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单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes(以下简称单增李斯特菌)是一种重要的食源性人畜共患病原菌，人类的感染能够引发脑膜炎、败血症和流产等疾病。李斯特菌病因其较高的致死率使其成为仅次于沙门氏菌Salmonella感染的致命食源性疾病，尤其对孕妇、婴儿、老人等免疫力低下人群风险极高[1-2]。单增李斯特菌的危险性目前已引起了世界各国的关注，中国与其他许多国家将其列为进出口食品的必检项目。根据美国食品网的调查显示[3]，美国每年约2 600人感染单增李斯特菌，造成约260人死亡，在所有食源性疾病引起的死亡中，李斯特菌病占30%。据报道，中国大部分省市每年均有人和动物感染单增李斯特菌[4]。单增李斯特菌广泛存在于自然界中，主要以食物为传播媒介，特别在食品储运及加工过程中极易受单增李斯特菌污染。人类的李斯特菌病大多是通过食用受污染的肉类、蛋类、禽类、海产品、速冻食品、乳制品和蔬菜等多种食品所致[5]。单增李斯特菌的致病力与其血清型密切相关。目前，在食物和环境中发现的单增李斯特菌血清型有16种，与人类疾病相关的血清型主要有4b，1/2a和1/2b[6]，但不同来源的分离株其毒力、致病性、耐药性等也存在较大差异[7]。鉴于李斯特菌病对人类健康构成极大的威胁，预防和控制这类疾病需要建立一个长期的追踪和调查方案，采用细菌溯源技术，通过亚种分型，能够准确、迅速地确定单增李斯特菌分离株的来源，鉴定比较致病菌株间的差别，为致病菌的溯源和疾病防控提供明晰可靠的科学资料[8-9]。近年来，食源性致病菌分子溯源分型技术发展较快，主要分为3类：①基于酶切技术的分型方法，包括脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)分型；②基于DNA测序技术的分型方法，包括多位点序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)和全基因组测序(whole-genome sequencing，WGS)；③基于聚合酶链式反应(PCR)扩增技术的分型方法，包括多位点可变数串联重复序列分析(multi-locus variable-number of tandem repeats analysis，MLVA)，DiversiLab系统和CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins)系统。本文就以上述3类基因分型方法在单增李斯特菌监测溯源中的应用做一综述。
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PFGE分型的基本原理是通过限制性内切酶切割DNA特异性位点，利用琼脂糖凝胶分离成大量的片段从而得出一组细菌带型。使用不同的限制性内切酶能够产生不同的带型，该技术通过利用多种限制性内切酶来提高分辨力，更深层次地对菌株间基因相关性进行分析。在食源性致病菌分子流行病学和溯源性追踪研究方面，PFGE已成为基因分型方法的“金标准”[10]。有研究利用PFGE评估单增李斯特菌在家禽食品生产中的污染情况，发现在家禽生产链中多个环节存在潜在的单增李斯特菌污染风险[11]。此外，LEONG等[12]采用PFGE分型技术对48个食品加工设备中分离的单增李斯特菌进行分型，结果显示在多个食品加工设备中检测出PFGE图谱相同的菌株，表明污染源的传播方向是从加工环境到食品。FUGETT等[13]结合AscI和ApaI酶对不同来源的单增李斯特菌进行PFGE分型，结果显示：从洛杉矶一起暴发病例中分离到的单增李斯特菌与瑞士暴发病例中分离到的单增李斯特菌具有相同的PFGE图谱，表明二者具有较近的亲缘关系。为调查因单增李斯特菌引发食物中毒事件中的污染源，LOMONACO等[14]利用PFGE型方法成功地追踪到本次事件与食用受污染的香瓜Cucumis melo有关。上述究结果表明：PFGE在全基因组的水平上对病原菌进行分型，相同菌株在不同实验室进行试验均能得到相同分型图谱，分型指数往往在0.95以上，与传统核糖体分型相比其重复性更好、分辨力更高，目前该技术已成为多种细菌追踪溯源、分型鉴定和分子流行病学调查的常规工具之一。
通过建立PFGE分型方法标准化操作规程，结合互联网平台实现实验室间数据共享及比对，这对于食源性病原菌暴发事件的追踪调查具有重要意义[15-16]。美国PulseNet已归纳整理了13 284个单增李斯特菌PFGE图谱，其中有人类7 576个，食品2 863个，环境2 799个以及动物46个(Joseph Lavin, personal communication)。目前，有一些国家正在进行类似的PFGE研究，利用不同国家和地区的研究成果通过网络共享平台可建立一个全球PulseNet(http://www.pulsenetinternational.org/protocols/pfge/)数据库。尽管PFGE分型过程存在耗时长、成本高、操作复杂、带型之间比对困难等不足，但PFGE的优势在于能对所有的单增李斯特菌分离株进行有效分型，使得该项技术成为目前单增李斯特菌基因分型的最优分型方法。
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近年来，WGS技术正逐步应用于病原菌的暴发调查和分型鉴定中。WGS分型是指利用测序技术对病原菌整个基因组碱基序列进行测序，在全面了解病原菌的遗传信息与变异特征的基础上进行基因分型，提高了菌株进化和溯源分析的分辨力，有助于快速地进行暴发识别并追踪传染源。目前，用于病原菌全基因组测序分型的方法主要有2种：基于全基因组的单核苷酸多态性分型(wgSNP)和基于全基因组的多位点序列分型(wgMLST)。全基因组测序分型方法在肠炎沙门菌Salmonella enteritides，单增李斯特菌，霍乱弧菌Vibrio cholerae，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus中已得到初步应用。有研究对引发人类李斯特菌病相关联的病原菌进行WGS分型，进一步追踪其污染源。结果发现：该方法不仅能精确定位污染源，同时还能根据单核苷酸多态性分析菌株在该时段的进化关系[17]。FAGERLUND等[18]对长期引起某食品工厂污染的ST8型单增李斯特菌进行WGS分析，发现这些菌株同之前丹麦和挪威暴发食品污染事件的ST8型单增李斯特菌的wgSNP分析结果几乎完全相同，此研究结果表明：食品加工环境中持续存在的致病性菌株易于传播，是威胁食品加工厂安全的重要因素。另外，RUPPITSCH等[19]用wgMLST分析方法对单增李斯特菌进行分型，结果显示：基于DNA测序分析的wgMLST方法与PFGE分型相比对单增李斯特菌具有更高的分辨率和灵敏度，能对食源性疾病暴发源头进行精确确认。
WGS分型结果包含了病原菌全部的遗传信息，有利于毒力基因、耐药基因的筛选，结合序列比对软件更易发现基因组的变异特征[20]。在MLVA分型中，利用重复序列分析软件Tandem Repeat Finder可对WGS序列进行搜索，直接确定重复序列数目。WGS分型方法在病原菌的暴发调查和监控上与传统基因分型方法(PFGE，MLST，MLVA等)相比其分辨力和灵敏度更高、重复性更好，且便于数据比对[18]。此外，不同实验室之间可通过国际PulseNet(http://www.pulsenetinternational.org/protocols/wgs/)网络公共数据库进行全球数据的交流和共享。在食源性致病菌的暴发识别和溯源分析中，WGS正逐渐成为一个准确、快速、高效的鉴定工具。
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MLST是在多位点酶切电泳技术的基础上为研究菌群基因结构而设计的一种高分辨率分型技术。该技术通过PCR扩增7个管家基因内部具有足够变异度的等位基因并对其产物进行测序。经MLST数据库分析后得出每个菌株各个位点的等位基因序号，将这些等位基因序号组合构成一个等位基因图谱，即序列类型(sequences type，STs)[21]。MLST分型方法在与人类李斯特菌病爆发和散发相关的流行病学研究方面已得到广泛应用。有研究利用MLST分型技术探究单增李斯特菌种群进化关系[22]，结果显示单增李斯特菌的进化主要是菌株不断突变的结果。另有研究利用3种方法对71株单增李斯特菌进行基因分型，认为在单增李斯特菌的分型研究中MLST的分辨力优于血清分型和PFGE，可用于追踪暴发疫情的传染源[23]。WANG等[24]研究表明：国内12个省分离的212株单增李斯特菌中部分ST型别属于国内外潜在可能传播和暴发李斯特菌病的STs型。再者，WU等[25]用MLST方法对国内零售的即食性食品(RTE)中分离出80株单增李斯特菌分型分析，发现部分菌株的STs型与人类李斯特菌病和不同地区的暴发事件相关。
细菌分型溯源技术种类繁多，MLST以其简便快速，重复性强，分辨率高和数据可共享等优势在一定程度上满足了流行病学研究发展的要求。目前，已建立了多种病原菌的MLST数据库，巴斯德研究所根据单增李斯特菌MLST分型的7个管家基因(acbZ，bglA，cat，dapE，dat，ldh，lhk)建立了用于单增李斯特菌MLST分型的数据库(http://www.pasteur.fr/fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.html)[25]。随着新一代测序技术的出现，wgMLST分型方法能同时将成百上千个基因位点的序列进行比对，与传统的7位点MLST基因分型方法相比具有更高的分辨力。但2种MLST分型方法均需要测序，使用成本较高。相信随着测序技术的发展，测序费用的降低，在不久的将来MLST分型技术有望成为某些细菌分型的“金标准”。
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MLVA分型是以PCR扩增为基础的基因分型方法之一，该方法利用存在于病原菌基因组DNA特殊位点中的大量可变串联重复序列作为检测靶标，设计特异性引物对每个位点进行PCR扩增产生不同大小的片段，通过毛细管电泳确定扩增产物大小，进而转化为每个位点的重复数，最终以一系列串联数字的形式来表示一个菌株型别。所有的细菌基因组序列都包含不同程度的串联重复数，这为细菌遗传多样性提供有关功能、进化及分型方面的重要信息。有研究对91株单增李斯特菌进行MLVA分型，结果显示该方法分辨力较高，可作为一线检测方法用于李斯特菌病的暴发确认和溯源检测[26]。此外，SALEH-LAKHA等[27]利用MLVA方法对2 421株单增李斯特菌进行分型，并建立了关于2 421株单增李斯特菌MLVA分型结果的数据库，用于单增李斯特菌的流行病学监测和溯源研究。在MLVA分型方法的初步应用中，LUNESTAD等[28]对农场和食品加工厂分离的65株单增李斯特菌进行MLVA分型时发现，其中1个MLVA图谱与曾经多次在本地区暴发的李斯特菌病病原菌图谱一致，表明消费一些鱼类产品仅仅是引起食源性李斯特菌病流行的可能因素之一。同样地，DASS等[29]研究发现，造成冷冻熏鲤鱼加工厂单增李斯特菌污染的污染源除了来源于生产线外，还可能是原材料携带污染源并通过生产加工线传播，最终导致成品冷冻熏鲤鱼的污染。
MLVA方法在大肠埃希菌Escherichia coli，单增李斯特菌和沙门氏菌等的分型研究中已得到广泛应用，并建立了国际PulseNet(http://www.pulsenetinternational.org/protocols/mlva/)网络在线数据库，用于全球范围内MLVA分型结果的共享与比较，从而为大范围细菌暴发事件的确认提供有利的数据支撑。MLVA方法不仅具有方便快捷、重复性好、高通量等优势，其分型结果能够以数字化的形式显示，降低了之前琼脂糖凝胶电泳分析过程中产生的主观影响，更利于资料的分析、共享和比较。虽然该方法已在细菌流行病学分析和溯源研究中广泛应用，但因其需要专门的序列分析仪器，同时试剂费用昂贵，故在普通实验室还难以普及。
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DiversiLab是以repetitive-sequence-based PCR(rep-PCR)技术为原理的自动化基因分型系统。通过PCR扩增细菌基因组的非编码重复序列，再将扩增片段在Agilent 2100自动生物分析仪上进行微流体电泳分离，并使用软件实时分析和处理数据对细菌进行基因分型[30]。该方法通过电泳产生的特异性指纹图谱来比较菌株间的相似性，提高了其分型能力，能对环境及食品样品中的病原微生物进行有效地监测和追踪。目前，该技术已被广泛应用于多种细菌和真菌的分子流行病学研究。有研究利用DiversiLab分型系统对食品中分离出的25株单增李斯特菌进行基因分型，结果显示某类食品在加工过程中通过不同或相同的途径污染了相同的单增李斯特菌，除此之外还有一些相同来源的菌株已发生变异[31-32]。另有研究对91株单增李斯特菌的同源性进行分析，结果发现所有菌株的rep-PCR型相似度较低，表明该地区单增李斯特菌的rep-PCR型存在多样性[33]。此外，ROUSSEL等[34]将DiversiLab分型系统同PFGE相比较，发现DiversiLab分型系统更适用于食品加工过程和环境中污染源的快速追踪。综合上述文献资料和数据可知，DiversiLab系统一次能对12个样本进行分析，总操作时长大约6~8 h，是单增李斯特菌暴发流行普查阶段最理想的分型方法。
DiversiLab系统分型与PFGE分型结果有良好的一致性[35-36]，相对于分型“金标准”的PFGE来说，其重复性更高，操作流程更简便，产生的数据易于标准化[37]，可作为快速分型或暴发疫情的流行病学分析首选分型方法。DiversiLab分型系统在食源性致病菌的主动监测及病原体溯源等方面具有重要的应用价值，但DiversiLab分型系统也存在一定的局限性。该系统试剂成本较高，需要昂贵的仪器设备，对实验操作人员的专业素养要求较高，结果判定标准还不够明确。这些问题都亟待进一步探讨和解决。
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CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)序列由一种成簇的、有规律间隔的短回文重复序列构成，其与周围的一些辅助蛋白(Cas)共同组成CRISPR-Cas系统(简称CASS系统)。该系统是细菌通过基因水平转移而形成的一种获得性免疫系统，与细菌抵抗外源遗传物质入侵有关。根据CASS系统中的Cas蛋白和识别机制的不同，CASS系统分为3个不同的类型，即TypeⅠ，TypeⅡ和TypeⅢ。典型的CASS系统主要由leader，repeat，spacer和一套cas基因组成，其中短的重复回文序列repeat是最核心的结构，cas基因主要负责编码修饰核酸的相关蛋白。根据细菌中是否存在CASS系统及细菌中spacer序列的数目和排列状态特征可对细菌进行基因分型[38]。目前已有研究利用CASS系统对空肠弯曲杆菌Campylobacter jejuni和沙门氏菌进行基因分型，但关于CASS系统在单增李斯特菌上的应用还未见报道。FABRE等[39]研究显示CASS系统在操作程序和样本通量上优于PFGE，MLST，MLVA等分型方法，更适合于沙门氏菌的暴发调查。因此，在食源性疾病污染源的追踪中，可利用CASS系统对环境和食品中病原菌的CRISPR结构进行测序分析，用于追踪疫情传染源和控制疫情蔓延。
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综上所述，基因分型方法已成为单增李斯特菌流行病学研究的重要工具，在单增李斯特菌的暴发调查和溯源研究中，PFGE，MLST，MLVA等分型技术已得到广泛应用。其中，PFGE技术具有高的再现性和分辨力，是病原微生物基因分型的“金标准”；而有着更高分辨力和再现力的MLST新技术正在逐渐被使用；MLVA重复性好、高通量，有利于实验室间数据交流共享；DiversiLab系统操作简便，快速省时，易于标准化；CRISPR-Cas系统在操作程序和样本通量上优势较大；WGS分型能结合多种基因分型方法对病原菌进行分析，具有更高的分辨率和灵敏度。这些分型技术均具备一定的优势同时也存在不足之处，在实际应用中可根据具体用途和各自的特点进行选择，但这些技术大多是针对病原菌基因组中的小部分遗传信息进行分析，对于高度克隆的菌株在分辨力上就略显不足。而全基因组测序分型是对病原菌整个基因组碱基序列进行分析，不仅提高了分型能力，还能鉴定分子血清型，筛选毒力基因、耐药基因等。此外，利用全基因组测序获得的序列信息，可同时对病原菌进行MLST，MLVA，DiversiLab系统和CRISPR-Cas系统分型，不仅提高了分型的准确性，也有利于不同分型方法的比较。但全基因组测序技术目前还存在测序耗时长，费用昂贵等不足，在推广上还存在难度。相信未来在确定病原菌的亲缘关系、追踪传染源、控制疫情的暴发和传播等方面，基因分型技术将以其准确、快速、高分辨力、高重复性、易于交流分享等优势会受到越来越多研究者的青睐。
Application of genotyping methods to monitoring and source-tracking of Listeria monocytogenes
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摘要: 单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes是一种重要的食源性人畜共患病原菌，能引起人和多种动物流产、脑膜炎、肠胃炎、败血症、死胎等病症。与传统基于表型的分型方法相比，基因分型方法具有简单快速、分辨率高、敏感性强、重复性好等特点，在李斯特菌病病原菌的监测和溯源中具有重要的应用价值。对单核细胞增生性李斯特菌的3类基因分型方法：酶切技术，DNA测序技术和聚合酶链式反应（PCR）扩增技术进行了概述，从分型成本、样本通量、分辨力、灵敏度、重复性、快捷性和普及性等方面比较了3类基因分型方法的主要特点，重点评述了这些方法在单核细胞增生性李斯特菌暴发监测和溯源上的应用案例，为研究不同基因分型方法在单核细胞增生性李斯特菌暴发诊断、分型检测及感染溯源等方面的应用提供参考。
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关键词:
- 动物细胞学 /
- 单核细胞增生性李斯特菌 /
- 基因分型 /
- 监测溯源 /
- 综述
Abstract: As an important food-borne zoonotic pathogen, Listeria monocytogenes could cause people and various animals abortion, meningitis, gastroenteritis, sepsis, stillbirth and other diseases of listeriosis. Compared with the traditional phenotypic typing methods, the genotyping methods were characterized by simplicity and rapidity, high resolution, strong sensitivity and good reproducibility, thus having important application value in the monitoring and source-tracking of L. monocytogenes. In this research, three types of genotyping methods for L. monocytogenes, namely, enzyme digestion, DNA sequencing and PCR amplification were reviewed. The main features of these methods were compared in terms of the genotyping cost, sample throughput, resolution, sensitivity, reproducibility, rapidity and popularity, especially focusing on the application of these methods to the monitoring and source-tracking of L. monocytogenes. The research provided reference for the study of applying different genotyping methods to the diagnosis, typing and source-tracking of L. monocytogenes.-
Key words:
- zoocytology /
- Listeria monocytogenes /
- genotyping /
- monitoring and source-tracking /
- review
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杨树为杨柳科Salicaceae杨属Populus植物，共包括五大杨派100余种，在世界范围内广泛分布，以30°~60° N的温带或暖温带地区较为常见[1]，是短期轮伐的造林树种，对解决生态环境治理和木材短缺问题有利[2]。目前中国林业发展中推广的杨树新优品种主要来源于人工杂交选育，具有早期速生、材质好、抗性强等特点，创造了巨大的生态效益、经济效益以及社会效益[3]。因此杂交育种仍然是目前乃至今后培育杨树良种的重要手段。美洲黑杨Populus deltoides原产于北美密西西比河下游地区，是中国引种的南方型平原地区重要速生工业用材树种和绿化造林树种之一，是人工杂交选育新品种的常用亲本。李世峰等[4]发现：美洲黑杨杂交组合苗高和胸径平均值均超过亲本(T120和I-69)。罗敬[5]以美洲黑杨与小叶杨P. simonii为亲本进行杂交发现：获得的130株杂交子代苗高和地径在组合间和组合内都存在广泛变异。李火根等[6]以美洲黑杨与欧美杨P.×euramericana作亲本构建杂交组合，结果发现：得到的F1代13个无性系及亲本I-69杨的生长量和分枝特性在无性系间存在较大差异。王瑞文等[7]以黑杨派不同杂种无性系为亲本开展杂交试验，并估算杂种苗期生长性状遗传参数，结果表明：F1代杂种优势明显，通过综合评价可初步筛选出优良杂交组合及优良无性系。王庆斌等[8]以I-69杨为母本，青杨P. cathayana和小黑杨P. simonii×P. nigra为父本进行杂交，初选了一批杂种新无性系并进行了综合分析评价，为杨树改良和新品种选育提供了指导。但目前杨树发展过程中也存在着一些急需解决的问题，如品种单一，低产林分多，良种化率不高，飘絮严重等，严重影响长江中下游平原地区杨树生产与发展，亟待选育出适合本地速生、优质、高产及无絮的南方型美洲黑杨新品种进行更新换代。本研究选择速生、优质、高产及抗性较好的美洲黑杨作亲本构建杂交组合，对杂种苗期生长性状和叶片性状进行遗传变异分析，并通过综合指数选择法选出生长量较大的优良杂交组合，以期为长江中下游地区杨树良种化生产提供材料。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
研究区位于南京市栖霞区八卦洲街道外沙村南京林业大学无絮杨育种基地(32°13′N，118°48′E)，该地区属亚热带季风气候区，四季分明、温暖湿润、雨量集中，全年平均气温为15.4 ℃，土壤肥沃，土壤结构良好，透气透水性较强，土壤中性偏碱。
1.2 试验材料
2020年3月进行杂交试验。9个杂交组合分别为：NL15 (P. deltoids ‘Nanlin 15’，♀)×S3239(P. deltoides，♂)，SY2(P. deltoids ‘Siyang-2’，♀)×NL447(P. deltoides ‘Nanlin 447’，♂)，NL15(♀)×NL780(P. deltoides ‘Nanlin 780’，♂)，NL15(♀)×SH3(P. deltoids ‘Hong-3’，♂)，NL15(♀)×B106(小叶杨回交F1代，♂)，SY2(♀)×NL3804(P. deltoids ‘Nanlin 3804’，♂)，NL15(♀)×SH2(P. deltoids ‘Hong-2’，♂)，SY2(♀)×SH2(♂)，NL15(♀)×NL447(♂)，各杂交亲本遗传背景信息详见表1。5月收集所有的杂交种子带回实验室处理，随后在研究区河泥苗床上播种育苗，7月初将所有的杂种苗分区移栽到普通苗床上，遮阳数日，苗期正常水分管理。每个杂交组合按单因素随机排列，6株为1小区。
表 1 美洲黑杨杂交亲本信息Table 1 Basic information of parents in hybrid experiment of P. deltoides杂交亲本 来源 S3239、SH3(洪3)、SH2(洪2)、
NL3804(南林3804杨)起源于美国密西西比河下游的美洲黑杨无性系，属美洲黑杨，原产地美国密西西比河下游第38号
洲，1991年从美国南方林业试验站引进，2008年从美洲黑杨种质资源库中选出NL447(南林447杨) 来源于I-69×445杂种无性系(属于欧美杨，开花早) NL780(南林780杨) 来源于85杨半同胞家系 B106 来源于小叶杨与美洲黑杨优良亲本回交F1代杂种无性系 SY2(泗杨2号) 来源于母本I-69杨×S3239杂种无性系 NL15(南林15杨) 来源于I-69×S3244杂种无性系，母本I-69杨来源20世纪70年代引自意大利杨树研究所，父本S3244来 自美国密西西比河下游第32号洲 1.3 试验方法
1.3.1 苗期生长性状测定
2020年10月调查苗高和地径。苗高用精确到1 cm的3 m塔尺测量，地径用精确到1 mm的游标卡尺测量，材积根据王明庥等[9]的方法计算，公式为：V材=πD2H×10−2/12。其中V材为材积(cm3)，H为苗高(cm)，D为地径(mm)。
1.3.2 苗期叶片性状测定
2020年9月，从各杂交组合小区内选取2个标准株，各株采集第5~7片叶。测定叶长(cm)、叶宽(cm)、叶柄长(cm)，叶宽基距(叶最宽处距叶基距离，cm)用直尺测量，侧脉夹角(主脉与最大叶宽处侧脉的夹角，°)用量角器测量，叶面积(cm2)和叶周长(cm)用IMAGE J的图像处理功能计算获得，叶形指数=叶长/叶宽。
1.4 数据处理与分析
采用R语言、DPS软件和Excel 2016对试验数据进行统计分析、处理和绘图。
用R语言进行性状方差分析，线性模型如下：Xijk=μ+ti+bj+eijk，Xij=u+ti+eij。其中：Xij、Xijk为实际观测值，μ为总体平均数，ti为组合效应，bj为区组效应，eij、eijk为随机误差。
遗传参数估计公式：
$$ {h}_{1}^{2}=\frac{r{\sigma }_{\mathrm{f}}^{2}}{{\sigma }_{\mathrm{e}}^{2}+r{\sigma }_{\mathrm{f}}^{2}}\times 100\%; $$ $$ {h}_{2}^{2}=\frac{{\sigma }_{\mathrm{f}}^{2}}{{\sigma }_{\mathrm{e}}^{2}+{\sigma }_{\mathrm{f}}^{2}}\times 100\%; $$ $$ {C}_{\mathrm{v}\mathrm{g}}=\frac{\sqrt{{\sigma }_{\mathrm{s}}^{2}}}{\overline X}\times 100\%; $$ $$ {C}_{\mathrm{v}\mathrm{e}}=\frac{\sqrt{{\sigma }_{\mathrm{e}}^{2}}}{\overline X}\times 100\mathrm{\%}; $$ $$ {C}_{\mathrm{v}\mathrm{p}}=\frac{\sqrt{{\sigma }_{\mathrm{p}}^{2}}}{\overline X}\times 100\%{\text{。}} $$ 其中：
$ {h}_{1}^{2} $ 、$ {h}_{2}^{2} $ 为家系和单株遗传力，r为各组合的重复数，Cvg为遗传变异系数，Cve为环境变异系数，Cvp为表型变异系数，σs为遗传标准差，σe为环境标准差，σp为表型标准差，σf为遗传方差，$ \overline X $ 为各性状的平均值。遗传进度和选择效率计算：
$$ {G_{\rm{s}}} = q \times \sqrt {\sigma _y^2} \times \sqrt {h_y^2} \times 100\% ; $$ $$ {G_{\rm{y}}} = q \times \sqrt {h_x^2} \times \sqrt {h_y^2} \times {r_{xy}} \times \sqrt {\sigma _{{\rm{p}}y}^2} ; $$ $$ E = \left( {{G_{\rm{y}}}/{G_{\rm{s}}}} \right)/100\% {\text{。}} $$ 其中：Gs为直接选择遗传进度，q为选择强度，
$ {\sigma }_{y}^{2} $ 为性状y的遗传方差，$ {h}_{y}^{2} $ 为性状y的遗传力；Gy为相关遗传进度，$ {h}_{x}^{2} $ 为性状x的遗传力，rxy为性状x与性状y的遗传相关，$ {\sigma }_{\mathrm{p}y}^{2} $ 为性状y的表型方差；E为选择效率。通径分析模型。根据遗传相关系数建立多元高斯方程组，求解方程组，计算得到直接通径系数，具体参照王庆斌等[10]方法。计算间接通径系数=rda×baY，其中rda为自变量d与自变量a之间的遗传相关系数，baY为自变量a与响应变量Y之间的直接通径系数。计算遗传增益：△G
$=\dfrac{{h}_{1}^{2}S}{u}\times 100\mathrm{\%}{\text{；其中}}$ S为选择差，u为某一性状总均值。多性状综合指数选择。指数选择法采用Smith-Hazel指数选择对各杂交组合进行综合评价，公式为：
$I=\displaystyle\sum _{g=1}^{n}{b}_{{g}}{x}_{{g}}$ 。其中：I为选择指数值，bg为g性状的指数系数，xg为g性状的表型均值。指数系数计算公式为：bg=P−1GW；其中P为每个性状的表型协方差矩阵，G为遗传协方差矩阵，W为每个性状的经济权重构成的向量；利用等权重法估算杂交组合各性状的经济权重Wg，假设各性状表型标准差的单位变化具有同等重要性，即Wg=1/${\sigma }_{{g}}$ [11]，其中${\sigma }_{g}$ 表示各性状的表型标准差。2. 结果与分析
2.1 美洲黑杨不同杂交组合子代苗期性状遗传变异分析
由表2可知：杂种苗期生长性状与叶片性状在杂交组合间均达到差异极显著水平(P＜0.01)，表明不同杂交组合间子代苗高、地径、材积和各叶片性状均存在较大差异。杂种苗期生长性状和叶片性状的遗传变异分析得出(表3)：9个杂交组合的子代苗高、地径、材积平均值分别为150.10 cm、9.95 mm、41.16 cm3，其中NL3804×SY2子代苗高最大(170.63 cm)，NL447×NL15最小(119.94 cm)，两者相差42.26%。B106×NL15子代地径最大，为11.71 mm，NL447×NL15子代地径最小，为8.23 mm，前者为后者的1.17倍；S3239×NL15子代材积最大(60.62 cm3)，NL447×NL15最小(21.90 cm3)，两者相差2.76倍。叶片长度均值为13.63 cm，B106×NL15平均叶片长度最大，达15.98 cm，超出群体均值的17.24%，是最小组合SH3×NL15(12.04 cm)的1.32倍；叶片宽度均值为13.13 cm，B106×NL15平均叶片宽度最大，为15.25 cm，高于总均值16.14%，是叶片宽度最小组合NL780×NL15 (11.32 cm)的1.34倍；叶长/叶宽平均值为1.041，NL780×NL15长宽比最大，达1.093，SH3×NL15最小，为0.968；叶柄长度平均值为7.27 cm，组合B106×NL15最大(8.64 cm)，超出总均值18.84%，是最小组合NL447×NL15(6.18 cm)的1.76倍；侧脉夹角平均值为72.62°，最大组合为S3239×NL15，达75.42°，最小为NL3804×SY2，只有69.52°；叶宽基距平均值达2.46 cm，最大组合为NL447×SY2，可达 3.05 cm，最小为SH3×NL15，只有2.00 cm；叶面积平均值为142.25 cm2，最大组合B106×NL15 (188.71 cm2)与最小组合NL780×NL15 (110.95 cm2)相差1.70倍；叶周长平均值为 58.59 cm，最大组合B106×NL15 (69.15 cm)与最小组合NL780×NL15 (51.16 cm)相差35.16%。由表3可知：各性状表型变异系数均大于遗传变异系数，其中材积的遗传变异系数(31.13%)和表型变异系数(43.88%)均最大，说明具有较大选择潜力；除叶形指数和侧脉夹角外，其他叶片性状的表型变异系数均大于10%，其中叶面积表型性状变异最大(21.69%)，说明具有较大的选择空间。各性状的家系遗传力均大于单株遗传力，其中苗高、地径、材积、叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长的家系遗传力均大于0.8；单株遗传力为0.503~0.648，均属偏强度遗传控制；叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距的家系遗传力分别为0.743、0.696、0.712，单株遗传力分别为0.419、0.364、0.382，均为中度以上遗传控制。
表 2 美洲黑杨不同杂交组合生长性状与叶片性状方差分析Table 2 Variance analysis of growth and leaf traits of different hybrid combinations in P. deltoides性状 变异来源 自由度 F P 性状 变异来源 自由度 F P 苗高 组合间 8 8.372 0.000*** 叶柄长 组合间 8 6.865 0.000*** 地径 组合间 8 5.951 0.000*** 侧脉夹角 组合间 8 3.288 0.009** 材积 组合间 8 5.055 0.001*** 叶宽基距 组合间 8 3.469 0.007** 叶长 组合间 8 6.696 0.000*** 叶面积 组合间 8 6.748 0.000*** 叶宽 组合间 8 8.097 0.000*** 叶周长 组合间 8 6.677 0.000*** 叶形指数 组合间 8 3.885 0.004** 说明：***表示P＜0.001；**表示P＜0.01 表 3 美洲黑杨杂种苗期生长性状和叶片性状变异分析Table 3 Analysis on variation of growth traits and leaf traits of P. deltoides hybrids at seedling stage性状 苗高/cm 地径/mm 材积/cm3 叶长/cm 叶宽/cm 叶形指数 叶柄长/cm 侧脉夹角/(°) 叶宽基距/cm 叶面积/cm2 叶周长/cm 平均值 150.10 9.95 41.16 13.63 13.13 1.041 7.27 72.62 2.46 142.25 58.59 最小值 119.94 8.23 21.90 12.04 11.32 0.968 6.18 69.52 2.00 110.95 51.16 最大值 170.63 11.71 60.62 15.98 15.25 1.093 8.64 75.42 3.05 188.71 69.15 遗传变异系数/% 12.21 11.97 31.13 8.60 9.37 3.36 10.52 2.56 12.34 16.65 9.45 表型变异系数/% 15.54 16.09 43.88 11.22 11.72 5.18 13.64 4.25 19.98 21.69 12.34 家系遗传力 0.881 0.832 0.802 0.851 0.877 0.743 0.854 0.696 0.712 0.852 0.850 单株遗传力 0.648 0.553 0.503 0.588 0.640 0.419 0.595 0.364 0.382 0.590 0.587 2.2 美洲黑杨杂种苗期叶片性状与生长性状相关分析及间接选择
2.2.1 叶片性状与生长性状的相关性分析
由表4可知：在表型和遗传上，3个生长性状(苗高、地径和材积)之间均呈极显著正相关(P＜0.01)；叶长、叶宽、叶柄长、叶面积、叶周长分别与生长性状间呈显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关。叶形指数与生长性状间在遗传上呈显著负相关(P＜0.05)，在表型上负相关，但相关性不显著；侧脉夹角、叶宽基距与生长性状间相关性均不显著。叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长相互之间存在着显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关，叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距与其余叶片性状间呈较弱相关或负相关，相关性均未达到显著水平，表明叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距与其他性状间的遗传互作较小。
表 4 美洲黑杨不同杂交组合叶片性状与生长性状的相关性分析Table 4 Correlation analysis between leaf and growth traits of different hybrid combinations of P. deltoides性状 苗高 地径 材积 叶长 叶宽 叶形指数 叶柄长 侧脉夹角 叶宽基距 叶面积 叶周长 苗高 0.788** 0.880** 0.653* 0.792** −0.615* 0.708** −0.078 0.089 0.697** 0.735** 地径 0.711** 0.988** 0.857** 0.969** −0.570* 0.960** 0.206 0.287 0.967** 0.978** 材积 0.833** 0.977** 0.882** 1.010** −0.628* 0.958** 0.204 0.311 0.980** 1.004** 叶长 0.543* 0.762** 0.760** 0.941** −0.128 0.990** 0.388 0.404 0.956** 0.969** 叶宽 0.672* 0.881** 0.892** 0.923** −0.454 1.063** 0.359 0.357 0.988** 0.984** 叶形指数 −0.415 −0.395 −0.430 0.069 −0.320 −0.506 0.014 0.057 −0.377 −0.330 叶柄长 0.552* 0.860** 0.847** 0.899** 0.983** −0.329 0.277 0.603* 1.052** 1.050** 侧脉夹角 0.170 0.379 0.389 0.444 0.495 −0.168 0.491 −0.061 0.472 0.507 叶宽基距 −0.142 0.138 0.119 0.353 0.287 0.167 0.408 −0.024 0.329 0.282 叶面积 0.579* 0.872** 0.858** 0.943** 0.985** −0.227 0.974** 0.564* 0.270 1.001** 叶周长 0.606* 0.866** 0.860** 0.957** 0.973** −0.163 0.949** 0.591* 0.228 0.993** 说明：对角线下方为表型相关，对角线上方为遗传相关；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01 2.2.2 叶片性状对生长性状的间接选择
为进一步了解苗期叶片性状对生长性状的相关遗传进度和间接选择效率，参照王明庥[12]方法研究估算5%入选率(选择强度为2.06)下间接选择的相关遗传进度和选择效率。由表5可以看出：利用叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长对生长性状进行间接选择，相关遗传进度较大，苗高、地径、材积分别为26.492~32.615、2.378~2.729、27.106~31.508，间接选择效率苗高、地径、材积分别为74.8%~92.1%、106.27%~121.97%、114.66%~133.28%，其中对材积的选择效率最大。叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距对生长性状的相关遗传进度和间接选择效率均较低，表明叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距不适合作为生长性状的间接选择性状。
表 5 美洲黑杨不同杂交组合叶片性状对生长性状的间接选择Table 5 Indirect selection of leaf traits to growth traits in different hybrid combinations of P. deltoides性状 苗高 地径 材积 相关遗传进度 间接选择效率/% 相关遗传进度 间接选择效率/% 相关遗传进度 间接选择效率/% 叶长 26.492 74.80 2.378 106.27 27.106 114.66 叶宽 32.615 92.10 2.729 121.97 31.508 133.28 叶形指数 −23.310 −65.82 −1.478 −66.03 −18.031 −76.27 叶柄长 28.785 81.28 2.669 119.30 29.505 124.81 侧脉夹角 −2.862 −8.08 0.517 23.10 5.670 23.98 叶宽基距 3.303 9.33 0.728 32.55 8.742 36.98 叶面积 28.295 79.90 2.685 119.99 30.137 127.48 叶周长 29.810 84.17 2.713 121.24 30.847 130.48 2.3 美洲黑杨杂种苗期材积生长量的遗传控制通径分析
单株材积是影响苗期生长量的主要因子。由苗高、地径、叶片性状对材积的遗传作用(表4和表5)可知：苗高、地径、叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长等7个性状对材积生长量具有较强的遗传控制作用。由表6可知：7个性状对材积生长量均呈不同程度的遗传控制，其中地径对材积的直接控制作用最大，通径系数达0.565，其次为苗高，通径系数达0.417，同时苗高通过地径对材积产生较大的间接遗传控制作用；叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长对材积的直接通径系数均较弱，但这些性状通过地径对材积生长量的间接通径系数较大，达0.485~0.554，说明这些性状对材积生长量具有较大的正向间接遗传控制作用，并且这种间接遗传控制作用主要是通过与地径的遗传相关来实现。
表 6 美洲黑杨不同杂交组合各性状对材积的通径分析Table 6 Path analysis of volume in different hybrid combinations of P. deltoides性状 通过叶长 通过叶宽 通过叶柄长 通过叶面积 通过叶周长 通过苗高 通过地径 叶长 0.327 −0.542 0.160 0.269 −0.182 0.272 0.485 叶宽 0.308 −0.575 0.171 0.278 −0.184 0.330 0.548 叶柄长 0.324 −0.612 0.161 0.296 −0.197 0.295 0.543 叶面积 0.313 −0.569 0.170 0.282 −0.187 0.290 0.547 叶周长 0.317 −0.566 0.169 0.282 −0.187 0.307 0.554 苗高 0.213 −0.455 0.114 0.196 −0.138 0.417 0.445 地径 0.281 −0.559 0.155 0.273 −0.184 0.329 0.565 说明：粗体为各性状对材积的直接作用，其他为各性状通过另一性状对材积的间接作用 2.4 美洲黑杨优良杂交组合综合评价与遗传增益估算
采用多性状综合指数选择法对9个杂交组合进行综合评价。由于叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距与生长性状间的遗传互作及对材积生长量的直接或间接遗传控制均较弱，因此利用苗高(X1)、地径(X2)、叶片长(X3)、叶片宽(X4)、叶柄长(X5)、叶面积(X6)和叶周长(X7)等7个性状构建选择指数方程，进行生长性状与叶形性状的联合选择。根据等权重法估算各性状指标的经济权重，经济权重向量分别为W=(0.085，1.059，1.088，1.166，1.721，0.056，0.238)。
不同性状组合的指数选择方程和性状综合育种值选择进展(表7)显示：指数方程I1、I2、I3的综合育种值选择进展(△H)、指数遗传力和综合选择指数的估计准确度均较高，但苗高和地径的偏回归系数均存在负值，即为负向遗传进展；生长性状是育种改良的首要目标，不能以牺牲生长量的改良进行选择，所以这些方程不太理想。以苗高、地径、叶面积和叶柄长构建指数方程I4，其各性状的偏回归系数均为正值，即均为正向选择；综合育种值选择进展为5.71，指数遗传力为0.862，综合选择指数的估计准确度为0.926，方程较为理想。
表 7 不同性状组合指数选择方程Table 7 Index selection equation of different characteristics指数选择方程 综合育种值
选择进展(△H)指数遗
传力综合选择指
数的估计准确度I1=0.0975X1−0.189 0X2+0.6725X3+2.5578X4+2.8459X5+0.1195X6−0.3977X7 10.08 0.868 0.928 I2=0.1047X1−1.1988X2−0.4551X3+2.036 0X4+3.6552X5+0.0774X6 8.62 0.872 0.930 I3=−0.1347X1+4.1451X2+13.6535X4+4.0199X5−0.7178X6 7.35 0.896 0.937 I4=0.0954X1+0.0249X2+2.022 0X5+0.0613X6 5.71 0.862 0.926 根据方程I4计算各杂交组合的选择指数，按30%的入选率[12]选出B106×NL15、S3239×NL15、NL447×SY2 等3个杂交组合(表8)。其中B106×NL15、S3239×NL15的材积和叶面积的遗传增益较大，分别达29.00%、27.82%和37.91%、19.60%。从整体评价效果来看，材积生长量所获得遗传增益最大，达26.90%，超出总均值33.55%；叶片性状中叶面积所获得遗传增益最大，达16.85%，高于总均值19.78%。
表 8 美洲黑杨优良家系生长性状与叶片性状遗传增益估算Table 8 Estimation of genetic gain of growth and leaf characteristics in superior families of P. deltoides杂交组合 苗高/% 地径/% 材积/% 叶柄长/% 叶面积/% B106×NL15 3.06 14.69 29.00 16.07 27.82 S3239×NL15 9.56 14.14 37.91 12.54 19.60 NL447×SY2 8.36 3.27 13.80 3.13 5.89 平均增益/% 6.99 10.70 26.90 11.50 16.85 3. 结论与讨论
选育出速生、优质、高产及无絮的南方型美洲黑杨新品种进行更新换代是目前开展美洲黑杨杂交试验的主要目的，其中生长性状是黑杨派良种选育的首要目标。本研究对美洲黑杨9个杂交组合子代苗期生长性状进了遗传变异分析，发现苗高、地径和材积等3个生长性状在杂交组合间均存在极显著差异，生长性状家系遗传力均达0.80以上，均大于单株遗传力，表明生长性状受强度遗传控制[13]；其中材积性状的遗传变异最大(31.13%)，说明选择潜力较大，苗高次之(12.21%)，地径相对较小(11.97%)。生长性状变异主要来源于杂交组合间基因型的遗传基础差异。叶片是植物重要的营养器官，尤其叶柄和叶面积对林木的同化产物运输、光合产物的积累起着重要作用。本研究中杂交组合间各叶片性状差异显著，叶长、叶宽、叶柄长、叶周长和叶面积的家系遗传力均在0.85以上，表明这些叶片性状受较强的遗传控制[14]；叶柄长和叶面积的表型变异系数和遗传变异系数较大，均超过10%，说明选择空间较大；叶长、叶宽和叶周长的遗传变异系数均低于10%，选择空间相对较小。与李金花等[15]对美洲黑杨与青杨杂交子代叶形、成星奇等[16]对美洲黑杨与小叶杨杂交子代叶片的研究结果类似。叶形指数和侧脉夹角的家系遗传力相对较弱，遗传变异较低，受环境影响较明显。
研究美洲黑杨苗期叶片性状与生长性状间的遗传互作，对美洲黑杨早期选择具有重大意义。本研究中苗高、地径和材积等3个生长性状间的遗传相关和表型相关十分密切。叶片性状中叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长间均呈极显著正遗传相关，并与苗高和地径间也存在极显著或显著正遗传相关，而叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距与其他性状间存在负弱相关或相关性不显著；与张勇等[17]对橡胶树Hevea brasiliensis无性系生长和叶片表型性状的研究结果相类似，表明叶长、叶宽、叶柄长、叶面积、叶周长与生长性状间的遗传互作较明显。通过叶片性状联合对苗高、地径和材积进行间接选择，发现叶长、叶宽、叶柄长、叶面积和叶周长对3个生长性状的遗传相关进度和间接选择效率较大，而叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距的间接选择效率较弱，说明叶形指数、侧脉夹角和叶宽基距不适合作为评选优良杂交组合的标准。材积是评价苗期生长量的主要因子，利用通径分析方法分析苗高、地径和叶片性状对材积生长量的遗传控制作用大小及控制途径，结果发现苗高、地径对材积的直接遗传控制作用最大，苗高通过地径对材积的间接控制作用也较大，可知苗高和地径是影响材积生长量的首要因子，在综合评价过程中苗高和地径性状可作为主要选择目标；叶片性状中，叶柄长、叶面积对材积的直接通径系数较小，叶宽和叶周长的直接通径系数为负，即为负向选择，但这些叶片性状通过苗高和地径对材积产生的正向间接遗传控制作用较大，说明叶片性状对材积的控制途径主要通过与苗高和地径间的遗传相互作用来实现。这与李春明等[18]对毛白杨Populus tomentosa杂种无性系苗高、地径的构成因素研究结果相类似，表明开展苗期生长性状与叶片性状的联合选择是可行的。
育种目标是杂交亲本选择与选配的首先考虑因素。美洲黑杨作为中国南方型速生工业用材和绿化造林树种，速生、优质和高产是主要育种目标。本研究选用生长量较大、干形圆满通直及抗褐斑病的主要美洲黑杨(S3239、南林3804、南林15杨和泗杨2号等)品种作亲本，研究生长性状与叶形性状间的遗传互作，进行生长性状与叶片性状的联合改良；以苗高、地径作为选择依据，选出B106×NL15、S3239×NL15、NL447×SY2等3个速生、高产的优良杂交组合，同时发现材积生长量获得的遗传增益最大(26.90%)，改良效果较好。但本研究只是1年生苗和单地点试验数据，后续研究需增加多年多点的无性系苗期对比试验，以便选出性状更优良、遗传稳定的优良杂种无性系。
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