱甲基OTC相对丰度极显著低于阳性对照(P＜0.01)，表明菌株ZAF-05在加速OTC分解的同时，还可能抑制了OTC向脱甲基OTC和EOTC的转化，使得体系中EOTC和脱甲基OTC丰度降低。
表 1 OTC及其推定代谢产物的相对丰度Table 1 Relative abundance of OTC and the putative degradation products可能的化合物 保留时间/min 分子式 相对丰度 阳性对照 降解菌处理 OTC 5.434 C22H24N2O9 13.872 7.254 EOTC 4.893 C22H24N2O9 20.931 5.231 ISO-OTC 6.550 C22H24N2O9 2.727 3.157 脱甲基OTC 7.279 C21H22N2O9 37.278 4.142 2.2 OTC及其降解产物对细菌的生物毒性
图3显示：72 h的培养期内，枯草芽孢杆菌在各处理中均有不同程度的生长，随时间推移细胞数量逐渐增加。具体来看，ckB处理下枯草芽孢杆菌生长良好，不同培养时间下细胞的吸光度[D(600)]始终最大，培养72 h时达2.563。相比之下，ckA处理72 h时D(600)仅0.334，表明受试细菌的生长受到明显抑制，极显著低于T1处理[D(600)=2.336]和ckB(P＜0.01)。同时T2处理下吸光度一直处于较低水平[D(600)=0.424，72 h]，与T1差异极显著(P＜0.01)。提示OTC的自然水解过程并不能明显降低液体中OTC及其水解产物的毒性，降解菌ZAF-05能有效分解OTC，降低OTC及中间代谢产物的毒性；T1处理下细菌细胞数量与ckB最为接近，说明降解菌减轻了OTC及中间代谢产物对枯草芽孢杆菌生长的不利影响。
图 3 不同处理对枯草芽孢杆菌生长的影响Figure 3 Effects of different treatments on growth of B. subtilisOTC的降解产物对大肠埃希菌生长的影响呈现出与枯草芽孢杆菌一致的态势(图4)。T2处理下，大肠埃希菌生长受阻，72 h培养期内，与ckA处理差异均不显著，说明OTC自然水解的解毒作用甚微。T1处理下，整个培养期内大肠埃希菌细胞数量始终处于较高水平，仅次于ckB，培养后期(48~72 h)甚至超过后者，推测可能是经ZAF-05降解后，OTC中间代谢产物为细菌生长提供了额外的碳源。
2.3 OTC及其降解产物对斜生栅藻的生物毒性
2.3.1 OTC及其降解产物对斜生栅藻生长的影响
从图5可以看出：斜生栅藻在4个不同处理中的长势不同，ckB处理下供试藻生长良好[D(680)＝1.064，96 h]，而ckA中培养96 h后斜生栅藻吸光度[D(680)]仅0.028，表明OTC抑制斜生栅藻生长，生理毒性较强。T1处理下，斜生栅藻细胞数量与ckB无显著差异，远高于T2和ckA，说明降解菌株ZAF-05有效缓解了OTC对斜生栅藻的生物毒害。培养0~48 h，T2处理的吸光度与ckA比较差异不明显，尽管48 h后有所增加但远不及T1，说明OTC能发生自然水解，但解毒作用有限。
2.3.2 OTC及其降解产物对斜生栅藻叶绿素的影响
从图6可以看出：ckB处理下斜生栅藻叶绿素质量浓度为2.126 mg·L−1，ckA为0.193 mg·L−1。可见，OTC的存在大大降低了藻的叶绿素质量浓度。与ckA相比，T1处理一定程度上缓解了叶绿素的减少(0.555 mg·L−1)，但仍极显著低于ckB (P＜0.01)。结合图5认为：尽管T1与ckB的藻类细胞数量相差不大，但其叶绿素质量浓度却显著降低，说明尽管降解菌ZAF-05能高效降解OTC，但短期(96 h)内，仍不能完全转化毒性物质，培养体系中残留的毒性可能会影响斜生栅藻的叶绿素合成。
图 6 不同处理对斜生栅藻叶绿素的影响Figure 6 Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus2.3.3 OTC及其降解产物对斜生栅藻亚细胞结构的影响
将斜生栅藻置于电镜下放大12 000倍观察细胞超微结构，由图7可见：ckB处理下斜生栅藻细胞截面为典型的椭圆形，细胞壁边缘整齐，细胞器界限清晰，叶绿体数量多，几乎布满整个细胞，平行排列的类囊体整齐地堆叠在叶绿体内。在叶绿体片层间的基质中可见电子密度较大的淀粉粒，淀粉粒数目较多(图7A)。相比之下ckA(图7B)和T2处理(图C)中的细胞壁边缘不整齐，略有缺刻，叶绿体数量少，且结构松散甚至破裂变形。叶绿体中基粒类囊体片层结构减少，形态模糊不清，且排列无序无方向。T1处理下(图7D)，斜生栅藻细胞叶绿体少于ckB，但结构仍然完整，整齐地分布在细胞壁周围，类囊体的片层结构清晰可见且平行排列整齐，细胞结构完整无明显损伤。以上结果证明：与T2和ckA相比，T1处理对斜生栅藻的亚细胞结构影响更小，再次证明降解菌ZAF-05能够有效降解并降低OTC的生物毒性。
图 7 不同处理下斜生栅藻的亚细胞形态Figure 7 Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus3. 结论与讨论
A. nicotianae ZAF-05是实验室前期分离获得的1株OTC高效降解菌，该菌株不仅能良好降解OTC，还对四环素和金霉素具有一定的去除能力，具有广泛的应用潜力。有些环境残留抗生素在消解时可能会被转化成毒性更高的中间代谢产物。如LI等[21]发现：经臭氧处理5~30 min后OTC大量分解，但产生的代谢产物比OTC的生物毒性更高，其生态危害也更大。因此明确降解菌株的代谢产物生物毒性是菌株能实际发挥作用的前提和保障。本研究采用HPLC-Q-TOF-MS技术解析了OTC的降解产物，最终获得脱甲基OTC、EOTC和ISO-OTC 3种代谢中间产物，其中脱甲基OTC和EOTC为自然水解产物，在降解菌体系和对照中均有出现，但对照中相对丰度远高于降解菌处理体系。研究[22-23]表明：四环素类抗生素的差向异构体，往往具有比母体化合物更高的毒性，而OTC水解形成的ISO-OTC毒性却较OTC及其衍生物(如EOTC)要小得多[23]。本研究中，对照中EOTC相对丰度为降解菌体系的4倍，而ISO-OTC在降解菌体系的相对丰度略高于对照，因此推测A. nicotianae ZAF-05促进了OTC及其高毒代谢产物EOTC向低毒物质(如ISO-OTC)的转化，降低了体系生物毒性。
本研究以大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和模式藻斜生栅藻为靶标生物，考察了OTC及其降解产物对供试细菌和藻类的影响。结果表明：OTC不仅抑制细菌和供试藻增殖，还导致藻细胞变形，引起叶绿体片层结构破裂，与同属四环素族的金霉素的细胞毒性表现一致[24]。OTC被降解后，细菌和藻细胞生长的抑制作用减轻，藻叶绿素合成和叶绿体超微结构的伤害作用缓解。说明降解菌ZAF-05促进体系中OTC及其高毒代谢产物EOTC向低毒物质转化，从而降低了生物毒性。
叶绿体是藻进行光合作用的重要细胞器，内部密布排列整齐的基粒内囊体，基粒内囊体既是叶绿素也是光合系统存在的场所，光合作用过程中的光反应在此进行[25-26]，因此基粒类囊体结构的完整性和有序性是叶绿体进行正常、高效的光能转换的首要前提，对于保障光合作用的顺利进行具有重要意义。本研究中OTC的存在破坏了藻细胞叶绿体中基粒内囊体片层结构的完整，影响了光合作用。这可能是OTC导致藻细胞数量减少的一个重要原因。而添加菌株ZAF-05后，藻内叶绿体仍整齐地分布在细胞壁周围，类囊体片层结构清晰可见且平行排列整齐，细胞结构完整无明显损伤，再一次证实，ZAF-05的降解作用能降低OTC的生物毒性，提高其生态安全性。
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图 1 2008-2013年枇杷黄毛虫灯下成虫种群数量特征
Figure 1 Quantitative characteristics of adult Melanographia flexilineata during 2008-2013
图 2 2008-2013年枇杷黄毛虫幼虫种群数量特征
Figure 2 Quantitative characteristics of larvae Melanographia flexilineata during 2008-2013
表 1 枇杷黄毛虫发生期预测因子历史数据
Table 1. Predictive factors for occurrence period of Melanographia flexilineata
年 份 x2 x5 x9 x10 x12 x20 x21 x22 x28 x31 x38 x40 x43 x46 x53 2008 15 77 91.7 15.8 27.5 28 8 3 9.4 66.6 157 22 508 84.7 60.2 2009 20 61.3 36.3 19.2 50.7 9 11 48 31.4 35.8 148 14 380 74.2 0 2010 2 69.5 37.1 12.7 70.6 61 40 9 24.9 24.7 43 15 5 84.2 173.9 2011 5 60.6 68 16.9 16.3 36 25 8 33.8 29.4 165.9 14 289 75 42 2012 19 64.8 148.5 17.8 30.1 25.5 10 9 36 105.3 188.9 9 210 83.3 37.8 2013 3 69.3 23 18.6 12 24.5 8.1 6 53.9 9.9 106.5 5 29 79.7 0 x2，x43分别为4月下旬、7月中旬诱蛾量（头·灯-1·旬-1）；x20，x21，x22，x38，x40分别为5月下旬、6月上旬、6月中旬、6月下旬、7月下旬幼虫量（头·株-1·旬-1）；x5，x46分别为上年12月、当年6月下旬相对湿度（%）；x10为4月中旬气温（℃）；x9，x12，x28，x31，x53分别为1月、4月中旬、5月中旬、5月下旬、7月中旬降水量（mm）。 
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表 2 枇杷黄毛虫发生量预测因子历史数据
Table 2. Predictive factors for occurrence quantity of Melanographia flexilineata
年 份 x5 x9 x11 x14 x17 x20 x27 x29 x31 x32 x40 x42 x48 x50 x53 2008 77 91.7 78.7 57.1 64.6 28 54.4 25.3 66.6 24.2 22 0 30.8 26.9 60.2 2009 61.3 36.3 75.8 53.2 49.8 9 60.6 22.6 35.8 24.8 14 328 29.1 58.1 0 2010 69.5 37.1 80.3 60.4 61.3 61 76 22.3 24.7 21.8 15 0 28.9 38.4 173.9 2011 60.6 68 60.1 57.9 63.7 36 52.5 20.8 29.4 24.2 14 0 30.8 2.4 42 2012 64.8 148.5 72.7 66.4 66.3 25.5 70.6 21.1 105.3 24.1 9 0 31.7 15.1 37.8 2013 69.3 23 49 63.7 70.4 24.5 70.1 25.4 9.9 22.9 5 0 31.6 1.5 0 x5，x11，x14，x17，x27分别为上年12月、当年4月中旬、4月下旬、5月上旬、5月中旬相对湿度（%）；x9，x31，x50，x53分别为1月、5月下旬、7月上旬、7月中旬降水量（mm）；x29，x32，x48分别为5月下旬、6月上旬、7月上旬气温（℃）；x20，x40分别为5月下旬、7月下旬幼虫量（头·株-1·旬－1）；x42为7月上旬诱蛾量（头·灯-1·旬－1）。
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表 3 枇杷黄毛虫发生期、发生量预测模型
Table 3. Forecasting model for occurrence quantity and period of Melanographia flexilineata
模型编号 预测模型 R2 1 y1=19.146+0.007x2-0.067 x5 -0.034 x9-0.486 x10+0.028 x12 1.000** 2 y2=-90.562+0.190 x5+0.142 x9+1.119 x11-0.044 x14+0.749 x17 1.000** 3 y3=3.005+0.245 x20+0.005 x21+0.085 x22-0.086 x28+0.010 x31 1.000** 4 y4=389.386+0.238 x20-1.230 x27-7.494 x29 +0.539 x31-0.763 x32 1.000** 5 y5= 34.876-0.139 x38-0.028 x40-0.004 x43-0.048 x46-0.043 x53 1.000** 6 y6=-492.071+2.252 x40+0.010 x42+15.380 x48-0.525 x50+0.061 x53 1.000** y1为第1代幼虫发生高峰期（5月15日为1）；y2为第2代幼虫发生高峰期（6月21日为1）；y3为第3代幼虫发生高峰期（8月1日为1）；y4为第1代幼虫高峰期发生量（头）；y5为第2代幼虫高峰期发生量（头）；y6为第3代幼虫高峰期发生量（头）。
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表 4 枇杷黄毛虫发生期预测模型验证
Table 4. Verification of forecastin model for occurrence period of Melanographia flexilineata
预测对象 a1 a2 t δ Ts 结论 第1代幼虫 5 5.04 10 2.11 99.95 准确 第2代幼虫 5 5.02 5 3.77 99.99 准确 第3代幼虫 16 15.99 15 5.81 100 准确
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表 5 枇杷黄毛虫发生量预测模型验证
Table 5. Verification of forecastin model for occurrence quantity of Melanographia flexilineata
预测对象 a a1 a2 t δ Ts 结论 第1代幼虫 53.75 31 30.62 10 15.03 100 准确 第2代幼虫 152.55 107 106.28 5 26.27 99.98 准确 第3代幼虫 22.67 6 5.83 15 13.22 99.97 准确
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